（化学专业论文）酶促化学法合成手性吗啉酮类凝血酶抑制剂研究.pdf

摘要 摘要 凝血酶抑制剂在心脑血管疾病的预防和治疗中发挥着重要作用，而抗凝药物 的母核以及生物活性基团都是杂环。对杂环化合物绿色合成方法的研究一直是有 机合成的热点。本论文研究了吗啉酮化合物合成反应的区域选择性和酶促水解反 应的立体选择性调控，探索了手性吗啉酮凝血酶抑制剂的酶促化学合成新方法。 论文研究发展了多步串联一锅法合成吗啉酮化合物的方法，通过反应介质 的选择实现合成吗啉2 酮化合物和吗啉3 酮化合物的区域选择性调控。以取代 氨基醇和反丁烯二酸二乙烯酯为原料，在纯水中经串联反应合成1 3 种吗啉2 酮化合物；在有机溶剂体系中合成2 种吗啉3 酮化合物，并通过酯交换合成6 种吗啉3 酮酯类化合物。考察了不同取代基团、反应温度、有机溶剂等对串联 反应的影响，并探讨了串联成环可能的机理。 论文研究了酶促立体选择性水解吗啉3 酮甲酯分别制备光学活性俾) 和( 回 吗啉3 酮甲酯的方法，考察了酶源、溶剂体系、反应时间、添加剂等各种因素 对水解的影响。结果表明：在甲基叔丁基醚水的混合体系，c a l b 催化水解反 应获得( r ) 一吗啉3 酮甲酯，e e 值9 1 ；在纯水介质中，c r l 催化水解反应获得 吗啉一3 一酮甲酯，e e 值为9 4 。当纯水介质中添加2 0 丙三醇，反应时间由 1 9 2h 缩短至4 8h ，e e 值也提高到9 9 以上。论文还考察了6 种不同离去基团吗 啉3 一酮酯的酶促水解，结果显示吗啉3 一酮甲酯的水解速度最快、选择性高。 论文建立了酶促化学合成手性凝血酶抑制剂的方法。以苄基氨基乙醇和马 来酸酐为起始原料合成苄基吗啉3 酮2 乙酸甲酯，经酶促水解制备光学活性 吗啉3 酮羧酸；通过e d c h o b t 缩合体系，羧酸与4 氰基苄胺缩合，再经过p i n n e r 合成法制备了( r ) - n - 苄：基吗啉3 酮2 乙酰( 4 一脒基) 苄胺。研究优化了合成路线，并 考察了底物结构、溶剂、缩合剂等因素的影响。 论文共合成了2 9 种化合物，其中1 3 种吗啉一2 酮化合物，1 2 种吗啉3 酮化 合物，2 种n - m i c h a e l j g 成产物，1 种- 酰胺化直链产物，1 种凝血酶抑制剂，产 物经1 i t - n m r 、1 3 c - n m r 、e s i m s 、f t i r 、i r 等手段表征分析和确证，证实2 6 浙江大掌硕士学位论文 种是新化合物。 关键词：取代氨基醇，吗啉酮，选择性，酶促化学法合成，凝血酶抑制剂 摘要 a b s t r a c t t h r o m b i ni n h i b i t o rp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ep r e v e n t i o na n dt r e a t m e n to f h e a r ta n db r a i nv a s c u l a rd i s e a s e s m o t h e rn u c l e u sa n db i o a c t i v eg r o u p si nt h em o s to f a n t i c o a g u l a n td r u g sa r eh e t e r o c y c l e s t h eg r e e na n de c o n o m i c a ls y n t h e s i so f h e t e r o c y c l i cc o m p o u n d sh a sb e e nah o ts p o t i no r d e rt oe x p l o r ean e wr o u t eo f e n z y m a t i c c h e m i c a ls y n t h e s i so fc h i r a lt h r o m b i ni n h i b i t o rb a s e do nm o r p h o l i n e o n e ， w eh a v es t u d i e dt h e r e g i o s e l e c t i v es y n t h e s i s a n d e n z y m a t i c r e s o l u t i o no f m o r p h o l i n e o n e t h i s p a p e r h a s e x p l o r e dm u l t i s t e po n e - - p o ts y n t h e s i s o fm o r p h l i n o n e h e t e r o c y c l e si n as i m p l ea n de f f i c i e n tm e t h o d as e r i e so fm o r p h o l i n e 一2 一o n ea n d m o r p h o l i n e 3 o n ed e r i v a t i v e sw e r es u c c e s s f u l l yo b t a i n e dw i t hh i g hr e g i o s e l e c t i v i t y b yc h o i c eo fs o l v e n t 1 3m o r p h l i n 一2 - o n ed e r i v a t i v e sw e r es y n t h e s i z e df r o mt h e a m i n o e t h a n o lw i t hd i v i n y lf u m a r a t ei nw a t e r t h ei n f l u e n c eo ft h er e a c t i o nc o n d i t i o n s a n ds u b s t a r t es t r u c t u r eo nt h et a n d e mr e a c t i o nw a ss y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e d a m e c h a n i s mo ft h e r e g i o s e l e c t i v es y n t h e s i s w a s p r o p o s e d a n dd e m o n s t r a t e d e x p e r t i m e n t a l l y n - b e n z y l - - m o r p h o l i n e 3 - o n ec o m p o u n d sw e r es y n t h e s i z e df r o mt h e a m i n o e t h a n o la n dm a l e i c a n h y d r i d e i n o n e p o t a f t e rt r a n s e s t e r i f i c a t i o n ，6 m o r p h o l i n e 一3 一o n ee s t e r sw e r ep r e p a r e d i nt h i s p a p e r ，a ne n z y m a t i cr e s o l u t i o ni sd e v e l o p e dt op r e p a r eh i g ho p t i c a l a c t i v i t y 俾) a n d ( 研- m o r p h o l i n e 一3 一o n em e t h y le s t e r t h ee f f e c t so fe n z y m es o u r c e ， m e d i a ，a d d i t i v e s ，a n dr e a c t i o nt i m eo ne n a n t i o s e l e c t i v i t ya n dr e a c t i o nc o n v e r s i o no f t h ee n z y m a t i cr e s o l u t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d ( r ) 一m o r p h o l i n e 一3 一o n em e t h y le s t e rc o u l d b eo b t a i n e dw i t h91 e ev a l u ei nt h em i x t u r eo fm e t h y l t e r t i a r y b u t y le t h e ra n dw a t e r a t2 5o cc a t a l y z e db yc a l b ( 回- m o r p h o l i n e 一3 - o n em e t h y le s t e rw i t h9 4 e ev a l u e i np u r ew a t e rw a so b t a i n e di nt h ep r e s e n to fc r l a f t e ra d d i n g2 0 g l y c e r o l ( v v ) i n t h es y s t e m ，t h er e a c t i o nt i m ew a ss h o r t e n e df r o m19 2ht o4 8h ，a n de ev a l u ea l s ow a s i n c r e a s e dt o9 9 f u r t h e r m o r e ，6d i f f e r e n tt y p e so fl e a v i n gg r o u po nt h ee n z y m a t i c h y d r o l y s i sw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a th i g he n a n t i o s e l e c t i v i t yw a so b t a i n e d w h e nm o r p h o l i n e - 3 - - m e t h y lk e t o n e c o m p o u n dw a s u s e da st h es u b s t r a t ef o r i i i 浙江大学硕士掌位论文 h y d r o l y s i s t h ee n z y m a t i c c h e m i c a ls y n t h e s i so fo p t i c a l l yc h i r a lt h r o m b i ni n h i b i t i o nw a s e s t a b l i s h e ds u c c e s s f u l l y a f t e rt h eo p t i m i z a t i o no fs u b s t r a t es t r u c t u r e ，r e a c t i o nm e d i a a n dc o n d e n s a t i o n a g e n t s ，r a c e m i c ( 4 一b e n z y l 一3 一o x o m o r p h o l i n 一2 一y 1 ) - a c e t i c a c i d m e t h y l e s t e rw a s f i r s t l ys y n t h e s i z e d i n o n e - p o t a n dt h e o p t i c a lp u r e m o r p h o l i n e 一3 - c a r b o x y l i c w a s o b t a i n e d b y t h e e n z y m a t i c r e s o l u t i o n ( r ) - n - b e n z y l - m o r p h o l i n e - 3 - o n e 一2 - a c e t y l - ( 4 一g u a n y l 一) b e n z y la m i n ew a ss y n t h e s i z e d b ya m i d a t i o na n dp i n n e rr e a c t i o n i nt h i st h e s i s ，2 9c o m p o u n d sw e r es y n t h e s i z e d ，i n c l u d i n g13m o r p h o l i n - 2 - o n e a d d u c t s ，12m o r p h o l i n 一3 - o n ea d d u c t s ，2n - m i c h a e la d d u c t s ，1a m i d a t i o na n d1 s p e c i e so ft h r o m b i ni n h i b i t o r t h e s e 1 h - n m r ，1 3 c - n m r ，f t i r ，e s i m s c o n f i r m e d c o m p o u n d sw h i c hw e r ec h a r a c t e r i z e db y a n di r ，2 6n e wc o m p o u n d sh a v e b e e n k e y w o r d s ： n - s u b s t i t u t e d a m i n o a l c o h o l s ，m o r p h o l i n e o n e ，s e l e c t i v i t y , c h e m - e n z y m a t i cs y n t h e s i s ，t h r o m b i ni n h i b i t o r i v 浙江大学硕士掌位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：叶盔嗣 签字日期： 2 口扣年弓月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘鲎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝垄盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：1 叶瑰只4 签字同期：2 0k 年弓月7 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 新签名：爿撕多 _ 夸 签字日期：洲口年罗月罗日 邮编： 电话： 第一章绪论 第一章绪论 凝血酶是一个类似胰蛋白酶的丝氨酸蛋白，它包括多肽链a ( 含有3 6 个氨 基酸残基) 和b ( 2 5 9 个氨基酸残基) 【1 1 ，在生物体系起到凝血作用 2 1 。心脑血 管疾病是现代社会最为关注的多发疾病之一，其重要原因就是心脑血管中非正常 的凝血作用，诱发了一系列的心脑血管疾病，给人类带来痛苦。凝血酶抑制剂是 心脑血管疾病治疗的重要药物。因此，研究发展具有强抑制活性的凝血酶抑制剂 的合成方法与技术有非常重要的意义。 1 1 凝血酶抑制剂的研究 凝血酶抑制剂可分为直接凝血酶抑制剂和间接凝血酶抑制剂。其分子的母核 结构为杂环或者芳香环【3 ，4 ，5 ，6 1 ，主要包括四氢吡咯、二氢吡咯、吲哚啉、吲哚酮、 吗啉酮、苯酚、吡啶、吡啶酮、哌啶、哌嗪、六元环内酰胺、七元环内酰胺、苯 并垩嗪一3 一酮等。这类化合物分子含有能够和凝血酶三个活性部位( s 1 ，s 2 ，s 3 ) 对 应匹配的活性基团( p 1 ，p 2 ，p 3 ) ，其中p 3 是亲脂性基团【7 】p l 是含胍或脒亲电子 活性基团【8 l ，p 2 基团是凝血酶抑制剂的母核，因此p 1 ，p 2 ，p 3 三者的设计组合非常 重要。 凝血酶抑制剂的母核环可以通过小分子直链化合物经过关环而得到的，如 b o n j o c h 等 9 1 以l t y r ( o m e ) o h 为原料经过b i r c h 还原和n - m i c h a e l 加成、再用b n b r 处理，全合成得到十氢吲哚母核的铜绿菌素( a e r u g i n o s i n ) 族系凝血酶抑制剂； h a n e s s i a n 课题组【1 0 】则是以l 谷氨酸为基本原料，经过低温7 8o c l i h m d s 立体选 择性控制的烯丙基化、第一次关环、二次烯丙基化、g r u b b s 关环得到双环的十氢 吲哚啉化合物。d a h l g r e n 等【l l 】以光学纯苹果酸为原料，经过酯化、羟基烯丙基化、 烯丙基在四氧化锇作用下发生氧化、氨化、酰胺化关环得到c 一功能化的吗啉酮母 核环，再与b o c 保护0 9 4 脒基苄胺发生缩合反应，最后用h 2 p d c 去b o c 保护基，得 到一系列n 取代的吗啉酮母核环凝血酶抑制剂。还有一些母核环是通过芳香族环 状化合物或者环状氨基酸衍生化得到，如d 苯丙氨酸脯氨酸精氨酸( p p a c k ) 序 列的凝血酶抑制剂【5 ，6 】以及以此为模板的低分子肽凝血酶抑制剂，主要以脯氨酸或 浙江大学硕士掌位论文 其衍生物为原材料，再以肽键形式连接氨基酸或其衍生物；吡啶酮 1 2 , 1 3 、吲哚酮【1 4 1 等母核是由吡啶和吲哚衍生化得到。 本论文的研究目的与内容 吗啉酮化合物具有很强的生物活性，是许多药物的药效团。吗啉2 酮和吗啉 3 一酮是比较常见的两种吗啉酮衍生物；n - 取代的吗啉酮母核环衍生物是一类重要 的凝血酶抑制剂。 本论文研究了吗啉酮化合物合成的新方法，并以吗啉酮甲酯为底物研究酶促 水解的立体选择性调控，还探索了手性吗啉酮凝血酶抑制剂的酶促化学合成新方 法，内容主要包括以下几个方面： ( 1 ) 合成了多种吗啉2 酮和吗啉一3 一酮化合物 研究氨基乙醇与反丁烯二酸二乙烯酯在纯水无催化剂条件的串联酯交换和 n - m i c h a e l 加成反应，合成吗啉2 酮化合物，并考察底物结构对串联反应的影响， 同时研究有机溶剂中的该串联反应，实现在有机溶剂中合成吗啉2 酮和吗啉3 一酮 化合物的选择性调控，提出了水相串联酯交换和n - m i c h a e l 加成反应的机理；研究 三步一锅法高产率合成单一吗啉一3 酮甲酯的方法，并考察一锅法合成的影响因素。 通过串联反应，建立吗啉酮化合物的简易制备方法，用于合成多种吗啉酮药物衍 生物。 ( 2 ) 研究了吗啉3 酮酯类化合物酶促水解的立体选择性调控 研究吗啉3 酮化合物酶促水解拆分的方法，通过对商品化脂肪酶的筛选，实 现酶促水解拆分的立体选择性调控，制备两种构型的手性吗啉3 酮化合物。同时 研究添加剂种类和用量对酶促水解效率的影响，考察溶剂、温度、含水量、酶量、 底物浓度、酯类离去基团对水解的影响。 ( 3 ) 探索了吗啉酮凝血酶抑制剂的酶促化学合成新方法 基于酶促水解制备的手性吗啉3 酮化合物，通过酰胺化连接活性基团，考察 酸和碱两种催化剂体系制备手性吗啉酮类凝血酶抑制剂。并从底物结构、溶剂、 第一章绪论 缩合剂等方面对合成路线进行优化和筛选，建立酶促化学法合成手性吗啉酮类凝 血酶抑制剂的方法。 浙江大掌硕士学位论文 参考文献 f 1 1 k i m b a l ls d ，c h a l l e n g e si nt h ed e v e l o p m e n to f o r a l l yb i o a v a i l a b l et h r o m b i na c t i v es i t e i n h i b i t o r s b l o o dc o a g u ，肋切d 正1 9 9 5 ，6 ：5l l 一519 2 1 c o l m a nr w ，c i o w e sa w ，g e o r g ej n ，h i r s c hj l ，m a r d e rv j ，o v e r v i e wo f h o m e o s t a s i s i nh e m o s t a s i sa n dt h r o m b o s i s b a s i cp r i n c i p l e sa n dc t i n i c a lp r n c t i c l i p p i n c o t t w i l l i a m s & w i l k i n s ：p h i l a d e l p h i a , 2 0 0 1 ：p p3 - l6 f 3 1 s c h e c h t e rl ，b e r g e ra o nt h es i z eo f t h ea c t i v es i t ei np r o t e a s e s b i o c h e mb i o p h y sr e sc o m m u n ， 1 9 6 7 2 7 ：1 5 7 1 6 2 f 4 1 s a n d e r s o np e j ，n a y l o r o l s e na m ，t h r o m b i ni n h i b i t o rd e s i g n c u r r m e d c h e m ，1 9 9 8 ，5 ： 2 8 9 3 0 4 5 1 k a h nm ，w i l k es ，c h e nb ，f u i i t ak n o n p e p t i d em i m e t i c so fb t u r n s ：af a c i l eo x i d a t i v e i n t r a m o l e c u l a rc y c l o a d d i t i o no f a na z od i c a r b o n y ls y s t e m za 脚c h e m s o c 1 9 8 8 1 1 0 ： 1 6 3 8 1 6 3 9 6 】k e t t n e rc ，s h a we ，d p h e p r o - a r g c h 2 c ! - 一as e l e c t i v ea f f i n i t yl a b e lf o rt h r o m b i n t h r o m b r e s ， 1 9 7 9 1 4 ：9 6 9 9 7 3 7 1 h a n e s s i a n ，s ：d e lv a l l e ，j r ：x u e ，y f ；b l o m b e r g ，n ，t o t a ls y n t h e s i sa n ds t r u c t u r a l c o n f i r m a t i o no f c h l o r o d y s i n o s i na za m c h e m s o c 2 0 0 6 ，1 2 8 ，( 3 2 ) ，1 0 4 9 1 - 1 0 4 9 5 8 1 h e l m u tm ，d o r i tb ，w 1 f r i e dh ，e ta i 0 r a l l ya c t i v et h r o m b i ni n h i b i t o r s p a r tl ：o p t i m i z a t i o n o ft h ep1 一m o i e t y b i o o r g m e d c h e m l e t t ，2 0 0 6 ( 16 ) ，1o ：2 6 4l 一2 6 4 7 【9 】v a i l s ，n ；l o p e z - c a n e t ，m ；v a l i r i b e r a , m ；b o n j o c h ，j ，t o t a ls y n t h e s i sa n dr e a s s i g n m e n to f c o n f i g u r a t i o no fa e r u g i n o s i n2 9 8 一a za 所c h e m s o c 2 0 0 0 ，l2 2 ，( 4 5 ) ，112 4 8 一l l2 4 9 【1 0 】h a n e s s i a n ，s ；m a r g a r i t a , r ；h a l l ，a ；j o h n s t o n e ，s ；t r e m b l a y , m ；p a r l a n t i ，l t o t a ls y n t h e s i s a n ds t r n c t u r a lc o n f i r m a t i o no f t h em a r i n en a t u r a lp r o d u c td y s i n o s i na ：an o v e li n h i b i t o ro f t h r o m b i na n df a c t o rv l l a ，a m c h e t ? 1 s o c 2 0 0 2 1 2 4 ：1 3 3 4 2 1 3 3 4 3 【ll 】d a h i g r e n ，a ；j o h a n s s o n ，p o ；k v a r n s t r o ，i ；e ta 1 n o v e lm o r p h o l i n o n e b a s e dd - p h e p r o - a r g m i m i c sa sp o t e n t i a lt h r o m b i ni n h i b i t o r s ：d e s i g n s y n t h e s i s a n dx r a yc r y s t a ls t r u c t u r eo fa n e n z y m ei n h i b i t o rc o m p l e x b i o o r g m e d c h e m ，2 0 0 2 1 0 ：1 8 2 9 1 8 3 9 【1 2 1 h a n e s s i a n ，s ，s i m a r d ，d ，b a y r a k d a r i a n ，m ，e ta l ，d e s i g n ，s y n t h e s i s ，a n dt h r o m b i n - i n h i b i t o r y a c t i v i t yo fp y r i d i n 一2 一o n e sa sp 一2 p 3c o r em o t i f s 。b i o m e d c h e m l e t t ，2 0 0 8 ，l8 。( 6 ) ，19 7 2 19 7 6 1 3 1 h a n e s s i a n ，s ，t h e r r i e n ，e ，z h a n g ，j b ，e ta 1 ，f r o mn a t u r a lp r o d u c t st oa c h i r a ld r u gp r o t o t y p e s ： p o t e n tt h r o m b i ni n h i b i t o r sb a s e do np 一2 p 一3d i h y d r o p y r i d - 2 o n ec o r em o t i f s b i o m e d c h e m l e t t ，2 0 0 9 ，l9 ，( 18 ) ，5 4 2 9 5 4 3 2 f 14 1 h a n e s s i a n ，s ：s a i l e s ，h ：m u n r o ，a ：e ta l ，s y n t h e s i so f d i v e r s e l yf u n c t i o n a l i z e d i n d o li z i d i n o n e sa n dr e l a t e db i c y c l i cl a c t a m su s i n gi n t r a m o l e c u l a rg r u b b so l e f i nm e t a t h e s i sa n d d i e c k m a n nc o n d e n s a t i o n o r g c h e m 2 0 0 3 ，6 8 ，( 1 9 ) ，7 2 1 9 7 2 3 3 4 第二章凝血酶抑制5 9 j - - 与 合成方法研究进展 2 1 引言 第二章凝血酶抑制剂与合成方法研究进展 血栓症是由于血管内部的凝结和血小板聚集造成的，是当前国内外常见的致 死病。这类病症通常表现为心肌梗塞、脑中风、静脉血栓、肺栓等。据美国心脏 联合协会( a m e r i c a nh e a r ta s s o c i a t i o n ) 估计，在美国5 4 的死亡是由心血管疾病造 成的，据不完全统计，血栓症及其并发症在美国每年造成大约2 0 0 万人死亡。而 在发展中国家，由于生活方式的改变，血栓症引起的相关生理系统紊乱也在逐年 增加。由于血栓症的高发病率和高死亡率，治疗成本也相当高【l 】。因此，寻找抗血 栓形成的药物具有非常重要的意义。 酶催化反应条件温和，而且具有高效性、高选择性和催化多功能性的特点， 一些酶促反应已经成功的应用于工业制备和生产。经过几十年的发展，酶促参与 的有机合成被越来越多的化学家们重视。为了提高酶促反应的选择性，达到对底 物定点、定向的衍生化，化学工作者们进行了深入的研究。在药物的研究开发领 域，药物的结构和光学活性对药效的发挥起着决定性的作用，而酶促反应由于其 显著优势受到越来越多的重视。 2 2 凝血过程 生理系统的止血是机体防卫血管受损而引起的一系列不受控制的出血复杂过 程【2 1 ，止血的机理通常可以简单描述为以下四个步骤：受到损害的血管痉挛；迅速 形成短期的血小板栓塞；形成强的纤维蛋白凝结物( t h r o m b u s ) ；凝聚物的溶解 ( f i b r i n o l y s i s ) 。 临床和实验研究发现，血管受损、血液凝结过快、血液郁积凝滞是形成血液 凝结物和血栓的主要原因【3 】。m o r a w i t z 在1 9 0 3 年第一次提出了一个血液凝结的可 能途径。高等生物体内血液凝聚过程的两项机制是内源途径1 4 1 ( i n t r i n s i cp a t h w a y ) 和外源途径【5 l ( e x t r i n s i cp a t h w a y ) ，这两条途径的区别在于：内源途径是血液中出 现所有的因子，而外源途径依赖于受损组织和细胞释放促凝血酶源激酶。凝血过 浙江大掌硕士学位论文 程示意图如图2 - 1 所示。 当血管外部或组织受到损伤时，血管会立即发生收缩反应以减少血液流失， 同时血小板会粘附在受损部位。血浆蛋白桥联激活血小板和内皮下层，而纤维蛋 白原桥联相临近的活化的血小板，它们共同作用形成血栓，同时激活的凝结因子 通过一系列的纤维蛋白形成的反应相互作用，加强血栓的形成。 当机体受到损伤时，组织因子脱辅基蛋白( t f ) 在c a 2 + 和磷脂推动下使v i i 因 子活化为激活 - 子( f v i i a ) ，然后f v i i “t f 复合物使x 因子活化为n - 子- ( f x a ) 【6 1 ， f x a 汇聚于内源途径促使凝血酶酶原最终转化为凝血酶，促使纤维蛋白原转变为纤 维蛋白。 e x t r i n s i cp a t h w a y 图2 - 1 凝血过程示意图 f i g u r e2 - 1 s c h e m a t i co v e r v i e wo ft h eb l o o dc o a g u l a t i o nc a s c a d e 血液介质的内源激活途径中，因子f x i i a 激活f x i 转变为f x i a ，也使激肽释放 酶原，并使高分子激肽原活化。f x i a 和c a 2 + 同时作用使f i x 被激活转变为f i x a ，而 i x a 协n f v i i a 、c a 2 + 和磷脂使因子x 被激活转变为f x a 。新形成的f x a 与f v a 、c a 2 + 和 磷脂形成一个接一个的复合物，促使凝血酶原转变为凝血酶，继而凝血酶使可溶 性的纤维蛋白原形成纤维蛋白。在f x i i a 和c a 2 + 的作用下【7 1 ，纤维蛋白单体交联成 聚集体。到目前为止，组织凝血和血栓形成的的途径有三种：a 通过阻止纤维蛋 白的形成；b 通过阻止血小板的粘附和活化；c 通过改进纤维蛋白的溶解途径。 凝血酶是体内最强的血小板聚集剂，当它在体内被激活后，能够促使血小板释放 5 羟色胺、a d p 、血栓素等，进一步激活血小板，正反馈凝血过程，放大血小板的 聚集作用。 6 第二幸凝血h 单剂与音成方法研究遵晨 2 , 3 凝血酶 凝血酶是一个类似胰蛋白酶的丝氨酸蛋白【埘，它是凝血和形成血栓的关键因 素。凝血晦包含多肤链a ( 舍有3 6 个氨基酸残基) 和b ( 2 5 9 个氨基酸残基) 它们由二硫键连接。它能够分解纤维蛋白原形成纤维蛋白肽a 和b 从而产生纤维蛋 白。研究发现，凝血酶不仅在血液凝结中发挥重要作用，它对血小板内皮细胞、 平滑肌细胞、白细胞、心脏和神经细胞也有较强的生理效应嘲 在生理平衡条件下，正常的机体组织在凝血酶作用下形成的血栓对有机体是 有保护作用的，但是如果生理平衡由于病变或其它原因被打破，在心脏或者血管 组织内形成血栓，就会引起组织器官变坏、萎缩甚至坏死，血栓如果脱落形成栓 子随血液漂流到重要的器官如心脏、肺、脑等部位，就会引起栓塞，严重时导致 死亡 凝血酶与抑制剂的晶体结构图提供了抑制剂与凝血酶活性部位相互结合作用 的非常有价值的信息1 q ”，m ，如图2 2 所示是凝血酶活性口袋的平面图，它可能的 主要活性部位如下呱1 1 ： 1 ) 特异性识别部位s l ：s 1 位于活性口袋底部，! 由a s p l 8 9 残基组成，可识别氪 基、胍基、脒基等碱性基团口1 ) 并与其发生强烈离于作用，而口袋中的丙氨酸残基 1 9 0 , 黾凝血酶区别于胰蛋白酶的特异性基团s c r l - h i s 5 7 - a s p l 催化三元组形成的 氧穴加强了与亲电基团的结合。 图2 - 2 凝血酶的空问结构图 f i g u r e 2 - 2f r o n t v i e w t o w a r d t h e t h r o m b i n m o l e c u l e 2 ) 活性部位s 2 ：由1 p6 0 a 和t r p6 0 d 的倒链组成的1 护p 持一p r 0 _ 1 即插入式 浙江大掌硕士学位论文 环装物、h i s5 7 的咪唑结构物、l e u9 9 的异丁基团形成，是最接近袋口的憎水口 袋，能够和亲脂基团( p 2 ) 发生强烈的结合作用。 3 ) 活性部位s 3 ：位于末端的这个s 3 口袋比s 2 口袋要大，i 扫l e u9 ，i l e1 7 4 和 t r p 2 1 5 的侧链组成，和憎水基团( p 3 ) 主要以范德华力结合。 基于以上对凝血酶活性部位的阐述，要达到对凝血酶的直接抑制作用，所设 计的抑制剂就必须具备在这三个口袋中能与凝血酶相互作用的活性基团( p 1 ，p 2 ， p 3 ) ，使酶丧失与纤维蛋白原底物结合的能力，从而起到抑制作用。 2 4 凝血酶抑制剂 凝血酶抑制剂二二二二：二三二戛三；兰兰三二。对刚a的抑制剂， 第二章凝血酶抑制剂与合成方法研究进展 测等【2 0 ，2 1 , 2 2 1 。因此，寻找和研究能够直接高选择性的抑制凝血酶的药物具有非常 重要的意义。 直接凝血酶抑制剂能够直接抑制纤维蛋白结合凝血酶【2 3 ，2 4 , 2 5 1 ，抑制剂与酶的 结合速度很快，半衰期短。口服凝血酶抑制剂的血浆浓度和剂量呈线性关系，抗 凝效果也因此与剂量成正相关。直接凝血酶抑制剂具有以下4 个优点：1 ) 它们不 会与血浆蛋白结合，其活性不受血浆蛋白浓度和种类的影响，因此它们的抗凝效 果不会因为患者个体差异而发生变化，用药也不需要随时监测；2 ) 它们既灭活游 离的凝血酶又可以灭活与纤维蛋白原结合的凝血酶，因此抑制血栓生长的效果明 显比比肝素要好；3 ) 它们不会结合血小板因子，因此不会减少血小板的量；4 ) 它 们的抗凝作用与维生素k 没有必然联系，因此不受患者摄入食物的影响。另外药物 本身相互影响很小。 随着人们对直接凝血酶抑制剂的认识逐渐深入，它们应用于临床的实例也在 不断增多。由于这类药物对正常凝血功能的影响很小，不会明显增加出血的风险， 安全性与间接凝血酶抑制剂相比更具有可测性。 如图所示，直接凝血酶抑制剂包括天然凝血酶抑制剂和合成凝血酶抑制剂两 大类。对于合成的凝血酶抑制剂，本章将从对f i i a 和f x a 这两大因子的抑制剂进 行论述。 1 9 5 7 年m a r k w a r d t 等报道的从药用水蛭唾腺中成功分离得到的的水蛭素是研 究最早的天然凝血酶抑制剂【2 6 1 。天然水蛭素是一条含有6 6 个氨基酸残基组成的单 键多肽，分子量约为7 0 0 0 。其n 端有三对二硫键( c y s 6 一c y s l 4 ，c y s l 6 c y s 2 8 ， c y s 3 2 c y s 3 9 ) ，使n 末端的肽链绕叠成密集形核心环肽结构，这是水蛭素的核心区 域；c 端富含酸性氨基酸残基，可阻断凝血酶与纤维蛋白原的识别位点，产生抗凝 作用。天然水蛭素第6 3 位的酪氨酸残基被硫酸化，而重组水蛭素没有这个特殊的 结构，因此后者抗凝比活性有所下降。水蛭素肽链中部有一个i 白p r o l y s p r o 组成的 特殊序列，一般蛋白酶不会使其降解，这一结构有两方面作用：1 ) 水蛭素分子的 稳定性；2 ) 水蛭素以正确的方向与凝血酶分子结合。水蛭素的临床应用范围很广， 但出血的不良反应发生率也较高，目前利用基因工程通过大肠杆菌、酵母菌等表 达产生的重组水蛭素的出血不良反应发生率较水蛭素明显降低，使其临床应用得 到了进一步推广水蛭素、重组水蛭素和凝血酶几乎是不可逆结合来发挥它的抑 制作用。但水蛭素口服吸收程度差，目前临床应用主要通过静脉注射，半衰期为 9 浙江大掌硕士学位论文 6 0m i n ，大约9 0 左右以原形形式经肾排泄出去。 在过去的十年中，抗凝药物制剂的研究增长十分迅速，尤其在药物的临床前 期和临床应用的研究上更是迅猛发展。抗凝制剂对凝血过程的特定凝血因子的选 择性抑制程度高，目前研究最为广泛的是对f x a 和f i i a ( 凝血酶) 的抑制药物。这类 药物的分子量小，它们不仅会对其他凝血因子起到抑制作用，而且当它们与血栓 结合后还可以在血浆中自由的循环流通。在临床抗凝药物的发展过程中1 2 7 】，大约 有7 0 是对f x a 的抑制剂，而只有3 0 是对f i i a ( 凝血酶) 的抑制剂。如图2 3 所示， f x a 是内源激活和外源激活途径的交点。通过阶梯式激活凝血酶酶原形成凝血酶。 因此，低分子量凝血酶抑制剂，不仅直接抑制凝血酶的活性，还可以是抑制关键 的激活因子f x a 等，破坏阶梯式激活途径，直接组织凝血酶的生成。而且，目前 。 研究的结果表明，凝血酶是丝氨酸蛋白酶的一种，在人体众多的丝氨酸蛋白酶中， 要直接抑制凝血酶的活性，难以达到高选择性抑制的目的，也存在药物口服活性 低、用药要随时监控以免引起大量出血的缺陷。对f x a 的研究正是为了避免这些问 题的发生。 n i 秭a “ t f v a m 哪她b 之二二慧雾 i v ai 垒呈! 苎兰垒苎旦 l 图2 - 3 抗凝血药物的作用机理 f i g u r e2 - 3 n e wa n t i c o a g u l a n ta g e n t s ：m e c h a n i s m so f a c t i o n 2 4 1 f i i a 抑制剂 为了提高针对凝血酶区别于其他丝氨酸蛋白酶的选择性和在血浆中的稳定 性，越来越多的凝血酶抑制剂化合物被设计为能与凝血酶活性部位可逆结合。这 类抑制剂化合物具有由一组亲电子基团形成丝氨酸圈闭形式的催化三元组，能够 和酶的活性部位结合，这些亲电子基团通常是酮类、酮酯类、二酮类、酮酰胺类、 羰基杂环类、有机硼酸类、有机膦酸类【2 9 ，3 0 , 3 1 1 ，它们可以和丝氨酸羟基以半缩醛 第二章凝血酶抑制剂与合成方法研究进展 形式结合，从而达到抑制酶的效果。 1 五元环母核 l i e m 等1 9 7 4 年研究报道了精氨酸和色氨酸残基在s 1 口袋与凝血酶活性部位 的特异性结合，而且只有小分子的缩肽在这个特异性1 3 袋才能提高抑制剂对凝血 酶的选择性；k e t t n e r 和s h a w 在1 9 8 1 年的研究中，叙述了脯氨酸作为p 2 活性基团 与凝