（应用化学专业论文）葡萄糖母液色谱分离填料的合成及其分离性能研究.pdf

摘要 采用折光仪和高效液相色谱法分析得到了葡萄糖一母液总糖含量为4 5 l o o m l ，葡 萄糖含量商达8 5 。 采用分散聚合方法合成了具有交联结构的苯乙烯一二乙烯苯基体树脂，然后基于此 填料磺酰化得到离子交换树脂，研究了色谱分离提取结晶葡萄稽母液中葡萄糖的色谱填 料。采用正交实验初步考察了不同因素对微球粒径和分离效果的影响。通过自行装分析 柱考察了其色谱分离性能，最终优化得到了合成钙离子螯合树脂所需的反应条件：交联 度1 5 ，致孔剂配比3 ：1 ，致孔剂用量5 0 。实验证明：自装柱性能良好，葡萄糖和 二糖分离度达到1 4 5 ，适宜分离提取葡萄糖母液中的葡萄糖。 采用自合成钙型螯合树脂装制备柱，对柱温、柱长径比、进料量、洗脱速度等操作 因素进行了分离条件优化。在优化条件柱温：6 0 ；柱高：6 0e m ；迸料量：1 0i i i l ； 洗脱速度：2 0m l m i n 下，对葡萄糖结晶母液进行分离，得到了纯度大于8 4 ，收率大 于9 5 的葡萄糖组分。 采用高效液相色谱法，双柱定性( 氨基键合柱和离子交换柱) ，外标定量分析葡萄糖 二母液( s m b 分离后母液) 中的低聚糖组分及其含量，分析得知二母中总糖含量达4 g l o o n i l ，其中异麦芽糖含量高达3 7 。 应用硅胶的氨基键合改性方法，研究分离提取葡萄糖母液中低聚糖组分中的同分异 构体的工业色谱填料。采用正交实验初步考察了不同因素对键合量和分离效果的影响。 经红外光谱、元素分析对键合相鉴定和评价，并且考察了该键合相的p h 适用范围。通 过自行装分析柱考察了其色谱分离性能。优化后得到分离提取异麦芽糖的填料合成条 件：y 一氨丙基三乙氧基硅烷用量为l _ 0 倍的硅胶，溶剂甲苯用量是硅胶的1 0 倍，反应 时间为1 6 小时。结果表明：改性后硅胶键合相具有较好的色谱性能，麦芽糖和异麦芽 糖之间的分离度达到1 2 3 ，且在p h 2 1 2 之间稳定性能良好，可以有效分离低聚塘中的 同分异构体。 采用自合成氨基硅胶装制备柱，在一定的分离条件下对互为同分异构体的麦芽糖和 异麦芽糖进行分离，能够得到纯度大于8 2 ，收率大于9 7 的异麦芽糖。 关键词：结晶母液，离子交换柱，氨基柱，固定相，分散聚合，改性，键合量，正交实 验，分离 a b s t r a c t c r y s t a l l i z e d m o t h e rl i q u o ro fg l u c o s ew a sa n a l y z e db yh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) o na ni o n e x c h a n g ec o l u m n t h er e s u l t si n d i c a t et h a tm o t h e rl i q u o r ic o n t a i n so v e r4 5 9 1 0 0 m ls u g a rc o m p o s i t i o n s ，a n dt h ep u r i t yo f g l u c o s ei so v e r8 5 i no r d e rt oe x t r a c tg l u c o s ef r o mi t sc r y s t a l l i z e dm o t h e rl i q u o r , as p e c i a lk i n d o f c a t i o n - e x c h a n g er e s i n , w h i c hh a st h ep r o p e r t yt oa d s o r bg l u c o s es t r o n g l yw h i l et h eo t h e r i m p u r i t i e sw e r ew e a k l yr e t e n t a t e dw a ss y n t h e s i z e db yn s t h er e s i nw a sp r e p a r e du s i n g d i s p e r s ep o l y m e r i z a t i o nm e t h o db a s e do nt h es t r u a t u r eo fp o l y ( s t y r e n e - - d i v i n y l b e n z e n e ) w i t hc r o s s l i n k e ra n ds u l p h o n i ca c i da sf u n c t i o n a lg r o u pa n dc 扩a st h ei n v e r s ei o n t h e i n f l u e n c e so fs y n t h e s i z e dc o n d i t i o n so nt h ed i a m e t e r sa n ds i z ed i s t r i b u t i o n so ft h e m i c r o s p h e r e s w e r e i n v e s t i g a t e db yo r t h o g o n a l _ d e s i g n i n g m e t h o d m e a n w h i l et h e m i c r o s p h e r e sw e r ep a c k e di n t oa n a l y t i c a lc o l u m n st o t e s tt h e i ra d s o r p t i o nc a p a c i t i e so n g l u c o s e t h er e s u l t sp r o v e dt h a tt h i sk i n do fa d s o r b e n tw a ss u i t a b l ef o rs e p a r a t i n gg l u c o s e f r o mt h em o t h e rl i q u i d t h eo p t i m u mo p e r a t i o nc o n d i t i o n s ，s u c ha so p e r a t i o nt e m p e r a t u r e ，t h er a t eo fl e n g t ha n d d i a m e t e ro ft h ec o l u m n , t h ea m o u n to ff e e da n dt h ef l o w r a t eo ft h ee l u e n t ) o fap r e p a r a t i v e c o l u m np a c k e dw i t ht h ec a 2 + r e s i nw e r ei n v e s t i g a t e d i ts h o w e dt h a tu n d e rt h eo p t i m u m c o n d i t i o n t h er e c o v e r yo f g l u c o s ew a so v e r8 4 a n dt h ep u r i t yi sm o r et h a n9 5 t h eo l i g o s a c c h a r i d e sw e r ef o u n di nt h ec r y s t a l l i z e dm o t h e rl i q u o ro fg l u c o s ea sw e l l h p l ci su s e dt oa n a l y z et h ec o m p o s i t i o no na ni o n - e x c h a n g ec o l u m na n dan h 2 一b o n d e d c a r b o h y d r a t ec o l u m n , r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t si n d i c a t et h a tm o t h e rl i q u o ri ic o n t a i n so v e r 4 9 1 0 0 m ls u g a rc o m p o s i t i o n s ，a n d t h ep u r i t yo f i s o m a l t o s ei so v e r3 7 i no r d e rt os e p a r a t ei s o m e r i cc o m p o u n d sf r o mf u n c t i o n a lo l i g o s a c c h a r d e s ，t h ep a c k i n g m a t e r i a l sw h i c hu s e di nc h r o m a t o g r a p h i ci n d u s t r i e sw e r ep r e p a r e db yt h em o d i f i c a t i o n f u n c t i o n a lg r o u pn h 2b o n d e do ns i l i c ag e l t h ei n f l u e n c e so fp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n so nn h 2 a m o u n ta n dt h es e p a r a t i o ne f f e c t sw e r ei n v e s t i g a t e db yo r t h o g o n a ld e s i g n i n gm e t h o d s t h e b o n d e dp h a s e so b t a i n e dw e r ec h a r a c t e r i z e db yi n f r a r e ds p e c t r u m ，e l e m e n t a la n a l y s i sa n dt h e c h r o m a t o g r a p h i cp e r f o r m a n c e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es t a t i o n a r yp h a s eh a de x c e l l e n t c h r o m a t o g r a p h i cp r o p e r t i e sa n dr e s i s t a n c et oh y d r o l y s i sb e t w e e np h 2 1 2 i tc o u l db eu s e d f o r t h ee f f i c i e n ts e p a r a t i o no f i s o m e r i cc o m p o u n d sf r o mo l i g o s a c c h a r d e s m a l t o s ea n di s o m a l t o s ew e r es e p a r a t e db yp r e p a r a t i v ec o l u m n sp a c k e dw i t l lt h e n h 2 - b o n d e ds e l f - p r o d u c e dr e s i n s u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n st h er e c o v e r y8 2 o f i s o m a l t o s e ( p l l r i t yo v e r9 7 、h a sb e e na c h i e v e d k e yw o r d s ：c r y s t a l l i z e dm o t h e r ，i o n e x c h a n g er e s i n , n h 2 - b o n d e dr e s i n , d i s p e r s e p o l y m e r i z a t i o n , m o d i f i c a t i o n , b o n d i n ga m o u n t ，o r t h o g o n a l _ d e s i g n i n gm e t h o d ，s e p a r a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其继人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位线证书而使用过的材料。 与我一间工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示落意。 签名： 日期：年月日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了懈江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保鼹并囊翼家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制乎段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容鄹纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 网期：姗) 辞 i 第一章绪论 第一章绪论 1 1 葡萄糖母液概述 1 1 1 葡萄糖的生产现状 1 8 0 1 年p r o u s t 首次从葡萄汁中结晶而得一晶体，将其命名为葡萄糖( g l u c o s e ) ， 1 8 1 1 年k i r c h h o f f 又用淀粉水解制得，1 8 6 6 年k o k u l e 发现其水溶液显示右旋性，故又 称右旋糖。葡萄糖是最普遍的单糖物质和重要的基础化学医药品，是人体及动物的主要 能源物质之一。工业上葡萄糖的生产是以淀粉为原料，采用酸法、酸酶法或双酶法水解 工艺。即糖化反应后，再经结晶、分离、干燥后制纠1 1 。酸解法制造的主要工艺流程： 淀粉一调浆一过筛一加酸一进料一糖化一放料一冷却一中和一脱色一压滤一糖液一分 蜜一干燥一成品。酶法制造流程：淀粉一淀粉乳一糖化一精制一蒸发一冷却结晶一分 蜜一干燥一成品。 1 1 2 葡萄糖母液的产生 在葡萄糖的生产过程中会产生大量的葡萄糖母液，通常母液的产出量为淀粉投料量 的2 0 9 6 左右。2 0 0 4 年全国结晶葡萄糖产量为9 0 万吨，每1 0 万吨结晶葡萄糖产生3 万吨葡萄 糖母液“1 。生产注射用葡萄糖产品，口服葡萄糖及工业葡萄糖均会产生葡萄糖母液。 葡萄糖母液，为深色的粘稠液，固含量7 0 8 0 9 6 ，p h 值4 0 4 5 。母液中除含有大量的 葡萄糖外，还有二糖、多糖等少量物质，它们的存在会严重影响母液中葡萄糖成分的再 次结晶，或使再次结晶所得的葡萄糖产品质量达不到要求。 葡萄糖母液中的糖分是很好的轻工及化工原料，这些葡萄糖母液如果不加合理利用 就会浪费宝贵的糖物质原料。所以开发利用葡萄糖母液就是节约粮食资源，这对于我们 这样一个人口众多、土地资源相对不丰富的国家来说，具有重大的意义。 1 1 3 葡萄糖母液的工业利用现状 1 1 3 1 葡萄糖的利用 生产注射糖所产生的母液，杂质含量较少，通过再次结晶回收可用于生产口服糖或 黄糖嘲。生产口服糖及工业糖所产生的母液，可采用复盐结晶法回收其中的糖分啪。 利用母液中的葡萄糖组分，在催化剂的作用下用硝酸及硫酸进行氧化反应，也可以 生产草酸伽。 利用葡萄糖母液中的葡萄糖组分，经化学反应可生产乙酰丙酸。母液固体物按一定 比例加入盐酸，进行加热水解反应。葡萄糖将脱水反应生成羟甲基糠醛，进而热分解生 成乙酰丙酸和甲酸。但是陕西省粮油科学研究院指出：甲酸是乙酰丙酸生产中的副产物， 酸性很强，有腐蚀性，是无色有刺激性气味的液体。在乙酰丙酸的生产过程中，甲酸的 回收问题有待进一步研究。 采用生物发酵的方法可以生产葡萄糖酸钙、谷氨酸、赖氨酸、酵母、柠檬酸等产品 。上海新立工业微生物科技有限公司利用葡萄糖母液直接深层发酵法生产柠檬酸：不 江南大学硕士学位论文 经任何预处理，不添加任何酸促进剂，直接发酵生产柠檬酸。这不失为一种比较好的利 用方法。 利用流加培养发酵生产红曲色素鲫。流加培养是指在培养过程中，向反应器内加入 一种或多种营养物质，直至得到最终产物。山东烟台大学以葡萄糖母液为原料，在生物 反应器中流加发酵生产红曲色素。 对于生产回溶糖及黄糖后所产生的母液，由于糖分更少，杂质含量更高，成分更为 复杂，目前其工业应用价值较低，只是用来生产焦糖“1 产品，或进行干燥处理后作为饲 料添加剂使用。采用葡萄糖母液生产焦糖的过程如下：先将母液浓缩，然后滴加氨水催 化剂加热反应，经冷却后即成为焦糖色素产品。 1 1 3 。2 二糖及多糖的利用 母液中葡萄糖和二糖占绝大部分，为了尽可能利用母液中的有效成分，有时须先对 母液进行预处理，利用重糖化反应，使绝大部分二糖及一部分多糖也糖化水解生成葡萄 糖，这样可有效地提高母液的利用效果“3 。葡萄糖母液预处理工艺如下：将母液加水调 整浓度，加入适量的工业盐酸，调节糖液p h 值，然后用蒸汽加热，使其糖化反应，糖液 的d e 值可达7 2 ，然后用碳酸钠溶液中和，除去表层油脂泡沫，再加入活性炭脱色处理， 经过滤后即得预处理后的葡萄糖母液。用处理好的葡萄糖母液作为原料，通过物理、化 学或生物发酵处理，可得到一些有价值的产品。 上述产品生产过程中用的催化剂是浓酸浓碱，它们的回收普遍存在着问题。而且生 产上述产品后，母液中的低聚糖还是没有利用，留在余下的母液中。 1 1 4 其他糖醇母液的工业利用 目前在木糖醇母液分离方面的研究可以值得借鉴。在玉米芯水解生产木糖工艺中， 母液中含有大量的葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、多糖和其他盐类等。经两次结 晶后得到的木糖产品纯度仍只有9 8 ，而且每生产1 吨木糖产品会产生1 4 吨木糖母液， 只能以木糖十分之一的价格出售，一般的分离技术根本无法完成如此复杂成分的提纯分 离工作。只有采用色谱技术方可同时分离提纯出木糖、葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖等， 这将会大大提高产品档次，降低生产成本。 在食品与医药方面的应用，对木糖酵的质量提出了较高的要求，国际标准为9 8 5 。 但在木糖醇的生产过程中，常含有1 0 左右的杂醇，主要是阿拉伯糖醇，该糖醇对人体 有副作用必须除去。 在目前的结晶生产工艺中，有大量的母液被废弃。经气相色谱分析，母液中含4 0 左右的木糖醇和3 0 左右的阿拉伯糖醇。净化液中含7 0 的木糖和2 0 0 , 6 的阿拉伯糖。因此 一研究这两种糖i 糖醇的分离具有较高的理论与应用价值f 吉林大学化学科学学院张锁秦 采用s m - 1 9 阳离子树脂作为固定相，蒸馏水为洗脱液，对工业生产的木糖酵母液及净化 液进行分离研究取得了很好的效果”1 。从分离结果可以得出：两种糖及糖醇的色谱行为 截然相反即在采用相同的固定相与流动相的条件下，分离木糖醇与阿拉伯糖醇时，阿 拉伯糖醇先被洗脱下来，木糖醇次之；而分离木糖与阿拉伯糖时，木糖先被洗脱下来， 2 第一章绪论 阿拉伯糖次之；从出峰时间上看，糖较糖醇更易于分离。 国外使用新型的分离技术如色谱技术于糖醇分离，已变得非常普遍，几乎为所有公 司采用。有些公司甚至专门从我国或其他地方收购纯度低的糖醇产品，通过色谱分离获 得高纯度产品高价销售。 1 1 5 葡萄糖母液中的低聚糖的价值 江南大学检测中心对某一葡萄糖母液进行了分析测试，得出其中各含量。分离前： 干物量5 2 ，单糖含量为7 8 ，二糖1 4 ，三糖4 ，四糖及以上3 。模拟移动床分离后： 葡萄糖4 9 ，麦芽糖1 2 ，异麦芽糖1 3 ，麦芽三糖1 ，潘糖1 0 6 ，异麦芽三糖0 4 ， 四糖以上1 4 。 我国功能性低聚糖的质量指标为：其中有效物含量不低于5 0 。如果母液所含的低 聚糖中异麦芽糖、异麦芽三糖等支链糖超过5 0 ，就可以不分离，作为功能性糖直接出 售。功能性低聚糖( 现在市场价格6 0 0 0 元吨) ，远远大于母液( 现在市场价格1 0 0 0 元 吨) 和上述应用中所得产品的价格。而生产上述产品过程中用的催化剂是浓酸浓碱，它 们的回收普遍存在着问题。若采用分离技术将母液进行分离纯化，尽可能去除杂质，除 去母液中葡萄糖和四糖以上成分，富集功能性二糖和三糖的含量，将会大大增加产品价 值。对于葡萄糖母液的分离研究不多，这方面的应用值得探讨。 。 1 2 低聚糖的概述 低聚糖( 寡糖) 一般是指由2 1 0 个相同的或不同的单糖以糖苷键连接起来的糖类 的总称0 1 。分子量3 0 0 2 0 0 0 ，介于单糖和多糖( 纤维、淀粉) 之间，又有二糖、三糖、 四糖之分。构成低聚糖的单糖主要是五碳糖和六碳糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、 阿拉伯糖、甘露糖等，这些单糖以直链或分支结构形成低聚糖“”。由于单糖分子结合的 。 位置和结合类型不同，低聚糖种类繁多，目前已知达1 。0 0 0 种以上，种类繁多，功能各 异。 根据低聚糖是否具有保健功能可以分为普通低聚糖和功能性低聚糖。普通低聚糖； 可被机体消化吸收，但不是肠道有益细菌双歧杆菌的增殖因子。如蔗糖、乳糖、麦芽糖、 麦芽三糖、麦芽四糖。功能低聚糖：在人体肠道中没有水解这些低聚糖的酶系统，因此 被人体消化而直接进大肠内优先为双歧菌利用，是双歧杆菌的增殖因子。 功能性低聚糖具有糖类的特效，可直接作为食品配料，其主要生理活性特点是： 难以被胃消化，但能被肠道吸收，甜度低，低热量，基本上不增加血糖血脂。 促进人体肠内双歧杆菌的增加，改善肠内细菌结构，抑制肠内有害菌及腐败物 质的形成，增加维生素含量，提高机体免疫能力。 防龋齿功能，新型低聚糖龋齿的链球菌作用，不被口腔中的酶液分解，因而能 防龋齿。 防止肥胖，低聚糖还有防止胆固醇蓄积，抗肿瘤，预防糖尿病等作用。 功能性低聚糖对于食品、化工、制药、饲料等行业有重要意义，是国内外食品、生 江南大学硕士学位论文 物、化学工业界研究的热门领域。 寡糖的结构如下： n 为聚合度，n = 3 1 0 在我国，功能性低聚糖，自1 9 9 6 年才有批量生产，目前年总产量达3 万吨左右，其 中万吨以上为低聚异麦芽糖，上千吨规模的是低聚果糖，其他品种如大豆低聚糖等产量 很少。在欧洲如荷兰、比利时、瑞典、英国均有大学和研究机构开展低聚糖的研究。在 这一领域，日本一直走在世界的最前沿，已经工业化的低聚糖有十多种，其主要被用作 功能性食品基料。功能性低聚糖附加值高，市场前景良好，有着极大的开发价值和推广 潜力。 1 2 1 低聚糖的检测分析 对于低聚糖的检测，由于其组成较为复杂且往往性质较为相近，其分析分离变得非 常困难，因此并不能用常规的化学法。可用于分析低聚糖的有纸色谱法1 、薄层层析法 “，气相色谱法“”以及液相色谱法等方法。这里主要介绍液相色谱法。 1 2 1 1 高效液相色谱法 1 9 9 8 年，全国食品标准化技术委员会将高压液相色谱法( h p l c ) 规定为功能性低聚糖 的测定方法“”。液相色谱分析低聚糖类化合物，国内外已经有很多报道“州。糖类化合 物近年来常用示差折光检测器直接测定，样品毋需衍生化。 q b t 2 4 0 1 - 2 0 0 0 中采用糖柱和氨基柱双柱定性，外标定量法来分析分离低聚糖。根 据保留时间用归一化法或者外标法定量。高效液相色谱分析糖类化合物流动相一般为水 和乙腈、甲醇的二元混合溶液或三元混合溶液。溶液配比视组分的多少，分子量范围， 结构组成等而定。采用反相化学键合相色谱体系分析单糖、低级糖，其出蜂顺序有规律 地依赖于分子量的大小，且相同分子量的酮糖较醛糖保留时间短。大多数单糖、低聚糖 在氨基柱上可得到满意的分离。氨基分析柱中分子量小的糖类先流出，离子交换柱中较 大分子的糖类先流出。低聚糖在乙腈水溶液中溶解度降低，有些成份检出量低或者完全 不能检出“”。 一般认为s u g a r p a k 柱和氨基键合固定相具有较好的分离效果。前者为w a t e r s 公司的 品牌，一价格昂贵f 后者常用的品牌有：l i c h r o s o r bn h 2 s p h e r i s o r bn h 2 ，h y p e r s i ln 心， p o l y g o s i l6 0 一5n h 2 ，y w g n h 2 。 中国食品发酵工业研究所以s p h e r i s o r b n h ：色谱柱对异麦芽低聚糖中各组分进行快 速地分离测定“”。分析结果表明利用氨基柱不仅可以很好地分离三糖以下的低聚糖，而 且还能将几种分支四糖完全分开。中国科学院福建物质结构研究所分离异麦芽低聚糖， 4 第一章绪论 以z o r a b a xc 1 8 为固定相，水为流动相，示差折光仪为检测器，外标法进行定量分析， 一次进样可同时测定葡萄糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和潘糖、异麦芽四糖等1 。此法不 仅实验成本低，而且流动相没有毒性，除了异麦芽三糖和潘糖是同分异构体不能分开合 并计算外，其余的几种糖分离效果好，能满足分析要求。 液相色谱测定寡糖有诸多优点：不需要进行衍生处理，克服了低聚糖难气化，以及 热稳定性差等许多问题，大大提高了分析效率。此外与其它方法相比，它更是具有快速、 准确、重现性好，不破坏样品等优点。 1 2 1 2 其他测定方法 除上述几种分析方法外，低聚糖的测定还有，荧光分析法啪1 ，生物传感器，化学发 光检测法嘲，超临界流体色谱啪1 ，凝胶色谱。”等方法。 1 2 2 低聚糖的分离进展 低聚糖自身在组成、连接、衍生化的高度复杂性和微观的不均一性及其检测上的困 难，使得低聚糖混合物的分离一直困扰着糖化学家d 1 1 。有关糖类分离提纯的方法主要有 色谱分离法和离子交换法、有机溶剂沉淀法、吸附法、发酵法嘲 上述方法主要分离依据有： a 利用多种糖混合物中各组分的分子量差异。 b 利用它们在不同浓度有机溶剂与水的混合液中的溶解度的差异。 c 对于带有可电离基团的酸性或碱性糖来说，利用其所带电荷的质和量的差异( 离 子交换或电泳法等) 。 从糖的混合物中将需要的低聚糖分离出来，再精制成纯净的产品，结晶是常用的方 法，但往往只有少数的低聚糖能通过这种方法从混合物中分离。因而需要更进一步的研 究工作。选择合适的方法对收集到的混合糖进行分离，是一项摸索性很强的工作。下面 就最近几年糖的分离手段的主要进展分述如下： 1 2 2 1 色谱分离 色谱柱分离法是基于混合物中各组分与色谱柱的填料间结合力强弱的差异，即各组 分在固定相与流动相间分配系数不同的性质而使混合物中难吸附与易吸附组分分离的 技术。色谱技术能够分离物化性能差别很小的化合物。当混合物各组成部分的化学或物 理性质十分接近，致使其他分离技术很难或根本无法应用时，色谱技术愈加显示出其实 际有效的优越性。迄今为止，只有以离子交换树脂为填料的色谱柱成功用于糖类的工业 化分离纯化”。 离子交换色谱柱法之所以能用来分离糖类，是由于离子交换树脂经改性或改良后其 功能基团与糖类形成的络合物或衍生物的强度不同。糖在水溶液中虽不以离子形式存 在，但可通过形成离子配合物的方式间接实现糖的分离。季铵基、伯胺基、仲胺基，叔 胺基等结构的阴离子交换树脂和钙、锶、银、联铵盐等结构的阳离子交换树脂( 磺酸盐 型) 可用于分离糖类混合物。 采用离子交换色谱法分离单糖，最先由d r e y w o o d 在分析分离上获得成功，他在单糖 江南大学硕士学位论文 混合物中加入硼酸钠使单糖形成配位阴离子，用强阴离子交换树脂吸附，随后用硼酸钠 溶液进行洗脱，葡萄糖首先被洗脱，其次是果糖。这种方法用于分析或制备上是可行的， 但作为工业生产显然是行不通的。后来，g o l d i n g 发现以钙型强阳离子交换树脂为载体 吸附单糖，以水为流动相可使果糖和葡萄糖分离。现在钙型磺酸树脂己成功用于工业化 分离果糖和葡萄糖、木糖醇和山梨糖醇等。 用阳离子交换色谱柱法可将高麦芽糖糖浆分离纯化麦芽糖生产中产生的大量的高 麦芽糖浆，其中含麦芽糖7 0 9 6 ，麦芽三糖以上糖分为3 0 。便可采用阳离子交换色谱柱 法分离成两部分：一部分中麦芽糖含量纯度为9 7 5 ，用于直接生产结晶麦芽糖；另一 部分含麦芽三糖6 5 以上，麦芽糖3 0 左右，再经处理后可生产麦芽三糖产品。 吉林师范大学化学系用7 3 2 强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂对异麦芽低聚糖浆分离 纯化汹1 ，最终可以得到葡萄糖含量为3 8 4 ，二糖含量为3 9 5 5 ，三糖含量为4 3 3 9 的产品，二、三糖总量达到8 1 9 4 。有效地降低葡萄糖，使二糖和三糖的含量达到8 0 9 6 以上，减少四糖以上成分，富集异麦芽低聚糖，提高了产品的功能性。若进一步分离， 有望得到更为理想的结果，使得生产高纯异麦芽低聚糖成为可能。应用离子交换色谱分 离法生产高含量低聚异麦芽糖，没有异味和杂质，低聚异麦芽糖总含量可达到日本同类 产品，是一种普遍常用的高新分离技术。 色谱柱法优点在于通过数百次连续循环操作，重复使用吸附剂，可以充分利用材料、 能量和时间。但此法初期设备投资高，操作复杂。 1 2 2 2 膜分离法 膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔 径的大小而达到物质分离的目的。按分离粒子或分子大小可将膜分离法分为：反渗透、 透析、电渗析、纳滤、超滤、微滤等6 种。其中反渗透和纳滤有望用于分离纯化功能性 低聚糖。 反渗透可用于分离糖类混合物，是由于糖液中各组分和反渗透膜如醋酸纤维膜的亲 和力不同，从而在膜中的渗透率不同。在果糖和葡萄糖的分离中，向料液中加入n a c i 、 n a h c o 。或n a h s o 。这些盐类只能和葡萄糖形成络合物而不能和果糖形成络合物，由于含 水络合物笨重而在反渗透膜中的渗透率明显减小，从而使果糖和葡萄糖的分离变得容 易。由于反渗透在分离过程完成的同时，也将料液进行了浓缩，节约了后续浓缩工艺的 费用。因此，对于功能性低聚糖的分离，若能找到加大各组分在反渗透膜中渗透率差异 的措施，反渗透也不失为一种较好的分离手段。 纳米过滤可从溶液中分离出3 0 0 1 0 0 0 相对分子质量小的物质。从纳膜过滤分离物 质的分子量范围来看i 选择不同孔径的纳滤膜，一可将单糖三糖三糖以至五糖以上组 分依次分开。但由于制膜技术的限制，纳滤膜的截留孔径不是绝对的，而是一个范围 的平均值，因此要达到较高的分离度往往需要较长的柱膜长度。纳膜过滤也有分离、浓 缩一步完成，节约动力的优点。除相对分子质量大小差异外，若能增加截留组分和透过 组分对膜渗透率的差异，纳膜过滤用于分离功能性低聚糖将是可行的。 6 第一章绪论 江苏微生物所鲍元兴便是采用纳滤分离技术去除葡萄糖，生产高含量的低聚异麦芽 糖侧。所选择的膜对葡萄糖截留率低，二糖以上的糖截留率较高，而且分离过程中纯水 用量少的甲型纳米膜。此法可使低聚异麦芽糖总含量达9 2 ，其中功能性糖之和达n 5 5 。只是本试验目前还处中试阶段，有待进一步研究开发。 1 2 2 3 酶法 该法是利用酶制剂将低聚糖混合物中的某一或某些组分专一性地除去。例如，可 以用葡萄糖氧化酶或葡萄糖过氧化物酶将低聚糖混合物中的葡萄糖氧化为葡萄糖酸，然 后以葡萄糖酸钙沉淀法或离子交换树脂法都可很容易地将葡萄糖酸除去。该法可用于除 去低聚异麦芽糖、低聚蔗果糖、低聚半乳糖等低聚糖混合物中的葡萄糖而使产品纯度得 到大幅提高。其不足是：葡萄糖氧化酶在氧化葡萄糖的同时，料液的p h 值降低而偏离酶 的最适作用p h 值范围，故在操作过程中需调节控制料液的p h 值；另外，葡萄糖氧化酶 价格较高，使得分离纯化操作变得不经济。葡萄糖氧化酶固定化技术的发展，有望降低 其使用成本，使其最终进入工业化生产。 江南大学杨瑞金用木聚糖酶水解得到阿拉伯糖葡萄糖木糖木二糖木三糖 之比为7 7 ：6 8 ：1 1 5 ：5 4 1 ：1 9 8 5 j 高纯度低聚木糖产品( 低聚木糖的质量分数大于7 0 ) ，且产品总糖的得率达n 2 6 4 ( 按木聚糖质量分数为3 5 的玉米芯计) “町。 此法的优点：设备投资少，操作简单。其不足：酶价格较高，使得分离纯化过程成 本提高。 1 2 2 4 微生物发酵法 该法利用多数功能性低聚糖的难发酵性，选择适当的微生物将非功能性低聚糖成分 发酵除去。例如，酿酒酵母可以将功能性低聚糖混合物中的葡萄糖选择性地发酵为酒精 而除去。由于酿酒酵母对麦芽糖、蔗糖等的发酵反应具有可变性，因此通过驯化、诱变、 基因工程等手段，有可能得到可以发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等非功能性低聚糖成分而 不利用功能性低聚糖成分的变异种。而实际上国外在这一方面已取得突破性进展，我国 也已研制出兼具有糖化和发酵能力的酿酒酵母。国外学者曾利用该法将果糖提纯到 1 0 0 ，异麦芽糖提纯到9 6 5 。 江苏微生物研究所鲍元兴啪1 筛选出一株耐高渗透压、消耗葡萄糖快、对低聚异麦芽 糖分离纯度高，异味小的优良菌株。该酵母能消耗低聚异麦芽糖浆中的葡萄糖、麦芽糖， 但不能发酵含。一1 ，6 糖苷键的异麦芽糖等，所得产品中低聚异麦芽糖总含量高达到 9 4 9 9 ，提高了糖浆中低聚异麦芽糖的总含量。该设备投资较少，但产品有一定异味， 含有非糖类杂质。适合于生产保健食品，不适合生产风味类食品。 此法优点是投资小，成本相对低廉。 1 2 2 5 凝胶层析法 凝胶层析法是六十年代发展起来的一种分离分析技术，所用固定相凝胶具有分子的 性质。在多种成分进行凝胶层析分离时，从柱中流出的次序按分子量递减的顺序排列。 h a v l i c e k 等人的研究表明，在分离桦木木聚糖经三氟醋酸部分水解的产物时，采用 7 江南大学硕士学位论文 b i o - - g e lp 2 凝胶柱，去离子水为流动相，得到d p 在1 8 的低聚糖。采用同样方法，南 京林业大学化工学院，在制备本低聚糖时完全能够去除聚糖和本糖，两殿至少霹以缛到 术二到本四糖的单一组分，为今后制备术低聚稽的单一缎分提供理论依据”。 该方法是分离糖的肖力工具，它克服了糖在硅胶柱上吸附力太强的缺点。利用葡聚 糖凝胶滋析，若选择豹躐格合适，分离效果相当耀想，尤其是当寡糖的分子量稠差较大 时，很容易得到纯品。该方法另一优点怒洗脱剂用量少，层柝时间短。 2 。2 。8 其谴分鬻纯亿方法 除上述几种分离方法外，述有超l i 每界流体色谱法( s f c ) ，超l | 螽界萃取法，微波协 韵萃取法渊，溺穰萃取法，固穗徽萃取法渊，顼空法及流动注射分拆授零等方法汪用于 食品的分离纯化。其中微波协助萃取法及流动注射分析法用于多糖的分离“”。 3 色谱固定糨的研究 在色谱技术中，色谱柱固定榻要求肖合适的救径和密的粒经分布范疆，以掇离桂效 率、分离效率，减少分离时间，改善流动性。提离和改善色谱填料品质怒提高色谱技术 水平和改善色谱分离的关键。目前，国产的填料谯性能和品种上与国外发达国家有较大 豢距，每年我国瑟在这方面花数酉万的外汇去迸嗣优质壤料或色谱柱，因此研究圈定相 以发展自己的高性能色谱填料。 。3 钙蹩螯舍辫瑟秘合戏 具有某种结合型的强酸性或弱酸性的阳离予树脂、强碱性或弱碱性以及大孑l 球型阴 掰子秘滕广泛应翔予糖豹分离。离子交换榜箨豹瘫焉，燕近年国内乡 割耱工堑辩一个重 点研究课题，是糖业现代化的重隳标志。 。3 。 离子交矮瓣疆凝述及其念戎 离子交换树脂是一类带有功能基的网状结构的高分子化合物，不熔不溶，能同溶液 孛豹褰予进行棼均程交换反应。瘸子交换裁由雩蓦经夤檠( 母传) 、嚣定鏊霆窝涵渤离子 ( 也可叫交换离子或反离子) 三部分组成；如阳离子型离子交换齐u r s o _ - m ，其中r 为 惨性嚣絮，s o 。为阑定基豳，鞋为活动离予或可交抉离子，s 醚为溪性基爨或功戆蒸团。 离子交换树脂都是用有机合成方法制成，合成方法可分为加聚型( 交联聚苯乙烯型 耧丙烯酸型) 和缀聚型( 多乙烯多胺巧畿氯代嚣烷和酚麟类) 。壤翦用薰最多熬楚加聚 型离子交换树脂。绝大多数离子交换树脂的合成都是先以悬浮共聚的方法合成交联共聚 球珠，再通过一定的化学反应弓l 入魇需要的离子交换基翳。豢用的原料为苯乙爝戏丙烯 酸( 酯) ，通过聚合反应生成具有三维空间立体网络结构的骨架，张在骨架上导入不同类 一型的酸性戏碱性慕团赢制成 影确离子交换树脂的因素很多，主要是树精类型，粒度，洗脱速率等。改变不同的 条件可分离单糖、二糖、三糖、网糖体系。树脂的结构对其性能肖重要影响，而致孔剂 静种类、蠲量所翩成静树脂结构建不同的。 1 3 1 2 笨乙烯钙型螯台树脂在糖醇分离中的应用 8 第一章绪论 糖及糖醇与金属阳离子形成配位络合物的情况是不同的。糖主要是通过其固定的配 位位置形成螯合物，而糖醇通过碳碳键的变旋作用来形成螯合物。二者与阳离子配位络 合物的形成和稳定程度都是不同的，从而为通过配位体离子交换来分离糖及糖醇提供了 可能。因此从糖醇类物质离子交换分离机理出发，选择合适的阳离子型式显得十分重 要。传统的做法是：糖与糖之间的分离是应用钙形式的树脂，而分离糖与非糖物质则选 用钾形式的树脂。a t s u s h im a e d a 选用了d v b 交联度为4 ，k + 离3 一酮葡萄糖和纤维二糖啪】。 江南大学发酵工程学院采用模拟移动床色谱分离技术，实验研究了一些常见的一价、二 价、三价阳离子型树脂对木糖醇母液分离效果的影响。结果表明钙型与铅型树脂对果糖 具有很强的络合能力，分离木糖和木糖醇都可以得到较好的效果，但是考虑到最终的产 品是应用在食品方面的，而铅离子对人体是有毒，因此选择了钙型离子交换树脂作为固 定相。江苏石油化工学院采用钠形树脂分离高麦芽糖浆m 】。 i 3 2 硅胶改性 1 3 2 1 硅胶基本性质 无机基质材料，特别是硅胶，已广泛用于色谱填料的制备。但是，化学稳定性较差， 难以耐受更宽的p h 范围，是硅胶固有的一个主要缺点。此外，残余的硅羟基又可能造成 对极性溶质的非特异性吸附，长久以来，不少实验室和厂家一直在寻找克服这一问题的 途径。在近代色谱中一大特点是广泛地、大量地使用不被溶剂抽提的各种硅胶化学键合 固定相。这是因为硅胶除了具有良好的机械强度，容易控制的孔结构和比表面，较好的 化学稳定性和热稳定性等优点之外，还有一个突出的优点是其表面含有丰富的羟基，利 用这些羟基可以方便地进行硅胶表面化学键合和改性。将不同有机基团通过化学反应共 价键合到硅胶表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相，很好的解决了固定液从 载体上流失的问题，还减弱了表面活性作用点，缓和了复杂样品在表面上的不可逆化学 吸附，使峰形对称。 1 3 2 2 氨基硅胶 化学键合相按键合有机硅烷的官能团分类，可分非极性、极性和离子交换键合相几 类。极性键合相指键合有机分子中含某种极性基团，如氰基( - c n ) 、二醇基( d i o l ) 、氨 基( 一n h 2 ) 等，在糖类的分离中最常用到的是氨基键合相色谱。 氨基硅胶是通过丙基把氨基键合到高比表面积的球型硅胶载体上而制得。可应用在 正相、反相和离子色谱中。在正相色谱中，常用于糖类化合物的分析；在离子色谱中， 可作为弱阴离子交换剂，用于阴离子和有机酸的分析。另外，此填料可用于超临界色谱。 氨基键合相的性质与硅胶有较大的差异。s i o h 基呈酸性，而- n h 。呈碱性，所以当 用于正相冲洗时表现有不同的选择性。n h ：基具有强的氢键结合能力，可与糖类分子中 的羟基发生选择性相互作用，主要利用氨基和羟基形成氢键不同和糖立体构象不同分析 同分异构体，因而可以分离单糖、双糖和多糖。 1 3 2 3 硅胶改性方法 硅胶的改性和修饰一般可通过三种途径进行：表面化学修饰、整体改性和涂敷“8 1 。 9 江南大学硕士学位论文 1 3 2 3 1 表面化学修饰 通过适当的化学反应，可以将特定的官能团或配剂以共价键与硅胶表面结合，从而 使硅胶的表面状态与性质达到预期的要求，即通过化学修饰，将所需要的官能团或配剂 牢固地联接在硅胶表面上，而硅胶基质固有的特性并没有发生变化。硅胶的化学表面修 饰方法大致分为3 种，即液相法、气相法、自组装法。七十年代末开始，采用表面键合 技术嘲邮“，对硅胶微粒表面进行修饰硅烷化，使之表面不带极性，或带有其他功 能基团的极性，以适应不同的分离对象。 用于硅胶表面化学修饰的试剂可分为烷基氯硅烷和烷氧基硅烷两类。通式为 r s i x ，r 为有机基团，如甲基、乙烯基、氨丙基等，具有亲和有机物的性质，与之发 生化学反应或物理缠结，从而改善异种物质的亲和性，提高复合材料的功能；x 为某些 易于水解的基团，如氯、甲氧基或乙氧基等，这些基团能与填料表面进行某种反应，形 成牢固的化学键，使之牢固结合在粒子表面上。 雷晓玲，王俊德等人便用二甲基氯硅烷与硅胶表面反应，形成牢固的s i - h 键“”，进 而制备了新型离子交换硅胶键合相。烷基氯硅烷虽是常用硅烷化试剂，但它有一些很明 显的缺陷。例如，氯硅烷会与空气中微量的水反应，放出具有腐蚀性和刺激性的h c l 气 体，造成污染与危害。放出的h c i 还会强烈地吸附于制备的填料中，从而造成s i - 键 的断裂。这可能是填料性能逐渐变劣的一个重要的原因；加之氯硅烷价格不菲，所以它 不是一种理想的硅烷化试剂。 相比之下，烷氧基硅烷则对环境和人体的危害性小得多。因此，烷氧基硅烷被广泛 用于色谱填料的制备中。 除氯硅烷和烷氧基硅烷外，还可以使用烷基硅氨烷。例如，六甲基二硅氨烷便是经 常使用的一种活泼的“封头”试剂o ”。 1 3 2 3 2 整体修饰 利用双官能团或三官能团的有机硅烷的自聚缩反应及溶胶一凝胶反应，使所制各的 干凝胶中含有所期望的功能性有机基团，是得到具有指定色谱模式填料的有效途径。所 引入的有机基团的种