（神经生物学专业论文）gnrh对非洲爪蟾卵母细胞atp激活电流的调制.pdf

华中斟丝土孝固舟压荤瞎 龋士季佳论点 第一部分 g n r h 对非洲爪蟾卵母细胞a t p 激活电流的调制 中文摘要 本文采用双电极电压钳记录，在带有滤泡膜的非洲爪蟾 卵母细胞上观察了g n r h 激活电流及其对内源性a t p 激活电流 的调制。在7 1 个卵母细胞标本，外加g n r h 可引起三种类型的 反应：1 ) 内向电流( 2 3 9 ，17 7 1 ) ；2 ) 外向电流( 1 4 0 ，1 0 7 1 ) ； 3 ) 双相电流( 7 0 ，5 7 1 ) ；其余细胞( 5 4 9 ，3 9 7 1 ) 对g n r h 不敏感。我室已证明a t p 激活d 1 电流为p 2 x 、p 2 y 受体所介导， d 2 电流则主要为p 2 y 介导。在对a t p 敏感的4 7 个细胞预加 g n r h ( 1 0 “3 1 0 - 9 m o l l ) 一分钟后，对a t p 激活电流d 1 的影 响有三种情况：1 ) 增强作用( 6 6 o ，3 1 4 7 ) ：抑制作用( 6 4 ， 3 4 7 ) ；3 ) 无影响( 2 7 6 ，13 4 7 ) ；在出现d 2 电流的3 8 个 细胞中，g n r h 对d 2 电流的影响也有三种情况，1 ) 增强作用 ( 7 1 1 ，2 7 3 8 ) ；2 ) 抑制作用( 5 2 ，2 3 8 ) ：3 ) 无影响( 2 3 7 ， 9 3 8 ) ；此种增强效应与g n r h 激活电流的形式无吾滟仅有 d 1 成分的细胞上预加g n r h ( 1 0 。1 1m o l l ) ，发现有增强作用 ( n = 5 ) ；更换无n a + 的任氏液进行灌流，观察到i a t p d l 减小为 对照值的( 4 3 5 3 2 ) ；再预加g n r h ( 1 0 1 1m o l l ) ，发现 对i a t p 。d i ，仍有增强作用，且增强百分比近似。g n r h 对i a t p 。d i d 2 ，的增强作用是通过胞内转导机制完成的，主要是对p 2 y 受体功能的正性调制作用。y ， 关键词：双电极电压钳g n r hp 2 x 受体p 2 y 受体 ! ! 型苎查! 竺塑! ! 垡堡! j 坚堂 m o d u l a t o r y e f f e c to fg n r h o na t p a c t i v a t e dc u r r e n t s i no o c y t e so f x e n o p u s l a e v i s a b s t r a c t d u a l e l e c t r o d ev o l t a g ec l a m pt e c h n i q u ew a su s e dt os t u d yt h e c u r r e n t si n d u c e d b y g n r ha n dt h em o d u l a t i o n o f e n d o g e n o u s a t p a c t i v a t e dc u r r e n t s ( i a t r ) b yg n r hi nt h em e m b r a n eo ff o i l i c u l a r o o e y t e s o fx e n o p u sl a c y i s e x t e r n a l l y a p p l i e d g n r he l i c i t e d a n i n w a r dc u r r e n ti ns o m eo o c y t e s ( 2 3 9 ，1 7 7 1 ) ，a no u t w a r dc u r r e n t i ns o m eo t h e r ( 1 4 0 ，1 0 7 1 ) ，a n dab i p h a s i cc u r r e n tj na n o t h e rf e w ( 7 0 ，5 7 1 ) ，w h i l eal a r g ep r o p o r t i o no fo o c y t e ss h o w e du pc u r r e n t r e s p o n s e ( s 4 9 3 9 7 11 i th a sb e e ni d e n t i f i e di no u ri a bt h a td 1 c o m p o n e n t o fi a t pi sm e d i a t e db yb o t hp 2 xa n dp 2 yr e c e p t o r s ，w h i l e d 2c o m p o n e n tm a i n l yb yp 2 yr e c e p t or - w i t ht h ep r e a p p l i c a t i o no f g n r h ( 1 0 “1 0 4 m o i ，l 1t oa t p s e n s i t i v eo o c y t e sf o rlm i n ，t h ed l c o m p o n e n to fi a t i ，w a sp o t e n t i a t e d i na m a j o r i t y o ft h e o o c y t e s ( 6 6 0 ，3 1 4 71 ，i n h i b i t e di naf e w ( 6 4 ，3 4 7 ) ，a n ds h o w e dn o c h a n g ei n t h er e m a i n d e r ( 2 7 6 ，1 3 4 71 i n o o c y t e sr e s p o n s i v et o a t pw i t hd 2c o m p o n e n t p r e a p p l i c a t i o no fg n r he n h a n c e dt h ed 2 c n m p o n e n t i na l a r g e p r o p o r t i o no fo o c y t e s u l 1 ，2 7 3 8 ) ，i n h i b i t e d i naf e wf 5 2 ，2 3 81 ，a n ds h o w e dn oe f f e c tj nt h er e m a i n d e r t h e e n h a n c i n g e f f e c tw a si n d e p e n d e n to ft h ew a v e f o r mo ft h eg n r h a c t i v a t e dc u r r e n t s i no o c y t e s r e s p o n s i v et oa t po n l yw i t had 1 c o m p o n e n t ，p r e t r e a t m e n tw i t hg n r hi n c r e a s e di a t p ( d i ) ( n = 5 ) a f t e r s u b s t i t u t i o no fn r - f r e er e n g e r ss o l u t i o nf o rt h en o r m a l t h ed 1 c o m p o n e n tw a s r e d u c e db vo fi t s c o n t r 0 1 a n dc o u l ds t i l l b e e n h a n c e db yas i m i l a r p e r c e n t a g ea f t e rp r e a p p l i c a t i o no fg n r h r 1o “1 m o l l ) t h ee n h a n c i n ge f f e c to fg n r ho n a t p f o i d 2 ) w a sm e d i a t e db y i n t r a c e l l u l a rt r a n s d u c t i o nm e c h a n i s m s ，w h i c hr e s u l t e di nt h ep o s i t i v e m o d u l a t i o no fp 2 y r e c e p t o r k e yw o r d s ：d u a l e l e c t r o d ev o l t a g ec l a m p ；g n r h ，p 2 xr e c e p t o r ；p 2 yr e c e p t o r 2 华十科擅五学田两压学院 龋士母( 圣话主 1 前言 促性腺激素释放激素( g o n a d o t r o p i nr e l e a s i n gh r m o n e ，g n r h ) 在下 丘脑促垂体区合成后，以脉冲的形式分泌，特异性地与垂体内的促性 腺激素细胞结合，刺激腺垂体合成和释放促性腺激素( g o n a d o t r o p i c h o r m o n e ，g t h ) ，g t h 通过血液循环调节性腺中类固醇激素的合成分泌， 以及精子、卵细胞的发生、发育和成熟【l ，2 1 。在带有滤泡膜的非洲爪蟾 卵母细胞上存在g n r h 受体，而卵巢有一些类似g n r h 的肽类，具有 类g n r h 的活性【3 】。 在带有滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞标本上，外加a t p 所引起的内 源性a t p 电流( i a t p ) 可分为3 个成分，快内向电流( d 1 ) ，馒内向电 流( d 2 ) 和外向电流( h ) 。有关这些成分的离子机制也已有报道，认 为d 1 、d 2 电流均由g 蛋白耦联的p 2 y 受体所介导的c a 2 + 依赖c 1 通 道开放的结果f 4 矧。然而我室最近实验发现，d 2 电流的确是由g 蛋白 耦联的p 2 y 受体所介导的c d + 依赖c l 通道开放的结果；但d 1 电流不 仅包括有p 2 y 受体所介导的c d + 依赖c l + 电流，也存在有p 2 x 受体介 导的以n a 十为主的非选择性阳离子电导的增7 - 8 1 ，与y u v a l k u p i t z 的报道 相吻合f 9 1 。 本实验在非洲爪蟾卵母细胞使用双电极电压钳记录方法研究 g n r h 对a t p 一激活电流的调制作用及其机制。 ! ! 型苎查! 苎墨! ! 堕 一一一二生主主羔生笠生 2 材料与方法 本文所用非洲爪蟾卵母细胞的标本制备及双电极电压钳记录方法 见我室以往工作【7 8 “0 1 。本文略有不同，现概述如下： 2 1 卵母细胞标本的制备 实验用非洲爪蟾3 0 只( 由中国科学院上海细胞生物学研究所提 供) 。选择6 周内未取过卵母细胞的爪蟾，每只可循环取卵4 5 次，冰 麻3 0 分钟，待其四肢活动丧失后，将蛙置于手术器械盘内，在下腹部 外侧皮肤上做约l c m 的切口，同样于肌肉层切l e m 切口，拉出子宫瓣， 剪下1 3 个卵叶，将其移入盛有b a r t h 液的培养皿中。手术切口分层 缝合。 根据卵母细胞的成熟状况，可将其分为六期 t 卵母细胞成熟状况 细胞直径( g m ) 细胞形态特征 第1 期5 0 1 0 0呈透明状 第1 i 期 3 5 0 4 5 0呈半透明和白色 第1 i i 期 4 5 0 6 0 0 细胞表面部分着色 第期 6 0 0 10 0 0 细胞分成着色深浅不同的两个半球 两部分分界明显，深色部分中央颜 第v 期1 0 0 0 m 2 0 0 色稍浅 第期 1 2 0 0 13 0 0 两半球中有明显的非着色带 在体视显微镜下用游丝镊从卵叶分离出单个卵母细胞，挑选第v 一 期细胞用于实验。将单个细胞置于容积为i m l 的浴槽内，记录膜电 华呻科盐土幸而精压学忿 龋士季佳话主 流反应。浴槽内持续任氏液灌流，实验温度保持在2 0 - 2 4 。c 。任氏液 的成分为：n a c i9 5 m m o l l ，k c llm m o l l ，m g c l 2l m m o l l ，c a c l 2 1 m m o l l ，h e p e s5 ，用l m o l l 的n a o h 调p h 值为7 4 。 2 。2 电生理记录 采用双电极电压钳记录方法。电压电极与电流电极的尖端直径分别 为3 - 5 9 r n 和5 - 7 p m ，电极电阻分别为5 - 1 0 m ( ) 和01 l m f l 。参比电 极用a g a g c i 电极与浴槽相连。选择膜静息电位 一3 5 m v 的卵母细胞 进行记录，钳制电压置于一5 0m v 。所用仪器为o c 7 2 5 b 型电压钳放大 器( 美国w a r n e r 公司) 。用二道生理记录仪( l m s 2 b ，成都仪器厂) 记录膜电流反应。 2 3 药物 包括a t p ，g d p p s ，h e p e s ，【d a l a 6 一l h r t t ，【d p h e 2 ， d a l a 6 】- l h - r h 均由s i g m a 公司生产，氯化胆碱购于上海试n - - u 。 2 4 胞内药物透析 胞内药物透析可采用插入第三根电极微注射( 剂量不超过7 0 n l ) 或微电泳方式进行。本实验将药物溶于记录电极内，通过弥散作用而 进行透析。此方法完全弥散约需4 0 5 0 分钟。 2 5 数据分析 实验数据用e x e c e l l 进行统计分析，实验结果以均数标准误 ( m e a n _ s e ) 表示，显著性检验采用配对t 检验，统计图用s i g m a p l o t 软件绘制。 ! ! 壁苎查茎竺堡堡雯堕生兰皇蔓堑兰竺 3 实验结果 3 1 带滤泡膜的卵母细胞g n r h 一激活电流： 本实验在7 1 例细胞外加g n r h ( 1 0 。1 m o l l ) ，记录到三种电 流形式：1 ) 内向电流2 3 9 ( 1 7 7 1 ) ；2 ) 外向电流1 4 o ( 1 0 7 1 ) ； ( 3 ) 双相电流7 o ( 5 7 1 ) ；其余细胞5 4 9 ( 3 9 7 1 ) 对g n r h 不敏感( 图1 ) 。 i2 s “ 图1 不同类型的g n r h 激活电流 f i g 1 d i f f e r e n tp a t t e r n so fg n r h a c t i v a t e dc u l t c f i t s 华哮科丝土学帕琦a i 学陵龋士学佳话盘 3 1 1 本文对出现率较高的两种电流形式即内向和外向电流作了 初步研究，发现二者均具有浓度依赖性。但其激活有效浓度范围 有所不同( 图2 ) 。 a b 口 v 工 5 ； 点 i 巨 呈 。n r hc o n c e n t m t l o n ( m o l n ) 1 0 ”l0 “ 1 0 。0 l 1 0 l 】 10u 1 0 i l 1 0 i o g n r hc o n c e n t r a t i o n ( m o l a 图2 g n r h 激活内向及外向电流量效曲线 f i g 2 c o n c e n t r a t i o n r e s p o n s er e l a t i o n s h i p f o r g n r h a c t i v a t e dc u r r e n t a o u t w a r dc u r r e n t c o n c e n t r a t i o n r e s d o n s e r e l a t i o n s h i pc u r v e ( n = 5 ) ；b i n w a r dc u r r e n t c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i pc u r v e ( n = 6 ) 广 一 1 o 。v=pglz 华牛科艇太孝呻两医学瞳龋t 孝住话土 3 1 2 应用双刺激法检测g n r h 一激活内向电流去敏感的恢复时 程，发现间隔9 分钟后外加g n r h ( 1 0 。m o l l ) 引起的电流与第一次 相等，所以g n r h 激活内向电流去敏感恢复时i 司为9 分钟( 图3 ) 。 a c o n t r o ll m i n 3 m i n5 m i n7 m i n 9 m i n b 一一一扩旷 羞 矗 ： 占 皇 匣 0 5 0 02d 681 0 t i m f ( m i a ) 图3 g n r h 激活内向电流恢复时程 f i g 3 t i m ec o u r s eo ft h er e c o v e r yo fg n r h - a c t i v a t e di n w a r dc u r r e n t 华母科挂土亏固两压学院再士季( 苎诒盘 3 1 3g n r h 激活之内向电流的电流电压关系 如图4 所示，g n r h 激活之内向电流的逆转电位在一7 0 m v 左右 ( n = 5 ) ，接近钟离子的平衡电位，推测可能为电压依赖性k + 通道关闭所 致。 析。 自电赢， 土、 1 h p 一1 0 0 。8 0 ! 2 。 弋一- 4 图4 g n r h ( 1 0 m o l l ) 激活的内向电流一电压关系 f i g 4 c u r r e n t v o l t a g er e l a t i o n s h i p f o rg n r h a c t i v a t e d i n w a r d c u r r e n t g n r h 一激活之外向电流及双相电流凶出现率较小，未作进一步分 3 2 带滤泡膜的卵母细胞a t p - 激活电流 在未去滤泡膜的卵母细胞标本上进行电压钳实验，共检测了9 7 个细胞，其中8 7 例对a t p 敏感，所记录到的a t p 激活电流( i a t p ) 包括三种成分：快内向电流d 1 ，慢内向电流d 2 和慢外向电流h 。各 种成分的出现率( i n c i d e n c e ) 约为：】) d 】+ d 2 + h ( 7 4 7 ，6 5 8 7 ) ： 兰! 型兰查雯苎堡! 兰堕 矍! 竺丝主 2 ) d i + h ( 1 7 3 ：1 5 8 7 ) ；3 ) d i + d 2 ( 5 7 ；5 8 7 ) ；4 ) d 1 ( 2 3 ； 2 8 7 ) 。根据3 种成分出现率的不同，本实验所观察到的a t p 激活电 流表现为四种基本类型。但同一蛙体各个卵母细胞对a t p 的反应电流 的形式基本相同( 图5 ) 。 d l + d 2 d l + h d l + d 2 + h d l i2 5 r t h l 2 4 s 图5a t p 激活电流的四种类型 f i g 5 d i f f e r e n tp a t t e r n so fa t p a c t i v a t e dc u r r e n t s c u r r e n tt r a c e ss h o wt h r e ec o m p o n e n t so fa t p - a c t i v a t e dc u r r e n t s i nd i f f e r e n tc o m b i n a t i o n ：l a t e d i ) f a s tt r a n s i e n ti n w a r dc u r r e n t ；i a t p ( d 2 ， s l o wl o n g l a s t i n gi n w a r dc u r r e n t ；l a t e h ，o n w a r dc u r r e m 0 华巾甜蓝五学田衙压学院 龋t 亏世话土 3 3g n r h 对a t p 激活电流的增强作用 3 3 1g n r h 对i a t p ( d l ，及i a t p ( 1 ，2 ) 电流的增强作用 在4 7 个对a t p 敏感的细胞( 包括仅出现d 1 电流( 5 例) 及合并其它电流形式( 4 2 例) ) 预加g n r h ( 1 0 。3 1 0 - 9 m o l l ) 一 分钟后，对a t p 激活电流d 1 的影i 响有三种情况：1 ) 增强作用 ( 6 6 o ，3 l 4 7 ) ；2 ) 抑制作用( 6 4 ，3 4 7 ) ；3 ) 无影响( 2 7 6 ， 13 4 7 ) ；在出现d 2 电流的3 8 个细胞中，g n r h 对d 2 电流的影 响也分为三种情况，1 ) 增强作用( 7 1 1 ，2 7 3 8 ) ：2 ) 抑制作 用( 5 2 ，2 3 8 ) ：3 ) 无影响( 2 3 7 ，9 3 8 ) ：在以上实验中仅 一例表现为对d 2 增强，而对d 1 抑制。g n r h 对d l d 2 电流的 增强与g n r h 的浓度有关，在1 0 。3 一1 0 - 9 m o l l 范围内曲线成钟形， 即从1 0 - 1 3 m o l l 开始，g n r h 增强i a t p 。d d 2 ，的作用随浓度增加 而增大到达峰值后( d 1 为l0 。m o l l ：d 2 为10 - 12 m o l l ) ，g n r h 浓度增加，此种i a - fr , d l ，d 2 ，增强作用反而逐步减小。如图6 所 示。g n r h 对d 1 电流的增强作用与g n r h 本身是否引起电流 及电流形式、大小无关。因d l 电流出现率高，且便于测量，故 本实验主要以d 1 电流成分为研究对象。 竺! 型苎查兰竺曼! 兰堡兰! j 坐 a b c 。”一一一 i2 5 n 2 4 # 0 n n nc o n c e a t r a i lo r l ( r m o v lj 图6 不同浓度的g n r h 对i a t p t d i d 2 ，的增强作用 f i g 6 d o s e r e s p o n s e c u r v ef o rp o t e n t i a t i o no fi a t p ( d 1 d 2 ) b yg n r h a a ne x a m p l eo fs i n g l eo o c y t er e c o r d i n go f i a t p ( d 1 ) ( 1 0 一m o l l ，h p = 一5 0 m y ) p r e t r e a t e dw i t hg n r h ( 1 0 “t o o l l ) ： b a l l e x a m p l e o f s i n g l e o o c y t er e c o r d i n g o f i a t p ( d 2 ) ( 1 0 - 3 m o l l ，h p = - 5 0 m v ) p r e t r e a t e d w i t h 2 。3：l 一。f 一。箸 华巾科拉走季呻两廛学瞳 龋士荤佳话主 g n r h ( 10 “m o l l ) ；c t h ed o s e r e s p o n s ec u r v ef o rp o t e n t i a t i o n o f i a t p ( d 1 d 2 ) b yg n r h ( 1 0 “m o l l ) ( n 2 6 ) 3 3 2g n r h 增强i a t p 。d l ，电流与a t p 浓度之间的关系 图7 所示为预加和不预加g n r h 的i r p ( d i ，电流的量效曲线。 从图中可以看出：1 ) g n r h + a t p 量效曲线与单独的a t p 量效曲线比 较，前者显著上移，说明预加g n r h 列i a t i ) 【d l ，电流有明显的增强作用： 2 ) g n r h + a t p 量效曲线中最大浓度的幅值较之单独的a t p 量效曲线 幅值增强达一倍以上，在a t p 最大浓度为1 0 - 3 m o l l 时两者分别为 2 2 43 和1 0 0 ：3 ) 预加g n r h 前和之后a t p 量效曲线的e c 5 0 值 非常接近，分别为1 0 - 4 m o l l 和7 1 0 - 3 m o l l 。 ： 气 i 羔 日 l t o z 1 0 7 1 0 1 0 4 10 1 c 41 041 0 l a t pc o n c e n t r a t i o n ( m 0 1 i ) 图7 有或无g n r l - 存在时i 盯p _ i ) l ，电流的浓度效应曲线 f i g 7 c o n c e n t r a t i o n r e s p o n s er e l a t i o n s h i p f o ra t pc u r r e n t sw i t h ( ) a n dw i t h o u t ( ) p r e a p p l i c a t i o no f g n r h ( 1 0 川m o l l ) t h e g r a p h s h o w st h e c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s ec u r v e sf o ri x r p d lw i t ha n dw i t h o u t 1 3 ! ! 型苎查雯竺璺! 雯苎生三主! ! 兰生 p r e a p p l i c a t i o n o f g n r h ( 1 0 ”m o l l ) e a c hp o i n t r e p r e s e n t s t h e m e a n j ：s e m o fi a t p d1o f4 7o o c y t e sa l li a t p d c u r r e n t sw e r en o r m a l i z e d t ot h ed e a kc u r r e n ti n d u c e db y1 0 。3 m o l la t p h o l d i n gp o t e n t i a lw a ss e ta t 一5 0 m v t h ec u r v ef o ra t pa l o n ei s ag o o df i to fd a t at ot h el o g i s t i c e q u a t i o ny + e m a x 【1 + ( k d c ) “ ，w h e r ec i st h ec o n c e n t r a t i o no fa t p ；y , t h e n o r m a l i z e dc u r r e n t s e x p r e s s e d a sf r a c t i o no ft h em a x i m u mc u r r e n t r e s p o n s ev a l u e k d t h ed i s s o c i a t i o nc o n s t a n to fa t pr e c e p t o r ( n 2 5 ) 3 4g n r h 增强i a r f j ( d f l 电流机制的分析 3 4 1i a t p i d l l 由p 2 x 、p 2 y 受体共同介导的证明 掘已有报道，认为d 1 电流同d 2 电流同样全部由g 蛋白耦联的 p 2 y 受体所介导的c a 2 + 依赖c 1 通道丌放的结果1 4 - 6 1 ，但我室以往实验【7 8 1 及以下实验证明：d 1 电流不仅包括有p 2 y 受体所介导的c a ”依赖c 1 _ 电流，也存在有p 2 x 受体介导的以n a + 为主的非选择性阳离子电导的增 加。因p 2 x 和p 2 y 受体均无特异性激动剂及阻断剂，故本实验采用离 子置换、胞内透析方法对d 1 电流进行分离及g n r h 增强i a t p ( d b 电流机 制的分析。 1 ) 除去任氏液中的n a + 对i a t p 。d l ，d ，的影响 本实验采用离子置换方法对d 】成分进行研究，以分离其不同成分。 应用等摩尔浓度的氯化胆碱替代任氏液中的n a c l ，配制成无n a + 的任氏 液。在同细胞上分别用任氏液和无n a + 的任氏液灌流，发现：在无 n a + 任氏液中的i a t p 的d 1 较正常任氏液中的i a t p 的d 1 明显减小( n = 7 ) ( 图8 ) 。 堡! 型苎查! 竺塑! 茎堕堡! 二! j 坚 a b c o n t r 0 1 a t p l o 4 m n a + 一f r e e a t p l 0 。q m c o i i n o l 无n a + 任氏液 i2 s n a l 2 4 s 图8 去除任氏液中n a + 对a t p 激活电流d 1 成分的影响 f i g 8 e f f e c t o fn a + - f r e er i n g e r ss o l u t i o no ni a t i ，。d i ，a a n e x a m p l eo f t h ed e c r e m e n to i i 朋ij _ d i ，a sc o m p a r e d w i t h t h ec o n t r 0 1 b h i s t o g r a ms h o w st h a ti ar p id i ) d e c r e a s e di nn a + 一f r e er i n g e r s s o l u t i o n ( + p 0 叭) 薯=叫v_自v自膏 ! ! 型苎查翌竺塑! ! 堡 二生三羔羔兰兰苎 2 ) 改变任氏液中c 1 浓度对1 a t ecd l ，d ，) 的影响 实验将任氏液中的c l 一用等摩尔浓度的s 0 4 2 。置代，逐步减少任氏 液中的c l 一含量，如图9 所示随着c 1 含量的减少，1 a t pc d 2 ) 的幅值逐 步增大，当c l 减少至5 m m o l l 时i a t p 。d 2 、的幅值增大到对照组值的 1 0 倍之多；d 1 电流也随着c l 。含量的减少而逐步增大，但当c l 。减少 至5 m m o l l 时，d l 幅值增大只达到对照组的2 倍( n = 1 2 ) 。说明d 1 电流成分中除了由p 2 x 受体介导的以n a + 内流为主的离子外，也含 有p 2 y 受体介导的c l 。电流成分；而d 2 电流全部为p 2 y 受体介导的 c l _ 电流。 c l c o n e e n t r a t i o n ( m m o l l ) 图9 任氏液中c l 。含量改变对【a t p 。d i f d 2 、的影响 f i g 9 e f f e c to fc i 。c o n t e n ti nr i n g e r ss o l u t i o no ni a t p ( d | d 2 ，h i s t o g r a ms h o w st h a tb o t hi p j pl d a n di a t pt d 2 ) i n c r e a s e d w i t ht h ed e c r e m e n to fc 1 c o n t e n ti nr i n g e r ss o l u t i o n 置h_lj dah【1目_h口鼻 华巾科址土学帕 _ 弁压学睫 龋士学佳话土 3 ) 胞内透析g d p b s 对l x r p 。d 1 d 2 ，的影响 已知d 2 电流全部为g 蛋白耦联的p 2 y 受体介导的c a ”依赖性的 c l 。电流，为将其与p 2 x 受体介导的f 乜流分离，本文应用g d p - p s ( 一 种非水解的g d p 类似物，5 0 0 u m o l l ) 进行胞内透析( n = 6 ) 。观察到 透析后，d 1 电流逐渐减小，5 0 分钟时为对照的( 5 6 0 4 - 2 1 ) ；d 2 电流随透析时间明显减小，5 0 分钟后基本稳定，仅为对照的( 5 0 0 2 ) 。 进一步证实了d 1 电流中有p 2 x 受体介导n a + 内流的成分。 扩卜厂 卜一 l 一一 3 0 r a i n k 卜 5 0 r a i n l2 5 “ 2 4 s 华中科盐太事田两压学拄 踊士髫佳话支 b 图io 胞内透析g d p 1 3 s 列1a r j ，。叫d 2 ，的影响 f 嘻10 e f f e c to fi n t r a c e l l u l a rd i a l y s i so fg d p b s ( 5 0 0 u m o l l ) o i li x r el d i d 2 ， 3 4 2g n r h 对d 1 的增强主要是作用于p 2 y 受体 如图1 l 所示在仅有d 1 成分的细胞上预加g n r h ( 1 0 1 im o i l ) ， 发现对1 0 3 m o l l 的a t p 激活电流有增强作用( n = 5 ) ；更换无n a + 的任氏液进行灌流后，观察到i a t p 吲，减小为对照值的( 4 3 5 3 2 ) ；再预加g n r h ( 1 0 “m o l l ) ，发现对ia t i ，。d l ，仍有增强作用，且 增强的百分比与正常任氏液时近似( n = 4 ) 。 ! ! 型竺查! 苎塑! ! 堕丝三j 丝兰 g h r h1 0 l - m v l 正常任氏液n a + f r e e 任氏液 图1 1 无钠任氏液灌流时g n r h 列a t p 激活电流d 1 的增强作用 f i g 1 1 p o t e n t i a t i o no f i a r p 。d 1 ) b y g n r h ( 1 0 。“m o l l ) i n n a + f r e e r i n g e r s s o l u t i o n 3 4 实验发现g n r h 受体拮抗剂 d - p h e ! ，d - a a 6 l h r h 不能消除g n r h 对a t p 激活d l 电流的增强作用，且其本身亦可引起外向电流，并具有 增强a t p 激活d 1 电流的作用，其机制尚待进一一步研究。 4 讨论 1 9 7 1 年首先从羊的下丘脑分离出促性腺激素释放激素 ( g o n a d o t r o p i nr e l e a s i n gh r m o n e ，g n r h ) 。以后进一步证实，哺乳类， 包括人类在内具有同一g n l h 化学结构，而两栖类的g n r h 则有不同 的结构【l l 】。本实验在7 1 例细胞外加g n r h ( 1 0 。1 m o l l ) ，记录到三种 电流形式，其中内向电流2 3 9 ( 1 7 7 1 ) ，外向电流1 4o ( 1 0 7 1 ) ， 双相电流7 o ( 5 7 1 ) ，其余细胞5 4 9 ( 3 9 7 1 ) 对g n r h 不敏感。其 电流反应形式表现多样性，内向电流的逆转电位接近钾离子的平衡电 ! ! 型些查茎竺堕! 耋堡! 生l 生坐 位，推测其为钾离子通道( m 通道) 关闭所致：与以往报道符合，被 认为与细胞膜的兴奋性有关【1 2 , 1 3 1 。外向电流及双相电流的离子机制尚 不清楚，有待进一步研究。 g n r h 的功能是由g n r h 受体介导的。g n r h 受体为g 蛋白耦联 受体，由7 个跨膜结构域组成，但缺乏胞内c 术端结构域( 胞内c 术 端尾部对脱敏和内化十分重要) 1 1 4 1 。列g n r h 受体的研究多以原代培 养的垂体促性腺细胞或垂体促性腺细胞系a t 3 1 为模型，证明其信号 转导是通过与g 蛋白耦联的磷酸肌醇途径及c a 2 + 动员介导完成的：首 先是经g 蛋白耦联引起磷酯酶c ( p l c ) 激活，导致磷酸肌醇水解为 i p 3 和d a g ，然后i p 3 诱发c a 2 + 库释放c a 2 + ；同时激活电压依赖性的 c a 2 + 通道( v s c c ) ，使细胞外c a 2 + 进入细胞内，打开c a 2 + 依赖性的k _ 通道。c a ”和d a g 激活p k c ，接着细胞内钙和p k c 相互作用从而对 细胞内反应调控删。 g n r h 对a t p 激活电流d l d 2 成分均有增强作用，且增强百分比 近似。已知d 2 电流全部为p 2 y 受体介导的c i 电流：本实验证明d 1 电流部分为p 2 y 介导的c l 电流，部分为p 2 x 受体介导的n a + 内流。 聂辉证明p 2 y 受体激活后通过p k c 和钙调蛋白转导，受体自身磷酸化， 正反馈增加氯离子通道的开放；同时可磷酸化p 2 x 受体，进而抑制 d 1 成分中p 2 x 受体介导的n a 十内流i m i 。匡朋亦在蟾蜍背根神经节细胞 上证明g n r h 可通过胞内p k c 途径抑制p 2 x 受体激活的电流 1 7 1 。所 以d 2 电流的增强应为c l 外流增多引起；g n r h 增强a t p 激活d 1 电 流，在更换为无n a + 的任氏液进行灌流后，仍具有增强作用，且增大 的幅值近似，所以推断g n r h 增强的d 1 电流也是由p 2 y 受体介导的 c 1 - 夕h 流增加造成的。 综上所述，推测g n r h 增强a t p 激活d i d 2 电流的机制可能为： 竺! 型苎查! 竺塑! ! 堡旦塑坚 g n r h 作用于g n r h 受体后，通过g 蛋白耦联激活磷酯酶c ( p l c ) ， 磷酸肌醇水解为i p 3 和d a g ，然后i p 3 促使胞内钙库释放c a ”，并激 活电压依赖性的c a 2 + 通道( v s c c ) ，使细胞外c a ”进入细胞内，激活 钙调蛋白：d a g 激活p k c 。二者共同作用使p 2 y 受体磷酸化，c i 一外 流增加，从而导致a t p 激活d 1 d 2 电流增强。同时g n r h 也可能通过 胞内转导机制抑制p 2 x 受体介导的n a + 内流，但是其对p 2 y 受体介导 的c l 外流增加幅度超过n a + 内流减小的i 幅度，故在多数细胞上表现为 d 1 电流增强：当然g n r h 也可能对p 2 x 介导的成分亦有增强作用( 图 1 2 ) 。 5 结论 ( 1 ) a t p 作用于非洲爪蟾卵母细胞，激活共存的p 2 x 及p 2 y 受体。 ( 2 ) a t p 所激活的d 2 电流为p 2 y 受体介导的c a ”依赖性c l 外流； 而d 1 电流则是由p 2 x 和p 2 y 受体共同介导产生的，既包含c a 2 + 依赖 性c l 。外流，又包含主要为n a + 的非选择性阳离子内流成分。 ( 3 ) g n r f l 作用于非洲爪蟾卵母细胞，可激活g n r h 受体，产生内向、 外向及双相电流。 ( 4 ) g n r h 对【a t p 。d 2 ，均有增强作用。 ( 5 ) g n r h 对 a t p t d i d 2 ，的增强作用是通过胞内转导机制完成的，主 要是对p 2 y 受体功能的正性调制作用。 ! ! 型苎叁! 竺塑! 茎堕 ! ! 一兰竺竺 一若，i口暑tv_j0善=三=。苫li。lsu_=o【fhi嚣iii)ik。tn_【盘lk 疆举蛄hg器驿s器脚no，iq蜒裁山-l2圃 苫名。罪弱札眦 篮卜n ( i t x n l 篮z e = u - - 一 【d=c日上。+)i ；c。屯口厶dp_u - ! ! 型苎查翌竺塑! ! 堡 堡! 童堡丝 参考文献 1 s c h a i l ya v , a r i m u r aa ，b a b ay n a i rr m ，m a t s u oh ，r e d d i n g t 、m d e b e l j u kl ：i s o l a t i o na n dp r o p e r t i e so ft h ef s h a n dl h - r e l e a s i n g h o r m o n e b i o c h e m b i o p h y s r e sc o m m u n1 9 7 1 ；4 3 ：3 9 3 - 3 9 9 2 c l a y t o nr n ，c a t tk j ：g o n a d o t r o p i n r e l e a s i n gh o r m o n er e c e p t o r s ： c h a r a c t e r i s a t i o n ，p h y s i o l o g i c a lr e g u l a t i o n ，a n dr e l a t i o n s h i p t o r e p r o d u c t i v ef