（生理学专业论文）甘丙肽对神经干细胞、pc12细胞和b104细胞增殖的作用研究.pdf

学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成 果据我所知，除文中已经注明引用的内客外，本论文不包含其他个人已经发表或撰 写过的研究成果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均巳在文中作了明确说 明并表示谢意 作者签名：盘宝日期：蔓垒：l 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在 解密后适用本规定 日期：竺! ：! ：i 学位论文作者签名：导师 手之凑 甘丙肽对神经干细胞，p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞增殖的作用研究 甘丙肽对神经干细胞、p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞 增殖的作用研究 院 专 方 研 导 业： 向： 究生： 师： 生理学 细胞与分子神经生物学 程爽 摘要 甘丙肽( g a l a n i n , g a l ) 是一个2 9 - - 3 0 个氨基酸的酰基化神经肽。它广泛 分布于中枢神经系统，对神经发生和神经损伤修复起到一定的调节作用。在神经 发生和神经损伤修复过程中，神经细胞的增殖是重要环节，本文运用几种可增殖 神经类细胞( 神经于细胞、p c i 2 细胞、b 1 0 4 细胞) ，检测g a l 及其受体( g a l r l 、 g a l r 2 和g a l r 3 ) 在该类细胞中的表达特性，并探讨g a l 对该类细胞增殖的影 响。由此推测它在中枢系统中可能起到的调节作用。实验分四部分： 第一部分，分离e 1 4s d 大鼠胚胎的前脑室下带( s v z ) 区域的细胞，接种 于含b f g f 、b 2 7 的d m e m f 1 2 的无血清培养基中。用n e s t i n 单克隆抗体检 测未分化的细胞。在诱导细胞分化后，分别进行m a p 2 、g f a p 、c n p 免疫组 化检测，分别鉴定神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞多种分化细胞。确定获 得的是神经干细胞。同时，培养p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞，为进行后面的研究提 供稳定的细胞来源。 第二部分，为了检测体外培养的神经干细胞，p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞是否 表达g a l l 及其三种受体_ g a l r l 、g a l r 2 和g a l r 3 ，实验中运用r t - p c r 方法 来检测g a l 及其三种受体m r n a 的表达。再用免疫荧光化学的方法来检测g a l 蛋白的表达。 第三部分，为了初步了解g a l 对神经干细胞，p c i 2 细胞，b 1 0 4 细胞的影 响，首先，实验中运用m t t 法来检测不同浓度的g a l 及其受体激动剂( g a l l 1 1 和g a l 2 1 1 ) 和拮抗剂( m 3 5 ) 对三种细胞增殖的影响。 甘丙肽对神经干细胞、p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞增殖的作用研究 第四部分，采用t u n e l 法进一步检测g a l 是否引起了神经干细胞的凋亡。 通过乳酸脱氢酶检测，看g a l 是否引起神经干细胞凋亡。 实验结果： 1 ) 经过上述分离与纯化细胞的方法，我们成功地获得能够稳定的生长。具有神 经干细胞特征，并具有多分化潜能的细胞。获得了稳定的p c i 2 和b 1 0 4 细胞 系。 2 ) 神经干细胞不仅有g a l 的表达还有所有三种g a l 受体的表达；p c i 2 细胞 表达所有三种g a l 受体，而不表达g a l ；b 1 0 4 细胞表达g a l 及两种受体 g a l t l 2 和g a l r 3 ，而不表达g a l r l 。 3 ) g a l 及其激动剂可抑制体外培养的神经干细胞和p c i 2 细胞的增殖，却对 b 1 0 4 细胞的增殖起到促进作用。非特异性受体阻断剂m 3 5 单独作用不影响 细胞的增殖，却能阻断g a l 及其激动剂的作用。 4 ) g a l 并非通过诱导细胞凋亡而对神经干细胞的增殖起到抑制作用。g a l 并 没有引发细胞坏死等毒性作用。所以推测g a l 是通过延缓细胞增殖周期而对 神经干细胞的增殖产生抑制作用。 综上所述，我们从e 1 4s d 大鼠胚胎的前脑室下带( s v z ) 分离纯化得到了 纯度较高的神经干细胞。利用这种细胞来研究g a l 的作用，结果说明g a l 抑 制这种细胞的增殖，但这种抑制效应不是通过引起细胞的凋亡或死亡而实现的。 所以推测g a l 是通过延缓细胞增殖周期而对神经干细胞的增殖产生抑制作用。 此外，p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞中由于受体表达不同，介导的g a l 的效应也不同。 说明三种不同的g a l r s 可能介导不同的作用。 关键词：神经干细胞；p c i 2 细胞；b 1 0 4 细胞；g a l ；g a l r s ；表达； 增殖；凋亡 甘丙肽对神经干细胞、p c i 2 细胞和b 1 0 t 细胞增殖的作用研究 t h er e s e a r c ho fg a l a n i n se f f e c t so nt h en e u r a ls t e mc e l l s ， p c i 2c e l l sa n db 1 0 4c e l l s d e p a r t m e n t ：s c h o o 1 o f l i f e s c i e n c e s m a j o r ：p h y s i o l o g y g r a d u a t e ： t u t o r ： c h e n gs h u a n g p r o f e s s o rc h o n g g a n gy u a n a b s t r a c t g a l a n i n ( o a l ) i sa2 9 3 0a n l i n o - a c i dn e u r o p e p t i d e i ti ss p r e a dt h r o u g h o u tt h e c e n t r a ln e r v o l l ss y s t e m g a l a n i ni si n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no fn e u r o g e n e s i sa n d n e u r a lr e g e n e r a t i o np r o c e s s h at h i sp r o c e s s t h ep r o l i f e r a t i o no f n e l w ec e l l sa r er e a l l y i n v o l v e d t os t u d yt h ee f f e c to fg a l a n i no nn e u r a lc e i l sp r o l i f e r a t i o n ，t h i se x p e r i m e n t i n v e s t i g a t e st h ee x p r e s s i o n so fg a l a n di t sr e c e p t o r si np r o l i f e r a t i v en e u r a lc e l l s s u c ha sn e u r a ls t e mc e l l s ( n s c s ) ，p c i 2c e l l s ，b 1 0 4 c e i l s ，a n df u r t h e rs t u d i e sw e r e m a d ef o ru n c e r s t a n d i n gt h ee f f e c t so fg a lo nt h ep r o l i f e r a t i o no ft h e s ec e l l s f o u r e x p r e s s i o n sw e r ec a r r i e do u ta sf o l l o w s ： f i r s t ，t h en e u r a ls t e mc e l l sf r o mt h es u b v e n t r i c u l a rz o n eo f r a te m b r y o n i cd a y 1 4 ( e 1 4 ) w e r ec u l t u r e di nt h es e n l m f r e em e d i u mc o n s i s t i n go fd m e m f 1 2 ( 1 ：1 ) ， b 2 7s u p p l e m e n ta n db f g ei d e n t i f i c a t i o nw a sc a r r i e do u tu s i n gn e s t i na n t i b o d i e sf o r u n d i f f e r e n t i a t e dc e l l s h ao r d e rt od e t e r m i n et h ep h e n o t y p eo ft h ed i f f e r e n t i a t e dc e l l s ， m a p 2 ，g f a p , c n p , d i s t i n c t i v em a r k e rf o rn e u r o n , a s t r o e y t e sa n do l i g o d e n d m c y t e s w e r eu s e d s e c o n d ，t od e t e r m i n ei fn s c si nv i t r o ，p c i 2c e l l sa n db 1 0 4c e l l se x p r e s s e dg a l a n di t sr e c e p t o r si n c l u d i n gg a l r 1 ，g a l r 2a n dg a l r 3 ，i nt h i ss t u d y , w ed e t e c t e d m r n a sf o rg a la n di t st h r e er e c e p t o r su s i n gr t o p c ra n a l y s i s ，a n dt h e n , t h e i m m u n o f l u o r e s c e n ts t a i n i n gw a su s e dt od e t e c tg a l 1 1 l i r d t od e t e r m i n ee f f e c t so fg a lo nn s c s , p c i 2c e l l sa n db 1 0 4 c e l l s ，m t i 3 甘丙肽对神经干细胞tp c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞增殖的作用研究 a n a l y s i sw a s u s e dt od e t e c tt h ee f f e c t so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fg a la n da g o n i s t ( g a l l 一1 1a n dg a l 2 1 1 ) ，a n t a g o m s t ( m 3 5 ) o f g a lr e c e l a t o r so nt h ep r o l i f e r a t i o no f p r o l i f e r a t i v en e u r a lc e l l s t h ef o u r t h , t h et u n e lm e t h o dw a sf u r t h e ru s e dt od e t e c ti fg a lc o u l dr e s u l ti n c e l la p o p t o s i s l d hw a sd e t e c t e dt os e ei f g a lc a u s e sc e l ld e a t h t h ef o l l o w i n g sa r et h er e s u l t so f t h i ss t u d y ： 1 ) w i t l lt h em e t h o d so fi s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o nm e n t i o n e da b o v e ，w es u c c e s s f u l l y o b t a i n e dt h ec e l l st h a te x h i b i tp r o p e r t i e sa n ds a t i s f yc r i t e r i ar e p r e s e n t a t i v eo fs t e m c e l l s 。 n s c se x p r e s sm r n ao fg a la n da l lt h et 1 1 r e eg a l r s p c i 2c e l l se x p r e s sm r n a f o ra l lt h et h r e eg a l r sb u tn o tf o rg a l b 1 0 4c e l l se x p r e s sm r n af o rg a la n df o r g a l r 2a n dg a l r 3b u tn o tf o rg a l r l 3 ) g a la n di t sa g o n i s t sc a l li n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o no f n s c sa n dp c i 2c e l l sb u tc a n i n c r e a s et h ep r o l i f e r a t i o no f b l 0 4c e l l s a l lt h ee f f e c t sc a nh eb l o c k e db ym 3 5 4 ) i na d d i t i o n ，t h er e s u l t so ft u n e la n dl d ha n a l y s i ss h o w e dt h a tg a l d i d n tl e a d n s c st oa p o p t o s i sa n dc e l ld e a t h i naw o r d ，u s i n gt h ei s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o nm e t h o d ，w eo b t a i n e dm u c hp u r e n s c sa n ds t u d i e dt h ee f f e c to fg a lo nt h e s ec e l l s t h er e s u l ts h o w e dt h a tg a l i n h i b i t e dt h e s ec e l l sp r o l i f e r a t i o n , b u tt h ee f f e c tw a sr e a l i z e dn o tb yl e a d i n gc e l l st o a p o p t o s i sa n dd e a t h i ts u g g e s tt h a tg a l m e d i a t e st h ee f f e c tb ys l o w i n gt h ec e l lc y c l e p c i 2c e l l sa n db 1 0 4c e l l se x p r e s sd i f f e r e n tg a l r sa n dh a v ed i f f e r e n te f f e c tt og a l i ts u g g e s t st h a td i f f e r e n tg a l r sc a nm e d i a t ed i f f e r e n tc e l lf u n c t i o n k e yw o r d s ：n s c s ；p c i 2c e l l s ；b 1 0 4c e l l s ；g a l a n i n ；g a l r s ； e x p r e s s i o n ；p r o l i f e r a t i o n ；a p o p t o s i s 五 甘丙肽对神经干细胞、p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞增殖的作用研究 前言 g a l a n i n ( g a l ) 是一个由2 9 3 0 个氨基酸组成的神经肽，最初是从猪的小 肠中分离出来的【l 】。在哺乳动物中，g a l 广泛地分布于中枢神经系统和外周神经 系统，具有多种作用，包括参与神经调制、生殖和内分泌功能的调节 2 - 4 。g a l 的这些作用是通过与至少三个特异性受体亚型g a l r l 、g a l r 2 和g a l l u 的相互作 用而介导的，三种受体亚型都属于g 蛋白偶联受体超家族成员【5 1 。在哺乳动物的 中枢神经系统中，前脑腹侧、杏仁核、海马、脑干和脊髓中都出现g a l 的高表 达 6 - 1 2 1 。与其广泛分布的特点相二致的是，g a l 具有非常广的作用，包括参与神 经功能的调制、神经再生和内分泌等功能【1 3 ”】。最新的一项研究发现在正常成年 动物的大脑中，位于室下带( s u b v e n t r i c u l a rz o n c ，s v z ) 和头向迁移通道( r o s t r a l m i g r a t o r ys t r e a m ，r m s ) 的未成熟的神经祖细胞高表达g a lm r n a 且具有g a l 的免疫反应性【1 6 】。在受损的神经区域，g a l 的表达则明显升高川9 1 。提示g a l 可能参与了神经发生和再生过程中的调控。研究发现，在中枢神经系统中，当前 脑瞬时缺血后，海马中出现g a l 表达的升高。而在外周神经系统中，当坐骨神 经和脊髓神经横断之后，脊髓背根神经节中也出现g a l 表达的升高。另外，在 阿尔茨海默病患者中也存在g a l 的高表达。上述g a l 高表达的出现都是在神 经系统受损的情况下出现的，提示g a l 可能参与了神经发生和再生过程中的调 控。但是，这种g a l 高表达的具体作用是什么至今还不是很清楚。已有研究说 明g a l 是一种神经抑制调质。而且近来的研究还发现，g a l 参与细胞增殖和凋 亡的调节。 我们曾经研究过g a l 对嗅成鞘细胞增殖的影响，发现g a l 对嗅成鞘细胞 的增殖起着明显的抑制作用1 2 0 1 。为确定g a l 对神经细胞增殖的影响是否具有普 遍性，我们首先在神经干细胞上进行了检测，之后又在两种同时具有可增殖细胞 和癌细胞特点的p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞株上进行了进一步的验证。 堂堕堕翌塑墅! 墅堕：鉴! ! 塑望塑! ! 竺塑望望堕塑堡旦堕窒 参考文献 1 t a t e m o t o ，k ，r o k a e u s ，a ，j o m v a l l ，h ，m c d o n a l d ，t ，jm u t t ，v 1 9 8 3 g a l a n i n ： an o v e lb i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d ef r o mp o r c i n ei n t e s t i n e f e b s l e t t1 6 4 ：1 2 4 1 2 8 2 k o r d o w e r , j h ，h k l e & e j m u f s o n 1 9 9 2 g a l a n i ni m m u n o r e a c t i v e t yi nt h e p r i m a t ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m j = c o m p n e u r 0 1 。3 1 9 ( 4 ) ：4 7 9 5 0 0 3 b a r t f a i ，t ，t h o k f e l t & u l a n g e l 1 9 9 3 g a l a n i n ：an e u r o e n d o c f i n ep e p t i d e c r i t r e v n e u r o b i 0 1 7 ( 3 一钔：2 2 9 - 2 7 4 4 i i s m a a , 1 p ) s h i n e 19 9 9 g a l a n i na n dg a l a n i nr e c e p t o r s r e s u l t sp r o b lc e l l d i f f e r 2 6 ：2 5 7 - 2 9 1 5 b r a n c h e k , t a ，k e s m i t h , c g e r a l d & m w w a l k e r 2 0 0 0 g a l a n i nr e c e p t o r s u b t y p e s t r e n d sp h a r m a c o l s c l2 1 ( 3 ) ：1 0 9 11 7 6 c h e u n g ，c c ，h o h m a n n , j g ，c l i f t o n , d k 。s t e i n e r , a 2 0 0 1 d i s t r i b u t i o no f g a l a n i nm e s s e n g e rr n a - e x p r e s s i n gc e l l si nm u r i n eb r a i na n dt h e i rr e g u l a t i o nb y l e p t i ni nr e g i o n so f t h eh y p o t h a l a m u s n e u r o s c i e n c e1 0 3 ：4 2 3 4 3 2 7 k o r d o w e r ，j h ，l e ，h k ，m u f s o n , e j 1 9 9 2 g a l a n i ni m m u n o r e a c t i v i t yi nt h e p f i m a t ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m zc o m p n e u r o l3 1 ：4 7 9 5 0 0 8 m e l a n d e r , t - ，h 0 k f e l t ，t ，r o k a e u s 。a 1 9 8 6 d i s t r i b u t i o no fg a l a n i n - l i k e i m m u n o r e a e t i v i t yi nt h er a t c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m j c o m p n e u r o l2 4 8 ： 4 7 5 5 1 7 9 p e r e z , s e ，w y n i c k ，d 。，s t e i n e r , r a ，m u f s o n , e j 2 0 0 1 d i s t r i b u t i o no f g a l a n i n e r g i ci m m u n o r e a c t i v i t yi nt h eb r a i no ft h em o u s e j = c o m p n e u r 0 1 4 3 4 ： 1 5 8 1 8 5 1 0 r o k a e u s ，a ，m e l a n d e r , t ，h o k f e l t ，t ，l u n d b e r g ，j m ，t a t e m o t o ，k ，c a r l q u i s t 。 m ，m u t t , v 1 9 8 4 ag a l a n i n - l i k ep e p t i d ei nt h ec e n t r a ln f f f v o u ss y s t e ma n d i n t e s t i n eo f t h er a t n e u r o s c ll e t t 4 7 ：1 6 1 1 6 6 11 s k o f i t s e h , g ，j a c o b o w i t z ，d m 1 9 8 5 i m m u n o h i s t o e h e m i c a l m a p p i n go f g a l a n i n - l i k en e u r o n si nt h er a ti ：e n t r a ln e r v o u ss y s t e m p e p t i d e s6 ：5 0 9 - 5 4 6 - 6 - 甘丙肽对神经干细胞、p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞增殖的作用研究 1 2 s k o f i t s c h , g ，j a c o b o 、v i t z d m 1 9 8 6 q u a n t i t a t i v ed i s t r i b u t i o no fg a l a n i n l i k e i m m u n o r e a c t i v i t yi nt h er a tc e i i t r a jn e r v o u ss y s t e m p e p t i d e s7 ：6 0 9 - 6 1 3 1 3 b a r t f a i ，th o k f e l t , t ，l a n g e l ，u 1 9 9 3 g a l a n i n ：an e u r o e n d o c r i n ep e p t i d e c r i t r e v n e u r o b h d 7 ：2 2 9 - _ 2 7 4 1 4 1 i s m a a , t p ，s h i n e , j 1 9 9 9 g a l a n i na n dg a l a n i nr e c e p t o r s r e s u l t sp r o b lc e l l d i f f e n2 6 ：2 5 7 - 2 9 1 1 5 k o r d o w e r , j h ，l e ，h k ，m u f s o n , e j 1 9 9 2 g a l a n i ni m m u n o r e a c t i v i t yi nt h e p r i m a t ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m j = c o m p n e u r o l3 1 9 ：4 7 9 - 5 0 0 1 6 。s h e n , p 。j 。，l a r m , j a ，g u n d l a c h , a l 2 0 0 3 e x p r e s s i o na n dp l a s t i c i t yo f p l e i o t r o p i cg a l a n i ns y s t e m si nc o r t i c a ln e u r o n s ，o l i g o d e n d r o c y t cp r o g e n i t o r sa n d p r o l i f e r a t i o nz o n e si nn o r m a lb r a i na n da f t e rs p r e a d i n gd e p r e s s i o n e u r z n e u r o s c l1 8 ：1 3 6 2 1 3 7 6 1 7 c h a n g ，j l ，c h r i s t o f i d e s ，n d ，a n a n d pg i b s o n , s ja l l e n , y s ，s u , a c ， t a t e m o t o ，k ，m o r r i s o n , j f ，p o l a k , j m ，b l o o m ，s i l1 9 8 5 d i s t r i b u t i o no f g a l a n i ni m m u n o r e a c t i v i t yi nt h ec e n t r a ln e r v o n ss y s t e ma n dt h er e s p o n s e so f g a l a n i n - c o n t a i n i n gn e u r o n a lp a t h w a y st oi i l j u r y n e u r o s c i e n c e1 6 ：3 4 3 _ 3 5 4 18 p h i l i p ，v h ，j a c q u e l i n e ，n c 1 9 9 6 o l f a c t r yb u l b e c t o m yi n c r e a s e s p r e p r o - g a l a n i nm r n al e v e l si nt h er a tl o c u se o e r u l e n s m 0 1 b r a i nr e s 3 6 ： 1 8 4 1 8 8 1 9 s c h r e i b e r , r c ，h y a r s a c h s ，h ，b e n n e t t a ，z i g m o n d ，r e 1 9 9 4 g a l a n i n i n c r e a s e si na d u l tr a ts y m p a t h e t i cr l e u r o n sa f t e ra x o t o m y n e u r o s c i e n c e6 0 ： 1 7 2 7 2 0 x i a , c y c x y u a n & c gy u a n 2 0 0 5 ，g a l a n i ni n h i b i t st h ep r o l i f e r a t i o no f g l i a lo l f a c t o r ye n s h e a t h i n gc e l l s n e u r o p e p t i d e s , 3 9 ( 5 ) ：4 5 3 - 4 5 9 一7 - 甘丙肽对神经干细胞、p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞增殖的作用研究 第一部分：大鼠胚胎神经干细胞的分离培养与鉴定、p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞的培养 【摘要】目的：从s d 胎鼠侧脑室下带( s v z ) 分离获得神经干细胞，进行体 外培养、扩增并鉴定其特性。培养p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞，作为进一步实验的 细胞源。方法：在胎鼠脑s v z 区分离神经干细胞，利用含有b f g f 和b 2 7 的无 血清培养基进行体外培养并扩增，采用免疫细胞化学方法检测细胞的神经干细胞 特异性抗原及分化的神经细胞和神经胶质细胞的特异性抗原的表达。分别用加入 1 5 马血清和加入1 0 f c s 的d m e m f 1 2 培养基培养p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞。 结果：从胎鼠s v z 区分离获得的细胞群具有连续克隆能力，并表达神经干细胞 特异性蛋( n e s t i n ) ；而诱导分化后的细胞表达出神经元、星形胶质细胞和少突胶 质细胞的特异性抗原。具备中枢神径系统干细胞的基本属性。得到稳定的可连续 增殖的p c i 2 和b 1 0 4 细胞系。 【关键词】神经干细胞p c i 2 细胞b 1 0 4 细胞细胞培养 1 9 9 2 年，r e y n o l d s 等人从胚胎1 4 天的小鼠纹状体原基分离培养得到一种具 有多分化潜能的神经细胞i l 】，通过单克隆分析和免疫组化检测证明分离培养的细 胞具有很强的增殖能力，在一定条件下，可分化成神经系统各种类型的神经元或 胶质细胞，称这类细胞为神经干细胞 2 1 。后续的研究又从胎鼠的大脑皮层、室下 带、海马等部位分离得到神经干细胞，说明胎鼠可以作为提供神经干细胞的稳定 来源【3 捌。 鼠源嗜铬细胞瘤( p c i 2 ) 细胞【6 】，由于具有神经祖细胞的特点而被广泛用于 神经系统研究的细胞模型。它能够在具有生长因子的培养基中持续增殖，并在加 入神经生长因子( n g f ) 后分化为交感神经元细剧。”。p c i 2 细胞还因其具有大 多数生长因子，神经营养因子以及激素的受体而被广泛应用于细胞信号转导，细 胞增殖以及分化的研究i s - 9 1 。 成神经细胞瘤( b 1 0 4 ) 细胞是从化学诱导的大鼠脑肿瘤中得到的【1 0 1 。对于 体外研究神经发育及调控非常有价值。它在含血清的培养基中增殖很快，去掉血 甘丙肚对神经干细胞、p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞增殖的作用研究 清后会停止增殖并可从成纤维样细胞转化为双极细胞。 本实验取怀孕1 4 天的s d 大鼠胚胎的前脑室下带( s v z ) 区域的细胞，在 体外利用无血清培养方法和群体培养的方法，获取神经干细胞，并进行增殖和多 向分化能力等特性鉴定，同时建立培养具有良好增殖特性的神经细胞系。为进一 步研究g a l 及其受体在神经细胞增殖中的作用奠定基础。 材料与方法 i 大鼠胚胎神经干细胞的分离培养与鉴定 i i 动物及试剂： 动物：妊娠1 4 天的s d 大鼠由上海计划生育研究所动物中心提供。 细胞培养用主要试剂：d m e m f 1 2 ( i ：i ) 培养基、b 2 7 s u p p l e m e n t 、胎牛血清 均购自g i b e o 公司。小牛血清购自华美生物工程公司。碱性成纤维细胞生长因子 ( b f g f ) 购自p r o m e g a 公司。 抗体及荧光试剂：鼠抗- - n e s t i n 单克隆抗体、小鼠抗微管相关蛋白- - 2 ( m o u s e a n t i m a p 2m o n o c l o n a la n t i b o d y ) 、小鼠抗胶质纤维酸性蛋白( m o u s ea n t i g f a p m o n o c l o n a la n t i b o d y ) 和小鼠抗2 ，3 一环核苷酸磷酸二脂酶( m o u s ea n t i c h i p m o n o c l o n a la n t i b o d y ) 的单克隆抗体，均购自s i g m a 公司。a b c 免疫组化检测试 剂盒、d a b 浓缩显色液、结合异硫氰酸荧光素的山羊抗鼠抗体( a n t i m o l s i g g f i t cc o n j u g a t e ) 购自华美生物工程公司。 无血清培养基：用d m e m f 1 2 ( i ：i ) 加h e p e s ( 1 5 m m o l l ) 、n a h c 0 3 ( i 2 9 l ) 、 b 2 7 ( 2 0t l1 m 1 ) 、b f g f ( 2 0 n g m 1 ) 、青霉素( i o o u m 1 ) 和链霉素( 1 0 0 0 m 1 ) l l l = 蒸 水配制而成，过滤除菌，4 c 保存。 i 2 取材： 麻醉：腹腔注射戊巴比妥钠( 1 5 ) 1 5 m l 。 分离室下带( s v z ) 区域的细胞：用碘酒和酒精消毒后在无菌室内打开腹腔， 取出胎鼠放入冰冷的d h a n k s 液中，剪下胎鼠的头部入另一盛有冰冷的 甘丙肽对神经干细胞、p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞增殖的作用研究 d h a n k s 液的培养皿内，在解剖镜下用眼科镊去除硬脑膜，打开胎鼠的大脑半 球，尽量剔除脉络丛，选取s v z 区域的组织，将所取组织置于d h a n k s 液中。 1 3 培养方法： 原代培养：将所取组织在1 0 m l 刻度离心管中离心后，加入2 m l 培养基，用 烧口的移液管机械吹打3 0 次，静置5 分钟，移上层细胞悬液以5 x 1 0 5 m l 的密度 接种到7 5 m l 培养瓶中，培养瓶置于饱和湿度的3 7 、3 c 0 2 培养箱中培养，每 天在倒置显微镜下观察细胞分裂和增殖情况。 传代培养：将培养瓶左右晃动几下，然后用移液管将细胞悬液全部吸出至 1 0 m l 刻度离心管中，以8 x 1 0 0 r p m 离心5 分钟，移去2 3 的旧培养基，加入新鲜 培养基，用烧口的吸管吹打神经球团，使分散成单细胞，以5 x 1 0 5 m l 的密度接 种到7 5 m l 培养瓶中继续培养。此后每5 7 天传代一次，传代细胞作为后继实验 的细胞来源。 低密度培养：将细胞从培养瓶中吸出，移入1 0 m l 刻度离心管中，8 0 0 r p m 分 钟离心，移去上清液，加新鲜培养基，用烧口的吸管吹打3 0 次，静置1 0 分钟， 移上层的细胞悬液以5 x 1 0 m l 的密度，取5 0u1 细胞悬液加到9 6 孔板中，每隔 2 4 小时在倒置显微镜下定期观察细胞的生长状态、增殖分化情况和细胞周期。 1 4 检测方法： n e s t i n 检测的实验设计：将形成的细胞克隆均匀地接种到预先放置的涂有多 聚赖氨酸盖玻片的2 4 孔培养板中，培养基为含1 0 胎牛血清的d m e m f 1 2 ，将 2 4 孔培养板放入3 7 、3 c 0 2 培养箱中培养，贴壁2 小时后进行n e s t i n 免疫 荧光标记和a b c 免疫组化检测。 神经干细胞分化实验：将形成的细胞克隆机械吹打为单细胞悬液，5 x 1 0 4 孔的密度均匀地接种到预先放置的涂有多聚赖氨酸盖玻片的2 4 孔培养板中，培 养基为含1 0 胎牛血清的d m e m f 1 2 ，将2 4 孔培养板放入3 7 c 、3 c 0 2 培养 箱中培养，每3 天换液一次，培养7 天后进行m a p , 、g f a p 、c n p 免疫组化检测。 n e s t i n 免疫荧光标记的步骤 1 细胞在盖玻片上贴好后，以4 多聚甲醛固定3 0 分钟。 甘丙驮对神经干细胞、p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞增殖的作用研究 2 0 0 1 m p b s 漂洗5 分钟3 次。 3 o 7 5 过氧化氢孵育，室温，1 0 分钟。 4 0 0 1 m p b s 漂洗5 分钟3 次。 5 o 3 t r i t o n x - 1 0 0 室温下作用1 5 分钟。 6 0 0 1 mp b s 漂洗5 分钟x 3 次。 7 加入1 0 山羊血清封闭剂，3 7 ，2 0 分钟。 8 倾去多余封闭剂，不洗，直接加入一抗( n e s t m1 ：5 0 ) ，4 过夜。 9 0 0 1 m p b s 漂洗5 分钟3 次。 l o 。滴加生物素标记的f i t c ，3 7 孵育l 小时。 1 1 0 0 1 m p b s 漂洗5 分钟3 次。 1 2 荧光显微镜下观察拍照。 按照a b c 法进行n e s t i n ( m a p 2 、g f a p 、c n p ) 标记的步骤 1 细胞在盖玻片上贴好后，以4 多聚甲醛固定3 0 分钟。 2 o 0 1 m p b s 漂洗5 分钟3 次。 3 o 7 5 过氧化氢孵育，室温，1 0 分钟。 4 o 0 1 m p b s 漂洗5 分钟3 次。 5 0 3 t r i t o n x 1 0 0 室温下作用1 5 分钟。 6 0 0 1 m p b s 漂洗5 分钟3 次。 7 加入1 0 山羊血清封闭剂，3 7 ，2 0 分钟。 8 倾去多余封闭剂，不洗，直接加入一抗( n e s t i n l ：5 0 ) ，4 0 过夜。 9 0 0 1 m p b s 漂洗5 分钟3 次。 1 0 滴加生物素标记的二抗，3 7 孵育i 小时。 1 1 0 0 1 m p b s 漂洗5 分钟3 次。 1 2 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，3 7 孵育1 小时。 1 3 o 0 1 m p b s 漂洗5 分钟3 次。 1 4 d a b 显色，镜下见显色适宜，即用自来水充分冲洗，终止显色。 1 5 晾干盖玻片，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。 2 p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞的培养 甘丙肽对神经干细胞、p c i 2 细胞和b 1 0 4 细胞增殖的作用研究 2 1 细胞及试剂： 细胞：p c i 2 和b 1 0 4 细