（神经生物学专业论文）胚胎神经干细胞对于死后人脑老化神经元的促存活作用研究.pdf

摘要 摘要 由于干细胞具有自我增殖，分化和修复的特性，外源性神经干细胞移植治 疗神经系统退行性疾病成为人们关注的热点，虽然在帕金森氏病的治疗方面显 示出一定的临床应用前景。但是细胞移植的定点性决定了其治疗的区域性的特 点，对于病变累及广泛的神经退行性疾病，比如阿尔茨海默病( a l z h e i m e rd i s e a s e ， a d ) 并不是一个完美的治疗方案。理想的方案应当是神经干细胞所释放的物质町 广泛的作用于a d 不同区域的脑组织。在a d 的病理改变中给我们留的一个机会 是：a d 脑内大量神经元并没有死亡而是“失活”，适当的刺激可使失活的神经 元再激活。我们的假设是：a d 脑组织中广泛受累“失活 的神经元或者“沉 默 的神经元可被外源性神经干细胞来源的因子修复或再激活，从而恢复神经 元的部分功能。 为验证该假设，本实验将死后人脑组织运动皮层脑组织切片( a d 组，n _ 7 ； 老年非痴呆对照组，n _ 6 ) 与大鼠胚胎来源的神经干细胞体外“分离式”共培 养，对a d 脑组织进行细胞活性检查( 1 i v e d e a dk i t ) ，结果发现： 1 体外培养的死后脑组织仍具有活性。 l i v e d e a dl ( i t 染色显示培养的a d 脑组织存在活细胞( 绿色胞浆，空细胞核) ， 死细胞( 红色细胞核) ，中间态细胞( 绿色胞浆，红色细胞核) 。在体外组织培养 ( o 3 0 天) 的过程中，三种细胞数目没有随着培养时间的延长发生显著性改变p 值分别为o 9 1 ，o 0 9 ，0 7 8 。 2 在正常培养的条件下a d 脑片包含更少的活的神经元。 a d 来源的脑片的存活神经元数目少于正常对照组( p = 0 0 1 7 ) ，并且显示出较 老年对照明显的个体差异。 3 干细胞共培养可促进死后脑组织的存活状态。 与未处理组或成纤维细胞共培养组( 作为干细胞的对照) 相比，神经干细 胞共培养组的脑片有更多的存活细胞( 约增加2 6 0 0 个蚴2 ，p o 0 0 1 ) 和更少 的死细胞( 约减少9 5 0 0 个m m2 ，p o 0 0 1 ) 。而共培养没有明显增加两组脑片中 间态的细胞数目( p = 0 3 6 ) 。 上述结果证明了共培养具有神经保护和促进损伤修复的作用，接下来的问 题是：存活的细胞是否具有转录活性? 本研究进一步探讨了神经干细胞共培养 摘要 对人脑组织转录水平的影响，运用荧光实时定量p c r 的方法，检测了在共培养期 间常规参考基因及神经元特异性烯醇化酶烈s e ) ，应激相关基因j i p 1 的m r n a 水 平的改变。 1 没有表达恒定的“参考基因”。 在死后脑组织培养体系中，没有检测到表达水平恒定的“参考基因”( g a p g h ， e f l a ，d a c t i n ，y w h a z ，u b c ) ，但是上述基因表达显示出很高的相关性。 2 神经干细胞诱导老化神经元产生更多的n s em r n a 。 n s e 是神经元特异性表达的基因，参与神经元的糖酵解过程。在老年对照组， 神经千细胞共培养组的脑片显示出较高n s e 的转录水平，采用在内部平衡的 2 c t 【c t = c t ( d i v l o ) c t ( 未处理d 3 ) 】法分析p c r 结果显示p o 0 0 l ( a n o v a ) 或者p = o 0 2 1 ( m 锄一w h i t n e y ) ，提示共培养处理组神经元的转录水 平显著高于未处理组。同细胞活性染色一致，a d 组的n s em i 州a 水平亦较对照组 为低。 3 体外培养的a d 脑片未检测到应激敏感蛋白j i p 1 的表达。 j i p 1 是参与刷k 和a k t 信号转导途径的应激敏感型蛋白，最新研究发现与 磷酸化的b 淀粉样蛋白前体的运输有关。在冻存老年和a d 脑组织均检测到稳定的 j i p 1 m r n a 表达，但是培养的a d 脑片中未检测到其m r n a 存在提示a d 神经元对 外界的反应较对照组低下。 4 慢病毒载体转染的神经干细胞神经元分化率低，没有成功建立体转染和外移 植模型。 综上所述，本实验采用人脑组织，结合独特的“隔离式”共培养的体系，避 免了移植实验中的细胞转化所造成的效应，首次报道了神经干细胞对于人脑衰 老或退行性变神经元的细胞具有促进存活和提高转录活动的作用。虽然其作用 机制仍需要进一步阐明，但本研究提供的人脑组织基础上的实验资料为临床神 经退行性疾病的治疗提出了一条新思路。 i l 摘要 关键词：阿尔茨海默病( a d ) 干细胞培养组织切片培养“分离式”共培养神 经元实时定量p c r 神经烯醇化酶j i p l 慢病毒转染免疫组织化学 蛋白分析 a b s t r a c t ab s t r a c t n e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e sa r ep r o g r e s s i v ea n di n c m a b l ea 1 1 da r eb e c o m i n ge v e r m o r ep r e v a l e n t t bs t u d yw h e t h e rn e u r a ls t e mc e l l sc a nr e a c t i v a t eo rr e s c u em n c t i o n s 0 fi m p a i r e dn e u r o n si nt h eh u m a j la g i n ga 1 1 dn e u r o d e g e n e r a t i n gb r a i n ，w ec o c u l t u r e d p o s t m o r t e ms l i c e s 行o ma l z 王1 e i m e rp a t i e n t sa i l dc o n n 0 ls u b je c t sw i m r a te m b r y o i l i c d a y14 ( e 1 4 ) n e u r a ls t e mc e l l s h u m a np o s t m o r t e mb r a i ns l i c e s 丘1 0 mt h ee l d e r l y c o n t r o la n da l z h e i m e r sd i s e 2 l s e ( a d ) ( n = l3 ) w e r ec o c u l t u r e dw i t hn s cw i m o u t d i r e c tc o n t a c to rb y c e l l如s i o n u s i n gs e p a r a t e dc o c u l t u r i n gs y s t e m i m m 明o h i s t o c h e m i s t 巧a i l dv i a b i l i t ys t a i n i n gw e r eu s e dt oe v a l u a t et h em o 印h o l o g i c a i f e a t u r e sa n ds u r v i v a lo ft h eh u m a nn e u r o n si nn e o c o n i c a lt i s s u eo nd i f f e r e n td a y si n v i 仃or a l l g e df r o mot o3 8 v i a b i l i 谚s t a i n i n g ，b a s e do nt h ee x c l u s i o no f e t h i d i u r nb r o m i d eb yi n t a c tp l a s m a m e m b r a n e s ，s h o w e d 也a t 也e r ew e r es t r i k i n g l ym o r ev i a b l ec e l l sa i l df e w e rd e a dc e l l s i nc o c u l t u r e ds l i c e st h a ni nu n t r e a t e ds l i c e s t h ep r e s e n c eo fa l z h e i m e rp a m 0 1 0 9 yi n 让i eb r a i ns l i c e sd i dn o ti n f l u e n c et h i se 虢c t ，a l t h o u 曲t h es l i c e sf r o ma l z h e i m e r p a t i e n t s ， i n g e n e r a l ， c o n t a i n e df e w e rv i a b l ec e l l s c o c u l t u r i n gw i t h r a te14 肋r o b l a s t sd i dn o ti m p r o v et h ev i a b i l i t ) ，o fn e u r o n si nt 1 1 eh 啪a i lb r a i ns l i c e s s i n c e t h eh 胁a ns l i c e sa 1 1 dn e u r a ls t e mc e l l sw e r es e p a r a t e db yam e m b r a n ed u r i n g c o c u l t u 打n go u rd a t as h o wf o rm ef i r s tt i m et h a tn e u r a ls t e mc e l l sr e l e 2 l s ed i 丘u s i b l e a b s t r a c t f 配t o r sm a tm a yi m p r o v et h es u r v i v a lo fa g e da n dd e g e n e r a t i n gn e u r o l l si nh u m 锄 b r a i n s d a ：t a 肌a l l y s i sr e v e a l e dt h a tt h e r ew a l sn os i g n i f i c a n tc h a n g e so v e rt i m ev i a b l e q = 0 4 1 ) ，i e a k yq = o 7 2 ) a n dd e a d ( p = o 7 0 ) b yp a t i e n t v i s u a ji n s p e 甜o no f u n t r e a t e d s l i c e s 鲥n e dw i mt h el i v e d e a dl ( i td i dn o ts h o wa 1 1 yo b v i o u sd i 仃e r e n c e sb e t 、e e n t i s s u e 丘o mc o n t r o ls u 切e c t s 缸l da d p a t i e n t s h o 、 ，e v e r c e l lc o 咖sr e v e a l e dt l l a tt h e n u i n b e ro fv i 曲i ec e l l si i l1 1 1 1 仃e a t e ds l i c e so fa dp a t i e m sw 雒r e d u c e db y5 5 弱 c o i n p a r e d w i 也吼仃e a t e ds l i c e sf 如mc o n n l o l s u b j e c t s a n dt l l er e d u c t i o nw 弱 s i 嘶f i c a n t ( 尸= o 0 2 ) ，谢l e r e a sm ed i 艉r e n c e si nl e a l ( y d e a da | l dt o t a lc e un u m b e r w e r en o ts i g n i f i c a l l t 似( i n gc o n t r o l sa 1 1 da 1 z h e i m e rp a t i e n t st o g e 也e r t t l ee f r e c to f 仃e a 廿n e mw 曲n e u r a ls t e mc e l l sc o n s i s t e do fa i la v e r a g ei n c r e a s eo f2 6 0 0v i a b l ec e l l s p e fn l l i l 3 ( 尸 o 0 0 1 ) n en u m b e ro fl e a k yc e l l sr o u 曲l yr e m a j n e dt h es 锄e 妒= 0 3 6 ) ，w l l i l em em e a nn u m b e ro fd e a dc e l l sa l l d t 1 1 em e a l lt o t a ln u m b e ro fc e l l s d c c r e a s e d 丽t l la b o u t9 5 0 0 ( p 0 代表脑片中可以看到 一些阳性的神经纤维改变，但达不到l 级的分级水平；4 ，局部病理分级：用免疫组化的方 法标记脑片局部淀粉样蛋白沉积和磷酸化的t a u 蛋白的半定量分级，由本研究组4 个独立 观察者在显微镜下评分并取其数值平均值。 3 1 第2 章神经干细胞存进了体外老化和a d 神经元存活 n e u n 的免疫组化染色没有显示出a d 来源的皮层脑片有明显的神经元结构 的丢失。我们的试验结果发现，如图2 所示，在对照组的脑片上，没有或仅存在 弥散的颗粒状淀粉样斑结构( 2 a ) ，而a d 的脑片则显现出中等量( 2 b ) 或大量 的淀粉样斑块，在最严重的一个病人的脑片上，淀粉样免疫阳性反应的面积超 过脑片灰质总面积的9 0 ( 2 c ) 。异位磷酸化t a u 的免疫组化染色结果与老年斑的 染色基本一致，a d 脑片包含大量强免疫阳性的神经纤维，形态特点是粗细不等， 排列紊乱的缠结变性的神经原纤维，呈密集的条索状、卷发状甚至团块状遍布 于胞质内，如图2 d 所示。免疫组化的结果证明在本研究中所用的a d 脑片均存 在病程中自然形成的a d 病理特征，但严重程度不同。另本研究组所用的脑组织 标本的局部a d 病理严重程度亦用半定量法进行分级( 0 4 ) ，如图3 所示，其局部 病理与b r a a k 分级显示出良好的一致性，尤其是异位磷酸化的神经纤维的沉积情 况，在衰老对照组的评分是o 1 2 5 ，而a d 组的平均值则是2 7 5 ，显示出较严重的 病理沉积。 2 3 2 胚胎大鼠来源的原代神经干细胞的分裂分化的一般情况 本实验取材于胎龄为1 2 1 2 5 天的大鼠皮层细胞，因为早期发育学研究发现 大鼠皮层神经元最早出现于孕1 2 1 5 天，1 6 天之后就有突触发生( k o n i s h i ， l i n d h o l m ，y j 吼g ，“a n ds h e n ，2 0 0 2 ) 。本研究发现1 2 1 2 5 的胎鼠皮层己成型，厚约 1 2 m m 。接种的细胞在最初的1 0 个小时内是逐渐修复的过程，图3 a 为贴壁培 养l h 的原代神经干细胞，胞体多为圆形，胞核大、清晰，细胞分裂较明显，细胞 密度较接种时有明显增加，贴壁培养8 小时后，可见少量细胞有突起形成，此后 显微镜下可见细胞形态多样，细胞核清晰，突起数目增多，细胞间发生连接， 树突轴突较明显增长，神经元样细胞胞浆内出现折光度不同的颗粒，胞质清亮。 一般在培养7 9 天神经元细胞间连接密度高，有明显的网络形成。m a p 2 是脑 组织最主要的微管相关蛋白，目前认为有促进微管集合和形成分枝的功能，主 要定位于神经元的胞体和树突，图3 b 为培养7 天后经免疫细胞化学标记m a p 2 阳性的细胞，主要为胞浆和突起着色，细胞突起已连接成网，着色有深浅。但其 体积明显小于正常体内发育的神经元，胞核体积较大，密度较低，核仁明显， 胞浆含量少，核质比较大。图3 c 悬浮培养的细胞，可见单个的干细胞经多次 分裂成球形聚集体，因其中的干细胞可以较贴壁的细胞可以保留较强的分裂能 3 2 第2 章神经干细胞存进了体外老化和a d 神经元存活 力，被选择为本研究与人脑组织共培养的细胞。 a b 各 鳜 蒸 饕。睡 爹“ 勿 ， 缘 。磁 l 。鬃爹 、，：翘 j 麓毋 h 。一t 4 1 一“、h 、：r i ：j 、菇 ；毫。、：；、，：。，；“ t 7 。 ，毫。? f 。，焉o f 二，爿磐，4 渺i _ _ 图2 ：a d 特征性病理标记物的免疫组织化学染色，包括淀粉样蛋白沉积( ba 4 ) 和细胞 内的异位磷酸化t a u ( a t 8 ) 。a 图为一个老化对照组来源的脑片，免疫组化染色仅定位剑 少许弥散的颗粒状淀粉样斑结构，而a d 的脑片则显现出中等量( b ) 或大量的淀粉样斑块， 在最严重的一个病人的脑片上，淀粉样免疫阳性反应的面积超过脑片灰质总面积的9 0 ( c ) 。a d 来源的脑片包含大量强免疫阳性的神经纤维，星条索状或卷发状甚至团块状遍 布于胞质内( d ) 。 b a r ：1 0 0 p m ( a c ) ，5 0 p m ( d ) 3 3 黎 鑫荔 黪 谤漆 第2 章神经干细胞存进了体外老化平a d 神经元存活 二b 骥 一b _ 棼霪雾赫4 图3 ：培养状态下的神经干细胞。a ：消化后的单个的神经干细胞，培养后4 小时；b ：悬 浮培养的神经干细胞分裂成大小不等的球状( n e u r o s p h e r e s ) ，为培养后4 8 小时；c ：贴壁 培养的开始分化的干细胞，可以看到有明显的细胞突起，并互相连接；d ：体外培养一周 的干细胞的m a p 2 的免疫组化染，可以看到有一定比例的分化后的细胞荦m a p 2 免疫附| 生， 多数阳性细胞可见一个明显的强刚性类似轴突的结构。b a r ：3 0 岬( a ，d ) ；1 0 0 肛m ( b ，c ) 3 4 第2 章神经千细胞存进了体外老化和a d 神经元存活 b 亭t a - a m y i o i d4 3 b o c 5 - c 6 c l 23， b 憎a k 霉协舯_ 图4 ：所用脑片的b r a a l c 分级和局部病理强度分级。a 图描述了脑片的淀粉样沉积和异位磷 酸化t a u 数量上关系；b 图：a d 个体的b r a a k 病理分级和脑片的局部淀粉样沉积的显示出 一定的一致性：c 图：a d 个体的b r a a k 病理分级和脑片局部异位磷酸化的t a u 的也存在一 定的联系。 3 5 4 3 2 1 o 8 上 认 3 2 ， 口墨il-i-暑毒 第2 章神经干细胞存进了体外老化和a d 神经元存活 2 3 3 神经千细胞促人老化神经元存活作用 经过共培养3 ，7 ，1 0 天，脑片被收集起来，进行细胞染色。如图5 所示，绿 色荧光细胞为活细胞，有红色荧光细胞为死细胞，绿胞质和红核的细胞被认为 是介于中间状态的细胞。我们的染色显示，干细胞共培养的脑片包含有更多的 存活神经细胞。有趣的是，所有脑片中的绿色的细胞显示出人神经元细胞的形 状，镜下观察有符合解剖的神经元分层结构，且与n e u n 染色的脑片显示出相当 高程度的一致性。 数据显示，来自于同一个个体的脑片，在不同时间点的活细胞、死细胞和 中间状态的细胞数目没有显著性差异，p 值分别为0 9 2 ，0 2 3 ，0 4 3 。这些资料显示， 在一定的时间范围内我们的体外培养系统相对保持一个稳定的生长状态。每一 组的实验都显示了神经干细胞共培养组的脑片包含了更多的存活的神经元。为 了降低“假重复性 的数据统计干扰，我们选择每一个组的平均值来进行统计 分析。不管是衰老组还是a d 组，神经干细胞共培养组的脑片较对照组有检测到 更多的存活细胞，每平方毫米约增加2 6 0 0 个活的神经元，两组间有显著的统计 学差异( p o 0 0 1 ) 。而处于中间状态的细胞数目在两组间基本保持稳定，统计 学检验没有明显差异( p = o 3 6 ) 。同时，我们的计数资料还发现，干细胞处理组 的脑片的死细胞数也较对照组有明显降低，每平方毫米约减少9 5 0 0 个死的神经 细胞，两组有显著性统计学差异( p o 0 0 1 ) 。 3 6 第2 章神经干细胞存进了体外老化和a d 神经元存活 图5 ：脑片的活细胞，死细胞染色。a 图是常规培养的衰老脑片，可见到人量的死细胞和不多 的活细胞，还有一部分细胞为“l 髓k y ”，即存在结构部分损伤的细胞。b 图是和神经干细 胞共培养后的来自同一份人脑标本的脑片，视野内可见大量的活细胞，死细胞数日明显少 丁对照组。c 倒是和胚胎成纤维细胞共培养的脑片的染色情况，和常规培养的脑片没有明显 的差异。 ( b 缸：1 0 0 m ) 3 7 第2 章神经干细胞存进了体外老化利a d 神经元存活 b a a d 图6 ：细胞计数资料。图a 描述了干细胞共培养组和对照组的所有个体的活细胞计数情况。 在a d 组，干细胞处理组的脑片较常规培养的脑片平均多含有2 5 0 0 个m m 3 活细胞；在止常脑 老化组，则是2 6 0 0 个m m 3 活细胞，共培养显著性提高了脑片中的活细胞数( p o 0 0 1 ) 。a d 来源的脑片中活细胞数目明显少于衰老组( p - 0 0 1 ) 。图b 直观地显示了活细胞和死细胞数 所占的比例。a d 来源的脑片的活细胞比例明显少于老化组，对丁共培养处理，其比例的改 变幅度也低于老化组，但是在“1 e a k y ”的细胞数目没有显著性差异( p = 0 3 8 ) 。 3 8 第2 章神经干细胞存进了体外老化和a d 神经元存活 表3 ：共培养和单培养的脑片中分类细胞数目( m e 锄s 士s e m ) n s c m o c k t r e a t e dn s cm o c k t r e a t e d 表注：c o n 仃o l ：非神经疾病的衰老对照组；a d ：阿尔茨海默病组；n s c ：神经干细胞共培养 组；m o c k 仃e a t e d ：加入等量培养基的对照组。采用t 检验的方法，神经干细胞共培养组的脑 片中存活神经元的数目和单培养组组显示出统计学上的显著性差异( p 0 0 0 1 ) ，l e a k y 的细 胞没有统计学意义上的差异( p = 0 3 6 ) ，2 个组在死细胞数目也显示统计学上显著性差异 ( p o 0 0 1 ) 2 3 4 胚胎成纤维细胞没有显示出类似千细胞的促存活作用 为了明确干细胞的这一促存活的作用不是胚胎来源的细胞所共用的，我们 将来自于同一胎鼠的贴壁培养的原代成纤维细胞与a d 和一个衰老对照的脑组织 切片分别共培养，如图5 c 所示，成纤维细胞共培养组没有表现出更高的存活率。 细胞计数的资料也揭示出a d 脑片与胚胎成纤维细胞和干细胞共培养后，每平方 毫米活细胞数分别为3 3 0 0 8 2 ，6 8 0 1 7 2 ( 1 0 0 0 ) ：而对照组为2 8 l 0 4 9 。 正常老化的脑片上的试验结果则为3 8 0 1 3 5 和3 8 6 1 0 8 ( 1 0 0 0 ) 。 2 3 5a d 脑片较老化神经元在体外显示出较低的存活和代谢能力 考虑到每个个体的特异性，我们在图3 中对比了每一个处理组和非处理组的 存活细胞数。从图中可以看出，虽然干细胞共培养都诱导了更高的神经元的体 外存活率，a d 来源的脑片在体外显示出更大的差异性。活细胞计数也显示，a d 来源的脑片，活细胞数目明显低于正常老化脑片，分别为3 4 l 0 6 6 ，1 6 0 o 3 9 ， 约减少了5 0 ，统计学上有显著性差异( p = 0 0 2 ) 。既往有观点认为，从临床诊断 脑死亡到培养之前的时间耽搁也可能对细胞的存活产生影响( c u m m i n g s ，s t n h n ， y o o i l ，甜以，2 0 0 l ，p r e e c e 觚dc a i m s ，2 0 0 3 ，t o m i 饥v a e r ，w a l s l l ，甜以，2 0 0 4 ) ，但我 3 9 第2 章神经干细胞存进了体外老化和a d 神经元存活 们的实验结果，没有显示出这一时间差对人脑片中神经元存活产生明显影响 ( p = o 1 6 ) 。除此之外，在a d 的脑片中，死细胞所占的比例也远远大于正常衰老的 病人。总结个例患者对于神经干细胞的作用，老化对照组的反应明显好于a d 组。 而且我们的实验数据也提示，共培养后的a d 的病人对干细胞的反应个体之间有 较大的差异，由于本研究例数的限制，目前尚无法分析统计其病理的严重程度 与脑片的存活状况是否有密切的关系。 2 3 6 神经干细胞诱导老化神经元产生更多的n s em r n a 为了了解人的神经元在转录水平上的改变，我们用实时荧光p c r 的方法检 测了一些常规的参考基因和神经元中神经烯醇化酶的m r n a 水平( 表3 ) 。本研 究共检测了包括a c t i n ，g a p d h ，e f l a3 ，y 、槲a z 和u b c 在内的被常规认为 在大多数组织中可以作为内参的基因。我们的实验结果发现，用死亡后的脑组 织，培养3 ，7 ，1 0 天的组织，即使在保证每份标本的总r n a 量相同，他们也 没有一个相对比较恒定的表达，如图5 所示。但是这些基因的在同一个大脑来 源的组织改变的趋势显示出很大的关联性。我们的结果同时显示，组织被切片 的过程对于r n a 有一个较大的损伤过程，因为同一份标本，从冻存的组织可以 很容易地抽出结构相对完整的大量r n a ，而切成片的组织所得的样本，总是显 示出较低的i 州a 总量和较高的c t 值。根据文献，结合我们的试验资料，选择 用2 d e l t a c t 法分析处理组和非处理组的差异，公式为 d e l t ac t = c t ( d i v l o ) c t ( m o c k 讹a t e dd i v 3 ) 】。通常认为，很多因素可以影响i ：蝌a 的数量和完整性，所 以，我们更倾向比较同一个个体来源的标本之间m r n a 的差异。 第2 章神经干细胞存进了体外老化和a d 神经元存活 “j j 善三i引避羔羔羔型i ：l 鎏 塑 图8 ：n s e 的实时定量p c r 的增殖曲线。a ，b ，c ，d 分别为本研究所用的4 个正常老化的脑 组织，模板来源丁经过10 天共培养的正常老化的人脑标本和常规培养对照标本，每一个模 板做2 个平行孔，每个p c r 共生成4 条曲线。共培养组的模板显示出经过更低的循环数即 可收集到一定的荧光，说明其组织内存在更多的n s em r n a 。 图8 显示了4 个衰老个体的p c r 增值曲线，和n s c 共培养的脑片显示出更 低的c t 值，提示其模板中含有更多的m r n a 。所有的熔解曲线都是一个单峰， 证明了引物的特异性，随后进行的电泳试验也证明了本研究中p c r 产物的特异 性。因为有很多因素可以影响r n a 的降解，因此，在本研究中，我们更侧重于 比较来源于同一份标本的脑组织转录水平上的改变。 在共培养的脑片上，我们发现经过体外1 0 天的共培养n s em i 州a 量明显 高于对照组的脑片，尤其是在老化组，m a r u l w h i t n e y 检验证明2 组间的数据统 计学上有显著性差异( p = o 0 2 1 ) 。我们的资料还显示，老化组的个体显示了一个 比较接近的c t 值，这个现象从另一个方面说明不同个体来源的衰老脑组织在 体外的培养中均呈现一个较稳定的生存状态，而a d 来源的脑组织则显示出较大 的差异。 4 1 第2 章神经干细胞存进了体外老化和a d 神经元存活 首先，只有一个a d 的脑片中n s er n j 刚a 的含量在一个可信的丰度内，因 为通常在实时p c r 中，如果c t 大于3 3 ，可能混杂会有些非特异性的扩增。所 以通常在c t 小于3 2 的时候，我们认为这个c t 值是可信的。当然，在这一个a d 中，共培养组的脑片也显示出较对照组有更多的n s em i 喇a 合成。剩下的3 个 a d 来源的脑组织，因为c t 值过大，提示其模板中含有的m r n a 含量很低，共 培养组的神经元也没有显示出更高的转录水平。 j i p 1 被认为是一个压力敏感性的指标，在细胞感受到来自外界生存的压力 的时候，有更多的表达。我们的试验资料发现，即使在总i 必a 量相对少的老化 组的个体，在电泳上也可以检测到j i p l 的p c r 产物。但是，培养的a d 脑片几 乎没有检测到j 1 i ，l 的表达。相反的是， j i p lm i 斟a 的表达，这些结果也提示， 细胞反应能力降低。 4 2 在冻存的a d 脑组织中检测到相当量的 培养的a d 脑片，其神经元对于神经干 第2 章神经干细胞存进了体外老化和a d 神经元存活 卜 o = 口 a b攀謦 1 貔 mn s p c smn s p c 乌 t h ee l d e r l yc o n t r o 图9 ；a 图是经过1 0 天共培养的脑片和对照组脑片n s e 的绝对c t 值。非共培养条件下a d 来源的脑片的n s e 含量明显低于老化组的脑片；b 图是经过1 0 天共培养和对照的脑切片标 本的p c r 的c t 值。a d 的病人的各个值位置比较分散，提示其有较大的个体著异。对照 老化组的脑片在常规培养下，显示出比较一致的随时间改变的趋势，共培养组的较无处理 组的m r n a 有比较明显的增加。b 图是j i p 1 的p c r 产物的电泳结果。老化的脑组织在常 、 规培养和共培养组都有相当量的j i p 1 表达，而a d 来源的脑组织，仅有微量或几乎没有j i p 1 的产物。( a ：阿尔茨海默病患者来源的脑片；c ：老化对照组来源的脑片；n s c ：神经干细 胞共培养组；m ：空白培养基对照组。 4 3 舳 0 l 一 第2 章神经干细胞存进了体外老化和a d 神经元存活 2 3 7 转染后的神经干细胞 在转染2 4 h 后，用荧光倒置相差显微镜观察到绿色荧光蛋白的强度和位置。 绿色荧光一般在神经球的边缘部分比较明亮，也有的可以在神经球的中心位置 观察到表达，表明边缘的细胞较易被转染成功。分散存在的较小的神经求和单 个的细胞也在较短的时间内观察到明显的绿色荧光，但是从共培养的角度考虑， 我们没有选择此类细胞进行下一步的实验。在转染后2 4 4 8 小时，没有观察到神 经干细胞有明显死亡。没有进行稳转细胞系的筛选实验。 2 3 8l e n t i g f p 阳性的神经干细胞与a d 脑片共培养 一沿血管迁移，没有分化成n e u n 阳性、g f a p 阳性或o c t 阳性的神经细 胞 本研究中，将转染后的神经球轻置于脑片上，在共培养1 2 小时后，即可以 观察到有绿色荧光的细胞在脑片上迁移，考虑到在以前共培养实验中观察到， 经过1 0 天分离式共培养，宿主的神经元表现出更好的存活状态，在本研究接触 式的共培养中也选择类似的时间点进行观察。在部分共培养的脑片上，有较多 连接成网状的新生细胞生成，在显微镜下观察免疫荧光染色结果，显示此层的 细胞与脑片中人的神经元在不同的层面上，如图1 0 a 所示，没有g f p 和n e u n 共标记阳性的细胞生成，同样，在新分化的细胞群中，也没有发现星形胶质细 胞的特异性标记g f a p ( 图1 0 b ) 和小胶质细胞的o c t 免疫阳性的细胞，这些与 以往文献报道的结果有显著不同。我们同时还标记了血管内皮细胞，发现，干 细胞的迁移方向和脑片中的血管结构有一定的重合，如图所示，在图1 0 c 中可 以看到，干细胞球的迁移明显存在“密 和“疏 的区域，在更高的倍数下可 以发现，“舒”的区域正好介于不同分枝血管之间( 图1 0 d ) ，提示细胞的迁移更 倾向于沿着血管走形的方向。，在距离神经球更远的区域内，迁移的细胞数目逐 渐稀少( 图1 0 e ) ，但是有趣的是，我们观察到，如图1 0 f 所示，一个迁移的细 胞有3 个明显的突起，而这三段突起，分别与三条血管的分支重合。 4 4 第2 章神经干细胞存进了体外老化和a d 神经元存活 图l o ：接触式共培养后的脑片的免疫荧光染色。a 图：外源性的神经干细胞与脑片神经元 n e u n 免疫阳性的细胞位丁不同的解剖层面。( 蓝色是n 伽n 免疫阳性的细胞，绿色为绿色 4 5 第2 章神经干细胞存进了体外老化和a d 神经元存活 荧光蛋白阳性的细胞，即代表转染成功的神经干细胞) 。；b 图中显示了神经干细胞( 绿色) 并没有在共培养的过程中分化成表达n e u n ( 蓝色) 或g f a p ( 红色) 的神经细胞；c 图显 示出神经球来源的细胞迁移的方向不同，疏密程度也有差别( 绿色：g f p 阳性的干细胞球； 红色：懈免疫阳性的血管内皮细胞) ：d 图是更高倍数f 的干细胞和脑片中尉有血管的 共存现象；e 图是距离神经球相对较远的区域，迁移至此的细胞数目也明显减少，并且有明 显的沿血管前行的趋势；f 图：一个迁移的干细胞有三个明显突起，并且和血管的走形几乎 完全吻合。 第2 章神经干细胞存迸了体外老化和a d 神经元存活 2 3 9 上清中已知的蛋白成分列表 s 1 1 $ 2 1 $ 3 1 婢1 $ 4 2 $ 4 3 $ 5 1 s 5 2 $ 5 3 $ 5 _ 4 s 6 1 $ 7 - l $ 8 - l $ 9 1 $ 1 0 二l $ 1 1 1 $ 1 1 2 $ 1 2 一l s 1 3 - l $ 1 4 - l $ 1 5 1 $ 1 5 2 $ 1 6 - l $ 1 6 2 $ $ $ 7 一l 8 一l 8 2 $ 1 8 - 3 $ 1 9 1 $ 1 9 - 2 $ 1 9 3 $ 1 9 4 $ 1 9 - 5 h e m i f e r r n q 4 5 k d ap r o t e l n s p l i c ei s o f o r mlo fa l p h a f e t o p r o t e l np r e c u r s o r e p s i l o nlg l o b i n l6 k d ap r o t e i n l6 k d ap r o t e i n b a l - 6 6 7 7 4 k d ap r o t e r n 7 5 k d ap r o t e i n s p l i c ei s o f o r mlo fs e r o t r a n s f e r r l np l u ! c u r s o r g l u t a m a t e 附m d a 】r e c e i 吓o rs u b u n i t3bp r e c u r s o r s i m i l a rt os a c s r n r e c e p t o r t y p ep r o t e i n t y r o s 刑ep h o s p h a t a s en 2p r e c u r s o r s i m i l a rt ot w i s tn e i g h b o r s i m l l a rt o4 6 3l4 3 4 0l9 r j kp r o t e l n s i m l l a rt ok i a a10 0 7p r o t e i n 8 4 k d ap r