（蔬菜学专业论文）低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷效应及叶片超微结构的影响.pdf

y9 0 3 7 7 9 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行 科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮 助和作出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本 声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文 的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送 交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：在! 鹭当 导师签名：擞 日 期：2 碰乏5 p 山东农业大学硕士学位论文 摘要 本试验以山农5 号( 耐冷型) 、津优l 号( 较耐冷) 和津春4 号( 冷 敏感型) 黄瓜品种为试材，研究了低温锻炼对冷胁迫下黄瓜幼苗生理特性 以及叶片超微结构的影响。低温锻炼温度为1 0 。c 4 。c ( 白天夜晚) 、1 0 6 ( 白天夜晚) 和1 0 8 ( 白天夜晚) 。测定生理指标包括冷害 指数、s o d 活性、p o d 活性、c a t 活性、抗坏血酸含量、根系活力、电解 质渗透率、m d a 含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、叶 绿素含量等。叶片超微结构主要包括对叶绿体和细胞膜系统的观察。试验 结果表明： l适宜的低温锻炼能有效提高低温胁迫下黄瓜幼苗叶片中的s o d 、p o d 、 c a t 活性。不同的低温锻炼其效果表现不同，总体上来讲1 0 6 和1 0 8 锻炼效果要好予1 0 4 。不同的品种在同种温度处理下所表现 的趋势大体相同，但是随低温锻炼时间的延长所表现出的变化幅度不同。 冷敏感型的品种变化幅度较大。 2 适宜的低温锻炼能明显降低低温胁迫下黄瓜幼苗叶片中的m d a 含量和 电解质渗透率。l o 6 处理2 3 天、1 0 8 处理3 4 天均能显著降 低低温胁迫下黄瓜幼苗叶片中m d a 含量和电解质渗透率。 3适宜的低温锻炼能提高低温胁迫下黄瓜幼苗叶片中的可溶性糖、脯氨 酸、可溶性蛋白和v c 含量。1 0 4 处理、1 0 6 处理和l o 8 处 理，三种处理在1 4 天均能提高低温胁迫下黄瓜幼苗叶片中的可溶性糖 和脯氨酸含量；l o 6 处理和1 0 。c 8 处理卜一4 天，均能提高低温胁 迫下黄瓜幼苗叶片中的可溶性蛋白和v c 含量。 4 适宜的低温锻炼能使低温胁迫下黄瓜幼苗叶片中的细胞膜结构和叶 绿体结构保持良好。 5 本试验中山农5 号最佳低温锻炼条件为1 0 6 处理3 天，津优l 号 和津春4 号最佳低温锻炼条件为1 0 6 处理2 天。 关键词：黄瓜幼苗低温锻炼冷胁迫保护酶渗透调节物 超微结构 低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷效应及叶片超微结构的影响 e f f e c t o fc o l di n d u c e m e n to uc h i l l i n gt o l e r a n c ea n dl e a f u l t r a s t r u c t u r ei nc u c u m b e r s e e d l i n g w i t ht h ec u c u m b e rm a t e r i a l s s h a u n o n gn o 5 ( c o l dt o l e r a n c e ) ，j i n y o u n o 1 ( m i d d l ev a r i e t y ) a n dj i n c h u nn o 4 ( c o l ds e n s i t i v e ) ，t h e e f f e c t so fc o l d i n d u c e m e n to nc h i l l i n gt o l e r a n c eo fc u c u m b e rs e e d l i n gi nc o l ds t r e s ss o l u t i o n w e r es t u d i e d n ei n d u c e m e n tt e m p e r a t u r e si n c l u d e d1 0 c 4 c ( c l a y n i g h t ) 1 0 。c 6 。c ( d a y n i g h t ) a n d1 0 * ( 2 8 。c ( d a y n i g h t ) ，a n dm a j o ri n d e x e sc o m p r i s e ds o d a c t i v i t y , p o da c t i v i t y , c a ta c t i v i t y , c o n t e n to fv c ，r o o ta c t i v i t y , e l e c t r o 【y t i c a l l e a k a g e ，m d ac o n t e n t ，s o l u b l es u g a rc o n t e n t ，p r o l i n ec o n t e n t ，s o l u b l ep r o t e i n c o n t e n t ，c h l o r o p h y l lc o n t e n t ，c h o k o p l a s tu l t r a s t r u c t u r ea n de t c t h em a i n r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h el a m i n ao fc u c u m b e rs e e d l i n gc o u l dm a i n t a i nh i g h e rs o d p o da n d c a ta c t i v i t yt h r o u g hc o l da c c l i m a t i o nw i t l lf e a s i b l e t e m p e r a t u r e d i f f e r e n t t r e a t m e n tw i t hd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sw o u l dl e a dt od i f f e r e n tr e s u l t s i nt h e m a s s ，t h ei m p a c to ft r e a t m e n t s ，i o 。c 6 。ca n d1 0 8 ，w e r eb e t t e rt h a nt h e t r e a t m e n t10 4 d i f f e r e n tv a r i e t i e s u n d e rt h es a n l ei n d u c e m e n t t e m p e r a t u r e ，a p p e a r e ds i m i l a rc h a n g et r e n d , h o w e v e r , i nd i f f e r e n te x t e n t t h e c o l d s e n s i t i v ec u c u m b e rs e e d l i n gh a dg r e a t e rc h a n g e 2 t h r o u g hs u i t a b l ec o l di n d u c e m e n t ，t h el e a fo fc u c u m b e rk e p tl o w e rm d a c o n t e n ta n de l e c t r o l y t i cl e a k a g e s u c hr e s u l tw o u l db ea p p e a r 。e du n d e rt h e t r e a t m e n tw i t h1 0 6 ，2 - 3d a y s ，a n dt h et r e a t m e n t 谢血1 0 8 ，3 4 d a y s 3 f e a s i b l ec o l di n d u c e m e n tc o u l di n c r e a s et h ec o n t e n t so fs o l u b l e s u g a r , p r o l i n e ，s o l u b l ep r o t e i na n dv ci nc o l ds t r e s s c o n t e n t so fs o l u b l es u g a ra n d p r o l i n ea p p e a r e dh i g h e rt h a nc ki ne v e r yt r e a t m e n t ，i n c l u d i n gi o 。c n 。c ，i o 。c 6 a n d1 0 c 8 ，1 4 d a y s f o rc o n t e n t so fs o l u b l ep r o t e i na n dv c ，i t a p p e a r e dt h es a l n et r e n du n d e r10 * c 6 * c a n d1 0 。c 8 c 4t h r o u g hs u i t a b l ec o l di n d u c e m e n t ，t h el e a fo fc u c u m b e rk e p tb e t t e rc e l l m e m b r a n ea n dc h l o r o p l a s t 5 i nt h i ss t u d y , f o rs h a u n o n gn o 5 t h eb e s tc o l d a c c l i m a t i o nw a s1 0 6 f b r3 2 山东农业大学硕士学位论文 d a y s ，j i n y o un o 1a n dj i n c h u nn o 4w a s1 0 。c 6 。c f o r2d a y s ，a p p e a r e d c o l d - r e s i s tc h a r a c t e r i s t i c s k e yw o r d s ： c u c u m b e r s e e d l i n g c o l d - i n d u c e m e n tc o l ds t r e s s p r o t e c t i v ee n z y m e o s m o r e g u l a t i o ns u b s t a n c e s l e a f u l t r a s t r u c t u r e 3 低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷效应及叶片超微结构的影响 英文缩写符号及中英文对照表 英文缩写英文全称中文名称 a b aa b s c i s i ca c i d脱落酸 a s a a s c o r b i ca c i d抗坏血酸 a p xa s c o r b a t ep e r o c i d a s e抗坏血酸过氧化物酶 b rb r a s s i n e l i d e油菜素内酯 c a tc a t a l a s e过氧化氢酶 c h l ( a + b ) c h o l r o p h ll ( a + b )叶绿素( a + b ) d d a y 天 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 f wf r e s hw e i g h t鲜重 gg r a m克 g rg l u c o c o r t i c o i dr e c e p t o r糖皮质激素受体 g ss t o m a t a lc o n d u c t a n c e气孔导度 g s h g l u t a t h i o n e谷胱甘肽 m d am a l o n d i a d e h y d e丙二醛 n rn i t r a t er e d u c t a s e硝酸还原酶 p n p h o t o s y n t h e t i cr a t e光合速率 p o dp a r o c i d a s e过氧化物酶 r n ar i b o n u c l e i ca c i d核糖核酸 s o d s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 超氧化物歧化酶 v c v i t a m a i nc维生素c 中p si ia c t u a lp h o t o c h e m i c a le f f i c i e n c yp si i 实际光化学效率 o fp s h 4 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 黄瓜( c u c u m i ss a t i v u s 别名胡瓜、王瓜、刺瓜，起源于亚热带，属于 喜温蔬菜。中国栽培黄瓜的历史已有2 0 0 0 多年。黄瓜属于一年生、蔓性、 草本植物。黄瓜的茎为蔓性，茎节问较长，直立性差，具有不同程度的顶 端优势，茎的粗细及节问长短是诊断植株是否健壮的重要指标之一。 在我国北方，黄瓜是设施蔬菜生产中重要的蔬菜种类之一。由于黄 瓜起源于亚热带，适宜温暖的生长环境，对低温反应敏感。在我国北方冬 春季节经常会出现极度寒冷的天气和连阴天的现象，因此栽培设施内的温 度很低，甚至会使得栽培作物受到伤害，所以设施生产中最大的生产障碍 就是抗寒力低，经常出现低温冷害，对产量影响很大。低温对植物的损伤 以零度为界划分为冻害与冷害，o 。c 以上低温诱发的伤害称之为冷害，是 在非结冰低温胁迫下使植物体出现生理机能障碍。冷害主要发生在热带和 亚热带植物上。黄瓜属冷敏感植物，大多数研究者将其冷害温度设定在0 7 。c 左右。冻害是0 以下低温造成的。对黄瓜生产来讲，出现o 。c 以下低 温的可能性很小，主要以o * c 以上低温造成的冷害为主。冷害可以发生在 黄瓜生长发育的任何时期，从种子吸胀到萌发，从幼苗生长到开花结实， 以至于在黄瓜果实的贮运期间都有可能发生冷害。其主要症状是：种子萌 发期表现为不发芽或延迟发芽，胚根受害；幼苗期叶片萎蔫，如果冷害持 续时间过长，叶片出现坏死斑，叶缘黄化、干枯；成株受害则生长缓慢或 停滞、花打顶、坐果率低、畸形瓜多和产量下降等。果实储运期间受害， 瓜条出现水浸状，表面凹陷，容易腐烂( 张平等1 9 9 7 ) 。影响黄瓜冷害的 因素主要有：低温和持续时间、品种和类型、生育时期等。近年来，黄瓜 的低温冷害问题受到了广泛关注，制定克服设施栽培中出现低温与弱光等 不良天气影响的技术措施及选育耐低温弱光能力强的黄瓜品种，己成为农 业部和国家科技部攻关课题的重要内容。科技界对这方面的研究力度逐渐 增大，涉及对低温下黄瓜的生理生化反应的研究、对低温敏感性的变化规 律的研究、对低温冷害的化学防护的研究、对冷害机理的研究、对植物体 抗冷性的研究等多方面内容。 低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷效应及叶片超微结构的影响 1 1 低温冷害影响植物生长 冷敏感植物，如黄瓜、番茄、甜椒等对低温很敏感，很容易受到低温 冷害。冷敏感植物遭受低温胁迫时所表现的冷害症状基本相似，低温冷害 对植物体伤害直接的表现为叶片呈水渍状或果实上出现斑点，进而失绿萎 蔫。如果低温持续发展，则叶片逐渐黄化，生长发育迟缓，根系停止生长， 形成老化苗。 有研究表明自然低温抑制了番茄的生长速度，使株高、叶长和叶宽的 生长速度减慢，推迟了开花期和成熟期，降低了座果率。由此可见，引起 冷害的低温胁迫在植物整个生长发育过程中均能造成不利的影响。 黄瓜低温危害首先表现在植物的生长点处，使黄瓜生长点异常，其次 是叶和瓜，叶片变小、增厚，颜色加深，雌花数量增加，化瓜率提高。 地温过低会形成寒根现象，使叶部变黄，萎蔫( 生理干旱) ，但根系无 异状。若地温长期处于1 0 以下，土壤又过湿时，则根系部分变黄枯萎， 甚至腐烂，出现沤根表现，地上部表现为叶片深绿而不舒展，叶片边缘或 整个叶片枯萎。 气孔是植物体与外界环境交换水和二氧化碳等气体的重要通道，也是 气体交换的调节机构，对植物的光合、代谢、生长起着举足轻重的作用， 温度是影响气孔开闭的因子之一。冷敏感型品种的气孔开张度大，耐寒型 品种的开张度最小，中间型品种趋于二者之间( 朱其杰等，1 9 9 4 ) 。 冷害的发生与为害程度和种性、低温时间、水分状况、干物质含量有 关。原苏联的研究结果表明，零上低温3 1 0 抑制生长发育、降低产量， 长时期则引起死亡。解淑贞等认为幼苗在3 。c 低温下，3d 后7 5 的幼苗 死亡( 1 9 8 2 ) ，7 d 后全部死亡；如果长期处于1 0 温度条件下，则大部分 幼苗在子叶期死亡。 1 2 植物冷害在生理生化上的表现 低温冷害对光合作用的影响很大。大多数植物在低温胁迫下，都表现 出p n 明显下降。低温对光合作用影响有二个方面：第一，低温直接影响 了叶绿素的合成、光台机构的结构和活性；第二，低温影响植物体内的其 它生理过程，从而间接地影响光合作用，如引起水分胁迫，气孔对c 0 2 山东农业大学硕士学位论文 扩散阻力的增加，光合产物运输受阻从而导致光合产物在叶片中的积累 f l 】。当温度降低至引起冷害的临界温度时，光合作用表现为强烈的抑制 作用，甚至出现光氧化现象。李晓萍证明，经低温( 4 ) 处理后，黄瓜幼 苗光合速率降低。随着处理时间延长，光合速率降低加剧，而且在解除低 温胁迫后，光合作用恢复能力降低。郁继华等试验证明经低温弱光处理后 茄子幼苗叶片的p n 、g s 和叶绿素含量显著降低。 植物遭遇低温，呼吸作用也会受到影响。在低温影响下，在不可逆伤 害之前，往往引起呼吸的急剧增强，当呼吸作用明显地下降时，就出现不 可逆的冷害症状。试验证明低温能明显的减弱玉米的呼吸，减弱的程度随 低温强度和持续时间的增加而增强。史占忠等人用玉米龙单3 号幼苗进行 低温处理试验，2 叶幼苗分别在1 4 、1 0 低温下持续1 0 d ，呼吸强度比 在1 8 常温下分别下降1 9 6 和3 0 4 ；4 完全叶期分别在1 5 、1 1 下 持续1 0 d 比在1 9 常温下分别下降7 1 和2 1 4 。 抗性生理研究指出，作物受低温、干旱、盐分等逆境伤害的原初部位 是细胞膜( s e 洪春等，1 9 8 7 ) 。植物细胞电解质的大量泄漏通常被认为是膜 伤害或变性的重要标志，m d a 是细胞膜膜脂过氧化反应的重要产物。细 胞膜系统是植物感受外界刺激作出反应的部位，植物细胞膜在低温条件下 由液晶状态转变为凝胶状态，膜收缩，使膜透性增加，与膜结合的酶功能 异常，从而导致植物细胞代谢的变化和功能紊乱。邹志荣等( 1 9 9 4 ) 试验证 明低温胁迫下辣椒幼苗膜质过氧化物m d a 含量增加，且m d a 含量和细 胞膜透性呈极显著正相关，5 处理6 天时，细胞膜透性急剧增加，膜破 坏性极大。在低温处理过程中，水稻( 王以柔等，1 9 8 6 ) 、玉米( 张敬贤等， 1 9 9 3 ) 、 甘蔗( 陈少裕，1 9 9 2 ) 、番茄、辣椒( 钱芝龙等，1 9 9 4 ) 、黄瓜( 曾韶西等，1 9 9 0 ) 的m d a 含量明显增加。随着低温处理时间延长和冷害发展，膜脂过氧化 加剧，m d a 积累。王以柔等( 1 9 8 6 ) 发现水稻幼苗在光照和黑暗的低温胁 迫下，m d a 含量明显增加，且光照下的低温处理比黑暗中更为显著，这 是由于光氧化引起了叶绿体膜系统的降解。 植物在正常生命活动中活性氧的产生是不可避免的，同时植物体内也 存在着活性氧清除系统以维持植物的正常生理活动。植物处于低温、干旱 低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷效应及叶片超微结构的影响 等逆境条件下，细胞内活性氧的产生和清除平衡遭到破坏，活性氧的增加 后导致细胞的伤害。玉米、黄瓜、番茄等在0 。c 下，细胞过氧化酶的活性 下降，导致h 2 0 2 积累。水稻幼苗在冷胁追下，叶片中g s h 、a s a 含量减 少，s o d 、p o d 、c a t 活性明显下降。辣( 甜) 椒幼苗在低温胁迫下，叶 片中s o d 、c a t 活性，随处理温度降低和时间延长，其水平持续下降。 这两种酶活性的高低与膜脂过氧化产物m d a 积累量之间呈显著负相关。 这说明遭受低温胁迫，辣( 甜) 椒幼苗抗御活性氧毒害的能力被削弱，过 量的活性氧产生与积累加剧了对幼苗的伤害。 p r i m a k 用低温处理黄瓜幼苗，发现温室品种硝酸还原酶f n g ) 活力降 低。n r 活力的降低进一步引起氮代谢减速，从而影响植株生长与产量的 形成。侯锋试验表明，根系活力随黄瓜耐冷性的减弱而减弱，而且与冷害 指数有很好的相关性，证明在低温条件下黄瓜吸收水分和矿质营养的能力 下降。t a c h i b a n a 也发现温度低于1 7 2 0 时，黄瓜对水分与矿质营养的 吸收和运转均受到抑制。 王茅雁( 1 9 8 6 ) 将三叶期的玉米幼苗进行4 。c 低温处理，测定叶片核酸 含量减少，并随低温处理时间的延长使减小幅度有所增加，抗冷性强的品 种变化幅度小于抗冷性弱的品种，而且低温对r n a 含量的影响大于对 d n a 的影响。 l - 3 低温胁迫对细胞超微结构的影响 目前关于逆境胁迫对细胞超微结构造成影响的研究比较少，针对低温 胁迫对细胞超微结构所产生影响的研究更少。其中，逆境胁迫主要包括高 温( 王光耀，1 9 9 6 ；马晓娣等，2 0 0 3 ；陈燕等，2 0 0 3 ；张洁等，2 0 0 5 ) 、 低温( 李生泉等，1 9 9 8 ：刘爱琴等，1 9 9 7 ：李新国等，2 0 0 5 ) 、弱光( 沈 文云等，1 9 9 5 ；艾希珍等，2 0 0 4 ) 、干旱( 王风茹等，2 0 0 0 ：于海秋等， 2 0 0 2 ；徐世昌等，1 9 9 4 ) 、盐胁迫( 闰先喜等，1 9 9 4 ) 等，所涉及的作物 主要有黄瓜、番茄、辣椒、玉米、小麦等。在以往的研究中，主要是对叶 绿体结构和细胞膜结构的研究。研究结果表明，逆境胁迫对细胞超微结构 造成的影响有一定的相似性，即在逆境胁迫下，叶绿体结构受损，基粒溶 解，基粒片层结构解体，细胞膜受损。叶绿体结构受损，光合作用受阻， 进而影响作物的正常生长。细胞膜受损，造成细胞代谢紊乱，从而影响作 山东农业大学硕士学位论文 物的正常成长。 1 4 低温伤害的机理 2 0 世纪6 0 年代末，f r i d o v i c h 等提出了生物自由基伤害学说，现在已 被广泛地用于需氧生物细胞毒害机理的研究。在正常情况下，植物体本身 会产生活性氧( 0 。、h 2 02 、lo2 等) ，但是其量不足以使植物体受到伤 害，因为植物体内存在一套行之有效的清除系统。然而，一旦植物遭受低 温等逆境胁迫，活性氧的产生和清除平衡体系即被破坏，自由基数量增加， 从而导致植物细胞受到伤害。自由基首先袭击膜系统，使生物膜中脂质发 生过氧化或脱脂化反应，继而发生生理学的、代谢的及生物化学的功能障 碍。m d a 是膜脂过氧化的主要产物之一，m d a 含量的上升与膜透性的 增加呈显著的正相关，其积累是活性氧毒害作用的表现。膜系统的破坏导 致膜的孔隙变大通透性增强，离子大量外泻，因而电导率有不同程度的增 大。抗冷性较强的细胞或受害轻者不仅透性增加的程度较小，并且透性的 变化可以逆转，易于恢复正常，反之抗冷性弱的细胞或受害重者，不仅透 性大为增加，并且不可逆转，不能恢复正常，以致造成伤害甚至死亡。 2 0 世纪7 0 年代，l y o n s 和r a i s o n 提出，植物低温冷害来自膜脂物理 性质的改变。认为植物遭受低温伤害时，生物膜首先发生膜脂的物相变化， 膜脂从液晶相变成凝胶相，膜脂上的脂肪酸链由无序排列变为有序排列， 膜的外形和厚度发生变化，膜上产生皲裂，因而膜的透性增大，膜结合酶 结构改变，导致植物细胞生理代谢的变化和功能的紊乱。 8 0 年代初，m u r a t a 等又提出了植物对低温的敏感性与膜脂磷脂酰甘 油有关的观点。膜脂磷脂酰甘油是叶绿体类囊体膜的主要磷脂成分，且含 有叶绿体特有的脂肪酸反式十六碳烯酸。许春辉等( 1 9 9 7 ) 研究了冷害温 度( 0 、1 6h ) 对黄瓜叶绿体类囊体膜膜脂、膜蛋白成分的影响，发现在 没有出现伤害症状的低温处理条件下，黄瓜叶片叶绿体类囊体膜膜脂成分 已有变化，主要是膜脂磷脂酰甘油含量明显降低，类囊体膜上色素蛋白复 合体的变化以光系统i i 捕光叶绿素a ib 蛋白质( l h c i i ) 单体及寡聚体含 量的变化最明显，低温处理使l h c i i 单体比例增加。对提纯的分析表明， 低温处理改交了l h ci i 结合脂及其脂肪酸的组成，使膜脂磷脂酰甘油含 量降低。 低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷效应及叶片超微结构的影响 1 5 植物的抗冷性 李美茹等( 2 0 0 0 ) 认为植物抗冷特性的来源有二种：一种是植物本身 所具有的；另一种是通过冷驯化或其他方法诱导而获得的。后一种植物的 诱导抗性更加接近植物的自然生活环境，应是抗冷性研究的重点。 植物对低温胁迫的抗性与活性氧清除能力的大小密不可分。植物体内 活性氧清除系统主要分为酶促和非酶促两种。当植物受到冷害胁迫时，体 内活性氧增生，在一定程度上诱导了活性氧清除酶类的升高及抗氧化物质 含量的增加，从而更加有效地清除活性氧，保护植物细胞免受伤害。这是 植物自身对活性氧增生的一种调节性反应。在植物的酶促系统中，s o d 、 a s a - p o d 和g r 三种酶占有重要地位。s o d 通过催化o 2 的歧化反应清 除0 。2 同时产生h 2 0 2 ( 米勒反应) 。h 2 0 2 则由c a t 和a s a - p o d 加以清除。 c a t 定位于过氧化物酶体中，清除呼吸过程中产生的h 2 0 2 。a s a - p o d 再 清除h 2 0 2 ，特别是清除叶绿体中的h 2 0 2 显得尤为重要。g r 则通过保持 g s h 水平来防御活性氧伤害，它的保护作用只有在同其它保护酶及抗氧 化物质协同作用时才会充分体现出来。在非酶促清除系统中，抗坏血酸 ( a s a 即v c ) 和n - 生育酚的作用正日益受到重视。水溶性的a s a 与g s h 一起参加了自由基的清除，排除过氧化氢，淬灭102 和保护s h 基。w i s e 认为n 生育酚是保护光合色素免受光氧化破坏的首要物质。只有当活性 氧的增加超过了植物体对活性氧的清除能力，才会造成对细胞的伤害。 植物在低温条件下，可溶性糖、脯氨酸、蛋白质等渗透调节物质的大 量积累，被认为是植物体对低温胁迫的适应性反应。脯氨酸、可溶性糖在 细胞质中大量积累，不仅保持了蛋白质的水合度，防止原生质脱水，而且 还起到了平衡细胞质与液泡间的渗透势等多种作用，减低质膜受冻害的程 度，从而增强了植物对冻害的适应能力。许多试验表明，脯氨酸、可溶性 糖和可溶性蛋白质参与调控抗冷力的形成( 艾希珍等，1 9 9 9 ；陈杰忠等， 1 9 9 9 ；李美茹等，1 9 9 5 ；陆旺全等；2 0 0 0 ；柴圃耀等，1 9 9 9 ；武惠肖等， 2 0 0 0 ：刘鸿先等，1 9 8 1 ；武惠肖等，2 0 0 0 ；万琳琛等，2 0 0 1 ：简令成，1 9 8 3 ) ， 这在植物抗寒中起重要作用。 光呼吸作为一种消耗能量的过程，在低温等环境胁迫的条件下，对光 合机构免受破坏有重要的保护作用。m i c h a e l ( 1 9 9 8 ) 研究发现，低温导致玉 山东农业大学硕士学位论文 米o p s i i m c 0 2 的增大，表明与c 0 2 同化有关的电子传递速率加快了， 而活性氧和自由基清除酶的增加表明当叶片在寒冷环境中生长时，以o2 作为受体的相对电子流量明显增大，米勒反应在抵御低温胁迫中的作用得 到加强。 1 6 提高黄瓜耐低温的途径 目前提高黄瓜耐低温的途径主要有以下几种措施：低温锻炼、嫁接换 根、化学物质处理、选育耐冷品种。 有关试验证明，通过低温锻炼可以提高植株体内束缚水比例，提高保 护酶活性，增加可溶性糖等渗透调节物质含量，提高p s 的修复能力， 减轻低温诱导的光抑制，从而提高黄瓜耐冷性。试验表明，在掌握适宜锻 炼强度的条件下，低温锻炼是提高植株耐低温能力的一种有效的方法。目 前低温锻炼的作用已经在黄瓜( 2 0 0 0 庞金安) 、玉米( 2 0 0 5 简令成) 、番 茄( 2 0 0 5 筒令成) 、水稻( 2 0 0 5 潘沁红) 、大豆( 1 9 9 5 赵淑英) 、香蕉( 2 0 0 1 林善枝) 等作物上得以验证。 低温使黄瓜根系活力下降，吸收和利用水肥的能力降低。同时，根际 低温影响地上部同化物向根部运输。黑籽南瓜的根系耐低温能力较强，而 且根系强大，吸收水肥的能力极强，加之黑籽南瓜对枯萎病免疫，因而生 产上，特别是温室生产中己大面积用其作砧木给黄瓜嫁接换根，以提高黄 瓜耐低温能力，目前该技术应用十分广泛。 有试验表明，用脱落酸( a b a ) 处理黄瓜幼苗可明显减轻低温伤害。油 菜素甾醇类生长调节物质也可以提高黄瓜幼苗耐冷能力。天然泊菜素内酯 ( b r ) 明显促进冷处理后黄瓜幼苗的恢复生长，并降低冷处理后电解质泄漏 和稳定呼吸，还能促进黄瓜幼苗在低温下的转绿，提高冷处理幼苗的s o d 活性，减轻冷害。但是，a b a 和b r 的利用尚处于试验阶段，还没有在 生产上大面积使用。 采用传统的育种方法选育耐冷品种，是十分有效的提高黄瓜耐冷性的 方法，而且在生产上已经发挥了一定的作用。但是由于可利用的能稳定遗 传的耐冷资源缺乏，加之基因型差异难以确定，新的外源植物耐冷基因引 入表达困难，人们开始注意应用生物技术进行耐低温育种，并初步取得了 。定的成绩。鱼类抗冻蛋白基因被导入到番茄和烟草中，产生的融合蛋白 低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷效应及叶片超微结构的影响 具有抑制冰晶形成的作用。w a d a 等从一种抗冷的蓝绿藻s y n e c h o c y s t i s 中 克隆了一个与膜脂肪酸不饱和度有关的基因d e s a ，并导入另一种不耐冷 的蓝绿藻a u a c y s t i s n i d u l a n s ，改变了后者的膜脂组成，从而使其光合作用 在5 下不受明显抑制。m u r a t a 通过向烟草导入拟南芥菜叶绿体的甘油3 磷酸乙酰转移酶基因，以调节叶绿体膜腊的不饱和度，使获得转基因的烟 草抗冷性增加。但是，在黄瓜上还没有成功的报道。 1 7 低温锻炼对生化防御机制的影响 锻炼是指生物体通过某种方式提高机体的生理机能、健康素质和抗逆 能力，以期适应生态环境更好生存的自我调节和完善过程。由于逆境往往 是生物有机体在生命活动过程中难以避免的环境因素，因此，锻炼这种方 式无论是在动物界还是植物界都具有极大的普遍性和重要意义。 刘鸿先( 1 9 8 5 ) 等认为：黄瓜的耐冷力与低温冷害有直接的关系，而 耐冷力的强弱则是黄瓜自身长期适应环境形成的，并受遗传因素控制的一 种生理特性，存在着不同品种之间的差异。另一方面，有生命的生物体必 须具有对外部环境因子敏感和将这些变化转导引入生理反应的能力，才能 维持其稳定的生长。在低温条件下，黄瓜是通过形态变化、生理生化反应、 代谢功能的改变来提高对逆境的适应能力。因而低温诱导在植物抗寒性上 起到很重要的作用。 许多研究表明，低温锻炼可以提高植物防御光抑制的能力。曾纪晴等 ( 1 9 9 7 ) 的试验结果证实，经冷诱导的黄瓜幼苗子叶其叶绿素编码蛋白( d 1 ) 的合成能力比未经冷诱导的要大，即冷诱导提高了黄瓜幼苗子叶p s i i 的 修复能力，从而减轻光抑制。 l e i p n e r 等( 1 9 9 7 ) 发现，玉米幼苗在经过低温诱导后，叶黄素循环增大， 脱环氧化作用增强，内源氧化剂g s h 和n 生育酚含量增大，a s a 含量基 本保持不变，且胁迫处理后，a s a 、g s h 和o 生育酚的降解以诱导苗为 晚，而且并不明显。 王以柔等( 1 9 9 5 ) i 正明低温锻炼明显地提高了黄瓜和水稻幼苗叶中的 s o d 、g r 活性和a s a 、g s h 含量。胁迫处理后，未锻炼苗的s o d 、g r 活性和a s a 、g s h 含量明显下降，而经低温锻炼的苗则相对比较稳定， 且具有较低的膜脂光氧化水平。 1 2 山东农业大学硕士学位论文 h o d g e s 等( 1 9 9 7 ) 通过对玉米的研究表明，低温锻炼的时间长短以及玉 米幼苗生长的不同时期在相同的作用条件下会得出不同的结果，不同酶活 性的变化也不尽相同。低温锻炼时间越长，s o d 、a p x 和g r 相对于对照 均升高。 1 8 本试验研究的内容和意义 低温诱导在提高作物耐冷性，以及在抗性育种中的作用已经被广泛的 试验所证实。通过低温诱导的植株，在受到低温胁迫时植株形态结构得以 优化，各项生理生化指标得到改善，植株耐逆境能力显著增强。不同的植 物，以及同种植物不同品种之间其低温诱导的适宜温度不同。对黄瓜耐低 温规律进行研究，有利于制定相应技术措施和选育耐低温品种。近年来， 人们从生态学、形态学、生理生化以及遗传学角度对黄瓜的耐低温特性进 行了广泛的研究。在以往的研究中往往只局限于对几个抗性指标的研究， 尤其是对保护酶的研究，而且处理温度和取材都比较单一；低温锻炼对超 微结构影响的研究也很少，本人希望通过试验全面的研究低温诱导对黄瓜 幼苗生理生化指标以及叶片超微结构的影响，为制订相应的栽培措施，以 及选育优良的耐低温品种提供理论和技术支持。 。 本试验的主要研究内容为低温诱导对黄瓜幼苗生理指标和叶片超微 结构的影响。本试验包括两部分：第一部分，选用山农5 号( 耐寒型) 、 津优1 号( 较耐寒) 和津春4 号( 冷敏感型) 三个黄瓜品种作为试材，设 置了三种锻炼温度：1 0 4 、1 0 6 和1 0 8 ，同时每种温度处理 又设置了l 一4 天不同的时间处理，该部分测定指标包括电解质渗透率、 m d a 含量、s o d 活性、p o d 活性、c a t 活性、v c 含量、脯氨酸含量、 可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、根系活力和叶绿素含量。第二部分，选 用山农5 号作为试材，设置1 0 6 作为锻炼温度，锻炼对间为3 天，对 叶片的超微结构进行研究。本试验通过对低温胁迫下以上所述抗性指标变 化，以及叶片超微结构变化的分析，探讨了低温锻炼对冷胁迫下黄瓜幼苗 的影响，同时找出黄瓜不同类型品种适宜的锻炼温度及时间。 低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷效应及叶片超微结构的影响 2 材料与方法 2 1 低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷性的影响 2 1 - l 试验材料 供试黄瓜( c u c u m i ss a t i v u s 厶) 品种为山农5 号( 耐寒品种) ；津优1 号( 中间类型) 和津春4 号( 冷敏感品种) 。 2 1 2 试验设计和方法 2 1 2 1 试验设计 黄瓜幼苗长至三叶一心时，选取形态及长势基本一致的黄瓜幼苗将其 转移至光照培养箱中进行低温处理。首先预处理2 天，预处理温度为1 5 1 0 ( 白天夜晚) ，然后进行相应的低温锻炼处理。本试验低温锻炼温 度设置1 0 1 2 4 1 2 ( 白天，夜晚) 、1 0 6 ( 白天夜晚) 和1 0 8 ( 白天 夜晚) 三个温度，其中在每个温度处理下又设置1 天、2 天、3 天、4 天 处理，共1 2 个处理。( 每个处理选取1 0 株黄瓜幼苗) 低温锻炼处理完之 后在1 1 条件下冷处理1 2 个小时。( 对照进行2 天预处理后，直接在1 l 条件下冷处理1 2 个小时) 冷处理完之后，在1 5 1 0 1 2 ( 白天腋晚) 条件下恢复3 6 个小时，然后在2 5 1 5 ( 白天夜晚) 条件下恢复2 4 个小 时，( 在光照培养箱内处理，白天均设置为1 2 个小时，光照为5 5 0 0 1 x ；晚 上设置为1 2 个小时，光照为o ) 然后取样测定。取样部位为由上向下数 第二片真叶。 2 1 2 2 试验方法 本试验种子用温汤浸种消毒后于2 8 恒温箱内催芽，2 0 0 4 年1 2 月2 日选择出芽整齐一致的种子播种于8 x s c m 的装有基质( 草炭：蛭石：鸡 粪为3 ：2 ：1 ) 的营养钵内。在日光温室内育苗。当黄瓜幼苗长至三叶一 心时( 2 0 0 5 年2 月2 0 日) ，每个处理选取1 0 株形态及长势基本一致的健 壮的黄瓜幼苗，将其转移至光照培养箱( l r h 2 5 0 一g ) 内，( 每个温度处理 用一个光照培养箱) 2 0 0 5 年2 月2 0 日上午8 ：0 0 2 0 0 5 年2 月2 2 日上 午8 ：o o 进行1 5 l o ( 自天夜晚) 低温预处理，2 0 0 5 年2 月2 2 日- - 2 0 0 5 年2 月2 6 日每天上午8 ：0 0 往培养箱中放1 0 株黄瓜幼苗进行相应的低温 1 4 山东农业大学硕士学位论文 锻炼处理。2 0 0 5 年2 月2 6 日上午8 ：0 0 - - 2 0 0 5 年2 月2 6 日晚上8 ：0 0 进行1 l 冷处理。2 0 0 5 年2 月2 6 日晚上8 ：0 0 - - 2 0 0 5 年2 月2 8 日上 午8 ：0 0 设置1 5 1 0 恢复处理，2 0 0 5 年2 月2 8 曰上午8 ：0 0 - - 2 0 0 5 年 2 月2 9 日上午8 ：o o 设置2 5 1 5 恢复处理，之后取样测定各项指标。 2 1 3 测定项目与方法 2 1 _ 3 1 超氧物歧化酶( s o d ) 活性测定：采用氮蓝四唑光化还原法( c a k m a k i ，1 9 9 2 ) 。 2 1 3 2 过氧化氢酶( c a t ) 活性测定：采用过比色法c c a k m a ki ，1 9 9 2 ) 2 1 3 _ 3 过氧化物酶( p o d ) 活性测定：采用愈创木酚氧化比色法( c a k m a k 1 , 1 9 9 2 ) 。 2 1 3 4 丙二醛( m d a ) 含量测定：采用巴比妥酸显色法( r b a 法) ( 赵世 杰，1 9 9 9 ) 2 1 3 5 可溶性蛋白含量测定：采用考马斯亮蓝法比色测定( 汤章城，1 9 9 9 ) 。 2 1 3 6 可溶性糖含量测定：采用蒽酮法( 汤章城，1 9 9 9 ) 。 2 1 3 7 脯氨酸( p r o ) 含量测定：采用酸性茚三酮法( 汤章城，1 9 9 9 ) 。 2 1 _ 3 8 叶绿素含量测定：采用丙酮法( 汤章城，1 9 9 9 ) 。 2 1 3 9 根系活力测定：采用t t c 染色法( 汤章城，1 9 9 9 ) 。 2 1 3 1 0 电解质渗透率以o r i o n t d s 电导仪测定胁迫前后叶片的电导率。 2 1 3 1 1 维生素c 含量测定：采用2 ，6 一二氯酚靛酚滴定法。 2 1 3 1 2 冷害指数：参照于贤昌( 1 9 9 8 ) 的方法。 2 2 低温锻炼对黄瓜幼苗叶片超微结构的影响 2 2 1 试验材料 供试黄瓜( c u c u m i ss a t i v u s l ) 品种为山农5 号( 耐寒品种) 。 2 2 2 试验设计和方法 2 2 2 1 材料培养 材料培养同2 1 2 2 中试验方法。光照培养箱管理方法如2 i 2 2 中 试验方法。 低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷效应及叶片超微结构的影响 2 2 2 2 试验设计 黄瓜幼苗长至三叶一心时，选取形态及长势基本一致的黄瓜幼苗2 5 株，将其转移至光照培养箱中进行低温锻炼处理。其中，每5 株作为一个 处理，即有5 个处理。 处理1 ，作为对照，不进行任何温度处理。从中选取一株长势中等的 幼苗，在其第二片真叶处取材料。 处理2 ，在1 5 。c 1 0 。c ( 白天夜晚) 温度条件下预处理2 天，然后在 1 1 条件下冷处理1 2 个小时。从中选取一株长势中等的幼苗，在其第 二片真叶处取材料。 处理3 ，首先在1 5 。c 1 0 ( 白天夜晚) 温度条件下预处理2 天，然 后在1 0 ，6 ( 白天，夜晚) 温度条件下进行低温锻炼3 天，然后在l 1 条件下冷处理1 2 个小时。从中选取一株长势中等的幼苗，在其第二片 真叶处取材料。 处理4 ，首先在1 5 。c 1 0 ( 白天，夜晚) 温度条件下预处理2 天，然 后在1 0 6 ( 白天夜晚) 温度条件下进行低温锻炼3 天，然后在1 1 条件下冷处理1 2 个小时，之后在1 5 1 0 ( 自习夜晚) 条件下恢复1 天，然后在2 5 1 5 条件下恢复1 天。从中选取一株长势中等的幼苗，在 其第二片真叶处取材料。 处理5 ，首先在1 5 1 0 ( 白天夜晚) 温度条件下预处理2 天，然 后在1 1 条件下冷处理1 2 个小时，之后在1 5 1 0 ( 白天夜晚) 条 件下恢复1 天，然后在2 5 ，1 5 条件下恢复1 天。从中选取一株长势中等 的幼苗，在其第二片真叶处取材料。 2 2 2 3 测定项目 测定项目主要包括：叶绿体结构和细胞膜系统结构。 2 2 2 4 测定方法 将取得的黄瓜叶片材料用3 5 戊二醛前固定2 4 h r ，磷酸缓冲液冲洗 后用1 饿酸后固定4 h r ，乙醇剃度脱水，e l ：i i n 8 1 2 树脂浸透包埋，l k b v 超薄切片机切片，醋酸铀、柠檬酸铅双染色，日本j e m 1 2 0 0 e x 投射电境 观察拍照。 山东农业大学硕士学位论文 3 结果与分析 3 1 低温锻炼对黄瓜幼苗抗冷性的影响 3 1 1 对低温胁迫后黄瓜幼苗冷害指数