（生物化学与分子生物学专业论文）丙酸杆菌代谢物做为食品防腐剂的研究.pdf

论文摘要 防腐剂是食品中最重要的添加剂之一，目前经常使用的有苯甲酸( 钠) 、山 梨酸( 钾) 等化学防腐剂。经长期的研究发现这些化学防腐剂有诱癌性、致畸性 和易引起食品中毒等问题。生物防腐剂主要以天然农副产品为原料，用发酵等生 物技术制备，具有高效、无毒、适用性广、性能稳定等优点。取代化学防腐剂将 成为一种必然趋势。丙酸杆菌代谢物做为一种新近研究和开发的生物防腐剂，国 外对其进行了一些研究。但国内对这方面的研究还鲜见报道。本论文以食品中常 见的致酸败菌恶臭假单胞菌为指示菌对丙酸杆菌代谢物的抑菌特性做了较为详 细的研究。 本文的研究内容锻括对丙黢杆菌j 撞行初步研究，探讨其代谢产物的抑菌特 性：运用单次荦因子法分析得出了初始的优化培养基，然后运用s a s 统计软件 确定其发酵培莽基的黧要因素，并得到了其重要因素的最佳水平，以期得到抑馘 活性烫高的荫鞭杆菌代谢物：最后考察了该谢酸杆菌代谢产物的其它生物学性 质，包括其抑麓谱、稳机酸含爨、对濑度的稳定性、对不同蛋白酶的敏感性。 对该丙酸杆菌迸彳予显微形恣观察、生理生化鉴定及其代谢物抑菌饿质的研究 结果表弱：该斑酸枵萤细腿多为单生、多形态的，短锩戏丛生戏“汉字”状排列。 生理生化个别反应和文献报道不同。比浊法研究表明雨酸杆菌代谢产物在低p h 值( s o ) 条件下有较强的抑菌活性；琼脂扩散法研究凌明o d o n m 波长处吸兆 值为2 0 豹恶臭假单臆菡培养液，l o 倍稀释的麓液加入上层琼脂中，抑菌检测效 果最好+ 对丙酸轷旃培养条件及培弊基进行优纯绪采表明：丙酸秆菌以5 豹接种灏 3 0 培养7 2 小时其代谢物有较高的抑菌活性：在基础发酵培养基的水平上，单 次单因子法分析褥蜀傀纯的培养基成份为：氮源：1 o 豹玉米浆粉，碳源：2 的葡萄糖，并添加0 1 的t w e e n 8 0 。 为了确定影晌丙酸秆蘑教藩豹最熬要鑫豢，本文瘟霜了p l a c k e t - t - - b u r m a n ( p b ) 设计法。实验缩果表明发酵培养基中对发酵水平影响最大的围索为玉米 浆耪、簿母粉耪蔼萄耱。在确定重要困索静最馕承平辩，响应甏法是魄较毒效豹 一种方法。它建立在芷交设计原理的基础上，以很少的试验数爨对试验进行全颥 磺究，捷供爨熬与整钵豹关系，去解决颓测、，羧裁与俊纯赘露繇。霜桶瑾瑟法瓣 以上三个因素避 行水平的优化，得出最佳的培养基成份为：葡萄糖2 8 9 、玉米浆 耢1 0 9 、酵母鬻耱7 9 、k 2 h p 0 4 0 2 5 9 、m n s 0 4 0 0 0 5 9 、0 。1 熬t w e e n - 8 0 ，蒸馏零 1 0 0 0 m l ，p h7 0 。进一步对寓验结果进行回归分析，得到回归方程为： y = 3 1 7 6 6 6 7 + 6 1 5 3 7 5x l 一0 3 8 2 5x 2 0 5 8 3 7 5x 3 4 2 2 7 0 8 3x i - o 3 lx i x 2 0 4 0 7 5 x 2 x 3 3 4 1 4 5 6 3x 2 2 + 0 1 7x 2 x 3 1 9 0 2 0 8 3x 3 2 ，回归方程的标准差s = o 5 6 4 8 2 6 ，决 定系数r 2 = o 9 1 6 2 ，表明回归方程的拟合度较好。最优发酵培养基得到的代谢 产物的抑菌活力为3 4a u m l ，比优化前的基础发酵培养基的代谢产物的抑菌活 力1 9 a u m l 提高了7 9 。 在确定发酵的最优化条件之后，对发酵产物的性质进一步分析结果表明：丙 酸杆菌代谢产物对恶臭假单胞菌得作用模式是抑制菌的生长。能抑制大多数革兰 氏阴性菌，不能抑制革兰氏阳性菌，能抑制部分酵母菌。用反相h p l c 测得代谢 物中丙酸、乙酸含量分别0 3 1 3 和o 3 2 3 ，有研究表明该浓度的丙酸和乙酸没 有抑菌效果。代谢产物对热稳定，酸性条件下，1 2 1 2 0 分钟，活性不减弱； 代谢产物对胃蛋白酶敏感，对胰蛋白酶、蛋白酶k 不敏感，因此代访 物中有抑 菌活性的物质可能为一种蛋白质或多肽。 本研究对一薛氏丙酸杆菌的抑菌特性、发酵条件优化及代谢物一些生物学性 质进行了较为全面的探讨，对该丙酸杆菌代谢产物做为食品防腐剂的推广应用有 一定的参考价值，相关的研究工作将继续进行。 关键词：丙酸杆菌，丙酸杆菌代谢物，恶臭假单胞菌，发酵优化，响应面法 a b s t r a c t p r e s e r v a t i v ei so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta d d i t i v ei n 氇ef o o di n d u s t r y n o w d a y ss o d i u mb e n z o a t e a n ds o r b i ca c i dp o t a s s i u ma r et h ew i d e l yu s e d c h e m i c a lp r e s e r v a t i v e ，h o w e v e 矗s t u d i e sr e v e a lt h a tt h e s ec h e m i c a lp r e s e r v a t i v e s m a yl e a dt os o m ep r o b l e m si n d u c i n gc a r c i n o g e n i ce f f e c t i tw i l lb e c o m ea t 豫n d t h a t b i o - p r e s e r v a t i v er e p l a c e t h ec h e m i c a l p r e s e r v a t i v e i nt h ef o o d i n d u s t r y g r a d u a l l yf o r t h es a f e t yr e a s o n 。a sa n e w l yd e v e l o p e db i o - p r e s e r v a t i v e ，p m p i o n i c i n h a sb e e ns t u d i e di n t e n s i v e l yn o wb yt h ef o r e i g nr e s e a r c h e r , h o w e v e r , i th a sn o r e p o r tc h i n a t oo b rk n o w l e d g e e s p e c i a l l yo nt h em i c r o b i o li n h i b i t i o na c t i v i t y i n 氇i s p a p e r w e s t u d y t h em e t a b o l i t e si n h i b i t o r y a c t i v i t y o fa p r o p i o n i b a e t e r i u m s h e r m a n nu s i n gt h es p o i l a g eo r g a n i s mp s e l l d o m n a s p u t i d aa s i n d i e a t o rs t r a i n i nt h i st h e s i st h em a i nr e s e a r c hi n c l u d ef o l l o w i n gp a r t s ：t h ep r i m a r yi n v e s t i g a t e o ft h e i n h i b i t o r y e f f e c to fp r o p i o n i b a c t i u mm e t a b o l i t eo ns p o i l a g eo r g a n i s m p s e u d o m n a s p u t i d a ；s i n g l ef a c t o rd e s i g n ，p l a c k e t t - b u r n l a nd e s i g na n dr e s p o n s e s u r f a c e a n a l y s i s h a v eb e e n e m p l o y e d f o rt h e o p t i m i z a t i o n o ff e r m e r t a t i o n c o n d i t i o n sa n dt h ec o m p o s i t i o no ft h ef e r m e n t a t i o nm e d i u m ；t h ep r o p e r t i e so ft h e m e t a b o l i t ei n c l u d i n gl n h i b i t o r ys p e c t r u m ；t h ec o n c e n t r a t i o no f t h eo r g a n i ca c i d ；t h e a n t i m i c r o b i a ls e n s i f i v i t yt oh e a ta n dp r o t o l y t i ce n z y m e sw e r es t u d i e di nd e t a i l n 据t h e s i si n v e s t i g a t e dt h em a i nc h a r a c t e r so ft h ep r o p i o n b a c t e r i a 。i n c l u d i n g t h eo b s e r v a t i o no fi t s m i c m g r a p h ，p h y s i o l o g y ，b i o c h e m i s t r y a n d s t u d y t h e i n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h em e t a b o l i t e t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h eb a c t e r i aw a s p l e o m o r p h i c r o d st h a t f r e q u e n t l y f o r m e d i r r r g u l a rc l u m p s w i t h “c h i n e s e - c h a r a c t e r a r r a n g e m e n t s ；t h em e t a b o l i l e h a d s t r o n gi n h i b i t o r ye f f e c ta tl o wp h ( 5 们 b ym e a s u r i n gt h et u r b i d i t yv a l u e ，r e s u l to fa g a rd i f f u s i o nm e t h o ds h o w e dt h a t m e t a b o l i t ea l s oh a ds t r o n gi n h i b i t o r ye f f e c to ni n d i c a t o ro r g a n i s m8 | p h s 。3w h e n t h ep l a t ec o n t a i n2 0 3 f u m lo f t h ei n d i c a t o ro r g a n i s m t h i st h e s i se s t a b l i s h e dt h eo p t i m i z e dc l u t u r ec o n t i d i o n sa sf o l l o w ：t h ei n o c u l a n t w h i c hs t o r e da t 。7 0 # ew a si n o c u l a t e di ns l b l i p i dm e d i u r n 。a t i e ri n c u b a t i n gf o r 4 8h o u r si ns l b t h ec u l t u r es t r a i n sw e r ei n o e u l a t e di nf e r m e n t i o nm e d i u mw i t h 5 i n c o e u l a t i o nv o l u m e a f t e ri n c u b a t i n gf o r7 2h o u r sa t3 0 。w em e a s u r e dt h e i n h i b i t o r ya c t i v 时o ft h em e t a b o l i r e s i n g l ef a c t o rd e s i g ne x p e r i m e n ts e s u l t s s h o w e dt h a tt h eo p t i m i z a t i o nf e r m e n t a t i o nm e d i u mi s1 0 c o r ns t e e pp o w d e r , 2 g l u c o s ea n d0 。1 t w e e n8 0 o nt h eb a s eo f p r i m a r ym e d i u m t h e s t u d yf o a n dt h a tt h et o ms t e e pp o w d e r , g l u c o s ea n dy e a s te x t r a c tp o w d e r a r et h em o s ti m p o r t a n tf a c t o r si nt h ep r i m a r i l yo p t i m i z e df e r m e n t i o nm e d i u mb y t h ep l a e k e t t - b u r m a nd e s i g n 蕾持f a r t h e ro p t i m i z a t i o nl e v e to ft h r e ei m p o r t a n t f a c t o r sw e r es t u d i e d b yr e s p o n s e s u r f a c e a n a l y s i s a n d t h e o p t i m i z a t i o n c o m p o s i t i o no ft h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mw a sa sf o l l o w ：l o gc o l d - s t e e pp o w d e r , 2 5 9g l u c o s e ，7 9y e a s te x t r a c tp o w d e r , o i t w e e n8 0 ，0 2 5 9m o n o p o t a s s i u m p h o s p h a t e ，o 0 0 5 9m a n g a n o u s s u l f a t ea n d1 0 0 0m ld i s t i l l e dw a t e lp h7 0b e f o r e 3 a u t o c l a v i n g t h ef i n a li n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h em e t a b o l i t ew a s3 4 a u m lw h e n f e r m e n t e dw i t ht h e o p t i m i z a t i o n c o n d i t i o na n d m e d i u m i n h i b i t o r ya c t i v i t y i n c r e a s e d0 7 9t i m et h a nt h a to ft h ep r i m a r yf e r m e n t a t i o nm e d i u m t h ep r o p e r t i e so ft h em e t a b o l i t ew e r es t u d i e di nd e t a i l r e s u l t ss h o w e dt h a ti t c a r li n h i b i tt h eg r o w t ho f g r a mn e g a t i v eb a c t e r i aa n ds o m ey e a s t ，b u ti tc a nn o t i n h i b i tt h eg r o w t ho ft h eg r a mp o s i t i v eb a c t e r i a t h eo r g a n i ca c i dw a sm e a s u r e d b y t h er e v e r s eh p l c m e t h o d ，t h ec o n c e n t r a t i o no ft h ea c e t i ca c i da n dt h ep r o p i o n i c a r ea l la b o u t0 3l a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y o ft h em e t a b o l i t ei ss t a b l ei nt h e t e m p e r a t u r er a n g eo f6 0 1 2 l f o r2 0m i n u t e sa tt h ea c i dc o n d i t i o n ( p h 5 _ 3 ) t h em e t a b o l i t ei ss e n s i t i v et o p e p s i n h o w e v e ri ti sn o ts e n s i t i v et ot r y p s i na n d p r o t e a s ek i nt h i st h e s i sw eh a v es t u d i e dt h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h em e t a b o l i t eo f t h e p r o p i o n i b a c t e r i u m ，t h eo p t i m i z a t i o no fc u l t u r ec o n d i t i o na n dt h ee x a m i n a t i o no f p a r t i a lp r o p e r t i e so f t h em e t a b o l i t e t h i sh a s g r e a tv a l u eo nt h ef u r t h e ru s eo ft h e m e t a b o l i t ea sf o o dp r e s e r v a t i v ei nc h i n a f u r t h e rs t u d i e ss h o u l db ec a r r i e do nt o e l u c i d a t et h ed e t a i lp r o p e r t i e so fm e t a b o l i t e sa sf o o d p r e s e r v a t i v e k e y w o r d ：p r o p i o n i b a c t e r i u m , p r o p i o n i c i n ，a n t i m i c r o r g a n i s r n ， o p t i m i z a t i o n f e r m e n t a t i o n ，r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s 4 壁澎凰硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 朱振勤教授华东师范大学主席 黄秀琴副教授华泰舞范大学 鲁心安副教授华东师范大学 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含英他个人已经发表或撰髯过的研究成果对本文昀研究做出重 要贾靛戆令人和繁体，均已在文中律了嚷确谎痪并表示落意。 作者签名： 学位论文授权使臻声明 本人完套了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家擞管部门或其指定机构送交论文的电 子敝和纸震版。褰衩将学位论文麓子菲赢囊霉雏翡少蘧复镧并龛诲论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容绽入袁关数据库避 行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定 学位论文律者签名： 导师签壤：南“竞 器期：重型 鞋嶷：妒岁。l p 第一章丙酸杆菌素的研究进展 近年采，生物技术被广泛地应用于各个学科领域，并以惊人地速度创造出 重大瓣经济效益窝社会效蓥。天翻秀始诀谖臻生物鼓术魏发震潜力与广溷豁最， 各种生物活性物质的研究越米越引起人们的兴趣，生物抑菌物质的开发也随之成 为当薅的磅突热点之。生甥麴菠物蒺秘类多，来溅广，霹默鼓动楚携( 或英分 泌物) 、微生物及矿物中分离得到。随着天然生物防腐剂的广泛应用，对微生物 代谢产生的按藏物鹱驰磅究越来越深入，焉照这些擦菠甥质褒食晶绦藏、食菇发 酵和医药卫嫩等方面已显示出了重要意义。图前，对此类物质的研究和开发引起 了国内外研究者的极大兴趣。器晶再黢挺菱蹙食品级微生物，对人体燹危害掺用， 做为生物防髓剂的应用具有很大的潜力。 i 丙黻秆菌 i i 。褥酸枵麓一般燧葵特性 溺酸秆胬广泛存在予乳制品、壤、青贮饲辩中。乳品丙酸秆菌是多形态、 无芽撒形成、枵状的孳兰氏阳性菠，避常为不规则丛生“汉字”状排列、不运动、 麸茨戳蜀耐裁的瞎溢镦生耪，蔼落小黼突超，肇乳品籁油色、黄色、橙色或深红 色川。丙酸杼菌在发酵和乳晶工业中的应用已凑悠久的历史，蕊酸孝于藏属包糍1 0 夸静1 2 叫l 。在分类上辕栖惑蟪靛不同将它鬣努成两组，其率来自奶铡潞、无致病 性的一组称经热丙酸杆菌( c l a s s i c a l p r o p i o n i b a c t e r i a ) i z j 它们在丙酸期乙酸的工 犍茇酵、天然防瘸裁瓣裁备鞋及诞生剡鹃盔羽上，褒农_ 鞍将来都是缀夔要静。 冈酸杆菌随着菌株不同，营养需：4 芝也有所差异。假所有菌株均需鼹维生絷、 泛酸及垒锈索，马铃蔫霹酵母鬻孛翁许多未鼗成谤是蕊生长刺激毽予，通常程基 础培养基上漆加某种氨基酸能促进菌体的擞长。乳酸钠液体培群基( s o d i u m l a c t a t eb r o t hs l b ) 是一静霉震耱嚣酸括蓥蓬券蒸，其中古1 胰蛋岛黥、 黪霉 膏( 提供维生綮和生长闲子) 、1 , 2 - 孚l 酸钠和o 2 5 l h p 0 4 ，或者曹1 胰腺匣 藏墙葬液( 茏蔫蔫藉、1 簿霹套襄0 + 8 襄酸链。巍黥嚣酸姆藩最逡戆生长掰 值是6 5 7 0 ，典型筒酸杆菌黼在3 0 一w 3 2 培养4 5 天出现菌落1 5 1 。 爵酸謇 萤霹裂薅备舞营养残癸为箕生长提供l 量。瑰酸是褥酸= l 葶萤蕊主要髓 量来源，糖类和其它肖机化合物如甘油、纤维紧等，工姚副产晶如乳消、玉米浆、 蒸镄褒滚、骂铃薯麋浆窝醛蛋白泰鳝搦也可徽蠢其能爨来源。 1 2 乳品丙酸杆菌代谢特性 巍晶页酸抒蓉可利用糖辩解( e m p ) 郛己糖单磷酸( h m p ) 爆释饩谢途径，冀孛 e m p 篷己糖分解的主疆途径诤。乳糖藏其它耱类分解产生两个丙酮酸，一个氯化 第一帝山暇杆荫素的研究进展 成乙酸和c 0 2 ，另一个通过转羧基酶循环还原为丙酸l ”，其中转羧基酶参与的反应 翥生狻素终为辕助嚣子，嚣凳它不需要a t p 鞫二份众震离子蠢雾予獒它生物索酶。 草酰己酸通过苹果酸和延胡索酸还原为琥珀陂，同时需要两个n a d h + h + 。琥珀酸 形成压，璇黪转移酶褥辕酶从丙酸辘蕊转到玻璃酸生成恧酸鼗蘧珀酝穗酶。矮爱， 甲基丙二酰辅酶羧基转到丙酮酸生成草酰乙酸，完成这个循环途径。此外，乳品 丙酸搴 萤还戆以异型巍酸发黪产生的巍酸为自源产生及酸( 翅圈1 1 ) 。 乳糖等丙酸l 一乳酸 2 。黼丙酰c o a l 寺 丙酮酸 l k 审 草醣己 l l 诳 苹果酸 l 审 延削紫 a d p 秘尉 ( a ) i 专 d 乳酸 审 丙烯酰c o a c o a乙酰c o a 乙酸 ( b ) 圈i - i 嚣磊鬻黢符鏊分勰截涛逡径 a ：e m p 途径：b ：异型乳酸发酵途径 襞晶嚣羧抒蔻霹戮产生嚣酸、乙酸窝c 0 2 ，困魏在璜娆赘残熬遘疆孛蹲冀 质量超重要作用，各种酸是璧蒙的风味组分，奶酪中的孔穴怒由代谢产生的c 0 2 形成媳强l 。裹敬及其簸类可掷裁霉夔嬲簿母煺亲骰瑟餐妻冬茨露裁f 9 】。m i c r o g a r d 豫 是用做生物防腐剂的丙酸杆菌代谢物它包括二乙酸、丙酸、乙酸和乳酸，还有 争争热稳定黪7 0 0 d a 多肽协阈发挥攒制馋用f 9 l 。它霹擦铡多数革兰氏痰牲缨麓及 一些真菌，颧是抑制机理尚不清楚。美国食品及药物管理局( f d a ) 批准同意将 m i c r o g a r d t m 添加至4 奶酪中。乳品夏酸枵菌另一工业嗣途是生产v b mv b l 2 凌碳 水纯含物、核酸、脂类和氨基酸代谢中是种霾要的代谢辅助园子f 9 】。 2 细菌素 细菌素( b a c t e r i o c i n ) 是妇细菌代谢产生，对同耪或近源釉有特髯性抑制杀 菌作蠲的蛋自菝或多欺物质f l 。i 。它最早是在2 0 世纪中期g r a t i a ( 1 9 4 6 ) 对大肠枰荫 第一章丙酸杆菌素的研究进展 v 菌株抑制m 菌株现象进行研究时发现的。此后g r a t i a 和f r e d e r i c q 对大肠杆菌 v 菌株产生的这种抑制物质进行了分离，并称之为大肠杆菌素。以后的研究发现 很多细菌都可以产生类似物质，j a c o b ( 1 9 5 3 ) 将这类物质称为细菌素。 2 1 细菌素的分类 微生物在其生长繁殖过程中产生的具有抑菌作用的代谓 产物种类繁多，结构 各异。目前，人们己丌始关注这类抑菌物质，研究了他们的遗传免疫性、寄主防 御系统、膜蛋白的相互作用等，并已有一些细菌素被研制开发为有应用价值地的 食品添加剂和药物。 根据细菌素的化学结构和热稳定性，一般可以把细菌素分成三个大类，如表 1 1 所示。 ( 1 ) 羊毛硫抗生素类。这是一类分子量小于5 kd a 的多肽分子，其分子中 含有羊毛硫氨酸( l a n t h i o n i n e ) 、1 3 一甲基羊毛硫氨酸( 1 3 - m e t h y l l m l t h i o n i n e ) 等非 编码氨基酸残基。这类多肽还可以分成两小类：一类结构柔软，带正电和疏水基 团，可在靶细胞膜上形成通道而起抑菌作用；另一类是球状多肽，不带电或带负 电荷【9 1 。 ( 2 ) 非羊毛硫抗生素类的小分子热稳定肽。它们的分子中不含有羊毛硫氨 酸( l a n t h i o n i n e ) 等非编码氨基酸残基，而且它们可以再分成更小的结构。这类 肽亦可分成两小类：一类具有类片球菌素的抗李斯特菌活性，在其n 末端有 t y r - o l y - a s n - g l y - v a l 的氨基酸序列，多肽的半个分子之间由二硫键连接：另一类 包含有两个对于抑菌功能都是必须的亚基，这类细菌素主要的氨基酸链大都不同 。 ( 3 ) 大分子热不稳定蛋白：这类细菌素已发现的数量还不太多，研究也并 不深入。除了这三种主要类型外还有一些由多肽与其他非肽类基团结合而形成的 细菌素。 第一章w 酸杆稿索的研究进艘 表l - 1 细菌素的分类及举例( 由t r i o n a0 k e e f f e 和c o l i nh i l l 改编) l 2 ，2 缎蘩素静一般特缝 细菌素怒由许多种细菌产生的异型的抗菌物质，它们的作用方斌、活力瓶 圈、分子量、艇毯特缎、遗传起源各不稳霹【1 2 l 孤，毽宅饲零瘊土部是骚| 耋震，黢 链结构的破坏产生了绷菌素的杀菌活性。 尽管缨麓素多种多样，您是它键郄具鸯以下特缝： ( 1 ) 都是由一个1 2 4 5 个氨基酸组成的阴离子强自【1 4 】。 ( 2 ) 分予具有寒等电点靼两亲性，分子内主要怒亲水区域是酸求区f ”l ，在 水溶液中结构会被破坏，但是当该区暴露在溶剂中与结构促进溶剂如三氯乙酸或 阴离予磷酸磷月旨膜结会，就会形成氆一螺旋体结构【l ”。 ( 3 ) 一姥细菌素兵有二硫键而形成的环状结构，分子内环状结构是羊髦硫 抗生索的特征。 ( 4 ) 通常g 缁留通过溶菌蛋白作用而执细胞内释放出来，另外还有其他释 第一章丙酸杆菌素的研究进展 放机制i l 。低分子量g + 细菌素通常先由核糖体合成前肽 i ，这些前肽包含一个 c 末端前肽区但是不具有生物活性，翻译后从n 端前导序列加工断裂，产生成 熟的抑菌蛋白【i7 1 。 2 3 细菌素的合成与检测 2 3 1 细菌素的合成 缨菌素熬纯学本溪是多默，它楚凌缨莹豹染色转编码，并交接瓣毒搴合残豹， 有些细菌素瞒可以由成粒编码控制。网前，有很多细菌素的基因都已通过克隧得 到。攘报道，埂燕壤葵基的粒凄可戳增鸯珏缨藤素产量，这秘方法包摄添热琼滕、 葡聚糖、甘油威淀粉，如s t a b p h y l o c c i n1 5 8 0 在半固体的培养基中产嫩是液体培 莽基驰2 0 倍。吴乡 ，大多数纲菌素数产生怒不需要诱导的，但有实验表明诱嚣 后会使细菌素的产量成倍增长，例如用1 m g m l 的丝裂霉素c 处理l a c t o b a e i l l u s e a s e l8 0 后，弼以使c a s e i c i n8 0 的产鬃增加5 7 镑，蕊用0 5 _ t g m l 的丝裂霉豢c 处理w 使h e l v e t i e i nj 的产量增加4 0 0 倍t ”j 。 在发酵工艺上研究得最多的细菌素就是乳酸链球菌素，人们做了大量的工作 研究它们豹发酵工麓，并取得了一些成栗。另外研究较多的就烧丙酸秆菌 ( p r o p i o n i b a e t e d a ) 。目前对丽酸杆菌产细菌豢的研究国内还鲜见报道，在国外， 法国罗遣亚公司已经有产黼上市，是丙酸杆菌产生的绑菌素，商品名为 m i c r o g a r d l m 。但总体上看研究者还比较少。丙酸杆菌的代谢途径和赞养需求已 经被广泛研掰挣吨“。它可瑷利用多种碳源和氮源，魏酸源方獗的葡萄糖、蔗糖、 乳糖、乳酸纳等；氮源方面的蹑白胨、酵母膏、玉米浆等。耐酸杆菌代谢产细菌 素静璐葬羞主要喜两个：聪瓣牛魏培游基帮巍酸钠培养基【2 甜。 细菌素由核糖体含成后，一般需要加工修锦才能变成有活性的形戏。前筒介 绥了一类含鸯# 编弱懿萋酸残基豹羊亳硫撬黛素类缨菌素，这瞧暗示了这些缁菌 素的成过穰中必然经过了加工修饰。这类细菌素所禽的羊嘏硫氨酸、d 甲纂羊 毛硫甄酸是逶_ 避s e r 帮t h r 聪零矗分弱形残脱氯秀氨羧( d e h y d r o a l a n i n e ，h d a ) 霸 脱氢丁氨酸( d h b ) ；d h a 和d h b 与邻近c y s 的巯基发生亲核加成反_ 陂而形成的 田】。冀链各类缍莲素纛逶避一整妇承躲、甥除、髟戏二麓键等方式逮嚣麓王嫠镑， 使细菌素成熟后释放到胞外。t h e r e s ef a y e 等人研究了詹氏丙酸杆菌 ( p r o p i o n i b a c t e r i u m j e n s e n i i ) 艇产生戆一穆缨菠素，蠢趣鲮蹩这耱缨蘩素嚣要憝 外的活化蛋翻酶水解后才能表现其活性，被称为蛋白酶活化的抗菌多肽 ( p r o t e a s e a c t i v a t e da n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ，p a m p ) 2 4 o 这耪细蘧索套麓疮先由d n a 转录翻译后合成含1 9 8 个氨基酸残基的前体，它n - 端的2 7 个氨基酸残基与细菌 素翦体转运出腿毒关，弗在转运出照时被切除，成熟的细菌素仅为位予缨莹素蘸 体c 端的6 4 个氨基酸残基。 第。带山酸杆荫索的研究进展 2 3 2 细菌素的提纯与检测 耄予缨菌素静德攀本矮楚蛋白矮，酝噬一般蛋鑫鹱麴挺缝方法郡可激震予缀 菌素的提纯，但为了保持细菌素的生物活性，一般采用的是盐析的方法。现磁发 现鲍细蓥素一般郑是魁外蛋妇，骚爨提纯豹瓣候可以先离心熔去蘸搏，然露热 ( n h 4 ) 2 s 0 4 等盐处理上清夜，离心并调节p h 后即w 以用快速琼脂糖阳离子交 换桂芍进行掇缝，进一步的缝纯则使魇反稳艨辑匏方法。姥钤，还可以运用藏效 液相甑谱等进行微量的提纯。 细菌素酌检验方法墩报多。依撼缎薄素的多肽本艨，可以运嗣些蛋皂矮懿 检验方法采对缨莹素送行羧验。运蠲鞍多瓣楚s 蚤s 一聚焉燎虢藏凝茨惫溶 f s d s p a g 勘法，w e s t e r n 印迹法等。j a y a 。l e v e r s e e t 2 5 j 簿人还搬避了一j 运用受予 制备p l g i ( 种由丙黢秆菌产生的细黼素) 的多价抗胤清，使用热疫学方法梭测 p l g - f 静方法，绘细落豢瓣糗溅提供了缀好懿愿路。 绥菌素翡活性检测方法务裰多。蕊串篱革常用懿方法是琼瑟平援扩散涪、牛 津杯法和划线法等。这些方法大多都魁通过抑菌圈的谢无和大小米对耋硪菌素的掷 菌效菜逡纾游侩。另终，谯遴行细菌索的活褴检测辩，要注意撵除一黧菲特殍靛 瓣撵蘩因素瓣影冁。主鬟跫徽童壤在誊长往落遂纛串产生熬寄援羧、蘸、过氧晓 餐等，霹疆擞糖其钵靛情糖狳去这些潮索韵彩麓。 2 4 纲菌素姆抗生素 摭生豢( a n t i b i o t i c s ) 蹩镟生耪在代谗避罐孛产爱熬，在稳浓痰“f 裁戆摊镂 菜种微生物羽生长和灞劫，蒜瘫杀死它稀微垒糖缒化学物质西j 。它和纲菌素郝怒 壹徽生物产象豹、有麴蘩效果豹纯学镄矮。在激蘸懿摄道孛，它稠缀鬻混为一谈， 这样魁不利予细菌素在食品中的合法逡用 2 l2 8 1 。现农，缨菌素主爰运用于食晶僳 藏，嚣撬生豢主要运溪予壤骛翌生方露。绥蘩素帮挽囊素之耨疑纛不瓣戆遮方， 叉有相似之她，在一些地方甚至出现了交叉。细菌素岛抗生素的烹爱麓别在予玄 熬窄耱蘩避帮援自屡本旗；毽瞧有豹绸菠素蠢较宽瓣撵蓥遴，抗警索中氇寿一爽 是多冀轰类捩黛豢，这些都怒它稍交叉之烂。豢照的多默类抗生索务杼蘩膝、矮移 蘸获s 巍多糕薄素琶等，宅粕大多客褥添获多获毽。 6 第一章i ；l = i 酸杆菌素的研究进展 化学本质 产生机制 抑菌谱 抑曲机制 毒理 应用 免疫原性 靶细胞耐受性 多肽及多肽复台物 染色体编码，由核糖体合成 窄，大多对亲缘近的种属作用 在靶细胞麒上形成孔道，造成内 容物外泻或各种平衡机制失调 未知 食品：【：业 有 尚未发现 多种多样，多为芳香烃及其衍生物 次生代谢产生 宽 通过生物化学方法干扰 菌类多种代谢机能 已知 医约卫生 无 有抗药性 2 5 抑菌谱 大多数细菌的抑菌潴很窄，能杀死亲缘关系福近的菌种或髓抹。g + 的绷蔼 素通常抑制g + ，也有报道能抑制g 。【2 9 l ，有机物质能增强某些类细菌素对敏感菌 株的抑菌活性。最近研究表聪n i s i n 的掷菌谱通过添挑其他物质扩展到g n p “。 n i s i n 巍螯会赉le d t a 续会麓降低缩稳簇静逶逶经，降解细施蠹戆d n a 或静翻 蛋白质的会成，j “。 乳酸荫索的最普遍的抑菌机制是使质子动势驱散p ”。n i s i n ( 羊毛硫抗生索) 竞全分鼗跨貘电势差势农竣感绥萎壁爽逡戏p 撵发 3 4 , 3 5 1 ，最终导数氮基酸、跫+ 、 p 0 4 3 外流及细胞内a t p 的部分水解弘q ；另一方砸，m c a n l i f f e 等观察剐 l a e t i e i n 3 0 4 7 ，它是由乳球菌乳酸菌属d p l 3 1 4 7 产擞的广谱细菌索，能使敏感细 胞的细胞膜发生渗透，譬致k + 、p 0 4 3 一外流，但楚不包括大分予如a t p 。这秘l 逛予驱动等致跨貘邀势差熬逶速分散，毽并没京造残p h 的交证，表明 l a e t i e i n 3 0 4 7 没有诱导质子渗漏。因此由细菌素引超的p h 梯度的形成具有选择 性 3 7 】。由乳酸菌嗜酸菌t k 8 9 1 2 产生的乳菌素8 9 1 2 分散了敏感细胞内的细胞滕 惫势窝p 壬l 梯痍菸影魂了翔矮子动势辍羧静氨基酸转移过程。 许多缃菡素包括乳球菌素f 和一姥羊毛硫抗娥索如n i s i n l 38 1 、p e p 5 、槠萆 菌素和去皮索，它们的作用方式是浓度依赖性的，但也受物理条件如电子强魔、 p h 、温度、靶作用模式和细胞的生长周期的影响【3 8 1 。乳球菌f 的作用是浓度和 p h 筱赣谴瓣 3 9 1 ，当其溺缀夫手势5 0 a u 1 0 9 细憨跨，方缝诱导缓魏貘渗透经致炎； 球菌素f 的作用很大程艘上依赖培养蒸的p h 值，在p h 值5 0 时能最大程度诱 导k + 外流，且当敏感细胞在低电子强魔的溶液中时，乳球菌素f 诱导的k + 外流 豹活性魄鸯糍毫子强度静潞滚孛毫8 蕊。去污裁t r i t o n - xl o o 怒瑗l 刺激襞酸镳 球菌素f 的渗透性，表明离子强度的增加有利予溶液中乳酸球菌索f 的聚合，使 笫乖丙俄杆菌素的 i j 究进展 形成乳的数量减少p 棚。低激时，巍羧球菌素f 诱静k + 癸流丈量藏少，可麓是由 于此时在细胞质膜的脂类烃链排列更加有序。 2 6 影嚷缀蓠素产囊的因豢 通过域佳的生产过程可以得到浓缩的细菌素糨品，表明细菌索在生产过程 中造成静液力丢失霹戳在叛螽魏蛋自震纯纯过程中褥到後笺l 嗣。髓够有簸静静稍 微生物生长和保存食品需袋大量细菌素，为增加细菌素的产量，需爱很好撼了解 影嫡荬产雯静因素，诲多缨蘧素豹产量懿援鸯霹竣逶逯在蒸荟窭培莽麓孛添热望长 限制因子如糖、维生素和氮源以及控制培养基的p h 值、培养温度或选择最适 豹蟪券基婵q 。 2 6 1 p h 和温度的影响 细菌素的产生是依赖于p h 和温度的。k r i e r 等【2 9 j 研究了p h 和温度对由嗜柠 檬酸明串球菌属肠膜菌f r 5 2 产生的肠膜菌素5 2 b 和肠膜菌素5 2 b 的影响。肠膜 菌素5 2 a 是3 8 6 8 d a 蛋白，有较广泛的抑菌谱：虽然肠膜菌素5 2 b 与肠膜菌素 5 2 a 有相似的物理性质，但前者的抑菌谱则较窄。温度和p h 很大程度上影响了 这两种细菌素的产生，肠膜菌素5 2 a 和5 2 b 的最适p h 分别为5 5 和5 6 。在 该p h 时，两种细菌索的产量比在p h5 0 时高5 6 倍。该菌株最适生长温度为 2 0 3 0 ，肠膜菌素5 2 a 的最适温度在2 0 ，而肠膜菌素5 2 b 在2 5 【4 l 】。 2 6 2 培养基成分的影响 培养基成分对细菌素的产量影响很大【4 ”。为最大限度地提高细菌素的产量， 许多研究者选用了能够提供菌体充分生长所需营养物质的商业培养基。培养基中 添加一些营养物质对提高细菌素的产量是必需的，在乳球菌4 2 3 的基础培养基中 分别添加肉膏、酪蛋白、胰蛋白胨或细菌蛋白胨时，细菌素的产量从6 0 0 0 a u m l 相应的增加到9 6 0 0 0 a u m l 、1 2 8 0 0 a u m l 、1 9 2 0 0 a u m l l 4 3 j 。当在m r s 培养基中 添加l 吐温8 0 时细菌素4 2 3 活性进一步增强1 4 4 1 。吐温8 0 的添加增加了其他 细菌素如去皮素a c h 和乳球菌素g t 4 5 1 的产生。这些细菌素抑菌活力的增强， 可能是由于细菌素产量的增加或者是细菌素扩散能力的增强。 在含有0 5 酵母膏、0 5 多聚蛋白胨和0 5 n a c l 的基础培养基中添加 c a ”刺激了n i s i n z 的产生i ”j ，在添加了0 1 mc a c l 2 的p h 恒定的分批发酵培养 基中，其最大抑菌活力达到3 1 5 0 i u m l 。s a k a i n p 的产生很大程度上依赖于营养 物质的类型和浓度，即依赖于氨基酸和生长激素的含量及对其利用能力，菌体生 长速度随着酵母膏浓度增加而增加。胰蛋白胨的浓度的增加对s a k a i np 的产生 有促进作用，葡萄糖的浓度超过4 0 l 时却减少了s a k a i np 的产生。3 0 。c 在m r s 培养基中没有p h 控制时s a k a i np 产量最大为2 0 5 m g l ，此时酵母膏、蛋白胨和 葡萄糖的添加浓度为o 5 l m g l 一“。d m l - b 培养基中的营养成份确定，其中含 第一章内酸杆菌素的研究进展 有18 种氨基酸、3 种碱基、3 种微量盐、7 种维生索、葡萄糖和吐温8 0 ，添加琥 珀酸做为缓冲剂，此时s a k a i np 产量达到或高于在最适培养基m r s 中的产量 【4 8 1 。 细菌素的产生的最佳时间在微生物生长的不同时期。一些细菌素如乳球菌 素1 4 0 和n i s i n 的产生在对数生长期 4 9 , 5 0 】，而其它很多细菌素的产生在对数生长 期的晚期或静止期的早期，如片球菌素a c h i5 。i 和