毕业设计（论文）-木质素降解菌株发酵条件的研究.doc

生物与食品工程学院毕业论文生物与食品工程学院毕业论文木质素降解菌株发酵条件的研究The research about ligninolytic strain fermentation conditions学生学号学生姓名专业班级生工1101指导教师联合指导教师 完成日期2015年6月15日吉 林 化 工 学 院Jilin Institute of Chemical Technology摘 要木质纤维素，是自然界一种最重要的可再生资源，但目前认为未被充分利用，其主要原因在于木质素难于降解和转化。木质素又称木素，生物降解木质素的方法研究已成为人们广泛关注的研究课题。本文以吉林市龙潭山上的腐木木屑为原料，经过鉴别、筛选、富集、紫外诱变后，得到降解性能较好的Y菌。以纯碱木质素为唯一碳源摇瓶发酵过程中，通过调节发酵液不同发酵时间、转速、pH以及添加相关微量元素来优化Y菌的发酵条件，通过280nm波长的紫外测量发酵稀释液吸光度，来确定最佳优化条件。实验结果：Y菌在摇床发酵中，发酵温度38，转速150 rpm，pH 4.5，添加微量元素的Mn2+时，10天木质素降解率能到达30%。关键词：木质素；降解菌；发酵条件；优化- I -AbstractWood cellulose, is natures one of the most important renewable resource, but now that is fully utilized, mainly due to lignin degradation and transformation difficult. Lignin, also known as ligninsulfonate, the use of microbial fermentation method fungus lignin consumption has become a widespread concern research.In this paper,Jilin City Longtan hill rotten wood chips as raw material, through the identification, selection, enrichment, after UV mutagenesis, get a better performance degradation Y bacteria.Soda ash lignin as the sole carbon source in the fermentation process, the fermentation broth by adjusting different fermentation time, speed, pH and add related trace elements to optimize the fermentation conditions Y bacteria by 280nm wavelength UV absorbance measurement fermentation dilution to determine the best optimization criteria.The results:in 10 days of fermentation stationary shaker, Y bacteria in fermentation temperature 38 , speed 150 rpm/min, pH 4.5, adding trace elements of Mn2+ fermentation conditions are optimal, the best lignin degradation rate can reach 30%.Key words： lignin ; Degrading bacteria; Fermentation conditions; Optimization- III -目 录摘 要IAbstractII前 言1第1章 文献综述21.1 木质素结构及其性质21.2 国内外降解木质素研究现状41.2.1 降解木质素的微生物41.2.2 降解木质素的主要酶类51.2.3 影响木质素降解的因子61.3 研究热点71.4 展望8第2章 实验材料及方法102.1菌种及培养基102.2试剂102.3仪器112.4原料112.5.实验方法112.5.1 菌种富集培养方法112.5.2 木质素为唯一碳源的发酵方法122.5.3 发酵液pH对发酵的影响122.5.4 发酵温度对发酵的影响122.5.5 发酵过程转速对发酵的影响122.5.6 微量元素对发酵的影响122.5.7 最优条件下发酵实验13第3章 实验分析方法与数据143.1 碱性木质素性质分析143.1.1 碱性木质素碱性分析143.1.2 碱性木质素含还原糖量分析143.2 发酵液木质素含量分析143.2.1 测量前准备工作143.2.2 发酵液的提取143.2.3 待测液的制取143.2.4 测量143.3 不同菌种发酵情况测定153.4 微量元素对发酵情况影响的测定153.5 不同pH下发酵情况的测定153.6 不同发酵温度下发酵情况的测定163.7 不同发酵转速下发酵情况的测定163.8 最佳条件发酵163.9 木质素含量的测定17第4章 实验结果与分析184.1 不同菌种的发酵结果的对比184.2 不同微量元素对发酵结果影响194.3 发酵液pH对发酵影响204.4 发酵过程温度对发酵影响224.5 发酵过程转速对发酵影响244.6 各项最优条件的发酵25结 论26参考文献27致 谢28前 言吉林省的秸秆资源十分丰富，实际可利用的有3960万吨，直接应用农村生活燃料的占40%，废气燃烧的占25%以上。而直接用于开发利用的却不到43.5%，相当多的农作物秸秆被弃置或者进行焚烧，高消耗、高污染、低产出的状况没有得到根本改变。近年来吉林省做了多种努力。发展秸秆成型燃料加工、供热，秸秆加工成饲料、肥料、原料、本色纸、精制秸秆糖等，但是，由于产业发展不均衡，又受到地域、运输、成本等条件的制约，不少秸秆综合利用企业依然面临收购难的“瓶颈”问题，全省仍有大约30%50%，即近200300亿斤的秸秆尚未得到有效的利用。如何实现可再生植物纤维资源高效利用与转化，是我国能源、环境以及实现循环经济的迫切要求。秸秆中的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，三者间相互紧密结合形成天然稳定的晶体结构，在常态下很难被分解。天然木质纤维若直接用纤维素酶进行水解，转化程度很低，一般只有 1020 %。因此对天然木质纤维（秸秆）进行预处理脱去木质素，这是木质纤维材料综合利用的关键，但是该工艺首先要解决的难点是打破纤维素与木质素之间的结合，降低原料中木质素含量，将纤维素暴露出来。目前较为常见的木质素降解方法为物理，化学，生物降解这三个方面。但是前面两种办法能耗较大，仍存在一定的污染问题。而微生物降解处理木质素是一种相对更为安全、无公害的方法，也是目前国内外的研究热点1。在微生物群落中通过真菌、细菌的对木质素的共同作用，可以实现木质素的微生物降解。现阶段最为广泛的研究是真菌菌株对木质素降解的部分2。其中大部分的工作都集中在能够对木质素进行降解的真菌筛选过程。本文从龙潭山腐木分离出两种菌（B菌和Y菌），主要用Y菌进行以木质素为唯一碳源的发酵培养，进行培养条件优化的初步研究，为后续实验打下基础，为提高纤维素发酵效率提供另一条道路。第1章 文献综述1.1 木质素结构及其性质木质素共有3种基本结构：愈创木基丙烷、紫丁香基丙烷和对羟苯基丙烷，这些结构单元之间通过醚键和CC键连接在一起形成具有三维体型结构的天然酚类无规聚合物。虽然木质素只有3种基本结构如图1-1，但是不同科的植物木质素基本结构单元的数量比例很不相同3。木质素这种复杂的无定形结构特点，限制了其工业化利用4。迄今为止，人们仍没能把整个木质素分子以其完整的状态分离出来。图1-1 木质素3种结构依据木质素分子结构特点分析可知，木质素分子中有着数目众多的苯丙烷类结构，加之苯环上分布着羟基取代基，故木质素属一种结构复杂的酚类化合物，有一定生物学反应活性。由于木质素分子结构当中的羟基、羰基、苯环侧链等结构均属活化基团，是木质素化学反应性能的重要体现。主要发生亲核反应而使醚键断裂、磺化反应而造成脱甲基作用、吸收紫外而产生化学色变、酚经基使苯环邻位和对位发生亲电反应。木质素广泛存在于植物体内，呈无定型状态，它的组成成分和生物学性质较为复杂。木质素一般与植物细胞中的纤维素等物质相互交联，具有较强的机械耐受性，起到支撑植物形态的作用5。此外，木质素具有一定疏水特性，可保护植物细胞不易流失水分，起到保水作用。所以，木质素主要构成植物的输导组织、机械组织和保护组织中，便于水分、矿物质及营养物质的输送。最后，有木质素构成的植物组织具有一定的防护功能，可使植物避免遭受物理破坏、化学伤害或生物侵害。木质素分子中有各种各样的酚类前体物质，再加之前体聚合时可形成游离态自由基，这些物质对病原菌的生物膜、酶和毒素具有较强破坏作用，所以木质素分子可抵抗病菌侵入，免受破坏6。植物不同细胞的组成也不相同。裸子植物中，松柏醇自身进行脱氧反应不断交联形成聚合度较高的木质素。被子植物中，松柏醇与芥子醇进行脱氧反应随机交联形成聚合度高的木质素。一般松柏醇、香豆素与芥子醇为草本植物里木质素的基本组成形式。因此，不同植物中所含木质素结构的不同增加了降解木质素的难度。木质素结构的未知导致了无法确定各单体间的连接状态，使得木质素的结构更加复杂。至今仍没有明确的方法能够检测出木质素的天然结构，仅仅只能通过实验研究模拟出一些木质素的基础结构模型7。一般认为木质素的单体主要由碳碳键与醚键连接起来的。形成碳碳键与醚键的部位有多种可能8。如图1-2所示即为木质素各单体之间的不同连接方式：(1)为e-0-4醚键联接方式，(2)为a -0-4酸键联接方式，约占50%左右；(3)为3 -1碳碳键联接方式、(4)为P -5碳碳键联接方式、(5)为5-5碳碳键联接方式等。图1-2 木质素一般结构1.2 国内外降解木质素研究现状从1934年Boruf和Buswell首次发现能降解木质素的微生物开始，人们就在木质素生物降解领域进行了大量的研究9。多年后人们发现了木质素降解酶，至此对木质素的降解有了更深的研究。1.2.1 降解木质素的微生物自然界中，动物无法将木质素进行降解降解，主要是由能够对木质素进行降解作用的微生物群落通过生活代谢过程来进行降解，因此木质素的降解主要是微生物来完成的10。降解木质素的微生物主要是真菌，细菌和放线菌，其中真菌占主导作用，而细菌和放线菌主要起到辅助作用。1.2.1.1降解木质素的真菌真菌是降解木质素最主要的微生物，主要是白腐真菌、褐腐真菌和软腐菌，目前，研究最多的木质素降解真菌主要有黄孢厚毛平革菌、彩纸草盖菌、变色栓菌等担子菌亚门，无隔担子菌亚纲，无褶菌目的多孔菌科真菌11。邓勋等人对多种木材腐朽菌进行试验比较发现毛革盖菌、东方栓菌、彩绒革盖菌S2和白干酪菌4株菌株在15 d的培养中，各菌株对稻草木质素的降解率分别为36.71%、33.59%、22.46%和21.90%。黄慧等人研究发现黄孢原毛平革菌对不同粒度玉米稻秆中的木质素降解不同，35天培养后最大降解率能够达到45.2%。蒋荣清等人将具有较好木质素降解能力的真菌应用与稻秆的堆肥发酵中，结果发现该菌株对稻杆中的木质素具有良好的降解效果，在第14 d时木质素的降解率就高达36.25%，且该菌株能够很好的适应堆肥过程中温度的大幅度变化。类似的对真菌降解木质素的研究已经很多，其中也有一些混合发酵类得研究。1.2.1.2降解木质素的细菌在20世纪50、60年代，相关研究发现证实木材的腐朽降解与细菌相关，后期的试验研究发现细菌能够对木质素片段，如杨木二氧己烧木质素、低分子量的磺化木质素及Kraft木质素片断等进行代谢降解研究表明某些细菌能在一定程度改变木质素结构，使其成为水溶性的聚合产物，部分细菌还能够矿化木质素产生CO212。王纳贤等人从牛粪中分离出一株淀粉芽孢杆菌具有较好的木质素降解能力，发酵培养后该菌对木质素的降解率能够达到35.02%。王毅等也发现了一株能够降解木质素的枯草芽孢杆菌，该菌在发酵培养30天后对木质素的降解率可以达到9.47%。另外，研究发现细菌在木质素降解的过程中主要起着间接作用，即细菌通过自身代谢作用使木质素暴露出来易于受到真菌的代谢降解作用，同时细菌还能够去除对腐朽真菌有毒性的物质。1.2.1.3降解木质素的放线菌目前，研究已知的能够降解木质素的放线菌包含链霉菌、节杆菌、小单孢菌和诺卡氏菌等13。放线菌能够穿透木质纤维素等不溶基质，在中性、微碱性土壤或堆肥中，放线菌参与有机质的初始降解和腐殖化，因此放线菌对木质素的降解作用主要在于增加它的水溶性。顾文杰等人蹄选出两株能够降解木质素的放线菌，研究它们对稻杆中木质素的降解发现，两株菌对稻杆中木质素的降解率能够达到20.68% 和 22.59%。1.2.2 降解木质素的主要酶类1.2.2.1木质素过氧化物酶(Lip) Lip是一种同工酶，最早年由Kirk领导的研究小组于1983在黄孢原毛平革菌的胞外培养液中发现。该酶含有Fe3+、卟啉环和血红素，反应以H2O2为电子受体对富含电子的酚型或非酚型芳香化合物进行氧化作用14。当电子传递体攻击木质素时，Lip能从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子，并将其氧化成自由基，然后通过链式反应产生多种不同的自由基，使木质素分子中主要键发生断裂。1.2.2.2锰过氧化物酶(Mnp) Mnp是血红素过氧化物酶，它普遍存在于白腐真菌的各个菌种中。与Lip 样Mnp需要H2O2启动反应，但是它是将木质素中普遍存在的Mn2+氧化为Mn3+，然后以Mn3+为介质对各种酚型化合物达到氧化木质素的作用15。1.2.2.3漆酶(Lac) Lac是一种含铜的多酚氧化酶，在植物、昆虫和真菌中都已经发现，其结构和功能与植物体中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋都很相似，同时它们都是铜蓝氧化酶家族中的同一小族16。目前还没有Lac三维空间结构的完整报道，但是Lac中的铜离子在木质素的催化氧化反应起的决定作用已经得到证实。1.2.3影响木质素降解的因子1.2.3.1温度、时间和pH 木质素的降解是微生物生命活动产生木质素降解酶的反应过程，不管是微生物的生长还是木质素降解酶反应都受到温度的影响，这使木质素的降解对温度的依赖性十分高，因此温度是影响木质素降解最重要的影响因素之一。而微生物的生长、代谢产酶都是自然界具体存在的过程，因此木质素的降解也受到时间的制约。pH是酶动力学中影响酶学性质的重要因素，木质素的降解最终都是依靠木质素降解酶类来完成的，因此pH也能够明显的影响木质素的降解。崔艳红等人对白腐真菌的研究表明不同的温度、时间和pH对木质素降解酶的酶活性具有很大的影响。通过设置不同的反应条件对锰过氧化物酶的比较发现，温度为35-40，锰过氧化物酶反应最佳，最佳时间为72-120 h之间，最适pH范围是4.4-4.8。1.2.3.2碳源、氮源和金属离子 木质素的降解是微生物生命活动的过程，因此木质素的降解也会受到生物生长过程中摄入因子的影响，碳源是生物体生命活动所必须的基本元素，所以碳源也能够影响木质素的降解。氮源是生物体生长所需要的最重要的营养元素之一，很多时候氮源都是控制生物体个体生长快慢的重要因素，因此氮源能够对微生物的生长形成明显的影响，从而也对木质素的降解有明显的影响作用。金属离子是某些酶反应活性的重要组成部分，同时部分有害金属离子能够严重影响微生物的生长代谢，因此金属离子对木质素的降解也有明显影响作用。王佳玲等人白腐真菌的产酶条件研究发现，碳源和氮源能显著影响白腐真菌产木质素降解酶能力，高氮条件下是其研究真菌产生木质素降解酶的重要条件，而不同碳源的种类对漆酶的影响较大。同时发现Mn2+对试验菌株产木质素降解酶能力有显著影响，在不添加Mn2+情况下，菌株几乎不产生Mnp；而随着Mn2+浓度的加入和提高Mnp活力也显著提高，但是Lac的活性会发生相应的降低。余惠生等研究Cu2+浓度的变化对某白腐菌产漆酶的影响，结果表明该菌株产漆酶能力明显的受Cu2+的调控，没有铜离子或者铜离子浓度过低时，漆酶的活性都很低，随着Cu2+浓度的增加漆酶的产生随之增加，但过高浓度的Cu2+又会抑制漆酶的活性。1.2.3.3诱导物 诱导物是生物体酶类产生的重要影响因素，它的高低对白腐真菌木质素降解酶的合成有明显的影响。目前，对木质素的有效诱导物的看法还没有得到统一，部分学者认为木质素降解酶合成的有效诱导物是一些类木质素及木质素亚结构类似物；而有的专家则认为白腐真菌受诱导物的影响可能是其消除基质中一些对其生长有害的芳香类化合物的方式，从而达到提高木质素降解酶类含量的作用。微生物次生代谢过程机理十分复杂，目前弄清楚的也很有限，并不完全是在某一限制底物消耗尽时产酶，而是与菌体生物活性和体系内的代谢产物的量有关17。徐春燕等人研究四种诱导物对白腐真菌降解竹子的影响发现，其使用的四种诱导物对白腐真菌降解木质素的影响都很低，仅能将木质素降解率提高3.057%。而段传人等研究结果表明，合适的诱导剂能够将白腐真菌木质素能力提高20%。因此诱导物对木质素降解的影响因微生物种类的繁多而没有得到明确统一的说法。1.3 研究热点 目前研究木质素降解多集中关注于两方面,一方面是不断地发掘能偶降解木质素的微生物以及他们的产酶能力。另一方面就是通过调节微生物的生长环境使其能够高效的降解木质素。现已有较多的微生物能够降解木质素，白腐菌的代谢类型和其对木质素的胞外降解均较为特殊，因此研究较为广泛18。但是对白腐菌等微生物的降解木质素研究仅仅停留在初级阶段，到底菌株是怎样实现木质素高聚物解聚为木质素的单体形式以及单体时如何进一步反应的，都处于未知状态。同时微生物对各种类型的木质素降解效果也不尽相同，这些方面的研究较少。对于微生物生长环境的调控，可以从微生物生长的温度、pH值、溶氧量以及培养基的含碳量含氮量的调节进行19，使得微生物能在最适的环境下实现木质素的降解。一般情况下，哪怕是同一种微生物，生长环境也相同但是处理不同的木质素效果却不一定完全相同。需要从木质素的组成层次入手，不能忽视木质素本身的区别，而仅仅依靠环境因素的调控改变降解效果。针对不同的木质素在不同的微生物作用下的降解效果，以获得降解各种木质素的最佳降解菌株。在对菌株的生长环境因素进行调控研究，最终实现高效降解木质素的效果。同时，菌株降解木质素后所生成的代谢物的结构也不够清楚，代谢才产物的一些物理性质也很有可能会对木质素的降解产生影响20。因此，若能够对降解木质素的过程中所发生的反应和产物进行探究，会对调控木质素的降解效果有一定帮助。1.4 展望1.4.1应用生产单细胞蛋白 单细胞蛋白(Single cell protein，简称SCP)又称微生物蛋白或菌体蛋白，是利用工业废水、废气、天然气、石油烧烃类、农副加工产品以及有机垃圾等作为培养基，培养酵母、非病源细菌、真菌等单细胞生物体，然后经过净化干燥处理后制成，是食品工业和饲料工业的重要蛋白质来源。1.4.2应用于污染治理与环境保护 造纸制浆工业每年都会产生大量的工业废水，这些工业废水中含有大量的木质素，而目前这些废水都是直接排放，这不仅对环境造成严重的污染，同时也是对资源的一种巨大浪费。将微生物对木质素的降解应用与造纸制奖工业不仅能够减少环境污染，还具有一定的减少能耗和创造经济效益的作用。Lan D等发现使用一些真菌对纸装进行处理可增加纸张的抗张强度，同时可减少纸装提炼的电能耗费。1.4.3应用于化工产品 木质素、木质素衍生物和木质素改性产品都具有良好的分散性和表面活性，因此被广泛的应用与工业产品中。木质素类产品可用作染料溶液的稳定剂、水泥助磨剂、除虫杀菌剂的分散剂、粘土或固体燃料水悬浮液稳定剂、钻井泥装调节剂、循环冷凝水的缓烛阻拒剂等，可用作石油、沥青、錯等乳化剂。木质素进行微生物降解后可转化为工业产品、微生物蛋白饲料和有机肥料等，使其变废为宝。木质素的资源化利用应用于食品与发酵工业、饲料工业都显现出广阔的前景。1.4.4应用于农业废弃物处理 我国是一个世界级农业大国，每年的农业生产都会带来大量的农业废弃物。这些农业废弃物都是一些难处理的高分子化合物，其中都还有大量的纤维素和木质素。而目前我国大部分农业废弃物都是进行直接燃烧处理，这不仅对环境造成巨大危害加剧温室效应，同时还是资源的巨大浪费。而少部分农业废弃物用于饲养牲口和用于再利用生产，但是其中的木质素都没有得到有效利用。使用微生物降解农业废弃物中的木质素不仅能够减少环境污染也能促进农业废弃物的利用效率。微生物降解木质素应用于农业废弃物的研究在我国已经大量开展，其中包括对稻草、稻壳、玉米稻秆和麦秆等的研究，很多研究表明微生物能够有效的降解木质素，其中白腐真菌是最有效的微生物类群，但是细菌和放线菌都有降解木质素的能力，一些研究结果显示微生物在较短时间内对木质素的降解率可高达40%。这都表明微生物能够有效的利用于农业废弃物的处理中。第2章 实验材料及方法2.1 菌种及培养基菌种：1）B菌，龙潭山腐木中培养得到。2）Y菌，龙潭山腐木中培养得到。PDA液体（固体）培养基：马铃薯200g 葡萄糖 20g 自来水1000ml 自然pH (琼脂15-20g) 固体平板筛选培养基：碱木质素3g，(NH4)2SO4 2g，K2HPO4 1g，MgSO47H2O 0.2g，CaCl22H2O 0.1g，FeSO47H2O 0.05g，KH2PO4 1g，琼脂15g，蒸馏水 1000ml，自然pH，灭菌，备用；发酵培养基：碱木质素3g，(NH4)2SO4 2g，K2HPO4 1g，MgSO47H2O 0.2g，CaCl22H2O 0.1g，FeSO47H2O 0.05g，KH2PO4 1g，其中个别实验还另加MnSO4H2O 0.005g，CuSO45H2O 0.005g，蒸馏水 1000ml，自然pH，灭菌，备用。2.2 试剂本实验所用数据如表2-1。表2-1 实验药品一览表药品纯度来源琼脂天津市大茂化学试剂厂 氯化钙 分析纯沈阳医药股份有限公司浓硫酸分析纯北京化工厂氢氧化钠 分析纯天津市北联开发有限公司硫酸 分析纯新光化工试剂厂硫酸铵分析纯天津市北方天医化学试剂厂磷酸氢二钾分析纯天津市北方化玻购销中心磷酸二氢钾分析纯天津市北方天医化学试剂厂硫酸镁分析纯天津基准化学试剂有限公司硫酸铜分析纯天津市永大化学试剂有限公司硫酸亚铁分析纯北京化学试剂三厂硫酸锰分析纯天津市北方天医化学试剂厂 2.3 仪器 本实验所用仪器如表2-2。表2-2 实验仪器一览表仪器型号来源生物传感分析仪 SBA-40D 山东省科学院生物研究所紫外可见分光光度计UV-5500PC上海元析设备有限公司分析天平JA2603B上海精科天美有限公司电子天平JH2101上海精科天美有限公司压力蒸汽灭菌器YX-280D合肥市华泰设备有限公司精密酸度计PHS-3CF上海创发电子科技有限公司台式离心机TG16G湖南凯达科学仪器有限公司恒温培养振荡器ZWY-200D上海智城分析仪器有限公司干培培养箱GP-45B天津泰斯特仪器有限公司微波炉G70F20CN1L-DG(S0)格兰仕微波炉电器有限公司双人双面净化工作台SW-CJ-2F 苏州净化设备有限公司 此外还有以下实验用品：50mL，100mL，250mL，500mL锥形瓶、3mL，5mL离心管、50mL、250mL、1000mL烧杯、50mL，500mL，1000mL容量瓶、移液枪：1000l和100l规格，0.22m微孔滤膜和过滤器，10mL一次性注射器，胶头滴管，玻璃棒，纱布。2.4 原料碱性木质素 新沂市飞皇化工有限公司pH=10.24含还原糖量=3.6%（用SBA生物传感分析仪测量）2.5. 实验方法2.5.1 菌种富集培养方法配制PDA液体培养基，灭菌锅中灭菌20 min。静置24小时后，观察培养液是否澄清，如果澄清接着下一步，否则需重做。分别接种（B菌，Y菌），在无菌条件下操作（无菌台需要提前紫外灭菌20 min），用接种针挑取单菌落，放入锥形瓶中。培养，将接完种的培养基，在38，转速150 rpm下培养48 h，取培养液保藏。2.5.2 木质素为唯一碳源的发酵方法接种：分别取B菌，Y菌种种子悬浮液，加入到木质素唯一碳源的发酵培养基中。每次实验采用250 ml摇瓶。摇床条件为150 r/min、38 ，发酵10 d。分别在2 d，4 d，6 d，8 d，10 d取样，用于测量吸光度。2.5.3 发酵液pH对发酵的影响第一次实验：配制发酵培养液，取6份25ml液体培养基到6个50ml锥形瓶中，分别用20% NaOH，20%H2SO4溶液定标到pH=3、4、5、6、8（用精密酸度计测量）做好标记，另一瓶为空白样，标记；灭菌（121，0.1mpa）20 min；接种（Y菌），摇床发酵（150 r/min、38 ）。分5次取样，每次间隔2 d，发酵期10 d。第二次实验：配制发酵培养液，取5份25ml液体培养基到5个50ml锥形瓶中，用20%H2SO4溶液定标到pH=3、3.5、4、4.5、5（用精密酸度计测量）做好标记，另一瓶为空白样，标记；灭菌（121，0.1mpa）20 min；接种（Y菌），摇床发酵（150 r/min、38 ）。分5次取样，每次间隔2d，发酵期10 d。2.5.4发酵温度对发酵的影响配制发酵培养基500ml（pH=4.5），分装到4个250ml锥形瓶中，灭菌（121，0.1mpa）20 min；无菌条件接种（Y菌），分别放置到温度为20、25、30、38的摇床（150 r/min）中培养。分5次取样，每次间隔2 d，发酵期10 d。2.5.5 发酵过程转速对发酵的影响配制发酵培养基500ml（pH=4.5），分装到3个250ml锥形瓶中，灭菌（121，0.1mpa）20min；无菌条件接种（Y菌），分别放置到转速为120、140、150rpm下摇床培养，设定培养温度为38。分5次取样，每次间隔2 d，发酵期10 d。2.5.6 微量元素对发酵的影响配制发酵培养基1000ml（pH=4.5），取750ml分装到6个250ml锥形瓶中，两瓶分别加入MnSO4 H2O 0.005g，两瓶分别加入CuSO4 5H2O 0.005g，一瓶加入MnSO4H2O 0.005g，CuSO45H2O 0.005g，灭菌（121，0.1mpa）20min；接种，加入Mn2+的锥形瓶分别接B菌和 Y菌，同时加入Cu2+的锥形瓶分别接接B菌和 Y菌，同时加入的接Y菌，剩下一瓶为空白；摇床发酵（150 r/min、38 ）。分5次取样，每次间隔2 d，发酵期10 d。2.5.7 最优条件下发酵实验配制500ml发酵培养基（含微量元素MnSO4 H2O 0.0025g，pH=4.5），分装到5个锥形瓶中。灭菌（121，0.1mpa）20min；接种，4瓶，分别接B菌Y菌各两瓶，一瓶为空白样，摇床发酵（150 r/min、38 ）；摇床发酵（150 r/min、38 ）。分5次取样，每次间隔2 d，发酵期10 d。第3章 实验分析方法与数据3.1 碱性木质素性质分析3.1.1 碱性木质素pH值分析称取5g碱性木质素，加入10ml水，用玻璃棒搅拌均匀。开启精密酸度计，校准（温度校准，斜率校准），测量。3.1.2碱性木质素含还原糖量分析 称取1g碱性木质素，加入到50ml的容量瓶中，充分混合；用SBA生物传感分析仪，测量样品还原糖。3.2 发酵液木质素含量分析3.2.1测量前准备工作 对紫外分光光度计进行预热20 min，之后调节仪器的紫外波长，到280nm处（此时，为防止光栅疲劳，应该打开仪器盖），配制50ml、0.1mol/L的NaOH溶液作为测量的参比溶液。 对实验用的移液枪枪头进行湿热灭菌（121，0.1mpa）20 min，或者将枪头放入微波炉，微波灭菌2 min。3.2.2 发酵液的提取 取出待测的发酵液，用100l的移液枪分两次吸取100l的待测发酵液，放入4ml的离心管中，再用1000l的移液枪分两次吸取1000l的蒸馏水，放入之前的离心管中，充分混合摇匀。3.2.3 待测液的制取 将充分混合均匀的发酵液，分装到两个1.5ml的离心管中，做好标记，在3000转的离心机下离心2分钟，（离心液体应当对称放，保持离心机平衡）。 用10ml的一次性注射器吸取离心好的待测液的上清液，将0.22m的微孔滤膜装到过滤器中。将注射器的待测液经过滤器压入10mm石英比色皿，占比色皿的2/3左右。 与此同时，将参比溶液加入到另一个比色皿中，占比色皿的2/3左右。3.2.4 测量 将参比溶液放入到紫外分光光度计的第一个格栅，待测溶液放到第二个格栅，关闭盖子，在测量点位于第一个格栅时，对测量示数清零。向外拉金属杆，测量第二个格栅的比色皿数据，此时得到的待测液在280nm的吸光度。记录。3.3 不同菌种发酵情况测定参照3.2的实验分析方法，对以B菌和Y菌为发酵菌种的发酵液的发酵情况进行10天5次分析测定，得出表3-1实验数据：表3-1 不同菌种发酵过程吸光度时间（d）246810原样（空白）0.5560.5540.5540.5560.555原样（B菌）0.5530.4950.4620.4310.430原样（Y菌）0.5420.4810.4530.4410.4213.4 微量元素对发酵情况影响的测定 参照3.2的实验分析方法，对Cu2+，Mn2+两种离子对B菌和Y菌发酵的影响进行分析，经过10天5次的取样分析测定，得出表3-2实验数据：表3-2 微量元素对发酵过程影响吸光度时间（d）246810Cu2+（B菌）0.5540.5120.4970.4820.480Cu2+（Y菌）0.5430.4930.4820.4760.451Mn2+（B菌）0.5500.4890.4690.4250.392Mn2+（Y菌）0.5410.4760.4420.4010.381原样（空白）0.5560.5540.5540.5560.555Cu2+Mn2+Y菌0.5500.4790.4400.4050.3863.5 不同pH下发酵情况的测定参照3.2的分析方法，对第一次不同pH发酵条件进行10天5次分析测定得出表3-3实验数据：表3-3 第一次不同pH条件发酵吸光度时间（d）246810pH=30.5510.4820.4580.4410.429pH=40.5490.4740.4420.4320.413pH=50.5480.4770.4460.4320.412pH=60.5500.4800.4590.4380.421pH=80.5540.5080.4820.4740.461原样（空白）0.5560.5540.5540.5560.555对第二次不同pH发酵条件10天5次分析测定得出表3-4实验数据：表3-4 第二次不同pH条件发酵吸光度时间（d）246810pH=30.5520.4810.4590.4410.434pH=3.50.5520.4820.4490.4360.428pH=40.5490.4770.4490.4310.416pH=4.50.5480.4740.4450.4300.411pH=50.5480.4770.4460.4320.4143.6 不同发酵温度下发酵情况的测定参照3.2的分析方法，对不同温度下的发酵情况进行10天5次测量分析，得出表3-5实验数据：表3-5 不同发酵温度发酵吸光度时间（d）246810200.5480.4950.4820.4780.461250.5460.4900.4770.4650.450300.5460.4870.4680.4590.448380.5440.4840.4530.4410.4203.7 不同发酵转速下发酵情况的测定参照3.2的分析方法，对不同转速下的发酵情况进行10天5次测量分析，得出表3-6实验数据：表3-6 不同发酵转速条件发酵吸光度时间（d）246810120rpm0.5490.5010.4770.4630.453140rpm0.5490.4960.4670.4510.441150rpm0.5430.4900.4560.4410.4193.8 最佳条件发酵 参照3.2的分析方法，以发酵液pH=4.5，加入 微量元素锰离子，在38，150rpm发酵条件下培养，测量分析结果如表3-7：表3-7 最佳条件发酵吸光度时间（d）246810空白样0.5560.5340.5350.5490.521B菌10.5320.4780.4440.4210.38B菌20.5360.4850.4310.4170.382Y菌10.5330.4620.4370.40.363Y菌20.5410.4570.4220.3940.3513.9 木质素含量的测定 测定木质素含量采用分光光度法21。 离心后，取一定量上清液，0.22m微孔滤膜过滤，用参比溶液（0.1mol/LNaOH溶液）为对照，在280nm的吸光度下，使测量结果在（0.20.8）范围内。由以下计算：式中：c-发酵液中木质素的浓度； A-样品在280nm处吸光度； n-稀释倍数； a-在280nm处的吸光系数23.561g-1cm-1 b-样品池厚（一般为1cm）。木质素去除率（w%）可由下式计算：式中：c0-处理前木质素含量； c1-处理后木质素含量。第4章 实验结果与分析4.1 不同菌种的发酵结果的对比分别B菌和Y菌作为菌种发酵以木质素为唯一碳源的发酵实验，试验结果见图4-1。图4-1 B菌和Y菌对比发酵吸光度情况 根据3.9的木质素测定公式，可化简（式4-1），可得以下结果如表4-1：表4-1 B菌和Y菌对比发酵降解率时间（d）246810原（B菌）0.53%10.39%16.20%21.93%21.97%原（Y菌）2.46%12.85%17.78%20.18%23.55% 根据计算数据，得出降解率（DR）如下图4-2：图4-2 B菌和Y菌降解率结果对比情况 由图4-1、4-2可知发酵初期，B菌和Y菌在发酵液中都有一个适应期，吸光度和降解率都很低，从第4天开始降解率逐渐上升，B菌第8天到达最佳，Y菌到第10天到达最佳。根据式4-1可知，吸光度和降解率成反相关，测量吸光度越低，降解率越高。B菌第10日降解率为21.97%，Y菌为23.55%，Y菌的降解能力大于B菌的降解能力。4.2 不同微量元素对发酵结果影响 通过添加不同微量元素发酵，实验结果如下图4-3：图4-3 不同元素发酵结果吸光度对比情况 根据化简公式4-1，算出其降解率，如表4-2：表4-2 不同元素发酵结果降解率对比情况时间（d）246810Cu2+Mn2+(Y菌)1.05%13.20%20.07%26.49%29.70%Cu2+（B菌）0.35%7.39%10.04%12.98%13.18%Cu2+（Y菌）2.28%10.74%12.68%14.04%18.28%Mn2+（B菌）1.05%11.44%14.96%22.98%28.65%Mn2+（Y菌）2.63%13.73%19.72%27.19%30.58% 根据数据做出降解率（DR）图，如图4-4：图4-4 不同元素发酵率结果对比情况 由图4-3、图4-4可知Mn2+对发酵过程影响较大，不仅能使菌种提前度过休眠期，迅速到达生长期，对降解率有很大提高，而Cu2+对发酵过程提升不明显，当两种离子混合时，和单个Mn2+降解率差距不大。10天后加入Mn2+降解率能达到30%，Cu2+的降解率到达20%左右；对比B菌和Y菌，Y菌的降解能力和对微量元素的反应快慢均强于B菌。4.3 发酵液pH对发酵影响 不同pH条件对以Y菌为菌种发酵过程的影响，分两次实验，实验结果如图4-5、图4-6： 图4-5 第一次不同pH条件发酵吸光度对比情况图4-6 第二次pH细化实验吸光度对比情况 根据式4-1，计算出降解率如下表4-3和表4-4：表4-3 第一次不同pH条件发酵降解率对比情况时间（d）246810pH=30.88%12.68%16.90%20.18%22.14%pH=41.23%14.08%19.72%21.75%24.96%pH=51.40%13.56%19.01%21.75%25.13%pH=61.40%13.03%16.73%20.70%23.55%pH=80.35%8.10%12.68%14.39%16.52%表4-4 第二次不同pH条件发酵降解率对比情况时间（d）246810pH=30.70%12.85%16.73%20.18%21.27%pH=3.50.70%12.68%18.49%21.05%22.32%pH=41.23%13.56%18.49%21.93%24.43%pH=4.51.40%14.08%19.19%22.11%25.31%pH=51.40%13.56%19.01%21.75%24.78% 根据数据做出降解率（DR）图4-7、图4-8：图4-7 第一次不同pH条件下的Y菌降解率情况 图4-8 第二次不同pH条件下的Y菌降解率情况根据图4-7可知，Y菌在pH=8时降解率较低，其他pH情况下，降解率差异不明显，由图4-8可知，Y菌在pH4-5之间降解率最高，10天后能到达25%左右。所以Y菌在酸性较弱的条件下发酵情况较好。4.4 发酵过程温度对发酵影响不同温度条件下，Y菌发酵情况，取样测量结果如图4-9：图4-9 不同温度条件下Y菌发酵液吸光度情况用式4-1，计算降解率结果如表4-5：表4-5 不同温度条件下Y菌发酵液降解率情况时间（d）246810201.40%10.39%12.68%13.68%16.52%251.75%11.27%13.56%15.96%18.45%301.75%11.80%15.14%17.02%18.80%382.11%12.32%17.78%20.18%23.73%根据数据做出不同温度下降解率（DR）图4-10：图4-10 不同温度条件下Y菌发酵液降解率情况根据图4-10不同发酵温度下的降解率，可以看出：在实验温度区间内，温度越高，降解率越高，并且就单次纵向对比，温度越高，发酵越为迅速。实验也表明38为最佳发酵温度，发酵10天后其降解率为23%左右。温度过高的情况下，会影响发酵菌的活性，降低降解率。4.5 发酵过程转速对发酵影响不同转速情况下，Y菌发酵情况，取样测量结果如图4-11：图4-11