（分析化学专业论文）多酸纳米粒子在药物及蛋白质检测中的应用研究.pdf

两南大学硕十学何论文摘要 多酸纳米粒子在药物及蛋白质检测中的应用 研究 分析化学专业硕士研究生梁文婷 指导教师黄承志教授 摘要 多酸化合物作为一种独特的金属氧化物具有很多特殊性质。基于这些性质，多酸化合物 在催化剂，抗肿瘤药物以及作为分析检测探针等生化研究领都拥有优良的表现，也因此吸引 了众多研究者的关注。随着纳米技术的发展，多酸化合物的合成和应用也进入纳米领域。目 前，已经被报道的多酸化合物的纳米微粒涵盖了多种形态，包括纳米粒子，纳米棒，纳米线， 纳米管，纳米多孔材料等：而合成方法也是多种多样的，已有的方法包括模版合成，气一液一 固多相合成，电化学加工，液相合成等。其中，液相合成是研究较多的一种方法。这些多酸 的纳米材料被用于催化剂及药物研究，都表现出了更优异的特质。已有的报道表明，多酸化 合物除了可以用来检测微量痕量金属离子之外，还可以直接用作分析试剂来检测药物及蛋白 质等大分子。而这些研究都是直接使用了多酸化合物分子，利用多酸的纳米粒子作为分析探 针的研究极少。本文将两种不同的多酸纳米材料作为分析检测探针，应用到药物和蛋白质的 检测中去。首先，以四氯化碘钼酸盐与结晶紫的复合纳米颗粒为探针，发展了一种用紫外可 见吸收光度法检测多巴胺的快捷灵敏的方法：其次，探讨了一种k e g g i n 型多酸纳米粒子 a 9 3 p w , 2 0 4 的液相合成方法，并以其为探针用光散射的方法测定了朊蛋白、溶菌酶以及多巴 胺。具体研究内容包括以下两个大方面： 1 以四氯化碘钼酸盐与结晶紫的复合纳米颗粒为探针，发展了一种用紫外可见吸收光度法 检测多巴胺的快捷灵敏的方法。在酸性条件下，随着多巴胺浓度的增加，富含纳米粒子溶液 的颜色也随之加深，可以建立一种可视化半定量检测方法。在紫外可见分光光度计下得到多 巴胺的线性关系在5 0 x 1 0 。7 1 4 l o t o o l l 1 浓度范围内，检出限( 3 0 ) 为9 o x l o 3t o o l l 。该方 法被成功应用于盐酸多巴胺注射液的测定。 2 研究了一种a 9 3 p w l 2 0 4 纳米立方体的可控合成路线。并且近一步以该纳米粒子为分析探 西南大学硕+ 学位论文摘要 ii i _m m m i 量量量量曼曼曼罾曼曼曼曼 针，利用光散射信号检测了蛋白质及药物小分子。 ( 1 ) 研究发现，在有机小分子二甲基甲酰胺( d m f ) 的调控作用下k e g s i n 型多酸化合物 a g j p w l 2 0 4 在水溶液中形成规则的纳米立方体，随温度改变该纳米立方体转变为空心立方结 构。且基于该多酸纳米粒子，我们建立了一种以光散射信号为表征手段的检测朊蛋白的新方 法。该多酸纳米立方体可以与朊蛋白( p r p c ) 相互作用，产生显著的光散射信号增强，其增强 程度与3 6 - - 8 4 0n g m l l 浓度范围的朊蛋白呈线性关系。并且在相同实验条件下，与其它多种蛋 白相比，与朊蛋白的相互作用表现出较好的选择性。 ( 2 ) 实验发现，多酸纳米粒子a 勘p w t 2 0 4 0 可以与溶菌酶相互作用引起光散射信号的增强，建 立了一种溶菌酶的光散射测定方法。在磷酸缓冲溶液p h6 8 的条件下，光散射信号在溶菌酶 浓度为o 5 1 4 0 嵋m l 1 的范围内呈线性增强，检出限( 3 0 ) 为o 0 4 嵋m l - 1 。这个方法成功用 于合成样中溶菌酶的测定。 ( 3 ) 研究表明，在醋酸一醋酸钠缓冲溶液p h5 0 的条件下，多酸纳米粒子a g j p w l 2 0 4 0 可以与 多巴胺相互作用。以光散射信号为表征手段，可以得出在多巴胺浓度为3 0 1 0 扎1 2 1 0 5 m o l l 。1 的范围内光散射信号随着多巴胺浓度的增加呈线性增强，检出限( 3 0 ) 为1 4 l 矿 t o o l l 。这种多巴胺的光散射测定方法被成功应用于盐酸多巴胺注射液的测定。 关键词：多酸纳米粒子多巴胺朊蛋白溶菌酶光散射光谱吸收光谱 u 两南大学硕士学位论文 a b s t r a c t s t u d y o nt h ea p p l i c a t i o no fp o l y o x o m e t a l a t e s n a n o p a r t i c l e si nm e d i c a m e n ta n d p r o t e i na n a l y s i s m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r yp o s tg r a d u a t e ：w e n t i n gl i a n g su p e r v i s o r ：p r o f c h e n g z h ih u a n g a b s t r a c t p o l y o x o m e t a l a t e s ( p o m ) h a v eal o to fu n i q u ep r o p e r t i e s8 8ak i n do fs p e c i a lm e t a l l i co x i d e s b e c a u s eo ft h e s ep r o p e r t i e s ，t t l e yp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nav a r i e t yo ff i e l d ，s u c ha sc a t a l y s i s ， a n t i c a n c e rd r u g sa n da n a l y t i c a lr e a g e n t s ，a l lo ft h e s eh a v ea t t r a c t e dm u c ha t t e n t i o nb yr e s e a r c h e r s w i t ht h ed e v e l o p m e n to fn a n o t e c h n o l o g y , t h es y n t h e s i sa n da p p l i c a t i o no fp o mh a sc o m ei n t o n a n o m e t e rf i e l d 。a tp r e s e n t , m a n yk i n d so fp o m n a n o p a r t i c l e sh a v ea l r e a d yb e e nr e p o r t e d , i n c l u d i n g n a n o b a l l ，n a n o r o d ，n a n o w i r e ，n a n o t u b ea n dt h en a n o h o l l o wo nt h ef i l m a n da l it h e s ep o m n a n o p a r t i c l e sp r e p a r e db yu s i n gal o to fd i f f e r e n tw a y s ，s u c ha st e m p l a t e a s s i s t e d ，e l e c t r o c h e m i c a l p r o c e s s e s ，v a p o r - l i q u i d - s o l i d s - a s s i s t e da n dl i q u i d - a s s i s t e d a sas o r to fa n a l y t i c a lr e a g e n lt h ep o m c o u l db eu s e dt od e t e r m i n et h em e t a li o n ，s o m em e d i c a m e n ta n dp r o t e i nm o l e c u l e b u tm o s to ft h e s e h a v eb e e nd e t e r m i n e db yu s i n gp o mm o l e c u l en o tt h ep o m n a n o p a r t i c l e s i nt h i sp a p e r , t w ok i n d s o fp o mn a n o p a r t i c l e sh a v eb e e np r e p a r e da n da p p l i e dt oa n a l y s em e d i c a m e n ta n dp r o t e i nb yu v a n dl i g h ts c a t t e r i n gs i g n a l s t h em a i nc o n t e n ti sa sf o l l o w s ： 1 as p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd o p a m i n ei sd e s c r i b e db a s e do nat y p eo f p l o y o x o m e t a l a t e s - d y ec o m p l e xn a n o p a r t i c l e s w h i c ha r e c o m p o s e db yc r y s t a l v i o l e tw i t h m o l y b d a t e - i o d i n et e t r a c h l o r i d e b yt h e r e a c t i o nb e t w e e n d o p a m i n e a n d m o l y b d a t e - i o d i n e t e t r a c h l o d d er e a g e n ti na c i d i cm e d i u m ，t h ec o l o ro ft h es o l u t i o nh a sc h a n g e d ，a n d 锄a n a l y s i s m e t h o do fd o p a m i n ec o u l db ec o n s t r u c t e d 。b ys p e c t r o p h o t o m e t r i cs i g n a l ，al i n e a rr e l a t i o n s h i ph a s b e e no b t a i n e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f d o p a m i n ei si nt h er a n g eo f 5 0 x 1 0 7 - 1 4 x l o m o l l ，a n d t h ed e t e c t i o nl i m i ti s9 0 x10 m o l l 1 ( 3 t h i sm e t h o dh a sb e e nu s e df o ra n a l y s i so ft h ei n j e c t i o n c o n t a i n i n gd o p a m i n eh y d r o c h l o r i d e 2 ac o n t r o l l a b l es y n t h e t i cr o u t eo ft h ea g a p w l 2 0 4 0n a n o c u b e sw a si n v e s t i g a t e do no u rw o r k , a n d t h e s ep r e p a r e dn a n o c u b e sw e r eu s e da sa na n a l y s i sp r o b et od e t e c tt h ep r o t e i na n dm e d i c a m e n t ( 1 ) i tw a sf o u n di nt h i sc o n t r i b u t i o nt h a tk e g g i n - t y p eo fp o l y o x o m e t a l a t e sn a n o c u b e sc o u l db e i i i 西南大学硕十学位论文a b s t r a c t f o r m e di na q u e o u sm e d i u mu n d e rt h ea d j u s t m e n to fd i m e t h y l f o r m a m i d e ( d m f ) ，w h i c hc o u l db e c h a n g e df r o ms o l i dn a n o c u b e st o h o l l o wo n e sw i t ht h ei n c r e a s i n go ft e m p e r a t u r e f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n ss h o w e dt h a tt h i sk e g g i n - t y p eo fp o l y o x o m e t a l a t e sn a n o c u b e s c a l ls p e c i f i c a l l yi n t e r a c t w i t hp r i o np r o t e i n , a n dt h el i g h ts c a t t e r i n gs i g n a l sw e r ee n h a n c e di np r o p o r t i o n a lt ot h ec o n t e n to f p r i o n i nt h er a n g eo f3 3 6 8 4 0n g m l ( 2 ) t h ei n t e r a c t i o no fa 9 3 p w t 2 0 4 0n a n o e u b e sa n dl y s o z y m ew a ss t u d i e dw i t hl i g h ts c a t t e r i n g ( l s ) s p e c t r a l a 9 3 p w i 2 0 4 0n a n o c u b e sc a n b el i n k e dw i t hl y s o z y m e ，a n ds t r o n g l ye n h a n c e dt h e i rl s i n t e n s i t y i nt h ep bb u f f e rs o l u t i o nw i t hp hv a l u eo f6 8 ，t h ee n h a n c i n gl si n t e n s i t yw a si n p r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fl y s o z y m ei nar a n g eo f0 5 1 4 0l a g m l 一t h ee f f e c t so fr e a c t i o n t i m e ，p ho fs o l u t i o n , c o e x i s t e di o n sa n do r g a n i cr e g e n t sw e r es t u d i e di nt h i sw o r k u n d e ro p t i m u m c o n d i t i o n s ，t h ed e t e c t i o nl i m i to fl y s o z y m e ( 3 0 ) i so 0 4 甥m l - 1w i t hn a n o p a r t i c l e s 硒ap r o b e t i l i s m e t h o dw a ss u c c e s s f u l l yu s e dt ot h ed e t e c t i o no ft r a c el y s o z y m e ( 3 ) al i g h ts c a t t e r i n g ( l s ) m e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd o p a m i n ei sd e s c r i b e db a s e do n a g a p w 2 0 4 0n a n o e u b e s t h ed o p a m i n ec a ni n t e r a c tw i t ha 9 3 p w l 2 0 4 0n a n o c u b e s ，a n dt h e f tl s s i g n a lw a ss t r o n g l ye n h a n c e d i nt h ec h 3 c o o h c h 3 c o o n ab u f f e rs o l u t i o nw i t hp hv a l u eo f5 0 ， w ec a l ld e t e r m i n ed o p a m i n ei nar a n g eo f3 0 x 1 0 8 - 1 2 x 1 0 m o l l 1 a n dt h el i m i to f d e t e r m i n a t i o n ( 3 呻i s1 4 x10 t o o l l - 1 t h er e c o m m e n d e dm e t h o dh a sb e e nu s e df o ra n a l y s i so ft h ei n j e c t i o n c o n t a i n i n gd o p a m i n eh y d r o c h l o r i d e k e y w o r d s ：p o l y o x o m e t a l a t e sn a n o p a r t i c l e s ；p r i o np r o t e i n ；d o p a m i n e ；l y s o z y m e ； l i g h ts c a t t e r i n gs p e c t r u m ；s p e e t r o p h o t o m e t r i cs p e c t r u m 西南大学硕+ 学1 1 i ) ：论文 缩写符号对照表 缩写符号对照表 英文名称中文名称缩写符号 p o l y o x o m e t a l a t e s多金属氧化物 c r y s t a lv i o l e t结晶紫 d i m e t h y l f o r m a m i d en ，n 一二甲基甲酰胺 d o p a m i n e p r i o np r o t e i n 多巴胺 朊蛋白 b o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白 h u m a ns e r u ma l b u m i n 人血清白蛋白 n a n o p a r t i c l e s l i g h ts c a r e d n g 纳米粒子 光散射 v p o m c v d n d a p r p b s a h s a n p s l s 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了标注。 靴论文作者：窍妨锵嗍：- 矿了引心日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 导师签名： 签字日期：年月 日 西南大学硕十学何论文 第一章绪论 第一章绪论 1 多酸化学简介及多酸纳米材料研究的概况 1 1 多酸化学简介 多酸包括同多酸和杂多酸。由同种含氧酸根阴离子缩合而成的称为同多阴离子，其酸称 为同多酸( i s o p o l y a c i d ) 。由不同种类的含氧酸根阴离子缩合而成的称为杂多阴离子，其酸称为杂 多酸：( h c t e r o p o l y a c i d ) 。多酸化学就是对这两种酸的研究，至今有近2 0 0 年的研究史。1 8 2 6 年， 第一个杂多酸盐1 2 钼磷酸铵被合成出来，但到1 8 6 4 年，由c m a r i g n a c 合成并表征了第一个钨 的杂多化合物1 2 - 硅钨酸，才标志着多酸研究的开始。近代以来，随着对多酸性质的进一步认 识，金属一氧簇；( m e t a l o x y g e no u s t e r s ) , 及多金属氧酸盐化学( p o l y o x o m e t a l a t e sc h e m i s t r y ) 这两个 名称被更多的研究者所采用【i 2 1 。 多酸化合物含有较多的原子数目，结构也比较复杂。随着仪器分析的发展进步，如x - r a y 衍射仪、核磁共振谱、红外光谱、拉曼光谱等的发展和普及，迄今已确定了一百多种多酸结 构。杂多酸的k i g g i n 、d a w s o n 、a b d c r s o n 、w a n 曲( 1 ：9 系列) 、s i l v e r t o n ( 1 ：1 2 系列b 型) 结构( 图1 1 5 】) 以及同多酸的l i n d q v i s t 结构被称为多酸的六种基本结构，其中对k e g g i n 结构的研究和应用是最 为广泛的【1 捌。1 9 3 4 年英国物理学者j f k e g g i 一通过x 一射线粉末衍射得到了著名的k e g g i n 结构 模型，具有k e g g i n 结构的杂多阴离子的结构通式为 x m l 2 0 4 0 】小( x = p 、s i 、g e 、a s 等。m - - m o 、 、聊。四面体的x 0 4 位于分子结构的中心，四周包围着相互共用角氧和边氧的1 2 个八面体m 0 6 。 k e g g i n 结构杂多阴离子共有a 、1 3 、，、6 和型5 种异构体。 图1 杂多化合物的五种结构 ak i g g i n 结构bd a w s o n 结构ca n d e r s o n 结构dw a n g h 结构es i l v e r t o n 结构 除了k e g g i n 结构以外，三个m 0 6 八面体以边缘共角相连后形成m 3 0 1 3 三金属簇以不同 的方式与x 0 4 四面体结合，就形成各种不同的笼状结构的杂多化合物。在其基本的结构骨架 的基础上，可衍生出一系列的化合物。几乎所有金属非金属化学元素都可参与杂多化合物的 鲤 厨一恩一 叁 7 1 时，磷钨酸银纳米粒子空白对照的散射强度随着p h 值的增加而增强，由此推测在 偏碱性条件下纳米粒子本身发生了变化。在p h7 o 7 1 的条件下，磷钨酸银纳米粒子一朊蛋 白p r l p c 体系的散射强度达到最大且基本保持稳定，之后随着p h 值的增加，体系的散射强度 逐渐降低。由此看出。p h 值不但影响磷钨酸银纳米粒子本身在溶液中的状态，而且影响纳米 粒子与朊蛋白之间的相互作用。本实验最终选择p h 值7 0 的磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲溶 液控制体系酸度。 3 6 西南_ 人学硕士学位论文第三章多酸纳米粒子的可控合成及其与蛋白质或药物小 分于的相互作用 田6p h 位对体系散射光强度的髟响 港度：磷钨醴铋纳米粒t ，13 x 1 07 t o o l l 。朊崔f l p r p 。1 3 0 ”g m 在纳米粒子的浓度为33 x l o 弋2 _ 3 l 矿7 t o o l | 。之间，纳米粒子与朊蛋白相互作用的散射 强度逐渐增大，且增强趋势明显。而当纳米粒子的浓度再增大时体系的散射强度反而略有 降低变化趋势趋于稳定。最终选取磷钨酸银纳米粒子的最优浓度为i3 x 1 07 m o l l 。 在d h7 0 的磷酸氢二钠一磷酸一氢钠缓冲下，固定磷钨酸银纳米粒子的量增加朊蛋白 p r p c 的量，得到在3 3 6 8 4 0n g m 0 范围内的线性方程为a ，= 一38 6 + 1 1 7 6 i o 即( r i g m l 。) ，检出 限( 3 口) 为o0 2n g m l 。，相关系数09 9 1 5 。 围7 确钨酸银纳米粒子与多种蛋白相互作用 镕度。砖钨醴镕纳米粒r ，13 x 1 0 t o o l i in 左f f h 蛋0b s a - v b a1 68 雌m l l ：l s o z y m eb s a 1 1 l r o m b i nh s a , i6 8 雌m 一，朊伍自p r ：1 6 8n g m l 1 ，艘羁一钠一礴艘一瓤钠埋 ( p h7 0 ) 西南大学硕士学位论文 第三章多酸纳米粒子的可控合成及其与蛋白质或药物小 分子的相互作用 图7 所示的是磷钨酸银纳米粒子与多种蛋白相互作用的光散射信号强度对比。蛋白种类 从左到右依次为牛血清白蛋白第五组分( b s a 、牛白蛋白( b a ) 、溶菌酶( l y s o z y m e ) 、牛血清 白蛋白( b s a ) 、凝血酶( t h r o m b i n ) 、人血清白蛋白( h a s ) 及朊蛋白p r p c 。朊蛋白p r p c 浓度为 1 6 8n g m l 1 ，牛血清白蛋白第五组分( a s a 、牛白蛋白( b a ) 的浓度为朊蛋白p r p c 浓度的1 0 0 倍，其余四种蛋白浓度为朊蛋白p r p c 浓度的1 0 倍。可以看出在相同的反应条件下，磷钨酸 银纳米粒子对朊蛋白p r p c 有较好的选择性。 i 3 2 磷钨酸银纳米粒子光散射法测定溶菌酶 溶菌酶( 1 y s o z y m e ) 又称胞壁质酶( m u r a m i d a s e ) 或n 一乙酰胞壁质聚糖水解酶 ( n a c e t y l m u r a m i d eg l y c a n o h y d r l a s e ) ，是一种普遍存在于细胞中的能水解致病菌中黏 多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的n 乙酰胞壁酸和n 乙酰氨基葡糖之间的p 1 ，4 糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使 细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与d n a 、r n a 、脱辅基蛋白 形成复盐，使病毒失活1 2 2 ，2 3 1 。因此，临床上可以通过检测血清和尿液中溶菌酶的含量 来达到检测癌症、艾滋病、白血病等疾病的目的【2 4 2 6 1 。 目前，对于溶菌酶的测定方法有比浊度法，以溶壁微球菌为底物，通过测定酶作用前后菌 液吸光度的变化来表示【”1 ，荧光法【2 引，基于荧光聚合物的荧光共振能量转移【2 9 1 以及电化 学方法1 3 们。共振光散射法，作为一种新兴的分析方法，在分析化学中正在得到越来越广泛的 运用。共振光散射分析法具有灵敏度高，设备简单，反应快捷等特点，因而具有广泛的运用 前景。目前共振光散射技术已经广泛的运用于核酸、药物、有机小分子、蛋白质和糖类等物 质的检测当中【3 1 - 35 1 。 本文以溶菌酶为酶类代表，利用光散射信号。考察了磷钨酸银纳米立方体与溶菌酶相互 作用，并且根据二者相互作用后光散射光谱的增强与加入溶菌酶浓度具有一定线性关系，实现 了溶菌酶的定量检测。相对于已有方法，该方法简便易行，灵敏度较高，可以满足检测的需要。 3 2 1仪器与试剂 f - 4 5 0 0 型荧光分光光度计( 日立公司，日本) ，q l - 9 0 1 旋涡混合器( 海门市其林贝尔仪器 制造有限公司) 。 1 2 一磷钨酸( p o m ) 参照文献合成，配制成2 0 x 1 0 - 2 t o o l l j 的储备液，工作液为1 0 x l 矿 t o o l l 一。a g n 0 3 ( 重庆化学试剂总厂) 溶液，准确称取一定量的硝酸银溶于二次蒸馏水中，配制 成1 0 x 1 0 3m o l l d 的储备液，避光保存。d m f ( 重庆川东化工集团有限公司试剂厂) 。溶菌酶( 上 海生物试剂公司) ，准确称取一定量的溶菌酶固体，配制成5 0m g m l 。1 的储备液，在4 c 冰箱中 保存。 3 8 西南大学硕士学位论文第三章多酸纳米粒子的可控合成及其与蛋白质或药物小 分子的相互作用 曼曼皇曼曼舅舅曼曼曼曼曼曼2 m_mm 1 葛鼍曼鲁量量量舅曼量置皇鼻曼量舅量量 3 2 2实验方法 3 2 2 1 磷钨酸银纳米粒子的合成 在1 0m l 的比色管中，加入1 0 x 1 0 。4t o o l l 1 1 2 一磷钨酸溶液1 0m l 和6 00 l d m f ，漩涡 混合后取0 1m l 上述混合液缓慢滴加至3 0m l1 0 x 1 0 一m o l u 1 的a g n 0 3 溶液中。漩涡混合， 形成浅灰蓝色的溶液，光照有蓝色散射光，即形成具有立方体形态的纳米粒子。 3 2 2 2 磷钨酸银纳米粒子与溶菌酶相互作用 将制各好的纳米粒子，离心除去多余的a g n 0 3 和d m f , 加二次水使其重新分散，获得 最终浓度为3 3 x 1 0 击m o l l 1 的磷钨酸银纳米粒子悬浊液( 按照磷钨酸根的浓度计算) 。在p h6 8 磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲溶液( o 2 0m o l l - 1 ) 中，取一定量的纳米粒子悬浊液与溶菌酶作 用。每加入一种溶液都进行旋涡混匀，放置1 0r n i n 后测定。光散射信号在f - 4 5 0 0 荧光分光 光度计上以狭缝5 0n l l l ，电压4 0 0v ，同时扫描激发和发射单色器并保持4 a = 0 模式下获得。 3 2 3 结果与讨论 3 2 3 1 磷钨酸银纳米粒子与溶菌酶共振光散射光谱研究 图l 是磷钨酸银纳米粒子和溶菌酶相互作用的光散射图谱由图可以看出，单独的溶菌 酶和磷钨酸银纳米粒子散射信号都较弱当二者混合以后，散射信号即有明显增强，且随着 溶菌酶浓度的增加而不断增强 图1磷钨酸银纳米粒子与溶菌酶共振光散射光谱 i 为溶菌酶，2 为磷钨酸银纳米粒子，3 7 为磷钨酸银纳米粒子一溶菌酶浓度：磷钨酸银纳米粒子1 6 1 0 7 t o o l l _ 1 ；溶菌酶( 峙m l ，曲线i - 6 ) ：1 4 0 ，0 0 ，0 5 ，5 0 ，5 0 ，1 0 0 ，1 4 0 ；磷酸氢二钠- 磷酸二氢钠缓冲( p h6 8 ) 3 9 西南大学硕士学位论文第三章多酸纳米粒子的可控合成及其与蛋白质或药物小 分子的相互作用 图2 磷钨酸银纳米粒子与溶菌酶共振光散射信号线性关系 在p h6 8 的磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲下，固定磷钨酸银纳米粒子的量增加溶菌酶的 量，得到在o 5 1 4 0i t g m l l 范围内的线性方程为- - 2 2 9 7 + 4 7 4 4 1 0 9 c ( p g m l 1 ) ，检出限( 3 a ) 为0 0 4p g m l ，相关系数0 9 9 1 6 。 3 2 3 2 实验条件的选择 1p h 的选择 图3p h 值对体系散射光强度的影响 浓度：磷钨酸银纳米粒子，1 6 x 1 0 t o o l l 。1 ；溶菌酶，4 0 峙f i i l 1 实验发现，磷钨酸银纳米粒子空白对照在p h6 0 7 0 范围内散射强度基本保持稳定当 p h 7 2 时，磷钨酸银纳米粒子空白对照的散射强度随着p h 值的增加而增强，由此推测在偏 碱性条件下纳米粒子本身发生了变化。在p h6 4 7 0 的条件下，磷钨酸银纳米粒子一溶菌酶体 西南大学硕士学位论文第三章多酸纳米粒子的可控合成及其与蛋白质或药物小 分子的相互作用 系的散射强度达到最大且基本保持稳定，之后随着p h 值的增加，体系的散射强度逐渐降低。 由此看出，p h 值不但影响磷钨酸银纳米粒子本身在溶液中的状态，而且影响纳米粒子与溶菌 酶之间的相互作用。本实验最终选择p h6 8 的磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲溶液控制体系酸 度。 2 纳米粒子用量的选择 在纳米粒子的浓度为3 3 x l o l 2 3 x 1 0 7m 0 1 l 1 之间，纳米粒子与溶菌酶相互作用的散射 强度逐渐增大，且增强趋势明显。而当纳米粒子的浓度再增大时，体系的散射强度反而略有降 低，变化趋势趋于稳定。最终选取磷钨酸银纳米粒子的最优浓度为1 6 x 1 0 一m o l l 。 3 试剂加入顺序对反应体系的影响 试剂的加入顺序对反应体系的吸光度有一定的影响。实验结果表明，当缓冲溶液与溶菌 酶首先混合后，再加入纳米粒子，测得的光散射信号变化较为显著，因此在实验中选用试剂 的加入顺序为先加缓冲溶液，再加入溶菌酶最后加入磷钨酸银纳米粒子。 3 2 3 3 方法的选择性及其分析应用 1 共存物质的影响 表1 共存物质的影响 浓度：磷钨酸银纳米粒子，1 6 x 1 0 m o l l ；溶菌酶，5 0 喀m l ；磷酸缓冲( p h6 8 ) 在p h6 8 的磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲溶液下，当磷钨酸银纳米粒子浓度为1 6 x 1 0 7 t o o l l 1 。溶菌酶浓度为5 0p g m u l 时，研究了k + 、m 矿、c a 2 + 、c u 2 + 、f e 3 + 、a 1 3 + 阳离子，c i 、 4 l 西南大学硕士学位论文第三章多酸纳米粒子的可控合成及其与蛋白质或药物小 分子的相互作用 s 0 42 。阴离子以及一些生物物质对反应体系的影响，共存离子允许量如表l 所示。 结果表明，无机离子在反应体系中允许存在量比较大，其相对误差在- 4 2 o 8 之间。 生物物质中，人血清白蛋白与牛血清白蛋白的影响较大，允许存在量较小；氮基酸、环糊精 与几种糖类物质对反应体系有一定的影响，其相对误差在3 8 q 5 之间。由此可见，在不。 同的样品中，当上述生物物质不同时大量存在在同一体系中时，这些干扰物质的影响还是比 较小的。 2 分析应用 按照实验方法，测定了三种自制混合样品中溶菌酶的含量，结果如表2 所示。结果令人满意。 表2 合成样品中溶菌酶的测定结果 2 0 o o m a c l ( 1 0 x 1 0 4 ) ，环糊精( 4 0 x 1 0 击) ， 1 9 9 52 0 0 21 9 8 71 9 7 9 甘露糖( 4 0 x 1 0 4 ) 天冬氨酸( 5 x l o 4 ) 1 9 9 2 9 9 6 a i c l 3 ( 1 o x l o 5 ) ，f e c l 3 ( 2 o l 旷5 ) ，谷 2 0 0 92 0 1 61 9 9 32 0 1 l 2 0 0 0 氨酸( 5 o xl o - 4 ) ，牛血清白蛋白 1 0 0 3 2 0 0 4 ( 3 o x l o 。) c u s 0 4 ( 1 o x l o 一) ，环糊精( 1 o x l o 6 ) ， 1 9 8 41 9 9 92 0 1 02 0 0 4 2 0 o o 9 9 9 果糖( 4 o x l f 5 ) ，赖氨酸( 1 0 x lo 5 ) 1 9 9 3 浓度：磷钨酸银纳米粒子，1 6 x l f f 7t o o l l 。1 ；磷酸缓冲( p h6 8 ) 3 3 磷钨酸银纳米粒子光散射法测定多巴胺 多巴胺( d a ) 在生命体内对神经中枢，心血管，肾脏及激素分泌系统等具有重要的调 节作用【3 6 , 3 7 1 。临床上可以根据体内多巴胺的代谢异常来诊断一些疾病，如老年痴呆症，帕金 森综合症，癫痫症，h i v 感染等1 3 8 3 9 ，并且可以将其作为一种心血管药物，广泛应用于治疗 各种类型的休克、支气管哮喘、高血压和心脏病 4 0 - 4 1 】。因此，对其检测方法的研究不论在临 床应用还是在生理功能研究方面都具有很重要的意义。目前已报道的测定方法有很多，包括 高效液相色谱法【4 2 1 ，毛细管电泳法【4 3 1 ，紫外一可见分光光度法l ，荧光光度法【4 5 1 。化学发光 法1 4 6 1 ，电化学方法【4 7 l 等。 磷钨酸银是一种溶解度较低的多酸化合物，近年来其纳米形态的合成和应用被广泛关 4 2 西南大学硕士学位论文第三章多酸纳米粒子的可控合成及其与蛋白质或药物小 分子的相可作用 量量皇量喜詈量量量量量曼皇曼曼曼邑暑曼曼曼曼曼曼曼笪曼鼍曼量曼曼曼曼曼曼曼鼍曼皇曼皇曼舅曼鼍曼鼍曼晕鼍e mir i 鼍量鼍置鼍舅曼量量曼鼍量暑昌昌置詈鼍 注。其合成手段有液相合成1 4 8 j ，也有微波固相合成【4 9 l 。而对其应用的研究，集中在当其作为 一种新型催化剂时，其对某种有机反应的催化效率方面的探讨【5 0 l 。将其作为一种分析探针的 应用还未见报道。因为多巴胺的检测具有很重要的意义，所以我们选取多巴胺为检测对象， 来研究其与药物小分子之间的相互作用。不但实现了多巴胺快速灵敏的检测，而且也为多酸 纳米粒子在分析检测中的应用拓宽了范围。 3 3 1 仪器与试剂 f - 4 5 0 0 型荧光分光光度计( 日立公司，日本) ，q l 一9 0 1 旋涡混合器( 海门市其林贝儿仪器制 造有限公司) 。s - 4 8 0 0 扫描电子显微镜( 日立公司，日本) ，p h s 一3 c 型酸度计( 成都方舟科技 开发公司) 。 一 1 2 一磷钨酸( p o m ) 参照文献合成，配制成2 0 x 1 0 2m o l l 。1 的储备液，工作液为1 0 x 1 一 t o o l l 。a g n 0 3 ( 重庆化学试剂总厂) 溶液，准确称取一定量的硝酸银溶于二次蒸馏水中，配制 成1 0 x 1 0 。3m o l l 1 的储备液，避光保存。d m f ( 重庆川东化工集团有限公司试剂厂) 。盐酸多巴 胺标准溶液( 1 0 x 1 0 一m o l l 。1 ) ：准确称取一定量盐酸多巴胺( 美国s i g m a 公司) 溶于水中，定容至 1 0 0m l ，避光冰箱保存。 3 3 2 实验方法 3 3 2 1 磷钨酸银纳米粒子的合成 在1 0m l 的比色管中，加入1 0 x 1 0 r 4 m o l - l 1 1 2 一磷钨酸溶液1 0m l 和6 0p l d m f ，漩涡 混合后取o 10n i l 上述混合液缓慢滴加至3 0m l1 0 x1 0 。m o l l 1 的a g n 0 3 溶液中，漩涡混合， 形成浅灰蓝色的溶液，光照有蓝色散射光，即形成具有立方体形态的纳米粒子。 3 3 2 2 磷钨酸银纳米粒子与多巴胺相互作用 将制备好的纳米粒子，离心除去多余的a g q 0 3 和d m f , 加二次水使其重新分散，获得 最终浓度为3 3 x 1 0 击m o l l 1 的磷钨酸银纳米粒子悬浊液( 按照磷钨酸根的浓度计算) 。在p h5 0 醋酸一醋酸钠( h a c - n a a c ) 缓冲溶液( 0 2 0m o l l - 1 ) 中，取一定量的纳米粒子悬浊液与多巴胺作 用。每加入一种溶液都进行旋涡混匀，放置1 0m i n 后测定。光散射信号在f - 4 5 0 0 荧光分光 光度计上以狭缝5 0n m ，电压4 0 0v ，同时扫描激发和发射单色器并保持钡= 0 模式下获得。 3 3 3 结果与讨论 3 3 3 1 磷钨酸银纳米粒子与多巴胺相互作用的共振光散射光谱研究 图l 是磷钨酸银纳米粒子和多巴胺相互作用的光散射图谱。由图可以看出，在实验条件 4 3 西南大学硕士学位论文 第三章多酸纳米粒子的可控合成及其与蛋白质或药物小 分子的相互作用 下，单独的多巴胺和磷钨酸银纳米粒子光散射信号都较弱。而当二者混合以后，散射信号即 有明显增强，且随着多巴胺浓度的增加而不断增强。 图1磷钨酸银纳米粒子与多巴胺共振光散射光谱 1 为多巴胺，2 为磷钨酸银纳米粒子，3 7 为磷钨酸银纳米粒子一多巴胺浓度：磷钨酸银纳米粒子6 6 x 1 0 7 m 0 1 l - 1 ；多巴胺( m o i m l ，曲线1 - 6 ) ：1 2 1 0 - 5 ，0 ，3 0 i 0 - e ，1 0 x 1 0 ，1 0 x l 酽，2 0 1 0 r 6 ，3 0 x 1 0 6 ； h a c - n a a c 缓冲( p h5 o ) 图2 磷钨酸银纳米粒子与多巴胺共振光散射信号线性关系 在p h5 0 的h a c n a a c 缓冲溶液下，固定磷钨酸银纳米粒子的量增加多巴胺的量，得到在 3 0 x 1 0 s - i 2 x 1 0 一m 0 1 l 1 范围的线性方程为= 2 3 1 + 1 8 6 c ( 1 0 一m o l l 1 ) ，检出限( 3 0 ) 为1 4 x 1 0 。8 m 0 1 l - 1 ，相关系数0 9 9 4 3 。 西南大学硕士学位论文 第三章多酸纳米粒子的可控合成及其与蛋白质或药