（生理学专业论文）星形胶质细胞谷氨酸释放机制的研究.pdf

中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 5 1 0 n m 由s i t s 像机收集( d a g e l n s t r u m e n t ) 。f u r a - 2 减少的百分比在加入 1 0 0 1 z ma t p 一分钟后进行分析。悬液中星形胶质细胞体积用c o u l t e r 记数 仪计算( m u l t i s i z e r ，c o u l t e r 电子公司) ，星形胶质细胞经分解并在无血清 d m e m f 1 2 培养液中恢复- i , h , - t 后测量。光圈管的直径为l o o i x m ，细胞体 积用9 8 9 斗m 直径球做表准化。 实验结果 为了检验钙信号与星形胶质细胞体积增加相联系这一假设，本实验采 用三种不同的方法测量了细胞体积的相对变化。首先应用共聚焦x - z 激 光扫描技术( s c h r e i b e re ta 1 ，1 9 9 9 ) c a l c e i n a m ( 5 1 x m ) 孵育3 0 分钟后用 4 8 8 n m 激发进行x - z 方向横切面扫描( f i g 1 ) ，测量了腺苷受体刺激前后 - 9 细胞体积。采用这种方法的原因是有大量实验报道显示星形胶质细胞内钙 信号是由a t p 调节的( c o t r i n ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。加入 0 0 f 。ma t p 导致显著横 切面体积增加，而此体积的变化可被细胞内钙的鳌合剂b a f f a a m ( 2 0 p 。m ) 所降低。第二种方法系采用荧光稀释的方法( h a n s o ne t8 1 ，1 9 9 4 ) 探测到f u r a 一2 孵育后并加入a t p 的星形胶质细胞有9 6 士1 3 荧光降低， 与之相比对照组有1 1 1 3 荧光增加( p 0 0 1 ) 。第三种方法系悬浮 的培养的星形胶质细胞液中加入a t p 后用c o u r i e r 计数仪检测细胞体积 ( r a u te ta 1 ，1 9 9 6 ) 。结果显示有意义的可反转的细胞体积增加，其平均值 在第3 0 秒时为3 5 0 6 ( p 0 0 0 0 3 ) ，在6 0 秒时为3 0 - t - 0 5 ( p 0 0 0 1 ) ；在刺激2 分后细胞体积恢复到刺激前的水平( f i g 1 c ) 。与之相对 照，降低细胞外的渗透压值从3 1 4 到2 1 4 m o s m 产生了5 8 士1 5 细胞体积 增加，此细胞体积增加仅有部分可恢复。总之，上述三种方法表明在腺苷激 活下星形胶质细胞体积的瞬间增加，a t p 诱导的细胞膨胀较为温和约为3 1 0 ，相应于低渗则可导致2 5 6 0 的体积增加。 a b a 1 p h y p o f 。n k y 矮1 0 u 譬4 ：l 羹 尝 雪 1 0 a r t , c v o l u m ec h a n g eo fs l i s d e n d e dc e l l s 耋1 舳 童 宝10 2 粤 曼1 兽 o12345 i n i i l u l o s f i g 1星形胶质细胞c a 2 + 信号与细胞体积的瞬时增加相关联 1 0 *霉基善r ( a ) l o o p l ma 7 r p 诱导了培养的星形胶质细胞体积膨胀。共聚焦垂直横断面星形胶 质细胞图像( 与5 1 x m ，3 0 r a i n ，c a l e e i n 孵育后) 。在4 8 8 n m 激发光下x z 向重复扫描后 图像再建。两幅图像断面区域为暴露于a t p 前( 白色) 后( 绿色) ，显示细胞体积的变 化。低渗溶液( 2 1 4m o s m ) 诱导细胞膨胀。 ( b ) 相关横断面区域在施加对照液，a t p ( 1 0 0 斗m ) ，低渗液( 2 1 4 m o s m ) 前后1 分 钟的量化图。p 0 0 l ( t u k e y k r m e r t e s t ) ( c ) c o u l t e r 记数仪分析星形胶质细胞在a t p 诱导下体积相对变化的分析： 悬浮的星形胶质细胞在暴露于a t p3 0 6 0 秒是俄发生瞬时体积增加。p 0 0 5 ( t t e s t ) 。 讨论 本实验采用了几种不同方式的方法均探测到细胞体积的相对变化，即 在嘌呤激动剂及p g e 2 作用下星形胶质细胞发生瞬时体积增加，并发现胞 浆中c a “信号的增加对于受体介导的细胞体积增加是至关重要的。其原 因是a t p 介导的谷氨酸释放与细胞内c a 2 + 密切相关，而且谷氨酸释放可被 细胞内c a “鳌合剂b a v f a 以及h + 一a t p 酶的抑制剂t h a p s i g a r i n 所降低， 但是低渗所诱发的谷氨酸释放却是不依赖细胞内c a “的( k i m e l b e r g ， 1 9 9 0 ) 。 将培养的星形胶质细胞暴露于低渗溶液时可发生迅速的细胞体积膨 胀，进而导致兴奋性氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸的释放。需要指出的是这 一现象是否仅与脑外伤、脑缺血这样的病理壮态相关联? 是否在生理壮态 下星形胶质细胞较小的体积变化亦可引起谷氨酸释放? 本实验的结果发现 细胞外的a t p 可较强地易化体积调节的阴离子通道( v r a c s ) ，进而引发 非膨胀和渗透性膨胀的星形胶质细胞谷氨酸释放。 激动剂和抑制剂的实验结果分析提示：a t p 的调节作用可能是通过代 谢型p 2 y 受体的几个亚型进行的。星形胶质细胞的膨胀可启动特殊的细 胞体积调节机制，该机制涉及体积调节的阴离子通道开放而产生k + c l 一外 流。体积调节的阴离子通道可通透诸如谷氨酸、天冬氨酸等有机渗透电解 质。有机渗透电解质和c 1 一道对急性和慢性渗透压紧张状态下星形胶质 细胞的体积进行调解( s t r a n g e , e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 1 1 结论 a t p 可诱导培养的星形胶质细胞发生细胞体积膨胀，并且胞浆中c a 2 + 信号的增加对于受体介导的细胞体积增加是至关重要的。 1 2 参考文献 1 h a n s s o n ，e ( 1 9 9 4 ) m e t a b o t r o p i cg l u t a m a t er e c e p t o ra c t i v a t i o ni n d u c e sa s t r o g l i a ls w e l l i n g jb i o lc h e m2 6 9 ，2 1 9 5 5 2 1 9 6 1 2 k i m e l b e r g ，h ，g o d e f i e ，s ，h i g m a n ，s ，p a n g ，s ，a n dw a n i e w s k i ，r ( 1 9 9 0 ) s w e l l i n g i n d u c e dr e l e a s eo fg l u t a m a t e ，a s p a r t a t e ，a n dt a u r i n ef r o m a s t r o c y t i cc u l t u r e s jn e u r o s e i1 0 ，1 5 8 3 1 5 9 1 3 m o n g i n ，a 。a ，a n dk i m e l b e r g ，h k ( 2 0 0 2 ) 。a 四p o t e n d ym o d u l a t e s a n i o nc h a n n e l m e d i a t e d e x c i t a t o r y a m i n oa c i dr e l e a s ef r o mc u l t u r e da s t r o - e y t e s a mjp h y s i o lc e l lp h y s i o l2 8 3 ，c 5 6 9 5 7 8 4 n e d e r g a a r d ，m ( 1 9 9 4 ) d i r e c ts i g n a l i n gf r o ma s t r o c y t e st o n e u r o n si nc u l t u r e so fm a m m a l i a nb r a i nc e l l s s c i e n c e2 6 3 ，1 7 6 8 1 7 7 1 5 n e d e r g a a r d ，m ，r a n s o m ，b ，a n dg o l d m a n ，s 。a ( 2 0 0 3 ) 。n e wr o l e sf o r a s t r o c y t e s ：r e d e f i n i n gt h ef u n c t i o n a la r c h i t e c t u r eo ft h eb r a i n t r e n d sn e u r o s c i2 6 ，5 2 3 5 3 0 ， 6 s e h i p k e ，c g ，b o u c s e i n ，c ，o h l e m e y e r ，c ，k i r c h h o f f ，f ，a n d k e t t e n m a n n ，h ( 2 0 0 2 ) a s t r o c y t ec a 2 + w a v e st r i g g e rr e s p o n s e si nm i c r o g l i a lc e l l si nb r a i ns l i c e s 。f a s e bj1 6 ，2 5 5 2 5 7 7 s t r a n g e ，k ，e m m a ，f ，a n dj a c k s o n ，p s ( 1 9 9 6 ) c e l l u l a ra n dm o l e - c u l a rp h y s i o l o g yo fv o l u m e s e n s i t i v ea n i o nc h a n n e l s a mjp h y s i o l2 7 0 ，c 7 11 7 3 0 1 3 星形胶质细胞谷氨酸释放的药理学特性的研究 刖罱 在星形胶质细胞上存在有体积敏感的阴离子通道( v a r c s ) ，该通道可 通透各类无机阴离子、小的有机阴离子、以及不带电荷的分子如谷氨酸和天 冬氨酸。尽管体积敏感的阴离子通道( v a r c s ) 的结构组成尚不清楚，但有 证据表明这类通道具有膨胀激活的c l 一和有机渗透电解质的流动( b a n d e r a l ia n dj u n a n k a re ta l ，2 0 0 0 ) 。这类通道的作用主要为保持细胞体积的稳定， 而且还参与细胞增生和凋亡过程。 新近的离体实验的研究结果表明( m o n g i na a e ta l ，2 0 0 3 ) ，神经递质 和神经调节物可诱发细胞内c a “浓度的增加，进而引起瞬间细胞体积膨 胀，细胞通过体积敏感的阴离子通道( v a r c s ) 释放谷氨酸。此种体积敏感 的阴离子通道( v a r c s ) 调节的有机渗透电解质的释放在c a 2 + 依赖性的星 形胶质细胞与神经细胞间信号传递中发挥作用，而其中发挥主要作用的是 谷氨酸。 本实验以谷氨酸释放作为测量体积敏感的阴离子通道( v a r c s ) 的活 动的指标，进而研究细胞内信号机制对体积敏感的阴离子通道( v a r c s ) 的 调节，以及细胞外a t p 在细胞暴露于不同程度低渗( 5 t o3 0 ) 时的调节 作用。 材料与方法 谷氨酸的测量： 采用酶荧光探测技术( b e z z ie ta l ，1 9 9 8 ) 生长在玻片上的星形胶质细 胞放入光谱荧光计数仪的石英检测管中进行测量。检测管加有缓冲液 ( 1 3 8 m mn a c l ，1 5 r a mk 2 h p 0 4 ，2 r a mc a c l 2 ，2 r a mm g c l 2 ，1 0 m mh e p e s ， t o m mg l u c o s e ，p h7 3 ) ，并加入l m mn a d p + 及4 0 u 谷胺脱氢酶。n a d 1 4 暖 p h 的荧光用3 4 01 3 _ 1 1 1 光激发并在4 5 0n m 处收集。h p l c 高压液相色谱法分 析，将生长星形胶质细胞的玻片放入灌流小室中( 小室体积2 7 u l ) 并用 1 0 0 u l m i n 速度灌流。灌流缓冲液中含有( m m ) ：1 3 8n a c l ，1 5k 2 h p 0 4 ，2 c a c l 2 ，2m g c l 2 ，1 0h e p e s ，p h7 3 灌流小室及灌流液均保持3 7 0 c 。灌流 3 0 分后开始收集样本，间隔时间为9 0 秒。 实验结果 为了确认a t p 和低渗所导致的谷氨酸释放是否为同一机制，本实验采 用了高度敏感酶分析方法( t a k a n oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。施加1 0 0 1 x ma t p 可导致 每一细胞有2 4 9 ，4 - 0 2 1 f m o l 谷氨酸的释放。a t p 所诱导的谷氨酸释放与 细胞内钙的增加相关联，因为在给与b a p t a a m ( 2 0 1 x m ，3 0 r a i n ) 和t h a p s i g a r g i n ( 1 斗m ，1 0 m i n ) 减少了谷氨酸释放( b a z z ie ta 1 ，1 9 9 8 ) ，然而在去除细 胞外钙后对此无影响，而且b a p t a 和t h a p s i g a r g i n 并没有影响低渗所诱导 的谷氮酸释放( f i g ，2 a c ) 。 三种阴离子通道阻断剂即：5 - n i t r o - 2 1 3 一p h e r y l p r o p y l a m i n o b e n z o i ca c i d ( n p p b ，1 0 0 斗m ) ，f l u f e n a m i ca c i d ( f f a ，1 0 0 肛m ) ，g o s s y p o l ( 1 0 1 z m ) 都具有 减低a q 、p 和膨胀所诱导的谷氨酸释放。然而非竞争性谷氨酸转运子的抑 制剂d l t h r o - b e n z y l o x y a s a r t i ca c i d ( t b o a ，t 0 0 扯m ) 没有作用。 施加通道质子泵抑制剂li x mb a f i l o m y c i na 11 小时后，或者给与2 u g r n l 僵直毒素( t e n t ) 其作用为抑制出泡作用，2 4 小时后均未见有对a t p 和 低渗所导致的谷氨酸释放的影响。然而b a f i l o m y c i na 1 可有效地抑制脑片 海马的出泡作用，在应用b a f i l o m y c i na 11 小时内降低了抑制性突触后电流 的频率从2 。3 5 s e c 到0 。2 s e e ( p 0 。0 0 1 ，t t e s t ，n = 4 ) 。 此外，施加m e t h i o n i n es u l f o x i m i n e ( m s o ，1 5 m m ) ( k i m d b e r ge ta 1 ， 1 9 9 0 ) 即谷胺合成的抑制剂因而增加细胞内谷氨酸进而增加了a t p 和低 渗所导致的谷氨酸释放。综合上述方法表明a t p 和低渗所导致的谷氨酸 释放拥有许多共同的特性，但在细胞内钙依赖性上却明显不同；b a p t a 和 t h a p s i g a r g i n 可完全抑制a t p 所诱导的谷氨酸释放，但对低渗所导致的谷 氨酸释放无作用。 c o n n e x i n ( c x ) 半通道在去除细胞外二价正离子( c a “m 9 2 + ) 壮态下发 生影响( y e te ta 1 ，2 0 0 3 ) 。为了估价c x 4 3 ( 星形胶质细胞所表达的c x 家 1 5 族的主要成员) 的作用，本实验比较了c x 4 3 基因敲除小鼠和与之相配的野 型正常鼠a t p 所诱导的谷氨酸释放。a t p ( 1 0 0 肛m ) 所诱导c x 4 3 基因敲除 小鼠的谷氨酸释放为3 0 2 f m o l c e l l ，该数值为正常鼠的9 0 7 。因此c x 4 3 基因敲除鼠星形胶质的谷氨酸释放与正常表达c x 4 鼠相似( p = 0 6 4 ，t t e s t ) 。据此可以得出结论：即c x 4 3 半通道不太可能参与受体介导星形胶质 细胞的谷氨酸释放。 为了进一步探讨星形胶质细胞谷氨酸释放的特性，本实验检验了a t p 激动剂触发谷氨酸释放的能力( c o t r i n ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。1 0 0 p mu t p ( p 2 y 受 体亚型的激动剂) 所触发谷氨酸释放的强度与a t p 相近( f i g 。2 b ) 。相比 较而言，两种p 2 x 受体的激动剂( 1 0 0 斗mm e a t p ，p 2 x 激动剂和1 0 0 斗m2 ， 3 ，一0 一( 4 一b e n z o y b e n z o ) 一a t p ，p 2 x 7 激动剂) 没有作用( f i g 2 b ) 。进一步实 验将p 2 x 7 受体的抑制剂o x i d i z e da t p ( o x a 1 1 p ；3 0 0 p m ) 9 呼育l 小时并没有 明显降低a t p 诱导的谷氨酸释放( f i g 2 b ) 。这些实验观察表明：a t p 诱 导的星形胶质细胞谷氨酸释放是p 2 y 受体激活所引发的而不是p 2 x 受体。 总括上述实验结果表明由a t p 或者低渗所诱导的谷氨酸释放都可被 阴离子通道抑制剂所阻断，而对谷氨酸转运质和出胞作用产生作用的因子 不敏感。最近有报道指出a t p 显著地增强膨胀所诱导的星形胶质细胞谷 氨酸释放，相反高渗抑制了谷氨酸释放( m o n g i na n dk i m e l b e r g ，2 0 0 2 ) 。本 实验结果证明a t p 诱导的谷氨酸释放的量与细胞外的渗透压呈反比关系 ( r 2 = 0 9 9 ) 。即当渗透压增加1 5 或更高时，谷氨酸释放将完全停止 ( f i g 2 d ) 。需要指出的是腺苷受体激活所引发的谷氨酸释放是依赖于细 胞内钙离子浓度，而且比低渗所诱发的谷氨酸释放对c a 2 + 的变化敏感( 约 1 0 ) 。 星形胶质细胞的c a 2 + 信号中氨基酸类电鹪质的共同释放： 为探讨a t p 诱导的钙依赖性的谷氨酸释放的机制，本实验应用高压液 相色谱分析了细胞外氨基酸的浓度变化( f i g ，3 a ) 。有趣的是，谷氨酸并不 是单独释放的，而是与牛黄酸，天冬氨酸和谷胺共同释放的。这些氨基酸在 a t p 诱导下的释放非常的相似。从本质上讲，腺苷类刺激诱导的氨基酸外 移仅仅是被称为渗透性电解质( o s m o l y t e s ) ，而不包含其它如天冬酰胺，异 亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸和络氨酸( f i g 3 a ) 。 这一实验结果明显证实这一原理：即在受体刺激下的c a “信号下的体 积敏感通道激活导致胞浆中谷氨酸和其它氨基酸的共同外流。事实上， 1 6 n p p b 和b a p t a a m 不仅抑制了在a t p 刺激下谷氨酸释放并且还包含谷 氨酰胺及牛磺酸的释放( f i g 3 b ) 。 p g e 2 一诱导的星形胶质细胞谷氨酸释放 早些的研究表明前列腺素特别是p g e ：系受体介导的c a 2 + 依赖性的星 形胶质细胞谷氨酸释放所必需的( b e z z ie t 0 1 ，1 9 9 8 ) 。为了比较本实验结 果与目前有关星形胶质细胞谷氨酸释放的报道，我们提出假设：即是否 p g e ：一诱导的c a “信号与细胞膨胀以及体积敏感通道激活相关联。本实验 进行了对应于p g e ：诱导的星形胶质细胞体积变化量的测量( x z 激光扫描 技术) 。p g e ：触发了明显的细胞膨胀，而且这一膨胀可被细胞内c a “鳌合 剂b a p t a a m ( 2 l x m ) ( f i g 4 a ) 减弱。本实验发现p g e 2 诱导的星形胶质 细胞谷氨酸释放的量与a t p 诱导的谷氨酸释放的量相类似。进一步研究 发现，p g e ：诱导的谷氨酸释放可被b a p t a 抑制并被n p p b 降低( f i g 4 b ) 。h p l c 结果表明p c e ：触发电解质氨基酸如谷氨酸，牛黄酸和谷胺的 释放，但不含有天冬酰胺，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸和络氨酸( f i g 4 b ) 。 因此，p g e ：诱导的谷氨酸释放与腺苷诱导的谷氨酸外流拥有许多共同的特 征如c a “依赖性，细胞体积的瞬时膨胀以及谷氨酸，牛黄酸和谷胺的共同 释放。 a b 龋 j c ，一。， n l 警h 札二：i 曲h 2 ；i 。pi 22 f i g 2c a 2 + 依赖性谷氨酸释放受到阴离子通道阻断剂及高渗液的抑制 1 7 差一 也 ( a ) 曲线显示a t p 诱导培养的星形胶质细胞谷氨酸释放( 采用酶荧光探测的方 法) 。b a p t a a m ( 2 0 v , m ，3 0 r a i n ) ，阴离子通道阻断剂n p p b ( 1 0 0 1 l m ) 降低谷氨酸外 流。 ( b ) a 开诱导的谷氨酸释放系c a 2 + 依赖性的并被b a y i a a m ( 2 0 p m ，3 0m l n ) 及 t h a p s i g a r g i n ( 1 肛m ) 所抑制。) ，阴离子通道阻断剂n p p b ( 1 0 0 i m ) ，f u f e n a m i ea c i d ( f f a ， 0 0 斗m ) 以及g o s s p o l ( 1 0 p m ) 可阻断a t p 诱导的谷氨酸释放。然而，谷氨酸转 运子阻断剂t b o a 却无作用。相对于此囊胞释放的抑制剂b a f i l o m y c i na 1 ( 1 州，1h r ) ， 以及t e t a n u sn e m o t o x i n ( t e n f r ，2 肛m 1 ，2 4h r ) 亦无作用。谷胺合成酶抑制剂m e t h i o n i ns u l f o x i m i n e ( m s o ，1 m m ，2h r ) 增加a t p 诱导的谷氨酸释放。u t p ( 1 0 0 i 1 ，m ， p 2 y 2 ，p 2 y 4 特异的激动剂) 诱导的谷氨酸释放的强度与a t p 相类似。 m e a t p ( 1 0 0 l m ；p 2 x 激动剂) 和b z a t p ( 1 0 0 m ；p 2 x 7 激动剂) 不能诱导谷氨酸 释放。与o x a t p ( 3 0 0 t z m ，1 h r ；p 2 x 7 拮抗剂) 不能抑制a t p 诱导的谷氨酸释放。去除 细胞外的n a + 或c a “离子亦未能明显地降低a t p 诱导的谷氢酸释放。p c i 一= g l u t a m a t e c s + 。由于扣除漏电流可能影响用斜波指令电压方法所测量的反转电 位，本实验采用了交替方法测量a t p 诱导电流反转电位。对于每一种离子 替代条件下采用两种钳制电位，其一是高于反转电位而另一个低于反转电 位。用电压钳制方式在获得稳定基线后施加a r 四( f i g 5 c ) 。所测量到的 电流在两种检测钳制电位下发生反转，因而亦证实了斜波指令电压所测量 的结果。 总之，以上结果与我们前述所提到的细胞膨胀激活的星形胶质细胞通 道相一致。无机离子k + 和c 1 一以及有机离子如谷氨酸和牛黄酸通过离子 通道的释放而使细胞体积得以恢复( k i m e l b e r ge ta 1 ，1 9 9 0 h a l le ta 1 ， 19 9 6 ，p a r k e r s o na n ds o n t h e r m e r ，2 0 0 3 ) 。 1 一替代c l 一后星形胶质细胞体积会受到阻制( p a r k s o na n ds o u t h e i m e r ， 2 0 0 3 ) 。l 一离子具有很强的对a t p 诱导通道的抑制作用，并且在用r 替代 c l 一离子后星形胶质细胞体积恢复受到阻滞。( p a r k s o na n ds o n t h e i m e r ， 2 0 0 3 ) 然而仅以全细胞记录的结果无法排除细胞内c a 2 + 增加可直接启动 谷氨酸通透性通道的可能性，但是增加1 5 高渗透压抑制了通道激活及谷 氨酸释放的实验结果明显地支持这一结论：即细胞膨胀是受体介导的c a “ 依赖性的谷氨酸释放所必需的。 3 大脑皮层脑片星形胶质细胞分支突起的图像研究 为了探讨是否a t p 刺激引发星形胶质细胞内c a 2 + 信号与完整组织中 细胞体积瞬时增加相联系，本实验采用绿色荧光蛋白( g f p ) 标记星形胶质 细胞并用双光子激光扫描显微镜( t w o p h o t o nm i c r o s c o p e ) 对星形胶质细胞 精细分支进行图像研究。用腺苷病毒结合增强型绿色荧光蛋白( g f e ) 注 入1 2 天龄的幼大鼠的大脑皮层中，两天后进行大脑切片并用双光子激光扫 描显微镜采集图像。腺苷病毒与胶质细胞高度结合，并且g f p 主要在皮层 的星形胶质细胞探测到( 1 i n oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在高倍显微镜下星形胶质细胞 的精细分支清晰显像( f i g 6 a ) 。在a t p 刺激前后2 分钟在z 方向( 0 5 t x m ) 多层取图像。在浴液中施加1 0 0 ma t p 非常显著显示星形胶质细 胞分支的膨胀( f i g 6 a ) 。细小分枝的膨胀明显大于较大分枝。小于0 6 t 。m 的分枝其直径的增加平均值为2 1 0 5 4 ( n = 6 0 ) ；分枝直径为 0 6 0 7 p , m 的其直径的增加平均值为1 0 2 3 1 ；分枝直径为0 7 0 2 7 8 斗m 的其直径的增加值为4 1 2 5 ( f i g 6 a ) 。丽a t p 所诱导的细胞 体积膨胀低于探测的阈值。对照液并未引起有意义的细胞膨胀。例如，分 枝直径为 9 5 ，n = 2 5 0 ) ( f i g 6 c ) ( s c h i p k ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。因此 可以得出结论：a t p 可显著地诱导离体脑片中星形胶质细胞的c a “信号 ( f i g 6 c ) ，这与以前在培养的星形胶质细胞上观察到结果一致( c o t r i n ae t a 1 ，1 9 9 8 ) ( g u t h r i ee ta 1 ，t 9 9 9 ) 。 采用全细胞膜片钳方法可以记录到在体星形胶质细胞a t p 诱导的电 流活动。在d i c 显微镜下星形胶质细胞呈现小胞体结构形态( 1 0 t x m ) ， 未可见其突起，其静息电位为( 一8 4 0 8m v ，n = 6 4c e i l s ) ，呈低输人阻 抗( 2 0m q ) 。因为据有广泛缝隙联结及高密度内向整流k + 通道，并且 不具有去极化所诱发的动作电位( k a n g e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。用灌有5 0 m mg l u t a - m a t e 的记录电极，在施加1 0 0 1 l l ma 口时可诱发一内向电流( 2 5c e l l s 3 4 c e l l s ) ，其电流幅度为2 5 44 - 3 l p a ，范围：5 3 5 6 0 p a ( f i g 6d a ) 。与在培 养的星形胶质细胞所记录的结果相类似。当电极加有1 0 m mb a p t a 或细 胞外加入1 0 0 t x mn p p b 时可以明显衰减a t p 诱导的内向电流( f i g 6 d b ) 。 本实验未能对脑片中a t p 诱导电流通道的离子通透性进行确切的测量，其 原因是在浴液中将n a c i 用n m d g 替代时星形胶质细胞发生去极化。 4 在体的星形胶质细胞与神经细胞间的相互作用 通道介导的星形胶质细胞谷氨酸释放是否在胶质细胞与神经元问信息 交流中发挥作用是一件非常重要的事。为了回答这个问题，本实验在离体 脑片上采用电场刺激来诱发星形胶质细胞的c a “传播，同时观察在c a “波 及范围内中间神经元的谷氨酸受体激活的电流。远场电刺激可靠地触发脑 片中c a “波的传播( q t x1 斗m ，f l u o - 4 a m 示踪) ，其平均扩展半径为1 6 8 0 - 2 8 4 - 9 7i x m 。将脑片预先与b a f f a a m ( 2 0 t z m ) 孵育3 0 分钟，可减小传播 半径为5 l ( f i g 7 c ) 。 非常有趣的是：电刺激与星形胶质细胞分枝的膨胀有关联，其变化度与 a t p 暴露相类似( f i g 6 b ) 。b a p t a a m 预孵育可抑制电刺激所引起的细 胞膨胀，这表明c a 2 + 信号是星形胶质细胞c a 2 + 波动相关联细胞体积增加所 必需的。 本实验还记录了星形胶质细胞c a ”波中中间神经元的全细胞电流 ( 1 4 0 一】5 0 l m ) 。该电流幅度可作为星形胶质细胞谷氨酸释放的标识 ( f i g 7 a ) 。星形胶质细胞的a 2 + 波引发了一个平均幅度为1 7 5 2 3 5 6 p a 的内向电流。该电流主要起源于离子型谷氨酸受体的激活，因为 c n q x a p 5 可减低该电流幅度达7 6 ( f i g 7 e ) 。与培养的星形胶质细胞 结果相似，n p p b 和高渗显著地拮抗了星形胶质细胞谷氨酸释放。n p p b 可 减低该电流达7 4 ，高渗可减低达6 0 ( f i g 7 e ) 。本实验还检测了在 t f x 缺失状态下b a f i l m n y c i na 1 降低s l p s c s 的频率达9 l ，然而n p p b 和 b a f i a a m 预孵育对s l p s c s 的频率无影响( f i g 7 e ) 。 以上结果表明：脑片中星形胶质细胞谷氨酸释放的方式具有与培养的 星形胶质细胞相类似的特性。具有显著意义的是：c a “依赖性星形胶质细 胞谷氨酸释放可被n p p b 和高渗所抑制，但b a f i l o m y c i na 无作用。 a b d 2 9 o 薹饿婚 萋 警铡 b 。墨紫 。p “7 ： 毳b 薹 噶熙 、* w c 。么 j 杉夕 一， n a y “，m 、2 参巷3 8 ， 一、e o i7 7 p 一，t ：莒 p a * 0 既, 4 女# c ；p 紫 。 。一 o 辫 n ：支= 盖 - 。气。一 o 芸 。 。二搿 m 一耋鎏 d ，h 。，= 盐 f i g 5 星形胶质细胞的c a 2 + 信号与可通透谷氨酸通道的激活相关 ( a ) 左图：a t p 诱导的培养星形胶质细胞内向电流。 本实验采用全细胞电压钳方式记录，钳制电压为一6 0 m v ，记录电极内液为1 0 0 m m c s + g l u t a m a t e2 3 r a mc s + g l u c o n a t e ，细胞外液为1 2 6 m mn m d g a t p 诱发一大的内向 电流。 ( a ) 当1 2 6 m mn a c i 替代n m d g 时，内向电流的幅度增加。 ( b ) 当k + g l u c o n a t e 替代细胞内液中的c s + g l u t a m a t e 时，记录到一小的外向电流。 ( c ) k g l u c n m d g ( d ) b a p t a ( 1 0 m m 在电极内液中) 可抑制该内向电流。 ( e ) 右图：a t p 诱导电流的平均幅度。去除细胞外液中的c a 2 + 时诱导出- j , 的没 有明显变化意义的内向电流( n m d g 在细胞外液中) 。用i