（神经生物学专业论文）激素剂诱导的βarrestinl核转位及其机制的研究.pdf

皇里盔兰堡主芏垡芝苎一 塑垫型受量盟q ：! ! 堡! ! ! ! ! 堕整垡丞基垫型塑堑壅 缩写词 g p c r ( g p r o t e i nc o u p l e dr e c e p t o r ) ，g 蛋白偶联受体 d o r ( 8 - o p i o i dr e c e p t o r ) ，6 - 阿片受体 w t ，野生型6 _ 5 可片受体 a 3 1 ，缺失羧基末端3 1 个氨基酸残基的d o r 突变体 m 3 ，含t 3 5 8 t 3 6 1 s 3 6 3 g 的磷酸化位点被取代的d o r 突变体 g r k ( gp r o t e i nc o u p l e dr e c e p t o rk i n a s e ) ，g 蛋白偶联受体激酶 m o r ( p - o p i o i dr e c e p t o r ) ，g - 阿片受体 k o r ( k o p i o i dr e c e p t o r ) ，k 一阿片受体 1 3 2 a r ( p 2 - a d r e n e r g i cr e c e p t o r ) ，b 2 肾上腺素受体 n e s ( n u c l e a re x p o r ts i g n a l ) ，核输出信号 3 - a r r e s t i n ，p a r r 一 1 3 a r r l - 2 c t g f p ，由入p a r r e s t i n l 的n 端3 3 3 个氨基酸( 1 - 3 3 3 ) 和人p a r r e s t i n 2 的羧 基末端7 3 个氨基酸( 3 3 6 4 0 8 ) 组成的b a r r e s t i n 嵌合体。 p a r r 2 1 c t g f p ，由人d a r r e s t i n 2 的n 端3 3 5 个氨基酸( 1 - 3 3 5 ) 和人1 3 a r r e s t i n l 的羧 基末端8 5 个氨基酸( 3 3 4 4 1 8 ) 组成的b a r r e s t i n 嵌合体。 1 3 a r r l n ，1 3 a r r l 的n 端片段( i a r r l 氨基酸残基1 - 1 8 4 ) d a r r 2 n ，b a r r 2 的n 端片段( f h r r 2 氨基酸残基l - 1 8 6 ) 6 町1 c ，p a r r l 的c 端片段( p a r r l 氨基酸残基1 8 5 4 1 8 ) p a r r 2 c ，1 3 a r t 2 的c 端片段( p a r r 2 氨基酸残基1 8 6 4 0 8 ) h e k ，人胚肾细胞 g f p , 绿色荧光蛋白 2 ! 燮堂堡主堂垡堡奎 塑垫型重量盟旦：璺壁! 墅! 垫整垫墨苎垫型塑堑室 中文摘要 g 蛋白偶联受体( g p c r ) 是一类重要的细胞表面受体，通过g 蛋白传递信号。 p a r r e s t i n ( p a r r ) 是一类重要的信号调控蛋白和支架蛋白( s c a f f o l d ) ，在g p c r 的信号转导和调控中起重要作用。在激动剂的作用下g p c r 激活g 蛋白介导的信 号通路并发生磷酸化和内吞。p a r r 选择性地同磷酸化的g p c r 结合、引起受体内 吞而抑制受体的信号转导，并能作为支架蛋白结合其它信号分子易化细胞内其它 信号通路的激活。 d a r r 有两种亚型，d a r r l 和p a r r 2 ，两者的结构具有很高的同源性，在调控 g p c r 信号转导中的功能也很相似。研究表明，在激动剂的刺激下p a r r l 和p a r r 2 从细胞浆向g p c r 所在的细胞膜转位，与磷酸化的g p c r 结合、参加g p c r 的信号 转导和调控。但是随着研究的深入，p a r r l 和p a r r 2 之间的差异逐渐被发现，研 究结果提示p a r r l 和p a r r 2 对g p c r 信号的调控机制存在差异。此外，最近的研究 发现两者在细胞内的分布也有差异，f l a r r l 分布于胞浆和胞核而f l a r r 2 只分布在 细胞浆中。很多研究证明d a r r 在g p c r 激活后发生的细胞内重分布，即从细胞浆 向细胞膜的转位对其功能有重要影响。但p a r r l 和p a r r 2 在亚细胞分布的不同是 否与p a r r l 和p a r r 2 的功能有关以及其生物学意义目前尚未有任何报道。因此， 本课题在h e k 2 9 3 细胞上，使用b a r r g f p 融合蛋白研究了g p c r 激活后d a r r l 和 b a r n 在细胞内的重分布及其机制并对其相关功能进行了初步的探讨。 我们的研究结果表明：( 1 ) 激活6 一阿片受体能诱导p a r r l 向细胞核转位， 但在相同条件下未观察到b a r r 2 能向细胞核转位。( 2 ) 激活k o r 也可以引起p a r r l 向细胞核转位。而m o r 和b 2 a r 被激活后，p a r r l 只向细胞膜转位但未观察到其向 核转位，说明一些g p c r 的激活可以引起1 3 a r r l 发生核转位和膜转位，而另一些 受体只能引起1 3 a r r l 向细胞膜转位。( 3 ) 进一步研究发现受体的c 末端对激动剂 刺激的p a r r l 核转位有重要影响。激活缺失羧基末端最后3 1 个氨基酸的d o r 突 变体3 1 不能诱导p a r r l 向细胞核转位。激活d o r 突变体m 3 ( 磷酸化位点突 变体) 和e 3 5 5 q d 3 6 4 n ( g r k 结合位点突变体) 都不能刺激p a r r l 向核转位。这 些结果提示激动荆刺激的o a r r l 核转位依赖于激动剂诱导的g r k 催化的受体的 磷酸化。( 4 ) 我们在h e k 2 9 3 细胞中瞬时表达了p a r r 嵌合体，观察发现，与d a r r 2 相同，c 末端被换成相应的p a r r 2 片段的d a 玎l 突变体p a r r l - 2 c t g f p 主要分布在 胞浆，在激动剂刺激下不发生向细胞核的转位。而c 末端被换成相应的p a r r l 片 段的d a r r 2 突变体p a 玎2 1 c t g f p 则表现出与p a r r l 相同的分布特征，均匀地分布 3 墨旦2 三兰| 苎堡主堂垡堕塞 塑垫型重量塑g ：! 坚! ! 生翌! 堡整垡壁基垫型塑堑塞 在胞浆和核内，激动剂刺激后，向细胞核内和细胞膜上转位。这提示b a r r 的c 末 端不仅影响p a r r 在细胞内分布而且是影响激动剂刺激引起的p a r r l 核转位的重要 结构因素。p a r r 2 c 末端具有核输出信号，因此我们利用单点突变将1 3 a r r 2 上的核 输出信号引入p a r r l c 末端得到突变体p a r r l q 3 9 4 l ，并观察了核输出信号对激动 剂刺激的p a r r 核转位的影响。结果显示带有p a r r 2 核输出信号的b a r r l 突变体 p a r r l q 3 9 4 l 同野生型d a 以表现相似，主要分布于胞浆，在受体激活后不发生核 转位，说明1 3 a r t 2 的核输出信号是导致在激动荆诱导下1 3 a r r 2 不能在核内蓄积的 一个关键因素。同时，我们发现不具有核输出信号的p a r r 2 l 3 9 4 q 突变体与b a r r l 一样能在细胞浆和细胞核内分布，但与d a r r l 不同的是，在激动剂刺激下， 1 3 a r r 2 l 3 9 4 q 突变体不在细胞核内聚集。这一结果说明b a r r c 末端除了核输出信号 外还有其它结构将对d a r r 是否发生核转位有重要影响。( 5 ) 我们采用报告基因检 测t 1 3 a r r l 是否参与核内基因转录的调控。实验结果显示，表达b a r r l 可以剂量依 赖地提高p m a 诱导的a p 1 的转录活性，而过表达p a r r 2 对a p 一1 的转录活性没 有影响。我们又进而检测；f ；a r r 对t n f a 诱导的n f f c b 的转录活性的影响。结 果显示，在h e k 2 9 3 细胞中表达b a r r l 能降低t n f d 诱导的n f 1 c b 的转录活性。 这就进步证实t 3 a r r l 确实可以调节某些基因的转录活性。我们又利用主要分 布在核内的1 3 a , r l 的n 端片段和主要分布在胞浆中的p a r r l 的c 端片段初步探讨 t p a r r l 的分布与其调控基因转录的功能之间的关系。结果表明与野生型1 3 a r t l 相 似，主要分布在核内的i j a r r l 的n 端片段能有效地降低t n f 诱导的n f 1 c b 的 转录活性。但大部分存在于胞浆1 3 a r r l 的c 端片段对基因的调控能力较弱，只有 在高表达的时候才会对基因转录活性起一定的调节作用。提示1 3 a r r l 能影响某些 基因的转录。b a r r 对基因转录活性的调控与其在核内的分布具有相关性。这些 结果首次证明了激活g p c r 能引起p a r r 向细胞核内转位，并提示激动剂诱导的 p a r r l 核转位可能是介导g p c r 信号入核、调控基因转录的的重要机制，p a r r 可 能具有更为广泛的生物学功能。 关键词：g 蛋白偶联受体，p a r r ，膜转位，核转位，转录活性 4 童里盔兰塑主兰焦墼 塑垫型鋈量盐q ：兰登苎垫! 量整垡垦基垫型塑塑壅 a b s t r a e t p 。a r r e s t i n ( p a r r ) b i n dt op h o s p h o r y l a t e dg p r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r s ( g p c r ) t o f e e d b a c k - r e g n l a t er e c e p t o rs i g n a l i n ga n da l s os e r v ea ss c a f f o l dp r o t e i nt of a c i l i t a t e i n t r a c e l l u l a r s i g n a l c a s c a d e s n l er e d i s t r i b u t i o no fl j a r r st om e m b r a n e f o l l o w i n g g p c ra c t i v a t i o ni se r i t i c a lf o rt h e s ef u n c t i o n s i nt h i s s t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h e r e d i s t r i b u t i o no f p a r r la n d1 3 r r 2i nr e s p o n s et oa c t i v a t i o no fg p c r s i nh e k2 9 3c e l l s u s i n gg r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ( o f p ) t a g g e d1 3 a r t s a n dc o n f o c a ll a s e r s c a n n i n g m i c r o s c o p e a c t i v a t i o no f5 - o p i o i dr e c e p t o r ( d o 鼢c a u s e db o t hp a r r l a n d p a r r 2 t r a f f i c k i n gt oc e l lm e m b r a n ea n dc o l o c a l i z i n g 、析t l ld o r ；h o w e v e r , a c c u m u l a t i o no f f a r r l ，b u t n o t p a r r 2 ，t ot h en u c l e u sa l s oo c c u r r e d t r a f f i c k i n go fd a 玎1 w a sa l s o o b s e r v e di n1 i v ec e l l si nr e a lt i m e t r a n s l o c a t i o no f1 3 a r r lf r o mt h ec y t o p l a s mt oe e l l m e m b r a n ea n dn u c l e u so c c u r r e dw i t h i n1m i no fa g o n i s tc h a l l e n g ea n dt h ec e l l m e m b r a n e a n dn u c l e u s a s s o c i a t e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t i e sm e a s u r e di n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y t h ea g o n i s t - i n d u c e db a r r l t r a n s l o c a t i o nt on u c l e u sw a sc o n f i r m e db y w e s t e r na n a l y s i so fp a r rc o n t e n ti nn u c l e a re x t r a c t so fc e l l se x p r e s s i n gp a r r lo r p a r r l g f p b u t a c t i v a t i o n o f 肛一o p i o i dr e c e p t o r o r p 2a d r e n e r g i cr e c e p t o ro n l y r e c r u i t e db a “lt om e m b r a n en o tt on u c l e u s m u t a t i n ggp r o t e i nc o u p l e dr e c e p t o r k i n a s ep h o s p h o r y l a t i o ns i t e so fd o r c o m p l e t e l yb l o c k e da g o n i s t d e p e n d e n tr e c e p t o r p h o s p h o r y l a t i o na n dn u c l e a r a c c u m u l a t i o no fl j a r r tb u to n l yp a r t i a l l yb l o c k e di t s m e m b r a n et r a n s l o c a t i o n w ea l s of o u n dt h a tt h ec t e r m i n u so f p a r r lw a sr e q u i r e df o r i t sa c c u m u l a t i o ni nt h en u c l e u su p o na g o n i s ta d d i t i o n t h er e d i s t r i b u t i o no fc h i m e r i c p a r r s w a sc o m p l e t e l yr e v e r s e d f r o mt h e i r w i l d - t y p ec o u n t e r p a r t s m o r e o v e r , t h e i n t r o d u c t i o no fn e si nt h eb a r r lb l o c k e dt h ei t sn u c l e a ra c c u m u l a t i o nu p o na g o n i s t t r e a t m e n t c o n s e q u e n t l y , o u rd a t a s h o w nt h a t o v e r e x p r e s s i n gf j a r r s d e c r e a s e dt h e t r a n s c r p t i o n a la c t i v i t yo f n f kbi n d u c e db yt n f d h o w e v e r , o v e r e x p r e s s i n gp a r r l b u tn o t1 3 a r t 2a l s oi n c r e a s e dt h ea c t i v i t yo fa p 一1 i n d u c e db yp m a t h e s er e s u l t s c l e a r l yd e m o n s t r a t e dt h a ta c t i v a t i o no f c e r t a i ng p c r ss u c ha sd o ri n d u c e dp a r r l ， b u tn o tb a “幺a c c u m u l a t i o nt ot h en u c l e u sa n d1 3 a r r sh a d t h ep o t e n t i a lt om o d u l a t et h e t r a n s c i p t i o n a la c t i v i t y t h e s ef i n d i n gi m p l i c a t e di n v o l v e m e n t o fd a r ri nm o r ec o m p l e x c e l l u l a rf u n c t i o n st h a nc u r r e n t l ye n v i s i o n e d k e yw o r d s ：o a 玎，d o r ，a c c u m u l a t i o n ，t r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t y 5 墨呈莶兰堡兰堂焦重塞 堂垫型堡量盟：塑! 型! ! 垫整焦垦基垫型些堕塞 前言 g 蛋白偶联受体( gp r o t e i nc o u p l e dr e c e p t o r , g p c r ) 是一类重要的细胞表面 受体。g p c r 作为一个受体超家族，能接受多种形式的细胞外信号，如激素、神 经递质、趋化因子、光子和钙离子。g p c r 与这些信号分子结合后被激活从而将 细胞外环境的信息传入细胞内，使细胞做出相应的反应( 1 ) 。 g p c r 是由细胞外氨基( n ) 末端和细胞内羧基( c ) 末端及连接这两部分的 七次跨膜区组成的单链蛋白质。配体同受体的胞外部分结合，使受体激活，进而 受体的胞内部分同异三聚体g 蛋白偶联。受体与g 蛋白偶联使其活化，随后g 蛋 白的值亚基和p y 亚基解离各自激活其下游效应分子，从而介导多种细胞内信号。 激动剂的持续存在使受体的反应性下降，这称之为受体的失敏。研究表明，g p c r 被激活后，其胞内的c 末端很快被g 蛋白偶联受体激酶( gp r o t e i nc o u p l e d r e c e p t o rk i n a s e ，g r k ) 所磷酸化( 2 ，3 ，4 ) 。磷酸化的受体随后由细胞膜内吞 入细胞浆，使细胞膜上受体数目减少。内吞的受体可被降解或重新循环到细胞膜 上。因此，受体与g 蛋白解偶联、受体内吞及下调是细胞对受体介导信号进行上 游调控的主要机制。 a r r e s t i n 是一类重要的信号调控蛋白和支架蛋白( s c a f f o l d ) ，在g p c r 的 信号转导中起重要作用( 5 ，6 ，7 ) 。迄今为止，已发现的a r r e s t i n 蛋白共有四 种，可分为两类：第一类主要分布在视觉系统，包括v i s u a la r r e s t i n ( 8 ) 和 c o n ea r r e s t i n ( 9 ) ，它们主要在视网膜调节光受体的信号传导。第二类是 d a r r e s t i n ( p a r r ) 包括p a r r l 和p a r r 2 。最初发现p a r r 是由于在纯化g r k 时观 察到随着g r k 的逐步提纯其抑制信号转导的作用反而越低，所以人们推测有一种 与v i s u a la r r e s t i n 类似的蛋白与g r k 共同协作参与这一过程( 1 0 ) 。l o s h s e 等 人首先克隆出一种编码4 1 8 氨基酸的蛋白的c d n a ( 1 1 ) ，和v i s u a la r r 具有很 高的同源性，命名为p a r r l ( 也称为a r t 2 ) 。接着p a r r 2 ( 也叫a r r 3 ) 也相继从牛 脑( 1 2 ) 、人甲状腺( 1 3 ) 和大鼠脑中( 1 4 ) 被( s c a f f o l d ) 克隆，它p a r r 2 编 码4 0 8 个氨基酸。p a r r l 和2 分布广泛，几乎分布在机体的各种组织中，尤其在 神经系统中大量表达。 b a r r e s t i n 在激动剂诱导的g p c r 失敏中起重要作用。研究发现，p a r r 能与 磷酸化的g p c r ( s c a f f o l d ) 结合，并引起受体发生内吞，导致信号转导的减弱 或终止。g r k 介导的g p c r 磷酸化能增 鄄a r r 与受体的亲和力( 1 5 ) ，p 2 a r 被磷 酸化后与d a r r 的亲和力增加了8 0 。p a r r 参与多种g p c r 失敏的调控，过量表达 b a r r 可增强很多g p c r 的失敏，比如母2 一a r ，p 1 一a r ，m 2 一m a c h r ，c r i b a r 等( 1 6 ， 1 7 ，1 8 ，1 9 ) 。此外，d a r r 抗体可以阻断嗅觉受体的脱敏。磷酸化的g p c r 与 6 望兰苎羔型堂垡型这 堂垫型亟量盟q ：! 竺塾坚! 堡整垡墨基垫型鲍婴塞 p a r r 结合后一方面促进受体与g 蛋白解偶联，抑制受体介导的信号传导，另一 方面与c l a t h r i n 以及a p 一2 结合，导致受体聚集在c l a t h r i n 包被的凹陷处，启 动受体的内吞( 2 0 ，2 1 ，2 2 ) 。p a r r 起桥梁作用，把受体和c l a t h r i n 紧密的结 合在一起，如果把一a r r e s t i n 和受体或c l a t h r i n 结合位点突变，那么会损害g p c r 的内吞。 p a r r e s t i n 不仅在终止信号转导的过程中起重要的作用，而且其做为一种支 架蛋白可以激活新的信号通路。近来发现b a r r 与e r k 和j n k 3 信号通路有关。在 此过程中，p a r r 做为支架分子起桥梁作用，把e r k 或j n k 3 及其上游的激酶和受 体连接成为一个复合体，导致e r k 和3 n k 3 的激活( 2 3 ，2 4 ) 。此外还发现b a r r 可 以介导蛋白的降解。有实验表明p 8 r r 与m d m 2 结合能引起口2 肾上腺素受体的泛素 化从而导致受体降解( 2 5 ) 。还有证据表明b a r r 也参与了g r k 和c a m p 的降解过程 ( 2 6 ) 。在对果蝇视网膜的研究中也发现，受体与a r r e s t i n 复合体的形成会导致 光受体的凋亡，从而引起视网膜的降解( 2 7 ，2 8 ) 。可见b a r r 也是一种作用广泛 的信号分子。 由于a r r e s t i n 晶体结构的阐明，使得我们对p a r r 结构与功能的关系有了一 些了解。根据已知的a r r e s t i n 晶体结构推测马a r r 由两个主要的结构区域组成， 即n 端结构区和c 端结构区( 2 9 ，3 0 ) 。利用基因突变的手段进行的研究也发现 d a r r 具有两个主要的功能区，n 端功能区负责识别已被激活的g p c r ，c 端功能 区是第二受体识别区。而且研究发现，p a r r l 和p a r r 2 具有7 8 的同源性，其差 异主要存在于c 端。在这一区域b a r r 具有与c l a t h r i n 和a p 2 结合的位点。对 p a r r l 的活性有重要调控作用的磷酸化位点也位于c 末端。尽管p a r r l 和p a r r 2 的结构具有很高的同源性，在调控g p c r 信号转导中的功能也很相似，但是随着 研究的深入d a r r l 和p a r r 2 之间的差异逐渐被发现。b a r r 作为支架蛋白在细胞膜 上同c l a t h r i n 和a p 一2 等内吞蛋白结合介导受体通过衣被小泡的途径内吞。最新 的研究发现不同g p c r 与p a r r l $ 口p a r r 2 的亲和力不同。一类受体如d 2 a r 、“阿片 受体和多巴胺l a 受体等同p a r r 2 的亲和力较高。这类受体内吞后迅速和p a r r 解 离，随后被降解或重新循环到细胞膜上。另一类受体如血管紧张素1 1 1 a 受体和 p 物质受体等同p a r r l $ 口p a r r 2 两种亚型的亲和力相同，受体和p a r r 形成稳定的 复合物，受体内吞后仍不解离( 3 1 ) ，而且此类受体的再循环过程较慢。这些结果 提示p a r r l 和p a r r 2 对g p c r 信号的调控机制可能存在差异。p a r r l 和p a r r 2 在行 使支架蛋白作用时对某些信号分子的亲和力也不尽相同，p a r r 2 同a p 一2 和 c l a t h r i n 的亲和力较强，而c s r c 只与p a r r l 结合( 3 2 ) 。在对p a r r l $ 口p a r r 2 基 因敲除的细胞系的研究中发现两者在受体的脱敏和内吞的调节上也有所不同。以 受体激活的c a m p 水平为指标研究其脱敏，结果显示在缺失p a r r l 或p a r r 2 的细胞， 7 墓里奎兰堡主兰堡堕塞 塑垫型堡曼盟q ：! 坚! 垫! 堕茎垡垦基垫型塑堑塞 激动剂持续激活1 3 2 a r ，受体仍然可以发生脱敏，而在1 3 a r r l 丰f l l 3 a r r 2 双敲除的细 胞中b 2 a r 不发生脱敏，说明任意一种 3 a r r 都能介导受体的脱敏。但_ 3 a r r l 和1 3 a r r 2 对b 2 a r 内吞的调节能力不同，在 3 a r r l 着l j l 3 a r r 2 双敲除的细胞中重新表达 3 a r r 2 能有效地促进b 2 a r 内吞，而重新表达 3 a r r l 效果不明显。但对于血管紧张素受体， 3 a r r l 年l j 3 a r r 2 在对脱敏和内吞的调控中表现出同等的效力( 3 3 ) 。此外，最近的 研究发现两者在细胞内的分布也有差异， 3 a r r l 分布于胞浆和胞核而1 3 a r r 2 只分 布在细胞浆中。p a r r 2 的c 末端含有核输出信号序列，而1 3 a r r l 不具有这一序列， 这一差别可能是造成1 3 a r r l 和 3 a r r 2 在细胞内不同分布的原因( 3 1 ，3 4 ，3 5 ) 。但 p a r r l 和 3 a r r 2 在亚细胞分布的不同是否与 3 a r r l 和 3 a r r 2 的功能有关以及其生 物学意义目前尚未有任何报道。 现有的研究表明，在激动剂刺激下，d a r r 由细胞浆向细胞膜转位是其参与 调控g p c r 信号转导的基础。研究表明，在激动剂的刺激下 3 a r r1 毒 1 1 3 a r r2 从细 胞浆向g p c r 所在的细胞膜转位，在细胞膜上与磷酸化的g p c r 结合，参加g p c r 的信号转导的负调控并作为支架蛋白与多种主要信号分子结合，介导g p c r 信号 与其它信号通路的相互作用。由此可见，激动剂刺激诱导的 3 a r r 在细胞内的重 分布对其功能的行使有重要意义。但以往对 3 a r r 的研究主要采用 3 a r r 2 为对象， 对g p c r 激活对 3 a r r 亚细胞分布和功能的影响的研究都集中在激动剂诱导的 3 a r r ( 尤其是1 3 a r r 2 ) 向细胞膜的迁移及其对细胞浆内信号传递体系的影响，而忽视 了受体激活对 3 a r r ( 尤其是1 3 a r r l ) 在其它亚细胞结构中分布的可能影响以及 3 a r r 在细胞核内的可能作用。因此本课题主要观察了激动剂刺激对 3 a r r 在细胞 核内浓度的影响，发现g p c r 的激活能诱导 3 a r r l 向细胞核转位。并对激动剂诱 导的1 3 a r r 核转位的机制和生物学意义进行了初步研究。 8 塞呈查堂堡主兰焦堡苎 燮垫型逐呈塑e ：坐! ! ! ! ! 垫壁垡垦基垫劁盟堕塞 材料和方法 一、材料： m e m 培养液、无磷酸d m e m 培养液、胎牛血清( f b s ) 购自l i f et e c h n o l o g i e s 公 司。 d - p e n 2 ，o - p e n 5 卜强啡肽( d p d p e ) 、 d - a i a 2 ，n - m e p h e 4 ，g i y 5 一0 1 强啡 肽( d a m g o ) ，l e p t o m y c i nb ( l m b ) ，t n f 一旺和p m a 购自s i g m a 公司。人胚肾( h e k ) 2 9 3 细胞购自a m e r i c a nt y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n 。抗h a 的小鼠单克隆抗体1 2 c a 5 购自r o c h em o l e c u l a rb i o c h e m i c a l s 。d u a ll u e i f e r a s er e p o r t e ra s s a yk i t 购 自p r o m e g a 公司。偶联t t e x a sr e d 的兔抗鼠i g g 购自j a c k s o ni m m u n o r e s e a r e h 公 司。b a r r e s t i n 鼠多克隆抗体由中科院生化细胞所裴钢组提供。 p c rd n a 扩增仪为m jr e s e a r c h 公司产品。高速和超速冷冻离心机、液闪计数 仪和d u7 5 0 0 紫外分光光度仪均为b e c k m a n 公司产品。激光共聚焦扫描显微镜( t c s n t 型) 为l e i c a 公司制造。m i n ip r o t e i ni i 蛋白电泳仪、蛋白转移槽以及真空 干胶机购自b i o - r a d 公司。硝酸纤维素膜购白s c h l e i c h e r 8 c h u e l l 公司，g f c 玻璃纤维素膜为w h a t m a n 公司产品、( b2 5 m m 抽滤器为m i l l i p o r e 公司产品， l u m i n o m e t e r 为t u r n e r 公司产品。 二、方法： 质粒构建 载有编码人p a r r l 或p a r r 2e d n a 的p c d n a 3 、p a 廿1 一g f p 、p a r r 2 一g f p 、 b a r r l q 3 9 4 l g f p 、p a r r 2 l 2 9 3 q - g f p 、p a r r l n g f p 和p a r r l c w p 及姒一d a r r 2 n 和 h a p a r r 2 c 、带有h a 标记的小鼠野生型d o r ( w d 、c 末端3 1 个氨基酸残基缺失 的d o r ( a 3 1 ) 、t 3 5 8 t 3 6 1 s 3 6 3 g ( m 3 ) 突变体的质粒构建如前描述( 3 3 ，3 6 ，3 7 ， 3 8 ) 。d a r r l 和p a r r 2 嵌合体以野生型d a r r 为模板采用p c r 法构建( 3 1 ) 。p a r r l - 2 c t 是由编码b a r r n 一3 3 3 位氨基酸残基( n 端片段) 的c o n e 和编码p a r r 2 的羧基端最后 7 3 个氨基酸残基( 3 3 6 - - 4 0 8 ) 的e d n a 片段融合而成。而p a r r 2 一l c t 则是由编码 p a r r 2 的卜3 2 , 5 位氨基酸残基的n 端c o n e 片段和编码p a r r l 的c 端8 5 个氨基酸残基( 3 3 4 - - 4 1 8 ) 的c d n a 片段融合而成。分别使用在末端引入的h i n dl l l $ 口x h oi 及b a m h i 和e c o ri 酶切位点分别将d a r r 卜2 c t 和p a r r 2 一l c t 装入含有e g f p 的p c d n a 3 。 使用的p c r g l 物序列和模板如下： p a r r l 一2 c t g f p ： n 端片段：n p a r r l ：勾模板 5 引物：5 一g g a a g c t t a t g g g c g c a a a g g g 一3 9 皇呈壁塑圭兰焦丝塞 堂垫型重呈塑：竺! 型! ! 垫壁垡垦基垫型堕婴壅 3 弓1 物：5 一一c c a c a g a g a c a t c g c c g c c c c g a g a c t c 一一3 c 端片段：以 3 a r r 2 为模板 5 弓l 物：5 一一c g g g g c g g c g a t g t c t c t g t g g a g c t g c 一一3 3 弓l 彰日：5 一一g c c t c g a g g c a g a g t t g a t t g a t c a t c 一一3 1 3 a r r 2 i c t 。g f p n 端片段：以 3 a r r 2 为模板 5 弓i 彩口：5 一一g c g g a t c c a t g g g g g a g a a a c c c g g 一一3 3 弓i 物：5 一一g a t c t c c c a a c a g c c c g c c t c g a g a c a c 一一3 c 端片段：以p a r r l 为模板 5 弓i 物：5 一一c t c g a g g c g g g e l g t t g g g a g a t c t t 一一3 3 弓i 物：5 一- g c g a a t t c t c t g t t g t t g a g c t g - - 3 质粒的大量制各： 质粒被转化至e c o l id h 5 啦宿主菌中，在l b 培养基中扩增培养，应用q i a g e n 公司试剂盒进行质粒纯化制备。纯化的质粒溶于双蒸水中，经紫外分光光度计测 定a 2 6 0 、a 2 8 0 吸收度检测定量并通过l 琼脂糖凝胶电泳鉴定后，在- 2 0 0 c 保 存。 细胞培养及转染： 用含1 0 f b s 的m e m 培养液培养h e k 2 9 3 细胞。转染前2 0 小时，以每细 胞培养皿( 直径6 0 或1 0 0m m ) 约1 - 3 x 1 0 6 个细胞的密度将细胞传代培养。在免 疫荧光实验中，以六孑l 培养板或直径3 5r u m 的培养皿培养细胞。在报告基因实 验中，用1 2 孔板来培养细胞。采用磷酸钙共沉淀方法瞬时转染质粒d n a ，每皿 细胞转染i - 5 岭质粒。应用放射配体结合分析检测阿片受体的表达。阿片受体 表达水平是2 - 3p m o l m g 膜蛋白。 激光共聚焦荧光显微镜观察 细胞转染后4 4 , 1 , 时，换无血清的m e m 培养液于3 7 。c 预孵育2 d , 时。随后加入 激动剂，在3 7 。c 预孵育5 分钟，p b s 洗涤。使用4 多聚甲醛室温固定1 5 分钟，然 后在1 b s a p b s 中室温封闭1 ，j 、时。封闭结束后，细胞与1 2 c a 5 ( 1p g m 1 ) 在 1 b s a p b s 室温孵育l 。5 小时，用p b s 洗涤，加入t e x a s r e d 标记的二抗室温孵 育l 小时，p b s 洗涤，n f f 刮j n 5 0 甘油将盖玻片置于载玻片上，封片后4 。c 避光保 存。g f p i 蔓激发波长为4 8 81 1 1 3 1 ，测定波长5 1 5 5 4 0r i m ，t e x a s r e d 的激发波长为5 4 3 1 0 重坠兰堡主兰篁堡塞 堂垫型重量塑q ：! 坚墅! ! 垫塑焦丝基垫墅堕婴塞 n m ，测定波长5 9 0n m 。t c sn t 激光共聚焦显微镜记录扫描图像( l e i c a m i c r o s y s t e m s ，b e n s h e i m ，g e r m a n y ) 。在进行活细胞实时观察时，细胞转染后4 4 d 时，换无血清的m e m 培养液于3 7 。c 预孵育2 小时。在控温罩中使用激光共聚焦显 微镜实时观察。首先扫描未刺激前的图象，加入激动剂后观测同一层面细胞的变 化并实时扫描记录。然后，在扫描的图象中选取同一细胞的核、胞浆及胞膜的某 一固定区域进行荧光强度分析。荧光强度分析软件由l e i c a 公司提供。 细胞核的制备 激动剂刺激后，p b s 洗涤细胞，随后用1 0m m 的e d t a 收集细胞。在4 0 c 以4 0 0 x g 离心5 分钟，细胞沉淀重悬在高渗的m d h 缓冲液( 2 5m mh e p e s ，p h 7 9 ，3m mm g c l 2 ，lm md i t h i o t h r e i t o l ，0 5m mp h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e ) 中。冰 浴1 0 分钟后，加入0 5 ( v v ) n o n i d e tp 4 0 ，在4 0 c 用匀浆器匀浆重悬的细胞液， 随后裂解液在4 。c 以1 5 ，0 0 0 g 离心。用m d h 缓冲液洗涤含有细胞核的粗提 沉淀，然后将其离心并重悬在低离子强度的h d e k 缓冲液( 2 5m mh e p e s 匝h 7 9 】，2m me d t a ，1m md i t h i o t h r e i t o l ，o 1mk c d 中室温孵育3 0 分钟凛s 后在4 。c 以1 5 、0 0 0 g 离心1 小时得到细胞核提取物。这一核提取物用于c o o m a s s i e 染色 或者w e s t e r n 免疫印迹检测。 w e s t e r n 免疫印迹法 核提取物或者细胞裂解液，超声5 分钟，9 5 0 c 水浴中变性l o 分钟，取约5 0 肛g 蛋白样品于1 0 s d s 聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，电泳完毕取出凝胶，将蛋白质 电泳转移至硝酸纤维素膜上，将膜置于用t b s t 缓冲液( 1 5 0m mn a c l ，5 0m m t r i s h c i 口h7 4 ，0 2 t w e e n 2 0 ) 配制的1 0 脱脂牛奶中室温封闭1 小时，之后 与特异的一抗和二抗孵育( 抗体用t b s t 缓冲液稀释，一抗与二抗反应之后用 t b s t 缓冲液洗膜三次，每次1 0 分钟) ，并用e c l 试剂盒检测。 报告基因分析 采用p r o m e g a 公司试剂盒并按所提供的实验方法进行。以1 2 孔培养板培养 h e k 2 9 3 细胞，转染n f kb 1 u e ( 0 1 g ：l ) 或a p 一1 一l u c ( o 1 孔) 和r g - t k l u c ( 0 2 “g 孔，作为对照) ，共转或不共转1 3 a r t l ，1 3 a r t 2 ，p a r r ln ，p a r r c ，1 3 a r r 2n 或d a h 2 c ( 0 1 ，0 4 ，o 8u g 孑l ) ，并用p c d n a 3 p g a l 补齐质粒的量。转染4 4 小时后换无血 清的m e m 培养液，继续在3 7 。c 孵育2 小时。然后加入无血清的m e m 配制的激 动剂( t n f 乜：1 0n g m l ；p m a ：1 肛m ) 继续3 7 。c 孵育6 小时。l x p b s 洗涤细胞 后，用p r o m e g a 公司提供的双萤光素酶报告基因试剂盒中的p a s s i v e l y s i sb u f f e r1 0 0 l l j 室温裂解2 0 分钟。取5 肛l 细胞裂解液与同体积的底物( 试剂盒提供) 反应， 使用l u m i n o m e t e r 检测。剩余样品用w e s t e r n 免疫印迹法检测蛋白表达量。 壅里奎兰堡主堂垡堡塞 整垫型堡量堕e ：竺! ! 壁! ! ! 鳖鲎垡墨基垫型塑