（生理学专业论文）pdgfbb通过诱导epiregulin表达促进血管平滑肌细胞增殖.pdf

独创性声明 删i j f | i 舢m 朋 fy 1 8 9 4 9 2 8 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：易屏乡云 日期： l , 0 1 1 年石月，弓日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文 的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保密囡。 学位论文作者签名：夏粥云 z , oj 1 年易月i 弓目 雠：叶v 拥 - - 驷t 1 年6 月i 弓日 分类号 墅2 窆：2 u d c 6 1 2 江蒜大擎 硕士学位论文 p dgf bb 通过诱导e p ir egul in 表达促进血管平 滑肌细胞增殖 pdgf bbstimula tespr olifer a tionof v ascularsmo othmuscl ece llv ia ind ucingep ir egulinexpr ession 作者姓名：吴彩云 指导教师：陈永昌教授 申请学位：理学硕士 学科专业：生理学 论文提交日期：2 0 11 年4 月2 6 日 论文答辩日期：2 0 11 年6 月3 日 学位授予单位：江苏大学 学位授予日期： 2 0 11 年6 月 答辩委员会主席：王胜军 江苏大学硕士学位论文 摘要 研究目的： 研究表皮调节素( e p i r e g u l i n ) 在血小板源性生长因子 一b b ( p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r - b b ，p d g f b b ) 促进血管平滑肌细 胞( v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l ，v s m c ) 增殖中的作用，并阐明这种 作用是特异存在于v s m c 中还是普遍存在多种类型的肿瘤细胞中。 研究方法： 培养血管平滑肌细胞株c s 5 4 、胃癌细胞株b g c 8 2 3 、s g c 7 9 0 1 、 乳腺癌细胞株m c f 7 和肺癌细胞株a 5 4 9 ，用w e s t e r nb l o t t i n g 法检测 e p i r e g u l i n 在这些细胞株中有无表达，然后进一步检测p d g f b b 对 e p i r e g u l i n 蛋白表达的影响；用r e a l t i m ep c r 法检测p d g f b b 对 c s - 5 4 细胞e p i r e g u l i nm r n a 表达的影响；针对大鼠e p i r e g u l i n 基因的 m r n a 序列合成s i r n a ，采用脂质体转染法将其转染c s 5 4 细胞；用 w e s t e r nb l o t t i n g 法检测s i r n a 转染后c s 一5 4 细胞中e p i r e g u l i n 蛋白表 达的变化；用m t t 法检测p d g f b b 在不同浓度和不同作用时间下对 c s 一5 4 细胞增殖效应的影响；e p i r e g u l i ns i r n a 转染4 8h 后加入 p d g f b b ，然后进一步分析干扰e p i r e g u l i n 表达对p d g f b b 促进 c s 5 4 细胞增殖效应的影响。 研究结果： ( 1 ) 在血管平滑肌细胞株c s 5 4 和乳腺癌细胞株m c f 一7 中检测到 e p i r e g u l i n 的蛋白表达，其它细胞株如胃癌细胞b g c 8 2 3 、s g c 7 9 0 1 和肺癌细胞a 5 4 9 中没有检测到e p i r e g u l i n 的蛋白表达。 ( 2 ) 从m r n a 水平和蛋白水平检测到p d g f b b 可使c s 一5 4 细胞 e p i r e g u l i n 表达上调，但对m c f 7 细胞不起作用。 ( 3 ) p d g f b b 促进血管平滑肌细胞增殖，效应具有浓度和时间依 p d g f b b 通过诱导e p i r e g u l i n 表达促进血管平滑肌细胞增殖 赖性，在5 0 n g m lp d g f b b 作用2 4 h 时其作用最为明显( p o 0 5 ) 。 ( 4 ) 以e p i r e g u l i ns i r n a 转染c s - 5 4 细胞，可使e p i r e g u l i n 蛋白表 达水平明显降低，并明显阻断p d g f b b 对c s 一5 4 细胞增殖的促进作 用( p o 0 5 ) 。 结论： p d g f b b 通过诱导e p i r e g u l i n 表达刺激血管平滑肌细胞增殖，并 且这种作用是血管平滑肌细胞所特有的。 关键词：p d g f b b ，e p i r e g u l i n ，血管平滑肌细胞，r n a i ，细胞增殖 江苏大学硕士学位论文 a b s i r a c i o b j e c t i v e t oi n v e s t i g a t et h er o l eo fe p i r e g u l i ni np r o l i f e r a t i v es t i m u l a t i o no f p l a t e l e t - d e r i v e dg r o w t hf a c t o r - b b ( p d g f b b ) i nr a tv a s c u l a rs m o o t h m u s c l ec e l l ( v s m c ) ，a n dt o c l a r i f yt h a t t h i sp h e n o m e n o ni ss p e c i f i ci n v s m co rc o m m o ni nm u l t i p l et y p e so ft u m o rc e l l s m e t h o d s w e s t e r nb l o t t i n gw a su s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fe p i r e g u l i na n d t h ec h a n g eo ft h ee x p r e s s i o no fe p i r e g u l i nc a u s e db yp d g f b bi nr a t v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l ll i n ec s 一5 4 ，g a s t r i cc a n c e rc e l ll i n eb g c 一8 2 3 a n ds g c 一7 9 01 ，b r e a s tc a n c e rc e l ll i n em c f 一7 ，a n d l u n gc a n c e rc e l ll i n e a 5 4 9 r e a l - t i m ep c rw a sa p p l i e dt od e t e c tt h ei n f l u e n c eo fp d g f b bo n e x p r e s s i o n o f e p i r e g u l i n i nc s 一5 4 c e l l s e p i r e g u l i n s i r n aw a s s y n t h e s i z e da c c o r d i n gt om r n as e q u e n c eo fe p i r e g u l i ng e n eo fr a ta n d w a st r a n s f e c t e di n t oc s 一5 4c e l l s w e s t e mb l o t t i n gw a su s e dt od e t e c tt h e c h a n g eo ft h ee x p r e s s i o no fe p i r e g u l i nc a u s e db ye p i r e g u l i ns i r n a t h e i n f l u n e c eo fp d g f b bt r e a t m e n tw i t hd i f f e r e n td o s a g ea n dt i m ea n d i n t e r f e r e n c eo f e p i r e g u l i ne x p r e s s i o nb y s i r n ao nc s 一5 4c e l l s p r o l i f e r a t i o nw a sa n a l y z e db ym t ta s s a y r e s u l t s ( 1 ) t h ee x p r e s s i o no fe p i r e g u l i nw a sd e t e c t e di nv a s c u l a rs m o o t h m u s c l ec e l l l i n ec s 5 4a n db r e a s tc a n c e rl i n em c f 7a n dw a sn o td e t e c t e d i no t h e rc e l ll i n e ss u c ha sg a s t r i cc a n c e rc e l l sb g c 一8 2 3 ，s g c 一7 9 01a n d l u n gc a n c e rc e l l sa 5 4 9 ( 2 ) p d g f - b bi n c r e a s e de p i r e g u l i ne x p r e s s i o ni nc s 一5 4c e l l sa tb o t h m r n al e v e la n d p r o t e i nl e v e l ，b u th a d n oe f f e c ti nm c f 一7c e l l s ( 3 ) p d g f b bd o s a g ea n dt i m e d e p e n d e n t l yp r o m o t e dt h ep r o l i f e r a t i o n o fc s - 5 4c e l l s ，m o s te f f e c t i v ea t 5 0 n g m l p d g f b bf o r2 4h o u r s i i i p d g f b b 通过诱导e p i r e g u l i n 表达促进血管平滑肌细胞增殖 ( p o 0 5 ) ( 4 ) e p i r e g u l i ns i r n an o to n l yd e c r e a s e dt h el e v e l o fe p i r e g u l i n e x p r e s s i o n b u ta l s ob l o c k e dt h e p r o l i f e r a t i o n s t i m u l a t i n g e f f e c to f p d g f b bi nc s - 5 4c e l l s ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n p d g f b bs t i m u l a t e sp r o l i f e r a t i o nv i ai n d u c i n gt h ee x p r e s s i o no f e p i r e g u l i n ，a n dt h i se f f e c ti ss p e c i f i ci nv s m c k e y w o r d s ：p d g f b b ，e p i r e g u l i n ，v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l ， r n a i ，c e l lp r o l if e r a t i o n i v 江苏大学硕士学位论文 目录 ， 第一章绪论。1 1 1 血小板源性生长因子( p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r ，p d g f ) 1 1 1 1p d g f 及其受体的结构1 1 1 2p d g f 的生物学活性2 1 1 3p d g f b b 的结构和分布2 1 1 4p d g f b b 的功能3 1 1 5p d g f b b 与v s m c 增殖。3 1 2e p i r e g u l i n 的研究背景5 1 2 1e g f 家族5 1 2 2e p i r e g u l i n 的结构与功能6 1 3r n a 干扰技术一7 1 3 1r n a 干扰技术的研究进展8 1 3 2r n a 干扰技术的应用9 1 3 3r n a 干扰技术在本文中应用的意义1 0 。 1 4 本论文研究的目的、内容、意义、方法、实验方案的设计1 1 1 4 1 研究目的：11 1 4 2 研究内容：1 1 1 4 3 研究意义：1 2 1 4 4 研究方法及技术：1 2 1 4 5 实验方案的设计：1 2 第二章p d g f - b b 对v s m c 中e p i r e g u l i n 表达的影响1 5 2 1 材料和方法15 2 1 1 材料15 2 1 2 实验方法19 2 2 实验结果2 2 2 2 1p d g f b b 对v s m c 中e p i r e g u l i nm r n a 表达的影响2 2 2 2 2p d g f - b b 对v s m c 中e p i r e g u l i n 蛋白表达的影响2 3 2 2 3s i r n a 转染后e p i r e g u l i n 蛋白表达2 3 v p d g f b b 通过诱导e p i r e g u l i n 表达促进血管平滑肌细胞增殖 2 3 讨论2 4 第三章p d g f b b 对部分肿瘤细胞中e p i r e g u u n 表达的影响2 7 3 1 材料和方法2 7 3 1 1 材料一2 7 3 1 2 实验方法2 9 3 2 结果3 0 3 2 1e p i r e g u l i n 在m c f 一7 、a 5 4 9 、b g c 一8 2 3 、s g c 一7 9 0 1 细胞中的表达3 0 3 2 2p d g f b b 对乳腺癌细胞e p i r e g u l i n 蛋白表达的影响3 1 3 2 3p d g f - b b 对肺癌和胃癌细胞e p i r e g u l i n 蛋白表达的影响3 2 3 3 讨论3 2 第四章e p i r e g u l i n 对p d g f - b b 诱导的v s m c 增殖的影响 3 5 4 1 材料和方法3 5 4 1 1 材料3 5 4 1 2 方法3 6 4 2 实验结果3 7 4 2 1p d g f b b 对v s m c 增殖的影响3 7 4 2 2 干扰e p i r e g u l i n 表达对p d g f b b 诱导的v s m c 增殖的影响3 8 4 3 讨论：3 9 第五章主要结论和展望4 1 5 1 主要结论4 1 5 2 展望4 1 参考文献4 3 致谢4 9 英文缩写索引5 0 攻读硕士学位期间发表的文章5 1 v i 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 血小板源性生长因子( p l a t e l e t - d e r i v e dg r o w t hf a c t o r , p d g f ) 1 1 1p d g f 及其受体的结构 ( 1 ) p d g f 的结构 p d g f t l ，2 1 是调节细胞生长和分化的一种生长因子，它最初从血小板中分离出 来并由此得名。血小板是体内p d g f 的主要来源。后来发现巨噬细胞、成纤维细 胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、表皮细胞等间叶来源的细胞都能分泌p d g f 。其 结构是以二硫键共价连接的二聚体，连接形式为一条多肽链氨基末端第二位半胱 氨酸残基与另一条肽链的第四位半胱氨酸残基连接，二链反向平行【3 】。p d g f 的分 子组成因来源不同而异，可由a 链、b 链、c 链和d 链分别组成p d g f a a 、p d g f b b 、p d g f a b 、p d g f c c 、p d g f d d 异构体【4 1 。克隆资料显示a 链和b 链 由不同部位的两个基因控制。b 链是c s i s 原癌基因的表达产物，定位在第2 2 号 染色体上( 2 2 q ) ，a 链定位在第七号染色体上( 7 p 2 1 2 2 ) 。成熟a 、b 链同源性达 6 0 ，含8 个胱氨酸残基，与链内和链间的二硫键有关。c 链来自胚胎组织、肿 瘤、血小板颗粒【5 1 和s m c 等，其结构与p d g f a ，b 链相似6 1 。d 链为人们最 近所发现，与c 链有着相同的二级结构，以同源二聚体形式构成p d g f d d 7 1 。 p d g f c 和d 多肽链结构与p d g f a ，b 链不同的是此多肽链的n 末端含有 c u b 结构域，需要特异性蛋白酶将其剪切后才具有生理活性。p d g f 性质很稳定， 暴露到1 的十二烷基硫酸钠、4 m 的胍盐酸或加热到1 0 0 仍保持其生物学活性。 血浆内p d g f 含量较低，半衰期一般短于2 m i n 。 ( 2 ) p d g f 受体的结构 p d g f 受体( p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r r e c e p t o r , p d g f r ) 是酪氨酸激酶受体， 分子量约1 7 0 1 8 0 k d ，为含n 乙酰氨基葡萄糖和半乳糖残基的单链膜糖蛋白。 根据其功能分为胞外配体结合区、跨膜区、胞内近膜区和酪氨酸蛋白激酶区。 p d g f r 广泛分布于人体组织，如血管平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经 胶质细胞、软骨细胞等，不同器官的细胞所含p d g f r 的类型有差异性。p d g f r p d g f b b 通过诱导e p i r e g u l i n 表达促进血管平滑肌细胞增殖 由0 【和p 两种亚基分别组成a c 【，p p ，0 【p 三种形式的二聚体。p d g f 与其受体结合 存在着复杂的关系，a 链与a q 受体结合，b 链与0 c 0 ，0 【p 和p p 受体结合，c 链与 o , 0 t 和仅b 受体结合【7 1 ，d 链与p p 受体结合，但l a r o c h e l l e _ 等t s j 通过实验发现d 链 也可与c 【p 受体结合。p d g f 及其受体在胚胎发育，过程中扮演着非常重要的角色， 尤其是肾脏、血管、肺和中枢神经系统。 1 1 2p d g f 的生物学活性 p d g f 生物学特征主要有三方面：一是促分裂效应，p d g f 能刺激v s m c 、成 纤维细胞、胶质细胞的分裂增生。二是趋化活性，对中性粒细胞、平滑肌细胞、 成纤维细胞有趋化性，该作用在损伤组织的修复过程中极为重要。三是具有缩血 管活性。p d g f 的生物学活性包括诱导平滑肌细胞，巨噬细胞及中性粒细胞的趋化 性，诱导静止期成纤维细胞在培养条件下c m y c 和c f o s 基因m r n a 的表达，使静止 期细胞转变为增殖期细胞，上调低密度脂蛋白( l d l ) 受体的表达，促进磷脂酰肌 醇的更新，激活蛋白激酶、糖原合成酶。另外，还调节前列腺素的合成，刺激血 管收缩，促进细胞间质的增生和基质合成等。 p d g f 与其受体结合后使受体二聚化，导致受体酪氨酸蛋白激酶被激活；受体 的自身磷酸化，为底物蛋白与之结合提供了位点。这些底物蛋白均有一个保守的 结构片段，即同源片段s h 2 ，s h 2 是一段大约含有1 0 0 个氨基酸残基的保守序列， 在介导受体信号转导中起重要作用。底物蛋白包括生长因子受体结合蛋i 兰t ( g r b 2 ) 、 磷酯酶c - 7 、磷酯酰肌3 醇激酶、r a s 鸟苷三磷酸酶激活蛋白等，后者激活细胞分 裂素活化蛋白激酶如细胞外信号调节激酶、e - j u n 氨基末端活化蛋白激酶等，这些 信号分子进入细胞核刺激早反应基因的表达，从而调节细胞周期、细胞迁移、细 胞分化【9 】。 1 1 3p d g f b b 的结构和分布 生物活性p d g f _ b 分子由二硫键连接的同源或异源二聚体即p d g f b b 组 成，p d g f b 分子量为2 8 3 5 k d ，位于2 2 号染色体，由7 个外显子组成。在成熟 的p d g f 分子中，p d g f a 链和b 链有5 6 的氨基酸相同。许多组织如结缔组织、 2 江苏大学硕士学位论文 上皮组织、肌肉、神经组织的正常细胞和转化细胞及来源于造血系统的细胞都能 表达和分泌p d g f 。p d g f b 主要在内皮细胞表达【1 0 1 。p d g f b 受体为分子量约 1 7 0 1 8 0 k d 的单链膜糖蛋白，主要分跨膜区、胞内区、胞外区、信号区四部分， 其中信号区为与p d g f b 结合的部位。p d g f 受体是酪氨酸激酶受体p d g f r 眠 p ，含a 、p 两种亚基，一般以单体或不稳定二聚体形式存在，当p d g f b b 存在 并与受体结合时，0 t 、p 亚基连在一起，以o , 0 t 、b p 、q p 形式发挥作用f 】。a 亚基与 p d g f _ a ，b 链均可结合，而p 亚基仅与b 链结合。0 c 纵g p 及p p 型受体能与p d g f b b 配基结合而发挥作用。 1 1 4p d g f b b 的功能 p d g f b b 主要在内皮细胞表达，对成纤维细胞、平滑肌细胞和中性粒细胞有 趋化性，该作用在损伤组织的修复过程中极为重要。p d g f b b 也是引导平滑肌细 胞迁移的主要趋化分子，诱导平滑肌细胞从血管中膜迁移至内膜并聚集在由坏死 的泡沫细胞组成的脂池周围，产生胶原纤维和弹力纤维组成纤维帽包绕脂池形成 典型的粥样硬化斑块【l2 1 。研究发现，p d g f b b 收缩大鼠主动脉的作用较经典的血 管紧张素1 i 的作用还要强烈，其导致大鼠血压升高的机制主要是诱导血管重构【1 3 】。 p d g f b b 能刺激多种细胞如血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶质细胞的分裂增生， 通过刺激胶原合成和胶原酶的活化作用调节胞外基质的更新，最终促进d n a 合成 和细胞裂解、增殖【l6 1 。此外，p d g f b b 与其受体结合后可影响骨骼肌中细胞骨架 与细胞膜的作用而致细胞骨架重排，说明p d g f b b 不仅是重要的促细胞分裂剂， 还可能影响细胞结构。 1 1 5p d g f b b 与v s m c 增殖 血管平滑肌细胞是血管壁的主要细胞成分之一，它是决定血管活性和血管构 型的重要因素。在与心血管系统有关的许多疾病中，血管活性和( 或) 血管构型皆会 发生明显变化，如高血压【1 3 1 、动脉粥样硬化【1 4 1 、血管再狭窄等，相应的血管管壁 增厚，收缩功能增强而舒张功能减弱，细胞间胶质沉积增加，血管壁顺应性下降， 管腔狭窄，这些血管结构和功能的变化均涉及血管平滑肌细胞的参与。实际上血 3 p d g f - b b 通过诱导e p i r e g u l i n 表达促进血管平滑肌细胞增殖 管舒缩反应就是血管平滑肌细胞的收缩和舒张，而血管壁增厚，顺应性下降则主 是源于血管平滑肌细胞肥大、增生，产生和分泌细胞外基质的增加等。血管内皮 细胞损伤、平滑肌增殖是目前研究新生内膜形成和再狭窄的热点。血管内皮细胞 的损伤导致多种炎症因子和生长调节因子的表达、激活紊乱，诱导血管平滑肌细 胞进行表型改变，刺激血管平滑肌细胞从血管中膜向内膜迁移，发生过度增生和 凋亡抑制。损伤的内皮细胞、激活的血小板、移行于内皮下的单核巨噬细胞以及 表型转化后的合成型平滑肌细胞都能以自分泌、旁分泌形式释放大量的p d g f ， p d g f 与相应细胞膜p d g f 受体结合，促进大量单核细胞黏附、增殖及向内膜下转 移【l5 1 ，促进内皮细胞、纤维母细胞、血管平滑肌细胞的生长和增殖，促进平滑肌 细胞迁移，单核巨噬细胞、平滑肌细胞内吞脂质形成泡沫细胞以及促进平滑肌细 胞胆固醇合成，l d l 受体表达及细胞外基质沉积。 p d g f b b 介导的血管平滑肌细胞增殖信号转导途径： ( 1 ) 磷酯酰肌醇3 激酶( p 1 3 k ) 途径：p d g f r 2 1 3 亚基突变后丢失酪氨酸激酶2 区，可以抑制p d g f b b 诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞d n a 合成。p d g f r b 亚基第7 0 8 、7 1 9 位置上的酪氨酸残基丢失则不能和p 1 3 k 结合而抑制d n a 的合成， 但这种受体突变并不影响p 1 2 0 g t p 酶激活蛋白和磷酯酶c - 7 的结合，也不影响 r a f 的激活，提示p 1 3 k 在p d g f b b 诱导增殖过程中起主要作用【m 1 8 1 。 ( 2 ) r a s 途径：p d g f 与血管平滑肌细胞上的受体结合后激活膜上的一种小分 子g 蛋白( r a s 蛋白) ，通过r a s g t p 逐级激活m a p 洲a p l 洲e r k 通路，促进 细胞的有丝分裂【2 0 2 1 1 。用转染法使血管平滑肌细胞获得显性负性突变型r a s 后， 可抑制p d g f b b 诱导的d n a 合成以及由气囊损伤引起的细胞增殖反应。p 2 1 r a s 需要异戊二烯基化后才有活性，而利用抑制其异戊二烯基化的药物( h m gc o a 抑 制剂) 能够阻断p d g f b b 诱导的血管平滑肌细胞有丝分裂、迁移，提示p 2 1 r a s 在 此过程中起重要作用。 ( 3 ) 磷脂酶激活途径：p d g f b b 与血管平滑肌细胞上的受体结合后，激活细 胞内酪氨酸蛋白激酶( t p k ) ，进而激活磷脂酶c ，刺激肌醇磷酸产生三磷酸肌醇 ( i v 3 ) 和二酰基甘油( d a g ) 。i p 3 主要作用于内质网，d a g 可激活蛋白激酶c ， 蛋白激酶可使核蛋白体上丝氨酸残基磷酸化，从而促进d n a 的合成。而三磷酸肌 醇i p 3 作为第二信使诱导c m y c 基因表达，使胞内d n a 合成加快【2 2 1 。 江苏大学硕士学位论文 ( 4 ) c a p 离子途径【2 3 1 ：p d g f b b 可以促进血管平滑肌细胞的细胞外c a 2 + 内流 和内c a 2 + 释放增加。c a 2 + 内流可通过电压依赖性二氢吡啶敏感性钙通道，也可通过 能被无机离子n i 2 + 和c 0 2 + 阻断而对有机钙离子拮抗剂不敏感的通路进入细胞【2 3 】。 p d g f b b 促c a 2 + 内流的作用可被酪氨酸磷酸化酶抑制剂阻断，说明p d g f b b 促 c a 2 + 内流需要细胞内某些蛋白的磷酸化。 ( 5 ) 其它途径：可以引起受体自动磷酸化和在酪氨酸残基上的胞浆底物磷酸 化；还可以启动细胞核内c m y e ，c f o s ，c j u n 基因的转录，并使其水平升高， 继而激发与细胞分裂有关的各种转录调节因子的合成。 1 2e p i r e g u l i n 的研究背景 1 2 1e g f 家族 ( 1 ) e g f 的结构和生物学作用 1 9 6 2 年c o h e n 在研究神经生长因子的过程中发现在小鼠下颔下腺的提取物中 存在某种多肽，能够促进小鼠眼睑张开和门牙长出的提前。他们纯化了这种物质 后进行了序列测定，发现这是一种新的5 3 氨基酸残基的蛋白分子，根据其能促进 表皮的生长而命名为表皮生长因子( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ，e g f ) 。后来又从人 的尿液中纯化得到人体形式的e g f ，称为尿抑胃素2 4 彩】。e g f 的m r n a 大约 4 8 k b ，编码一个1 2 1 7 氨基酸残基的大分子蛋白前体，在这个庞大的蛋白质中除 e g f 自身外另有8 段与e g f 高度同源的序列。前体在结构上类似于一个跨膜受体， 一般认为e g f 就是在膜表面通过蛋白酶水解后由前体加工而来【2 6 1 。e g f 在多种组 织中有表达，包括颌下腺、鼻腔浆液腺、胃、十二指肠腺、垂体前页、骨髓，汗 腺，乳腺，卵巢，子宫和胎盘等【2 7 1 。 e g f 通过专性结合其细胞表面受体( e g f r ) 使受体自身磷酸化，激活g 蛋白 和磷脂酶c 等一系列生化反应将信息传递至细胞内，改变细胞内的钙浓度，促进 糖酵解、蛋白质合成、r n a 和d n a 的合成，从而刺激细胞增殖，调节细胞分化， 在某些条件下还能引起j 下常细胞的转化【2 8 】。它所表现的多样化的生理功能使其成 为首先试用于临床的生长因子之一。研究表明，h e g f 可刺激表皮和内皮细胞、成 5 p d g f - b b 通过诱导e p i r e g u l i n 表达促进血管平滑肌细胞增殖 纤维细胞和毛细血管生长，因而能促进烧伤、创伤和外科伤口的愈合、加速移植 表皮的生长；e g f 也可促使角膜上皮细胞和实质细胞的生长，因而在多种角膜相 关疾病的治疗上取得显著效果；此外e g f 能够抑制胃酸的分泌，其用于肠胃道溃 疡、胃酸分泌过多症等疾病的治疗正在研究之中。 e g f 的诸多医学应用使其很早就成为基因工程研究的对象。1 9 8 4 年美国的 c h i r o n 公司应用酿酒酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 的a 因子指导合成和分泌h e g f ， 1 9 8 5 年同本东京大学和w a r k u n a g a 公司应用碱性磷酸酯酶的启动子和信号肽序列 在大肠杆菌中成功地分泌表达了h e g f l 2 9 】。 ( 2 ) e g f 家族成员的研究概况 在发现e g f 后的3 0 多年时间里，又先后发现了转化生长因子( t r a n s f o r m i n g g r o w t hf a c t o r a ，t g f a ) 、双向调节素( a m p h i r e g u l i n ，a r ) 、肝素结合的e g f 样生长 因子( h e p a r i n - b i n d i n ge g f l i k eg r o w t hf a c t o r ，h b e g f ) 、p 动物纤维素( b e t a c e l l u l i n ， b t c ) 、，神经调节素1 、2 、3 ( n e u r e g u l i n ，n r g l 、n r g 2 , n r g 3 ) 及表皮调节素 ( e p i r e g u l i n ，e p r ) 这样一些生长因子，大小都在5 0 8 0 个氨基酸。这些分子在一 级结构上相差甚大，但在空间结构上具有一定的保守性，含有核心序列 c x 7 c x 2 _ 3 g x c x l 0 - 1 3 c x c x 3 y x g x r c x 5 n o 其中完全保守的6 个半胱氨酸残基在分 子内部形成3 对二硫键。使得这些分子具有相似的空间构象，因而都能够与e g f 受体结合。现在已经把上述的这些分子归纳为一个家族，称为e g f 家族，代表了 生长因子研究的一个领域【3 0 】。一些蛋白含有一个或多个e g f 样结构域，它们属于 e g f 相关蛋白，包括：组织型纤溶酶原激活物、哺乳类凝血因子和x 、蛋白多 糖、血小板产生的与凝血有关的一些蛋白酶、l d l 受体和早期胚胎发育相关蛋白( 果 蝇中n o t c h 、s e r 、d e l t e 和a l i t 等基因的产物) 等。e g f 家族生长因子是一类具有 重要生物功能的中、低分子量蛋白质，对于这类蛋白质结构与功能的研究一直是 生物学领域中的一个热点。 1 2 2e p i r e g u l i n 的结构与功能 e p i r e g u l i n 是e g f 家族中最新发现的一个成员，是从鼠成纤维细胞来源的肿瘤 细胞系n i h 3 t 3 t 7 的条件培养基( c o n d i t i o n e dm e d i u m ) 中纯化出的e g f 相关性生长 调节多肽。由一条包含4 6 个氨基酸的单链组成，其氨基酸序列中有2 4 - - - - 5 0 与其 6 江苏大学硕士学位论文 它e g f 相关性生长因子的序列相同。t o y o d a 等人于1 9 9 5 年首先报导了从小鼠 n i h 3 t 3 的条件培养基中分离到该物质，两年后他们又克隆了人的e p i r e g u l i n 基因。 从已有的实验结果来看，e p i r e g u l i n 与e g f 类似具有多种生物功能，对其进行深入 研究很有价值【3 1 - 3 3 】。 通过n o r t h e r n 印迹分析表明c p i r e g u l i n 主要表达于正常组织中的外周血巨噬细 胞及胎盘中，在心肌有少量表达，在正常成人的骨髓、卵巢、小肠、结肠、肺及 肝脏中表达甚微，但它在上皮肿瘤细胞系中则表达最高【3 3 1 。这种表达特性与e g f 家族其他成员在正常和肿瘤细胞中的表达有着明显的不同，提示e p i r e g u l i n 在正常 细胞生长与发育的维持及肿瘤发展等生理病理过程中具有重要作用。成熟的 e p i r e g u l i n 是- - 4 6 肽，分子量5 2 0 0 d a ，从c d n a 序列来看，成熟分子是从一个1 6 2 肽 的前体加工而来。前体中有两段高疏水序列，推测为信号肽和跨膜区。e p i r e g u l i n 很可能是在膜上加工成熟的，这一点为e g f 家族成员所共有。n o r t h e nb l o t t i n g 的结 果表明e p i r e g u l i n 在成年小鼠的各种组织中都没有表达，仅仅是在小鼠胚胎期的前7 天有明显表达，以后就快速下降直至停止表达。对人e p i r e g u l i n 的相应研究也得到 了类似的结果，仅在胎盘和外周巨噬细胞中检测到印i r e g u l u n 的m r n a 。这一点与 e g f 家族的其它成员明显不同，暗示e p i r e g u l i n n - i 能在胚胎早期的生长发育中有重 要的调控作用。 e p i r e g u l i n 的引人注目之处是它的生物学功能，在各种上皮细胞来源的正常组 织及肿瘤组织中发挥重要作用，具有双重调节特性。能抑制某些肿瘤细胞的生长， 包括h e l a 、表皮鳞癌细胞a 4 3l 和肺癌细胞a 5 4 9 。而另方面又刺激成纤维细胞及 其它各种类型细胞包括b a l b c 3 t 3 细胞，鼠原代肝细胞及人主动脉平滑肌细胞的生 长。其中，e p i r e g u l i n 与表皮鳞状细胞癌a 4 3 1 细胞e g f r 的结合要i ：i , e g f 弱，但作为 鼠原代培养肝细胞及b a l b c 3 t 3 a 3 1 成纤维细胞的有丝分裂原，e p i r e g u l i n 却较e g f 的作用强有力【3 。t a k a h a s h i 3 4 】等证明e p i r e g u l i n 从粥样硬化形成因素刺激的血管 平滑肌细胞中释放，是血管平滑肌细胞去分化的主要自分泌和旁分泌因子，参与 粥样硬化血管重塑的过程。 1 3r n a 干扰技术 r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 是近几年才兴起的一种新技术，是正常 p d g f - b b 通过诱导e p i r e g u l i n 表达促进血管平滑肌细胞增殖 生物体内抑制特定基因表达的一种现象。它是指当细胞中导入与内源性m r n a 编 码区同源的双链r n a ( d o u b l e s t r a n d e dr n a ，d s r n a ) 时，该m r n a 发生降解而导 致基因沉默的现象【3 5 1 。从提出至今，虽然只有短短几年时间，但这项技术已应用 于多个领域，并取得了突飞猛进的发展。r n a i 没有传统化学疗法带来的毒副作 用，是一种有潜力的治疗手段。 1 3 1r n a 干扰技术的研究进展 r n a 干扰现象早在1 9 9 0 年就有报道，当时美国和荷兰的两个转基因植物实验 组在研究矮牵牛时，将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色 更深的花，结果出乎意料，非但没有出现深紫色的花朵，大多数花朵却成了杂色 甚至白色。当时人们认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基 因都失去了功能，并称这种现象是“协同抑制 【3 6 1 。1 9 9 4 年，c o g o n i 等m 在真菌 中发现了r n a 干扰现象，他将外源类胡萝卜素基因导入链孢菌，结果使转化细胞 中的内源性类胡萝卜基因受到了抑制，当时称这种现象为消除作用。1 9 9 5 年，康 奈尔大学的g u o 等 3 8 】尝试用反义rna 阻断线虫par 1 基因的表达，结果发现 反义r n a 和正义r n a 都阻断了基因的表达，人们对这种现象百思不得其解。直 到1 9 9 8 年，f i r e 等【3 5 】的研究才解释了这个奇怪的现象。他们的研究证明，在正义 r n a 阻断基因表达的试验中，真正起作用的是双链r n a ，并首次将这种现象称 为r n a 干扰。目前r n a 干扰现象已在许多生物中被发现【3 9 】。大量的研究表明， r n a 干扰现象广泛存在于真核生物体内，操纵着许多细胞功能，如参与细胞正常 的生长、发育调控、稳定转座子，同时调控机体抵御外来病毒的入侵【4 0 1 。r n a 干 扰研究已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿。 在正常生物体内，细胞内的双链r n a ( d s r n a ，3 8 个碱基以上) 在依赖a t p 的情况下，被核糖核酸酶d i c e r 切割成双链小干扰r n a ( s i r n a ，1 9 2 3 个碱基) 。 s i r