（神经生物学专业论文）钠尿肽在大鼠视网膜无长突细胞上的表达.pdf

缩略语及符号 缩写英文名称 p m m i c r o m e t e r a ca m a c r i n ec e l l a n pa t r i a ln a t r i u r e t i ep e p t i d e b c b i p o l a rc e l l b n pb r a i nn a w i u r e t i cp e p f i d e c g m p g u a n m i n e - 3 5 - c y c l i cm o n o p h o s p h a t e c h a tc h o l i n ea c e t y l t r a n s f e r a s e c n p c - t y p en a t r i u r e f i cp e p t i d e c n sc e n t r a ln c r v o n ss y s t e m g a b a 7 - a m i n o b n t y r i ca c i d g c g u a n y l y lc y c l a s e g c l g a n g l i o nc e l ll a y e r g l y g l y c i n e 1 n li n n e rn u c l e a rl a y e r i p li n n e rp l e x i f o r ml a y e r n pn a t r i u r e t i cp e p f i d e n p rn a t r i u r e t i cp e p f i d er e c e p t o r o n lo u t e rn u c l e a rl a y e r o p lo u t e rp l e x i f o r ml a y e r p a r p a r v a l b u m i n t h t y r m i n eh y d r o x y l a s e 中文名称 微米 无长突细胞 心房钠尿肤 双极细胞 脑型钠尿肽 3 ，5 ，一环鸟苷酸 乙酰胆碱转移酶 c 型钠尿肽 中枢神经系统 卜氨基丁酸 鸟苷酸环化酶 神经节细胞层 甘氨酸 内核层 内网层 钠尿肽 锄尿肽受体 外核层 外两层 钙离子结合蛋白 酪氨酸弪化酶 4 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示的谢意。 作者签名：e t 期 论文使用授权声明 本人完全了解复且大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：导师签名：日期 一、中文摘要 钠尿肽( n a t r i u r c t i cp e p t i d e ，n p ) 是一类有高同源性氨基酸序列组成的肽类物 质，它们都拥有一个结构相似的1 7 个氨基酸组成的内环。n p 家族主要包括三个 成员：心房钠尿肽( a t r i a ln a t r i u r e t i cp e p t i d e , a n p ) ，脑型钠尿肽( b r a i nn a t r i u r e f i c p e p t i d e ，b n p ) 和c 型钠尿肽( c - t y p e 衄t r i u r 舐cp e p t i d e ，c n i ) 。n p 通过与三种 特异的钠尿肽受体( n a t r i u r e t i cp e p t i d er e c e p t o r ，n p r ) 结合而在中枢神经系统 ( c n s ) 中发挥其神经调质的作用。在本工作中，我们通过免疫荧光双标和共聚 焦显微镜技术检测了a n p ，b n p 和c n p 在大鼠视网膜无长突细胞( a m a c r i n ec e l l ， a c ) 不同亚型上的分布模式。这三种n p 在乙酰胆碱转移酶( c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e ，c t u 玎) 标记的胆碱能a c 和酪氨酸羟化酶( t y r o s i n e h y d r o x y l a s e ，t h ) 标记的多巴胺能a c 上都有表达，免疫标记出现在这些神经 元的胞膜，胞浆以及突起上。而钙离子结合蛋i 白- p a r v a l b u m i n ( p v ) 标记的甘氨 酸能a c 的胞膜上只有很微弱的、点状分布的b n p 阳性反应产物，胞浆中则无 阳性标记。这些结果提示，n p 可能在a c 中生成，并在内层视网膜中起到神经 调质的作用。结合我们先前的免疫组织化学结果：钠尿肽受体- b ( n p r b ) 在培 养的大鼠视网膜g a b a 能a c 上有表达，推测在a c 中合成的n p 可能调节其本 身的活动。 关键词：钠尿肽；无长突细胞；免疫荧光双标；共聚焦显微镜；视网膜 中图分类号：q 4 2 5 二、英文摘要 n a t d u r e t i cp e p f i d e s ( n p s ) ，i n c l u d i n ga t r i a ln a t r i u r e t i cp e p t i d e ( a n p ) ，b r a i n n a t r i u r e t i cp e p t i d e ( b n p ) a n dc - t y p en a t r i u r e t i cp e p t i d e ( c n p ) ，c o m p r i s ea f a m i l yo f s t r u c t u r a l l yr e l a t e dp e p t i d e s ，w h i c hs h a r ea1 7 - a m i n oa c i di n t e r n a lr i n g t h e ym a ya c t 硒n e u r o m o d u l a t o r st h r o u g ha c t i v a t i o no ft h r e es p e c i f i c 他c e p t o rs u b t y p e so i p i 勘i n t h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ( c n s ) i nt h ep r e s e n ts t u d yw ee x a m i n e dt h e e x p r e s s i o no f a t r i a ln a t r i n r e t i c p e p t i d e ( a n p ) ，b r a i nn a t r i n r e t i cp e p t i d e ( b n p ) ，a n dc - t y p e n a t r i u r e t i cp e p t i d e ( c n p ) o nd i f f e r e n ts u b t y p e so fr e t i n a la m a c r i n ec e l l s ( a c s ) i nr a t b yi m m u n o f l u o r e s e c e n c ed o u b l el a b e l i n ga n dc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y a l lt h r e en p sw e r em o d e r a t e l ye x p r e s 靶di n c h o l i n e r g i ca n dd o p a m i n e r g i ca c s 。 s t a i n e db yc h o l i n ea c e t y l t r a n s f e r a s c ( c h a t ) a n d t y r o s i n eh y d r o x y l a s e ( n d ， r e s p e c t i v e l y t h ei m m u n o s t a i n i n ga p p e a r e do nt h em e m b r a n e ，c y t o p l a s ma n d s o n m t o d e n d r i t i cc o m p a r t m e n t so ft h e s ea c s i na i ig l y c i n e r g i ca c s ，l a b e l e db y p a r v a l b u m i n 口v ) ，h o w e v e r , o n l yf a i n tp u n c t a t es t a i n i n gf o rb n pi so b s e r v e do nt h e m e m b r a n eo ft h e s ec e l l s ，i fa n y , w a ss e e n t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tn p sc o u l db e p r o d u c e di na c sa n dp l a yan e u r o m o d u l a t o r yr o l ei nt h ei n n e rr e t i n a t o g e t h e rw i t ha p r e v i o u si m m u n o c y t o c h e m i c a ls t u d y , s h o w i n gt h a tn p r - bi sp r e s e n ti nc u l m r e dr a t o a b a e r g i ca c s ，o u rr e s u l t sf i l r 0 1 e rs u g g e s tt h a tn p sp r o d u c e di na c sm a ya l s o m o d u l a t et h e i ro w n a c t i v i t y k e y w o r d s ：n a t r i u r e t i cp e p t i d e ；a m a c r i n ec e l l ；i m m u n o f l u o r e s e c e n c ed o u b l el a b e l i n g ； 6 c o n f o c a ll a s e rs c a n n m g m i c r o s c o p y ；r e t i n a 中图分类号：q 4 2 7 三、正文 ( 一) 引言 钠尿肽( n a a i m e f i ep e p t i d e ，n p ) 属于神经肽家族，是一类结构相似的肽 类物质的总称，其中包括心房钠尿肽( a t r i a ln a u i u r e t i cp e p t i d e ，a n p ) ，脑型钠尿 肽( b r a i nn a u i u r e f i cp e p t i d e ，b n p ) 和c 型钠尿肽( c - t y p en a t r i u r e t i cp e p t i d e ， c n p ) 【1 - 4 。a n p 9b n p 和c n p 尽管基因来源完全不同，但是结构相似，均具有 一个高度保守的1 7 个氨基酸组成的环状结构( 图1 ) 。 翁” 图1 州。刚p 越，伽和o n p n 结构示意图。a n p ，叫p 和c n p 均具有一个1 7 个氨基酸组成 的功能内环。 a n p 是由心肌细胞分泌的一种多肽，d eb o l d 【5 】首次在大鼠心脏中发现了 a n t 。a - h a n p 为2 8 肽，是a n p 的主要活性形式【6 】。a n p 具有调节钠尿排泄、 利尿及舒张血管的作用。与此相应，n o v a c k 和l e o p o l d 曾报导a n p 在眼内能调 节眼内压 7 】。 b n p 于1 9 8 8 年由日本学者m a t m o 从猪脑中首先分离出来，因此命名为脑 8 钠尿肤【8 】。后来发现心肌细胞也能合成b n p 。b n p 的氨基酸序列，特别是功能 性c 端的氨基酸序列，与a n p 结构非常相似。在中枢神经系统，b n p 主要以 b n p 2 6 和b n p 3 2 两种小分子形式存在，并发挥其作用 9 1 。a n p 和b n p 均有利钠 利尿、舒张血管以及降低血压的作用，且作用机制也基本相同。在中枢神经系统 中，b n p 的含量高于a n p ，约为a n p 的1 3 倍。 c n p 是与a n p 结构同源的多肽 1 0 - 1 2 ，但是c n p 的分子结构与a n p 和b n p 不同，c n p 并无c 末端 1 3 ，1 4 。在中枢神经系统中，c n p 以c n p 2 2 和c n p 5 3 两种形式存在 1 5 】。c n p 能使外周血管扩张，血压降低，但没有a n p 、b n p 那 样的利钠利尿的作用。 n p 通过与胞膜上的n p 特异性受体( n a t r i u r e t i cp e p t i d er e c e p t o r , n p r ) 相结合 而发挥其生理功能。目前为止，发现n p 的受体主要有三类：n p r - a ，n p r - b 和 n p r - c 1 6 - 1 8 。图2 显示了钠尿肽家族与其相对应的受体结合示意图。其中，a n p 主要与n p r - a 和n p r - c 结合；b n p 主要与n p r - c 结合，而与n p r - a 的亲和力较低； c n p 主要与n p r - b 和n p r - c 结合 1 9 - 2 1 。n p r - a 和n p r - b 为同一亚型，均为鸟苷 酸环化酶( g u a n y l y lc y c l a s e ，g c ) 受体，它们的分子同源性很高【1 9 】。g c 有两种不 同的受体( g c - a 和g c b ) ，而a n p 、b n p 和c n p 与它们的亲和力也不同，与g c - a 的亲和力：a n p _ b n p c n p ；与g c - b 的亲和力则相反：c n p a n p _ b n p 2 h 。 n p r - a 和n p r - b 主要是通过激活g c 使胞内c g m p 水平升高而起调控作用 【1 8 ，2 2 ，2 3 1 ，n p r - c 则完全不同，它不含有g c 的结合位点，可能经g 蛋白介导抑 制腺苷酸环化酶或者通过激活磷酸肌醇通路进行信号传递 1 4 ，2 4 。 9 a n p b n p c n p | 、 o n p r c p r - a p r b 胞外胞内 图2 钠尿肽家族成员与其相应受体结合示意图 g t p c g m p 视觉是最重要的感觉，至少7 0 以上的外晃信息由视觉系统接受、处理和感 知。视网膜中光信息转换和处理过程是视觉系统的起始点。所有脊椎动物的视网 膜均按同一基本模式组织起来( 图3 ) ：两个突触层( 外网状层和内网状层) 插 在三层细胞( 外核层、内核层和神经节细胞层) 间 2 5 】。光线进入眼球后，被最 远端的光感受器外段吸收，触发整个视觉过程。视觉信息传递的纵向通路是：光 感受器一双极细胞一神经节细胞，而水平细胞和无长突细胞则分别在外网状层和 内网状层起横向的信号整合作用。 脊椎动物视网膜的内网状层( i p l ) 呈现高度复杂的神经网络，双极细胞 ( b c ) 、无长突细胞( a c ) 和神经节细胞( g c ) 在这里互相形成广泛的突触 联系 2 5 1 。a c 是视网膜的第三级神经元，其胞体通常位于内核层近端，而有部 分a c 的胞体移位于神经节细胞层内，被称为移位a c ( d i s p l a c e da m a g r i n cc e l l ， d a c ) 。a c 接受b c 谷氨酸能的突触输入并与b c s 形成交互突触，也与其它a c 形成串行突触，参与调节视网膜的输出神经元神经节细胞的反应特性，在内 层视网膜横向的信息加工与调控中起着重要的作用 2 5 ，2 6 。a c 种类繁多，目前 1 0 在哺乳动物视网膜中已确认有2 9 种a c 存在【2 7 】，其中近半数为g a b a 能 a c 2 8 。其中几类a c 的形态特征以及功能意义己被详细研究，如：胆碱能a c 对神经节细胞的方向选择性有重要贡献【2 9 】；多巴胺能a c 与视网膜明暗适应有 关【2 7 】；甘氨酸能的a i i 型a c 与视网膜视杆b c 通路有关【3 0 ，3 1 。 外核层 外网状层 内核层 内网状层 神经节细胞层 图3 视网膜组构模式图。光信号首先由光癌受器细胞转变成为分级电位形式的电信号，并 在视网膜各级神经元回路中进行加工和处理，最后由视网膜神经节细胞把分级电位转换为动 作电位向视觉中枢传递。视网膜神经节细胞除了接受来自双极细胞的谷氨酸能兴奋性输入 外，还接受来自无长突细胞或网间细胞的g 队能和甘氨酸能的抑制性输入。 在中枢神经系统中，最早由t a n a k a 用放射自显影方法在下丘脑检测到有 a n p 存在 3 2 1 。此后，越来越多的实验表明，n p 及其受体在c n s 2 3 ，3 3 ，包括 视网膜 7 ，3 4 - 3 7 6 p 广泛分布，提示n p 可能作为神经调质而起作用。例如，在大 鼠下丘脑，a n p 通过抑制渗透压的改变而引起垂体激素释放，从而调节从渗透 压感受器至视交叉上核的突触传递 3 8 1 。据报导在几种动物的视网膜中，n p 存 在于神经元及胶质细胞中，特别是在神经元丰富的内核层( i n l ) 0 0 3 4 3 7 。在 功能方面，已经证实b n p 和c n p 能通过分别激活n p r - a 和n p r - b 来调节o n 型b c 上的g a b a 受体和a c 上的谷氨酸受体的活动 3 9 , 4 0 。 虽然b l u t e 等人 3 4 】曾报导在海龟视网膜中，一些类似a c 的细胞表达a n p ， b n p 和c n p ，但是作者并没有进一步探究n p 的表达与包含不同神经递质的a c 之间的关系。在本工作中，我们运用免疫组织化学和共聚焦显微镜的方法，研究 了a n p 、b n p 和c n p 在大鼠视网膜不同类型的a c 上的表达，我们的结果表明： a n p ，b n p 和c n p 在胆碱能和多巴胺能a c 上均有表达，这两种a c 都是g a b a 能的神经元 4 1 ，4 2 】。与此形成对照的是，只有很微弱的b n p 表达在窄野的甘氨 酸能a l i 型a c 上 2 8 】。 1 2 1 标本的制备 ( 二) 材料与方法 成年雄性大鼠( s p r a g u e d a w l e y 。体重2 0 0 - - 2 5 0 9 ) 由中科院动物研究所购 得，腹腔注射2 0 乌拉坦( 1 n w l 0 0 9 ) 麻醉后，迅速摘出眼球，在角膜和巩膜交 界处沿冠状方向切开眼球，弃去前半，将后部的眼杯置于o 1m 磷酸盐缓冲液 ( p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n , p b s ) 配制的4 多聚甲醛固定2 0m i n ( 4o c ) 。然后 将固定好的眼杯依次浸入1 0 、2 0 和3 0 蔗糖磷酸缓冲液( 4o c ) 中，时间 分别为2 h 、2 h 和过夜。次日将眼杯用o c t 包埋剂( m i l e s ，e l k h a r t ，i n ，u s a ) 包埋，用恒温箱切片机( l e i c a , n u s s l o c h , g e r m a n y ) 沿视网膜垂直方向切片，切 片厚度为1 4l a n ，裱于事先涂有明胶的载波片上。切片贮存于一7 0o c 冰箱内备用。 2 免疫荧光组织化学反应 采用间接免疫荧光法进行标记。具体步骤如下：将切片用0 0 1m 磷酸盐 缓冲液( p b s ，n 7 4 ) 漂洗三次，每次1 0 r a i n ，然后在切片上滴加含6 正常驴 血清和0 2 t r i t o nx - 1 0 0 的p b s 中于4o c 封闭过夜，以降低非特异性背底染 色。兔抗a n p 多克隆抗体( 1 ：4 0 0d i l u t i o n ，c h e m i e o n , t e m e c u l a , c a , u s a ) ，兔抗 b n p 多克隆抗体( 1 ：1 0 0 0d i l u t i o n , c h e m i c o n ) 和兔抗c n p - 2 2 多克隆抗体( 1 ：1 0 0 d i l u t i o n , p h o e n i xp h a r m a c e u t i c a l s ，i n c ，b e l m o n t , c a , u s a ) 用作一抗分别标记 a n p ，b n p 和c n p ，而羊抗乙酰胆碱转移酶( c h a t ) 单克隆抗体( 1 ：4 0 0d i l u t i o n ， c h e m i c o n 。t e m e c u l a c a l i f o r n ia ，u s a ) ，小鼠抗酪氨酸羟化酶( t h ) 单克隆 抗体( 1 ：5 0 0 0d i l u t i o n ，s i g m a , s a i n tl o u i s ，u s a ) 和小鼠抗钙离子结合蛋白 - p a r v a l b u m i n ( p v ) 单克隆抗体( 1 ：1 5 0 0d i l u t i o n ，s w a n t , b e l l i n z o n a , s w i t z ) 则用 作一抗分别标记胆碱能、多巴胺能和甘氨酸能a i i 型a c 。一抗用含0 2 t r i t o n x - 1 0 0 、3 正常驴血清的p b s 液稀释至所用浓度。单标实验是在结束封闭后将 切片移入上述一种稀释过的一抗中孵育7 2 h ( 4o c ) ，再用0 0 1mp b s 漂洗。 带有荧光标记的二抗用于识别一抗上的特异性结合位点。标本在二抗中孵育2 h ( 4o c ) 。对于免疫荧光双标实验，切片依次在含有两种一抗和两种二抗的混合 液中孵育。二抗是用t e x a sr e d ( t r ) 耦联的驴抗兔i g g 标记a n p ，b n p 和c u p i 用f l u o r e s e e i n i s o t h i o c y a n a t e ( f i t c ) 耦联的驴抗羊i s 6 ，驴抗小鼠i g g 以及驴抗 小鼠i g g 分别标记c h a t ，t h 和p v ( 1 ：2 0 0d i l u t i o n , j a c k s o ni n u n u n o r c s c a r c h l a b o r a t o r i e s ，w e s tg r o v e , u s a ) 。最后用甘油封片即可。为防止荧光淬灭，一般 次日观察结果。作为对照，当在双标实验中省略其中一种一抗以正常驴血清和 p b s 代替，则仅能观察到保留的那种抗体的免疫反应产物：当省略两种一抗则 未见到阳性标记出现。从而排除了种属特异的二抗有交叉反应的可能性。 3 预吸附实验 将抗a n p ，b n p 和c n p 的一抗与它们相应的抗原( 浓度为1 0 4m o f l ) ， 分别为a n p ( a 8 2 0 8 ，s i g m a ) ；b n p - 3 2 ( b 9 9 0 1 ，s i g m a ) 和c n p - 2 2 ( 0 1 2 - 0 3 ， p h o e n i xp h a r m a c e u t i c a l s , i n c ) 混合过夜( 预吸附) ，次日代替正常一抗孵育组 织切片以验证一抗的特异性。 1 4 共聚焦激光扫描显微镜观察 进行免疫荧光双重标记后的切片样本在t c s - n t 共聚焦激光扫描显微镜 ( l e i c a , m a n n h e i m ，g e r m a n y ) 下观察，使用6 3x 的浸油物镜。免疫双标图案为 对同一焦平面单层光切片进行两次扫描叠加而成。免疫荧光图片用a d o b e p h o t o s h o p7 0 1 软件进行处理，叠加。 1 5 ( 三) 实验结果 1 大鼠视网膜中的胆碱能、多巴胺能和甘氨酸能a l i 型无长突细胞 c h a t 、t h 和p v 分别用来特异性地标记大鼠视网膜胆碱能、多巴胺能和甘 氨酸能a i i 型a c ( 图4 a ，b 和c ) 。由图4 a 可见，c h a t 标记的胆碱能a c 由 两类细胞组成，它们的胞体分别位于i n l 和g c l ，形成类似镜面对称的标记模 式。两类胆碱能a c 的突起分别在i p l 的s 2 和s 4 亚层形成两条窄而对称的荧光 亮带，与先前报导的大鼠胆碱能a c 的标记模式相类似 4 3 - 4 6 。胞体位于i n l 内侧部位的神经元，其树突在s 2 亚层分枝，被称为a c h - a 型a c ，而胞体移位 至g c l ，且树突在s 4 亚层分枝的，为典型的a c h - b 型a c 4 7 。图4 b 为t h 免 疫阳性的神经元。神经元的胞体位于i n l 的最内侧，而绝大部分突起只在i p l 的最远端分枝，形成一条荧光带紧贴胞体下部，这些t h 阳性神经元的形态特征 与在蝾螈、小鼠、猫和猴子视网膜中观察到的多巴胺能a c 相似 4 8 5 1 。多巴胺 能a c 在大鼠视网膜中分布较少，密度相对比较低。图4 4 2 为p v 标记的a c ，其 胞体较小，排列在i n l i p l 的交界处，突起弥散地分布于i p l 中，与先前报导的 大鼠甘氨酸能a i i 型a c 相同 3 1 , 5 2 1 。甘氨酸能a i i 型a c 占所有a c 数量的1 0 0 4 左右【2 8 】，是庞大的家族，也是目前研究的比较清楚的窄野型a c 的一种。 1 6 图4 大鼠视网膜垂直切片的共聚焦免疫荧光照片，显示c h a t ，t h 和p 1 ，在大鼠视网膜 中标记的 c 。c h a t 标记的胆碱能 c ( 图4 ) 的胞体位于i n l 和c - , c l ，突起在i p l 的s 2 和 s 4 亚层形成两条荧光亮带。t h 标记的多巴胺能 c ( 图4 b ) 的胞体位于i n l 最内侧，树突则 分布于i p l 最外侧的s 1 亚层。p 1 ，标记的 i i 型a c 较密集地排列在l n l i p l 边界处，它们 的突起弥散地分布在i p l 。0 p l ，外网状层；i n l ，内核层；i p l ，内网状层；g c l ，神经节细 胞层。标尺= 2 0p m 。 2 a n p ，b n p 和c n p 在大鼠视网膜胆碱能以及多巴胺能无长突细 胞上表达 图5 显示a h p ，b n p 和c h p 在大鼠视网膜中的总体分布。免疫阳性标记主 要集中在视网膜外网状层( o p l ) 和内网状层( m l ) ，而内核层( i n l ) 的很多 神经元也呈h i p 阳性，其中一些或许是双极细胞( 如箭头所示) 。不仅如此，一 些位于内核层内侧的细胞( 如粗箭号所示) 也被n p 标记上，根据胞体所在位置 以及形状等推测这些细胞可能是a c 。为了验证a n p ，b n p 和c h p 抗体的特异 性，我们做了预吸附实验作为阴性对照。当这三种一抗被其相对应的抗原( 图 4 a ，b 和c ) 预吸附之后，原本在o p l ， p l 及 n l 的阳性标记都消失了，说明 这些抗体的特异性是良好的。 1 7 图5 大鼠视网膜垂直切片的共聚焦免疫荧光照片，显示a n p ，b n p 和c n p 的总体分布。三 种n p 均在大鼠视网膜o r _ ，i p l 上有表达，此外i n l 中有一些细胞也被标记上，从胞体的形 状以及所处的位置看来有可能是双极细胞( 斜箭头所示) 和无长突细胞( 横箭号所示) 。当 a n p ( a ) ，b n p ( b ) 和c n p ( c ) 分别被其各自的抗原预吸附后，免疫标记均消失。0 p l ，外 网状层；i 睫，内核层；i p l ，内网状层；c - c l ，神经节细胞层。标尺= 2 01 1m 。 我们进一步用c h a t ，t h 和p v 与三种n p 进行双标，以检测a n p ，b n p 和c n p 在这三种a c 中是否有表达。 c h a t 标记的两类胆碱能a c 即a c h - a 和a c h - b 的胞体均呈a n p 免疫阳 性反应( 图6 a ，b ”和c ”) ，胞膜染色更强，双标的部位显示为淡黄色。同时， 由这些神经元的突起所形成的两条荧光带也被a n p 标记上了。b n p ，c n p 与 c h a t 双标的结果相似，即胆碱能a c 的胞膜，胞浆以及突起上都有b n p 和c n p 的表达，且胞膜和树突基部的阳性产物染色较强。 图7 a a ”显示的是大鼠视网膜中a n p 与t h 的双标。多巴胺能a c 的胞体 位于i n l 的最内侧，而其突起伸向i p l 的最外侧。由图7 a 和图7 a 叠加而成的 图7 a ”可见，在t h 标记的多巴胺能a c 的胞膜、胞浆以及突起上有明显的a n p 阳性标记，胞膜和树突近端阳性染色较深，说明多巴胺能a c 表达a n p 。b n p 和c n p ( 图7 1 3 ，c ) 在大鼠视网膜中的表达模式类似于a n p ，稍有不同的是b n p 的阳性反应强于a n p 和c n p 。从图7 1 3 ”( 图7 1 3 和j 7 b 叠加而成) 和c ”( 图7 c 和7 c 叠加而成) 可以清楚地看到t h 标记的a c 呈b n p 或c n p 阳性反应，同 1 5 样的，b n p 和c n p 不仅表达在多巴胺能a c 的胞膜上，还表达在胞浆内和突起 上。 图6 a n p ，b n p 和c n p 在大鼠视网膜胆碱能 c 上的表达的共聚焦显微镜图片，a ，b ，c 分 别为a n p ，b n p 和c n p 的表达模式。a n p ，b n p 和c n p 在o p l 和i p l 有强的免疫阳性标记，且 i 札的一些细胞也被标上。 ，b ，c 显示o h m 标记的胆碱能a c 。 ”，b ”，c ”分别 是 ，a ；b ，b ；c ，c 的叠加图。有双标的位置为淡黄色。o p l ，外网状层；l n l ，内 核层；i p l ，内网状层；g c l ，神经节细胞层。标尺= 2 0ui l l 。 1 9 图7 共聚焦显微镜图片显示a n p ，b n p 和c n p 在大鼠视网膜多巴胺能a c 上的表达，a ，b ， c 分别为a n p ，b n p 和c n p 的标记模式。t h 标记的多巴胺能a c 胞体位于i n l 的内侧，突起位 于l p l 的最外侧( 图7 a ，b ，c ) ，a ”，b ”，c ”为叠加图。o p t ，外网状层；i n l ， 内核层；ip l ，内网状层；s o l ，神经节细胞层。标尺= 2 0p 1 1 1 。 3 a n p ，b n p 和c n p 在大鼠视网膜甘氨酸能a h 型无长突细胞上 的表达 p v 标记的甘氨酸能a i i 型a c 的胞体位于i n l 的最近端( 图8 a ，b 和c ) ， 突起弥散分布在i p l 中。从叠加的图a ，b ”和c ”中可见，只有b n p 在一些a n 型a c 的胞膜上有微弱表达( 如箭头所示) ，而a n p 和c n p 在a c 上未见标记。 与胆碱能和多巴胺能a c 的结果相比，a i i 型a c 的胞浆中没有n p 的免疫标记 存在。由于n p 在i p l 的免疫染色很强，且分布弥散，因此很难判断a i i 型a c 的突起是否被双标上。 2 1 图8 大鼠视网膜垂直切片的荧光照片，显示w ( ，b ，c ) 分别与a n p ( ) ，b n p ( b ) 和c 岬( c ) 双标的结果。从叠加图( ”，b ”，c ”) 中可见a n p 和c 咿都没有表达在p v 标记的a ii 型 c 上，只有b n p 在有些细胞的胞膜上有少量点状标记( 箭头所示) 标尺2 0 1 4 1 1 1 1 。 ( 四) 讨论 a c 是脊椎动物视网膜的中间神经元，其突起伸入i p l 中，并与b c 轴突终 末、其它a c 的突起以及c , - c 的树突形成突触，a c 与b c 形成交互突触【5 3 ，5 4 1 ， 在a c 间则存在广泛的串行突触 5 5 ，5 6 1 ，共同构建了内侧视网膜高度复杂的神经 网络 5 7 1 。已有不少证据表明，a c 参与了b c 、c _ , - c 时间和空间特性的调制 5 8 1 。 a c 种类很多，在细胞形态以及功能上均有差别。根据生理、生化和解剖标准， 目前发现哺乳动物视网膜中有2 9 种a c ，几乎所有的神经递质都可以在a c 中发 现 2 7 ，5 9 1 。在这些a c 中，有几类a c 的形态特征和功能意义已被较详细研究， 如：胆碱能a c 与c , - c 的方向选择性有关 2 9 1 , 多巴胺能a c 通过释放多巴胺调 节视网膜对光反应的敏感度1 2 7 b 甘氨酸能的a i i 型a c 与视网膜视杆b c 通路 有关 3 0 。3 1 1 。我们的结果显示c h a t 标记的两类胆碱能a c 的胞体分别位于i n l 和g c l ，呈t h 免疫阳性的多巴胺能a c 的胞体则位于i n l 的最内侧，而p v 标 记的甘氨酸能a l l 型a c 排列在i n l i p l 的交界处，均与先前的有关报导一致 3 l ，4 5 ，4 6 ，5 2 1 。 越来越多的实验表明，脑内的a n p 、b n p 和c n p 并非来自外周血液，而是 可由脑内细胞合成。n p 通过与胞膜上的特异性受体相结合发挥其生理作用。在 视网膜中有关n p 的表达已有报导【7 ，3 4 - 3 7 ，虽然b l u t e 等【3 4 】曾报导在海龟视网 膜中类似于a c 的神经元上有n p 的表达，但他们并没有通过免疫双标实验确定 是哪种类型的a c 。本工作首次报导了a n p ，b n p 和c n p 表达在大鼠视网膜不 同的a c 上，提示这些肽类物质有可能是从a c 中释放并发挥其生理功能的。 尽管很多研究表明，a c 含有多种神经肽类物质，比如：生长抑素，血管活 性肠肽和神经肽y 等 6 0 l ，本研究还是第一次报导a n p ，b n p 和c n p 表达在视 网膜的a c 上。我们用预吸附实验对a n p ，b n p 和c n p 免疫荧光标记的特异性 进行了检验。当n p 抗体被它们相应的抗原预吸附之后，原本出现在o p l ，i p l 及i n l 的阳性标记完全消失，表明抗体的特异性良好，可以用之检验大鼠视网 膜中是否有a n p ，b n p 和c n p 的表达。我们的结果显示胆碱能和多巴胺能a c 上有n p 免疫阳性标记，提示这些肽有可能是由a c 释放，这种释放可能为去极 化诱导，并且是钙依赖性的，类似于之前报导过的其在下丘脑神经元中释放的机 制，但此推论还需进一步实验来证明。此外，我们还注意到n i 在a c 上的表达 由于细胞类型的不同而不同。在甘氨酸能a i i 型a c 的胞膜和树突上只能观察到 微弱的b n p 标记，而在胞浆中未发现有n p 的标记。值得注意的是，有文献报 导，几乎所有p v 标记的a i i 型a c 都被它们周围的多巴胺能a c 的丛状突起所 包绕，形成了多巴胺能的“环状结构” 3 1 ，因此我们所见到的包裹在a l l 型a c 周围微弱的b n p 染色很有可能是b n p 标记上的多巴胺能“环状结构”。因此， n p 是否确实表达在这类细胞中尚不能确定。 胆碱能a c 能增强某些神经节细胞对移动的刺激的反应 2 9 】，并且它们与发 育早期的视网膜波的产生有关 6 1 1 ，而多巴胺能a c 能有节律地自发发放动作电 位，以调节明暗适应中视网膜神经元的敏感性【2 7 】。因此包含在胆碱能和多巴胺 能a c 中的n p 很可能参与内层视网膜的信息处理过程。最近，我们报导在大鼠 o n 型b c s 上，b n p 能够通过激活n p r - a 而压抑g a b a a 受体介导的电流【4 0 】。 这种作用可能是由a c 释放的b n p ，通过b c 和a c 之间的交互突触而与b c 上 的n p r 结合而引发的。此终，本实验室的另一项研究结果表明n p r - b 表达在培 养的大鼠视网膜g a b a 能a c 上( 有可能是胆碱能或多巴胺能a c ) ，并且c n p 能通过激活n p r - b 压抑这些a c 上谷氨酸受体介导的电流【3 9 】。这就提示存在 于胆碱能和多巴胺能a c 中的n p 一旦释放，有可能通过激活作为自身受体的 n p r 而调节其本身的活动。 ( 五) 总结 在本工作中，我们运用免疫荧光双标和共聚焦显微镜的方法，首次报导了 n p 在大鼠视网膜不同亚型的a c 上的表达，提示在大鼠视网膜a c 中合成的n p ， 可能在内层视网膜中作为神经调质而起作用。结合本实验室先前的免疫组化结 果：n p r - b 在培养的大鼠视网膜g a b a 能a c 上有表达，进一步提示在a c 中 合成的n p 可能调节其本身的活动。 我们实验结果表明： 1 a n p ，b n p 和c n p 广泛分布于大鼠视网膜o p l ，i p l 以及i n l 中的一些神 经元上。 2 免疫荧光双标结果表明a n p ，b n p 和c h i p 在胆碱能和多巴胺能a c 的胞膜， 胞浆以及突起上均有表达。 3 甘氨酸能a i i 型a c 上无a n p ，b n p 和c n p 的免疫阳性标记。 6 1 0 1 l 1 2 ( t k ) 参考文献 l e v i ne r , g a r d n e rd g s a m s o nw kn a t r i u r e t i ep e p t i d e s ne n g ljm e d 1 9 9 8 ：3 3 9 ( 5 ) ：3 2 1 - 3 2 8 k o u r i ej i r i v em j r o l eo fn a t d u r e t i ep e p t i d e si ni o nt r a m p o r tm e c h a n i s m s m e dr e s r e v1 9 9 9 ；1 9 ( 1 ) ：7 5 - 9 4 s u z u k i y 撇a k i 正y a z a k iy t h er o l eo ft h en a l d u r e t i ep e p t i d e si nt h e c a r d i o v a s c u l a rs y s t e m c a r d i o v a s er e s2 0 0 1 ；5 1 ( 3 ) ：4 8 9 - 4 9 4 t a n a k ai ，i n a g a m it r e l e a s eo fi n u n u n o r e a e t i v ea t r i a ln a t r i u r e t i cf a c t o rf r o m r a th y p o t h a l a m u si nv i t r o e u rjp h a r m a c o l1 9 8 6 ；1 2 2 ( 3 ) ：3 5 3 - 3 5 5 d eb o l da j ，b o r e n s t e i nh b ，v e r e s sa t ，s o n n e n b e r gh ar a p i da n dp o t e n t n a t r i u r e t i cr e s p o n s et oi n t r a v e n o u si n j e c t i o no f a t r i a lm y o c a r d i a le x t r a c ti nr a t s l i r es c i1 9 8 1 ；2 8 ( 1 ) ：8 9 - 9 4 k o u r i ej i , h a n n ae 九h e n r yc l p r o p e r t i e sa n dm o d u l a t i o no fa l p h ah u m a n a t r i a ln a t r i u r e t i cp e p f i d e ( a l p h a - h a n p ) - f o r m e di o nc h a n n e l s c a njp h y s i o l p h a r m a c o l2 0 0 1 ；7 9 ( 8 ) ：6 5 4