（物理化学专业论文）多功能纳米粒子的制备及其诱导k562细胞凋亡的研究.pdf

论文题目： 学科专业： 学位申请人： 指导老师： 多功能纳米粒子的制备及其诱导k 5 6 2 细胞凋亡的研究 物理化学 周丽佳 沈鹤柏 摘要 纳米科技是8 0 年代术由多学科交叉而逐步发展起来的新兴学科，在生物医 学、材料、环境、化学等方面有广泛的应用前景。纳米材料的开发和应用在纳米 科技的发展中处于核心地位。近年来，随着纳米技术向生命科学领域的不断渗透， 利用纳米生物技术研究和解决其中的重大问题，推动纳米生物技术的发展，正成 为当前一个重要的前沿领域。其中纳米荧光材料、磁性材料在生命科学、医药领 域中的应用更是倍受关注：本文主要研究了纳米村子与牛物分子相结合形成的纳 米粒子生物分子复合物在诱导细胞凋亡中的应用。 ( 1 ) 采用反相微乳液的方法，利用正硅酸乙酯在碱性条件下水解，在有机荧光 染料f i t c 及y f e 2 0 3 的表面包裹一层s i 0 2 。再通过化学反应在其表面修 饰上具有活性的官能团。实验结果表明在f i t c 及磁核y - f e 2 0 3 的表面成功 地包裹了s i 0 2 层，形成了核壳型磁性荧光纳米粒子；t e m 图及荧光光谱 显示合成的核壳型磁性荧光纳米粒子具有均匀的粒径，良好的单分散性和 较好的荧光强度。 ( 2 ) r n a 干扰是向细胞导入d s r n a 引发的转录后基因沉默。本文以量子点作 为一个对r n a 干扰有效、实时、自追踪的转染剂，构建了s i r n a 与量子 点复合物，并且通过内吞作用，将此复合物作用于k 5 6 2 细胞。针对白血 病k 5 6 2 细胞中的b c r a b l 致癌基因设计双链s i r n a ，并与荧光量子点连接， 形成量子点s i r n a 复合物。量子点以其独特的荧光性能不仅可以起到标记 作用，监测复合物传送和转染，而且在本实验中它作为载体，成功的将 s i r n a 转导进入细胞。实验采用m t t 法来说明细胞活性，采用f a c s 来说 明细胞凋亡率。数据显示，此q d s i r n a 复合物可以有效抑制k 5 6 2 细胞 的活性，并诱导细胞凋亡。因此，量子点可以被认为是种用于分析r n a i 功效的有效工具。这些自追踪q d - s i r n a 复合物也有助于将来监测体内基 因沉默研究。 ( 3 ) 基于纳米技术与生物学上反义技术的理论基础知识，将红色量子点与特定 序列的反义核酸相连接得到量子点反义核酸复合物，该复合物与k 5 6 2 癌 细胞作用后，特异性地结合在细胞核部位，同时诱导该癌细胞的凋产：利 用激光共聚焦荧光显微镜等实验手段对结果进行了表征。结果表明连有反 义核酸的红色量子点特异性的集中在细胞核中的染色体部位。实验结果将 反义核酸诱导癌细胞凋亡的过程做到了可视化程度，为医学上癌症的诊疗 提供了技术平台。 关键字：磁性荧光纳米粒子；r n a 干扰；量子点；癌症诊疗；k 5 6 2 细胞； 论文类型：应用基础 a b s t r a c t n a n o t e c h n o l o g yi sa ne m e r g i n gs u b j e c td e v e l o p e df r o mm u l t i p r i n c i p l e sa n di t e n j o y saw i d ea p p l i c a t i o np r o s p e c ti nb i o l o g y , m e d i c i n e ，m a t e r i a l s ，e n v i r o n m e n t ， c h e m i s t r ya n ds oo n t h ee x p l o r a t i o na n da p p l i c a t i o no fn a n o m a t e r i a l sp l a y sac o r e r o l ei nt h ed e v e l o p m e n to fn a n o s c i e n c e r e c e n t l y ，w i t ht h ec o n s t a n t l yp e n e t r a t i o no f n a n o s c i e n c et ol i f es c i e n c e ，i th a sb e e na ni m p o r t a n tf r o n t i e ra r e at ou t i l i z e n a n o b i o l o g i c a lt e c h n o l o g ya n ds o l v eg r e a tp r o b l e m ss oa st oa d v a n c et h ed e v e l o p m e n t o fn a n o b i o l o g i c a lt e c h n o l o g y n a n o f l u o r e s c e n tm a t e r i a l s ，m a g n e t i cm a t e r i a l sa r ep a i d m o r ea t t e n t i o ni nl i f es c i e n c ea n dm e d i c a la r e a s 。t h i sp a p e ri sf o c u s e do nt h er e s e a r c h o ft h ec o m p l e xw h i c ha r ec o m p o s e do fn a n o p a r t i c l e sa n db i o - m o l e c u l e sa n dt h e a p p l i c a t i o no ft h ec o m p l e xi nt h ei n d u c i n gk 5 6 2c e l l sa p o p t o s i s ( 1 ) at h i ns i l i c a c o a t i n gl a y e re n c a p s u l a t i n gt h eb a r e ) - f e 2 0 3n a n o p a r t i c l e sa n d o r g a n i cf l u o r e s c e n td y e s t u f ff i t cw a sf o r m e db yab a s e c a t a l y z e dh y d r o l y s i s a n d p o l y m e r i z a t i o n r e a c t i o no ft e t r a e t h o x y s i l a n e ( t e o s ) i nr e v e r s e m i c r o e m u l s i o n t h es u r f a c eo ft h en a n o p a r t i c l e sw a sm o d i f i e dw i t ha c t i v ea g e n t t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tt h es t r u c t u r eo fc o r e s h e l li ss u c c e s s f u l l y s y n t h e s i z e da n dt h es y n t h e s i z e dn a n o p a r t i c l eh a su n i f o r ms i z ei nd i a m e t e r , v e r y f i n em o n o d i s p e r s i o ni ns u i t a b l ec o n d i t i o na n dg o o df l u o r e s c e n ti n t e n s i t y ( 2 ) r n ai n t e r f e r e n c ei st h ep o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c ei n d u c e db yd s r n a i n t h i sp a p e r q u a n t u md o t sw e r eu s e da sav e c t o ra n dc o n j u g a t e dw i t ha d o u b l e - s t r a n d e d s i r n a t h r o u g hp h a g o r y t o s i s t h i s c o n j u g a t e c a nb e s u c c e s s f u l l yt r a n s f e r r e di n t ok 5 6 2c e l l s t h ed o u b l e s t r a n d e ds i r n a ( s i r n a s ) w e r ed e s i g n e dt ok n o c kd o w nt h eb c r a b lo n c o g e n ei nl e u k a e m i ak 5 6 2c e l l s u s i n gs u c hac o n s t r u c t ，t h ed e l i v e r ya n dt r a n s f e c t i o no ft h es i r n ac a nb e m o n i t o r e db yt h ep r e s e n c eo ff l u o r e s c e n tq d si nt h ec o i l j u g a t e s q d sn o to n l y e x h i b i ts u p e r i o rp h o t o s t a b i l i t yf o rl a b e l i n gc e l l sb u ta l s ow o r ka sag o o dv e c t o r t h a ts u c c e s s f u l l yt r a n s f e r ss i r n ai n t oc e l l s c e l lp r o l i f e r a t i o nw a si l l u s t r a t e db y m t t a s s a ya n dc e l la p o p t o s i sb yf a c s o u rd a t as u g g e s t st h a tt h i sq d s i r n a c o n j u g a t ec a ne f f i c i e n t l yi n h i b i tt h ev i a b i l i t yo fk 5 6 2c e l l sa n di n d u c ea p o p t o s i s 1 i t h u s ，q d sc a nb ec o n s i d e r e ds t r o n gt o o l sf o rf u n c t i o n a la n a l y s i so fr n a i h e d e l i v e r ya n dc o n j u n c t i o no ft h e s es e l f - t r a c kq d s i r n ac o m p l e x e sw i l lb e h e l p f u lf o rr e s e a r c ho fi nv i v og e n es i l e n c e ( 3 ) b a s e do nt h et h e o r yo ft h en a n ot e c h n o l o g ya n dt h ea n t i s e n s e ，s e m i c o n d u c t o r n a n o p a r t i c l e s ( q u a n t u md o t s ) - n u c l e o t i d e sc o m p l e x e sw e r es y n t h e s i z e d t h e a n t i s e n s en u c l e o t i d e sw i t hs p e c i f i cs e q u e n c ew e r ec o n j u g a t e dt ot h es u r f a c eo t t h er e dq u a n t u md o t st of o r mt h eq u a n t u md o t s a n t i s e n s en u c l e o t i d e sc o m p l e x c s a f t e rc u l t u r e dw i t ht h ek 5 6 2c e l l s ，t h ec o m p l e x e sc o u l ds p e c i f i c a l l yl o c a t ei n t h en u c l e u so ft h ec e l l sa n di n d u c e dt h ea p o p t o s i so ft h ec a n c e rc e l l s t h e r e s u l t sw e r ec h a r a c t e r i z e db y t h el a s e rc o n f o c a lf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ea n d o t h e re q u i p m e n t s a l lr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h er e dq u a n t u md o t s a n t i s e n s e n u c l e o t i d e sc o m p l e x e sl o c a t e di nt h ec h r o m o s o m ei nt h en u c l e u so ft h e c e l l s a n d ，m o r ei m p o r t a n t l y , t h ee x p e r i m e n tm a d et h ec o u r s eo ft h ec a n c e rc e l l a p o p t o s i si n d u c e db yt h ea n t i s e n s en u c l e o t i d e sv i s i b l e ，w h i c hs u p p li e d a t e c h n o l o g yp l a t f o r mf o rt h ed i a g n o s i sa n dt r e a to ft h ec a n c e ri nm e d i c a la r e a k e yw o r d s ：m a g n e t i cf l u o r e s c e n tn a n o p a r t i c l e ；r n ai n t e r f e r e n c e ；q u a n t u md o t s ； i v c a n c e rd i a g n o s i sa n dt r e a t ；k 5 6 2c e i l s 论文独创性卢明上海师范人学硕十学位论文 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 论文作者签名： 焉唧 日期：喈年f 月 协同 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 论文作者签名：奶何 导师签名： j ，篪铌r 瓿 5 2 日期：1 峨年f 月 “日 日期：p 晴年f 月“同 上海师范人学硕十学何论文第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 研究意义 在2 0 世纪的最后十年，门崭新的学科一一纳米科学技术诞生了。其新颖 性、独特的思路和首批研究成果的问世，在科学技术界、军界和产业界引起巨人 反应，受到广泛关注。美国i b m 公司首席科学家阿姆斯特朗况：萨如2 0l 蝤：红： 7 0 年代微电子技术引发了信息革命一样，纳米科学技术将成为2 l 世纪信息时代 的核心1 1 1 。 所以，我们可以说，纳米技术是新世纪的新动力。 “纳米”是“n a n o m e t e f 的译名，即旧称微毫米，通常用“n m ”表示。在物 理学中，纳米是长度的单位：它与长度单位米的换算关系是：l n m = 1 0 一m ，或 l n m 为i o a t 2 1 。纳米科学技术是- f q 在0 1 n m l o o n m 尺度空间内，研究电子、 原子和分子运动规律与特性的高技术学科。纳米技术涉及各个领域，纳米材料与 纳米生物学、纳米电子学、纳米加工学、纳米测量学、纳米化学、纳米摩擦学和 纳米物理学共同构成了纳米科学技术的内涵，它是现代科学和先进工程技术结合 的产物。纳米科技的诞生，是人类改造自然的能力直接延伸到分子和原子。因此， 纳米科技的诞生，标志着人类科学技术进入一个崭新的时代一一纳米科技时代。 纳米生物技术主要是将纳米科学领域的纳米材料应用于传统的生物科学领 域。研究纳米技术在生命医学上的应用，可以在纳米尺度上比较清楚认识生物大 分子的惊喜结构及相应功能的关系，获取生命信息或物质。纳米微粒已被成功用 于细胞分离，在磁性纳米微球的表面上接枝或者吸附具有生物活性的吸附剂或其 他配体活性物质，利用这些活性物质的性质和特定的细胞或酶结合，在外加磁场 的作用下可将不同的细胞和蛋白分离开来。毫无疑问，类似的利用纳米技术制造 人工生物体将越来越受到人们的重视和广泛应用。利用纳米科技可将生物降解性 和生物相容性的聚合物与药物一起制成纳米药物，作为靶向药物制剂，直接导入 病灶部位的器官、组织甚至细胞，达到提高药物治疗，降低毒性的作用。相信随 着纳米生物材料的不断出现和完善，将给生物医学领域带来新的变革和快速的发 展【3 】。所以，综合各个方面的发展态势，纳米生物学已经作为一门独立的学科而 吸引越来越多的研究人员的关注。 第一章文献综述上海师范人学硕十学位论文 1 2 研究进展 1 2 1 核壳型磁性纳米粒子的合成及其在生物体系中的应用 磁性纳米粒( 如f e 3 0 4 、y - - f e 2 0 3 ) 可作为磁性介质，与各种载体材料结合， 可以制备成磁导向给药系统，如磁性微球、磁性微囊、磁性脂质体、磁性微乳等， 这些磁导向给药系统可用于抗肿瘤等的靶向给药，还可进一步与抗体结合，制备 成免疫磁性纳米微球。它们在临床和生物医药领域中有着广泛的应用前景。 4 - 7 1 。 由于磁性纳米粒子具有高比表面积、高比表面能，以及粒子各向异性的偶极距作 用从而很容易团聚，从而导致粒子发生聚集和沉淀，不能形成稳定的分散体系， 使其在生物医学中的应用受到了限制。【s j 因此，对磁性纳米粒子进行表面修饰使 其具有更好的分散性和生物相容性的研究具有重要的理论和现实意义。 通过对磁性纳米粒子的表面修饰可以降低其表面能，提高粒子的抗氧化能 力，得到分散性好的纳米复合粒子：同时适当的表面修饰可以调节磁件纳米粒子 与其他材料的相容性和反应特性。由于s i 0 2 具有以下优异的性能：可以屏蔽磁性 粒子之间的偶极相互作用，阻止粒子团聚 9 1 ；具有良好的生物相容性、亲水性以 及非常好的稳定性；并且s i 0 2 微球的制备技术已经相当成熟，为制备高质量 的s i 0 2 修饰的磁性微球提供了技术支持，同时发展成熟的硅化学又为磁性微球 进行表面生物修饰和其在生物医学中的应用提供了重要保障1 。因此近年来核壳 结构二氧化硅磁性纳米粒子的制备及应用备受关注。 目前，核壳结构二氧化硅磁性纳米粒子的制备方法主要有溶胶一凝胶法 ( s o l - - g e l ) 、反相微乳液法( r e v e r s em i e r o e m u l s i o n ) 、气溶胶高温分解法( a e r o s o l p y r o l y s i s ) ，其中溶胶一凝胶法又可以分为硅酸钠水解法、正硅酸乙酯水解法、 s t l 皇b e r 法。( 8 】对磁性二氧化硅微球进行表面功能化修饰，常用试剂是有机硅氧烷 及其衍生物，如3 氨基丙基硅氧烷和3 巯基丙基硅氧烷，这些试剂能够为微球 表面提供官能团以便与生物分子和药物分子等进行偶联。在表面偶联方面我们采 用的化学试剂是n ( 2 氨乙基) 3 氨基丙基三甲氧基硅烷，通过这样的表面修 饰方法，我们得到了表面带有氨基活性官能团的生物亲和性磁性纳米粒子。 表面经过活化的核壳型磁性纳米粒子由于其粒径小比表面积大、功能化的表 面以及具有良好的超顺磁性等物理和化学方面的性质，使其在生物体系运用中有 2 上海师范人学硕十学位论文第一章文献综述 着许多其它纳米粒子无法替代的作用。例如在生物分子的分离和纯化、靶向给药 以及磁共振成像等方面有着重要的应用。 1 2 2 有机荧光染料的研究进展及其在生物体系中的应用 近l o 几年来，有机荧光染料在工业、民用的各个领域都得到应用。有机荧 光溶剂染料已广泛应用于有机荧光颜料与涂料、塑料与人造纤维的荧光染料、光 学增白剂、有机闪烁器、火箭和轮船及大型设备的探伤、化学及电化学发光体中 的有机荧光源、荧光化学分析、生物及医学的荧光示踪以及军事等方面的荧光源 等领域。 荧光的发射与强度主要与染料的分子结构有关。荧光物质分子一般都含有发 射荧光的基团( 称为荧光团) ，如c o 、c hc h 、c hn 、n h 等基团，以及能 使吸收波长改变并伴随荧光增强的助色团，如n h 2 、一n h r 、0 r 、- n h c o r 等基团。从染料结构上分有荧烷衍生物类( 包括罗丹明类) 、1 ，8 萘酰 亚胺类、香豆素类、三芳甲烷类、偶氮类、葸醌类、二苯乙烯类、萘二甲酸衍生 物、苯并蒽酮衍生物等。但从近几年的研究看，有机荧光染料的合成与应用主要 是荧烷衍生物类、1 ，8 萘酰亚胺类和香豆素类3 大结构。f 1 2 1 有机荧光染料作为重要精细化学品之一，以其独特的性能在越来越多的领域 内起着重要的作用，已越来越引起众多研究者的关注。随着合成及应用技术的不 断改进，人们对有机荧光化合物的认识和研究将不断深入，其应用范围也将不断 扩大，人们开始将多种荧光试剂用于组织染色和多种离子的测定， 然而这些试 剂用于活体细胞的实时、活体检测时，还有许多因素要考虑：试剂本身的毒性、 稳定性、与生物大分子的相互作用、以及试剂从细胞内泄漏等问题，这样一来， 合适的荧光试剂就比较少了。由此人们开始研究基于荧光核壳纳米颗粒建立的纳 米生物探针，它可直接进入单个活体细胞，高灵敏、高选择性地监测感兴趣的 对象，还可实现对单个细胞健康状况的评估，这种纳米传感装置可用于检测活体 细胞中活性物质( c a 2 + ，矿，r n a 或蛋白质) 的含量，并可实时测定在外界 刺激下活体细胞内的这些活性物质的空间分布i l 引。 1 2 3 量子点及其在生物医学领域的应用 半导体量子点，简称为量子点( q u a n t u md o t s ) ，通常由周期表i i ，v i 或i i i v 族元素合成的半导体材料，它们既不是原子也不是大分子半导体。q d s 的半径从 第一章文献综述上海师范人学硕十学何论文 1 0 1 0 0 a ，正是这个物理尺寸决定了它们的各项性能【】。相对于有机荧光基团， q d s 具有独特的光学和电子性能，七匕如量子点的尺寸和成分可调节，使其荧光发 射范围从可见光至红外波长，此外，量子点还具有非常好的光强度、耐光性以及 激发光谱宽和发射光谱窄且对称分布的优点i i 孓1 6 】。这些性质为生物分子和细胞 成像与超灵敏生物鉴定和诊断提供了新的可能性【1 7 1 8 19 1 。自1 9 9 8 年b r u c h e z 和 c h a n 等解决量子点作为生物探针的生物相容性问题，并首次利用量子点分别成 功标记活体3 t 3 纤维细胞和h e l a 细胞以来，量子点作为细胞标记的新技术在生 物学中的应用引起了国际学术界的高度重视【2 0 2 1 1 。近年来，量子点在离体细胞 标记，活体细胞成像，细胞结构与受体标记，免疫荧光标记，活体动物荧光显微 成像，多组分检测，编码等方面都取得了重大进展【2 2 2 7 1 。 有关量子点的合成方法有很多，然而根据所采用原料和工艺的不同，概括起 来大致可分为会属化合物一元素有机物路线和水相无机合成路线。美国a r k a n s a s 大学的p e n g 小组在量子点的有机合成方面做出了大量突出而细致的工作，为推 动以半导体荧光量子点为基础的理论和应用研究做出了重要贡献【2 弘3 引。直接水相 合成是量子点制备的另一重要途径。德国的w e l l e r 小组【3 4 ，3 5 】和国内的高明远小 组【3 6 4 0 1 在这方面的工作较为特出。 在生命科学领域，荧光图像技术是一种重要的手段，然而由于有机染料易于 淬灭，无法对标记物进行长期的追踪及观察标记物的动力学过程。荧光蛋白的出 现可以在一定程度上解决这一问题，但需使用基因工程技术制备可表达融合蛋白 的质粒，进行细胞培养、基因转染等一系列操作，不易普及。量子点的出现，以 其独特的优点，吸引生命科学家的注意，比较彻底地解决上述存在的问题。 量子点在生命科学领域的应用主要由以下几个方面：1 9 9 8 年美国加州伯克 利大学的a l i v i s a t o s 小组【4 1 1 和印地安纳大学的n i e 小组【4 2 l 同时在( ( s c i e n c e ) ) 发表 相应的研究成果，最早提出了量子点作为生物标记物的思想，他们的工作充分显 示了量子点作为一种新型的荧光试剂，完全可以取代传统的有机染料，其优异的 荧光性能将为生命科学技术带来新的突破，从而拉开了量子点在生命科学中应用 的序幕。a l i v i s a t o s 用两种不同大小( 2n m 和4n m ) 的二氧化硅包裹的c d s e c d s 量子点做探针，标记术3 t 3 成纤维细胞，生物分子通过静电和氢键或配体受体 与量子点表面相互作用而结合，从而实现标记。发绿色荧光的量子点结合到细胞 4 上海师范人学硕+ 学位论文第一章文献综述 核，发红色荧光的量子点结合到肌动蛋白丝上，同时在细胞中观察到红色和绿色 的荧光( 见图1 1 ) 。 图1 i 双色量子点标记单个细胞不同组分的荧光成像 f i g 。if l u o r e s c e n c em i c r o g r a p h so fd u a l e o l o u rq u a n t u md o t ss t a i n e d3 t 3m i c ef i b r o b l a s tc e l l s 2 0 0 2 年，a k e r m a n 等【4 3 铷1 将肽与量子点结合用于标记特定组织部位的内皮 细胞受体。通过静脉注射将连有肽片段的量子点注入到小鼠体内，可以观察到量 子点在特定的目标组织部位聚集，从向实土见体内组织的可视化( 见图1 2 ) 。 图l 一2 量子点用于小鼠体内的癌细胞活体标记 f i g i - 2 i nv i v ot a r g e t i n ga n di m a g i n go fc a n c e rc e l l si nm o u s e 1 2 4 反义核酸技术的原理及应用 1 9 8 4 年，l z a n t 和w e i n t m u b 提出了“反义核酸技术 的概念，即根据碱基 互补原理，用人工合成和生物合成的特定互补的d n a 或r n a 序列，导人靶细 胞，形成m r n a d n a 或m r n a - r n a 杂交双链，从而抑制或封闭基因表达，使 其丧失活性，达到基因控制和治疗的目的。反义核酸技术是继基因克隆和重组技 术后分子生物学领域的一种全新的技术。该技术由于其核苷酸具有与d n a 意义 链相同的序列，且可以选择性地抑制特定基因的表达而得名。目前，在基因功能 的研究和基因治疗中，人们越来越广泛的应用反义核酸技术来抑制目的基因的表 达，因此，该技术在肿瘤基因治疗中有着巨大的发展潜力。 第一章文献综述上海师范人学硕十学位论文 反义核酸技术的作用机制是由反义寡核苷酸( a n t i s e n s e0 1 i 9 0 n u c l e o t i d e ， a s 0 n ) 通过与靶m r n a 上特定序列以w a t s o n c r i c k 碱基配对原则杂交，抑制或 阻断了m r n a 基因的表达。理论上，人类基因组中只能出现一次的核苷酸序列 数目平均为1 3 个。基于这一点，一般设计1 5 2 5 个碱基特异序列的反义寡核苷 酸，能针对人类基因组中任何的单个基因作为靶点，从而调控基因表达。迄今为 止，反义寡核苷酸的作用机制尚未完全清楚，但现在已经明确的机制为：反义寡 核苷酸严格按w a s t o n c r i c k 碱基互补配对原理，定向互补到靶m r n a ，形成的 m r n a d n a 双链，激活r n a s eh ，水解该m r n a ，阻断m r n a 进入细胞浆， 使其蛋白质的翻译过程不能正常进行，从而阻断了翻译过程，这是反义寡核苷酸 发挥作用的一条重要机制。 反义核酸技术的优点主要如下： ( 1 ) 反义核苷酸是针对特定的靶m r n a ( d n a ) 的序列设计合成，具有极 高的特异性： ( 2 ) 反义核酸是针对已知序列的靶基因设计合成的，由于靶基因序列已知， 反义核酸仅有1 5 3 0 个碱基，结构简单，容易设计和体外大量合成。 ( 3 ) 反义核酸进入细胞内与细胞周期无关，既可进入增殖期细胞又可进入 非增殖期细胞。 ( 4 ) 反义寡核苷酸不含病毒序列，不会产生免疫反应，也不会整合入宿主 染色体内。 1 2 5r n a 干扰的生物学原理与应用 r n a 干扰是1 9 9 8 年由f 沁【5 i 】首先提出，其在2 0 0 0 年一2 0 0 3 年连续四年被 s c i e n c e 评为十大科技之一。近几年随着稳定表达载体的出现，转染效率的 提高，s i r n a 转染筛选后可以稳定表达，因此维持长时间的干扰效果， 使其 在功能基因组研究【5 2 1 和疾病基因治疗中应用更加广泛。 r n a i 现象最早是在1 9 9 0 年被发现的。当r i c h j o r g e n s e n 5 3 1 想通过转入外源 性的基因而使牵牛花的紫色更深， 却事与愿违，得到了杂色的牵牛花， 进一 步研究发现导入的外源d n a 在某种程度上可以影响内源性基因的表达，他们 称之为“共抑制 。而这种抑制作用当时被认为是发生在转录后水平的，所以 又称之为“转录后基因沉默”( p t g sp o s t t r a n s c r i p t i o ng e n es i l e n c i n g ) 。1 9 9 5 年 6 上海师范人学硕十学位论文第一章文献综述 g u o 等【”】发现不仅反义的p a 卜lr n a 可以抑制基因的表达，作为对照的f 义p a r i r n a 也能使目的基因抑制。这一惊奇的现象引起了f i r e 的注意，其在1 9 9 8 年 将正义、反义、双链r n a 分别导入线虫体内后，发现双链l 渊a 沉默靶基因的 效果是单链f 义或反义r n a 的十多倍【5 1 】，随之将这种d s r n a 抑制基因表达 的现象称为r n a 干涉( r n ai n t e r f e r e n c e ) 。自从在c 线虫中报道后， r n a 干 涉现象在许多生物中被发现，如：斑马鱼【5 5 1 、真菌【5 6 】、果蝇【5 7 1 和哺乳类老鼠的 胚胎【5 8 j 中，但在古细菌和原核生物中却无类似的现象，所以推测这是高级生物 特有的一种调节基因表达及抵抗病毒入侵或抑制转座子诱导基因突变的一种手 段【5 9 6 0 1 。 早期在哺乳动物细胞中应用d s r n a 可引起非特异性干扰素反应而导致细胞 死亡，后来遗传学和生物化学研究证明将d s r n a 切割成2 1 2 8 个核苷酸的s i r n a s 后不引起干扰素反应，并能有效降解含有同源序列的靶m r n a 。因此，s i r n a s 正迅速发展成为研究基因功能的新工具和作为治疗的新手段s i r n a s 是由 r n a s e i l l 家族中被称为d i c e r 的核酸内切酶在细胞质中剪切自然存在的长 d s r n a 的过程中产生的d i c e r 将长d s r n a 剪切为2 1 2 8 个核苷酸的s i r n a 双链 这种s i r n a 双链除了在5 末端是磷酸，3 末端是羟基外，3 端还有由2 个核 苷酸构成的悬突。s i r n a 双链与诱导沉默复合物( r n a i n d u c e d s i l e n c i n g c o m p l e x ，r i s c ) 结合后裂解为s i r n a 单链，与s i r n a 单链完全互补结合的同源 性靶m r n a 被r i s c 剪切降解，从而达到基因沉默的目的现在s i r n a 能够像核 酶一样通过化学合成的方法或者通过载体表达双链短发夹样r n a ( s h o r t h a i r p i n 1 i k er n a ，s h r n a ) 进入到细胞内，后者在细胞内可转化为s i r n a 而发挥 基因沉默效应一些研究证明s i r n a s 还有其他沉默机制，例如在几种生物中能够 通过r n a i 途径修饰细胞染色质导致转录水平的基因沉默【6 6 射 m i r n a s ( m i c r o r n a s ) 是一类非编码小分子r n a ，具有和s i r n a s 相似的功能，调 节细胞内基因表达成熟的m i r n a 是由胞质中7 0 个核苷酸组成的发央样结构前 体剪切为2 1 2 2 个核苷酸分子组成的单链他们组装成蛋白复合体( m i r n p ) 后在核 糖体内与m r n a 3 端非翻译区部分互补结合从而阻止m r n a 的翻译如果与同 源性靶m r n a 完全互补结合，那么m i r n a s 像s i r n a s 一样能够通过正反馈途径 循环降解靶m r n a 。 第一章文献综述上海师范人学硕十学亿论文 瓷多琴蓬彩d s r n a ，罄d i c e r 雠 n 膨 。非嗽 簇够r i s m c p p r o e t 嗽e i s n 髋一w ”掣”“ l 客。( 净剐s c fj 辣嗲 。， 嚣嫡n a 硼训啊鸭妫“” 一1 _ c t 蜘a r g 叼e t g m e r n a一1 _ ，c 蜘叼g e ，_ k 一- 嚣两s 亭；冬攀一1 确黔嘲黼 i 矽。蝉。翩糯酾锩 7 一， 图l 一3r n a i 机制示意图 f i g 1 - 3 t h es c h e m eo fr n a im e c h a n i s m r n a i 作为一种新的基因治疗方法引起了许多研究者的兴趣，在很大程度上 是因为其作为细胞内源性基因表达调节物质的低毒性和特异性，另外一方面则是 其比o d n s 、核酶有更强的基因沉默效率然而将s i r n a s 应用于临床治疗还存在 一些挑战，如将s i r n a s 导入细胞内的最佳方法及如何获得更高效率，如何避免 脱靶现象及非特异性反应因此，进一步深入研究r n a i 的机制将会丰富我们对 基因表达调控的认识，也将有利于基因治疗的实际应用 1 2 6 癌细胞诱导凋亡的相关研究 自1 9 7 2 年k e r rw v l l i e 和c u r r i e 首次报道细胞凋亡现象以来，细胞凋亡现象 及其机制一直是生命科学研究的热点。细胞凋亡的基本过程是细胞表面接到诱导 因子刺激并将信号传入细胞内部，触发细胞内部的死亡程序，主要通过内源性 上海师范人学硕十学位论文第一章文献综述 d n a 内切酶的激活导致细胞自然死亡。它是生物体以细胞有丝分裂相反的方式 保持细胞群体相对稳定的生物学过程，此过程发生紊乱导致发育异常和肿瘤发 生。 细胞凋亡过程以浓缩为特征。镜下可见细胞体积缩小，密度增加，细胞表面 微绒毛消失细胞膜内陷皱褶，形成泡样结构，最后形成胞膜包裹的凋亡小体 ( a p o p t o t i cb o d y ) 。凋亡小体中溶酶体有完整的胞膜，不释放水解酶，因而不能引 起邻近细胞的炎症反应。 凋亡细胞的染色质断裂是有控降解，d n a 双链在核小体连接部断裂，形成 1 8 0 2 0 0 b p 片段或数倍大小的片段，在琼脂糖凝胶电泳中呈现梯形图谱，这种特 征己被作为细胞凋亡的特异性标志。 1 3 实验方法和表征手段 随着纳米技术不断地向生命科学中的渗透，纳米技术与众多的其他学科的结 合，产生了许多新兴的交叉学科和边缘学科。在这些学科兴起的同时也带动了许 多表征技术的发展，如：各种电子显微镜在纳米粒子形貌表征方面的应用，原 子力显微镜在纳米粒子以及纳米级生物分子的表征方面的应用，这里将本论文所 涉及到的部分实验方法及表征手段简要综述如下： 1 3 1 反相微乳液法制备超顺磁性纳米粒子 微乳液法是利用两种互不相溶的溶剂在表面活性剂的作用下形成一个均匀 的乳液，从乳液中析出固体，这样可使成核、成长、聚结和团聚等过程局限在一 个微小的球形液滴内，从而形成球形颗粒。微乳液通常由表面活性剂、助表面活 性剂( 通常为醇类) 、油( 通常为碳氢化合物) 和水( 或电解质的水溶液) 组成 透明的各向同性的热力学稳定性体系。其中反相微乳液是指油包水( w o ) 型乳 液，即水相分散在油相而形成微小的不连续的“水池”，其大小可控制在几十到 几百个埃之间。纳米粒子的微乳液制备方法正是利用微乳液的“水池 作为“微 反应器”，从而达到控制纳米粒子的粒径和形状【6 3 】。 1 3 2 原子力显微镜1 6 4 l 原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，a f m ) 是利用一个对力敏感的探 针探测针尖与样品之间的相互作用力来实现表面成像的。将一个对微弱力极敏感 的弹性微悬臂一端固定，另一端的针尖与样品表面轻轻接触。当针尖尖端原子与 9 第一章文献综述 上海师范人学硕+ 学位论文 样品表面间存在极微弱的作用力( 1 0 - 8 1 0 击n ) 时，微悬臂会发生微小的弹性形变。 针尖和样品之间的力f 与微悬臂的形变a z 之间遵循胡克定律( h o o k el a w ) f = k a z 其中，k 为微悬臂的力常数。测定微悬臂形变量的大小，就可以获得针尖与 样品之间作用力的大小。由于a f m 与电流无关，因此它既可以用来观察导体的 表面形貌，又可以用来观察非导体的表面形貌，弥补了s t m 只能观察导体的不 足。针尖与样品之间的作用力与距离有强烈的依赖关系，所以在扫描过程中利用 反馈回路保持针尖和样品之间的作用力恒定，即保持微悬臂的变形量不变，针尖 就会随表面的起伏上下移动，记录针尖上下运动的轨迹即可得到表面形貌的信 息。若在x y 扫描过程中，不使用反馈回路，保持针尖与样品之间的距离恒 定，检测器直接测量微悬臂z 方向的形变量来成像，称之为“恒高”模式。这种 方式由于不使用反馈回路，可以采用更高的扫描速度，通常在观察原子、分子像 时用得比较多，而对于表面起伏较大的样品不适合。 1 3 3 透射电子显微镜( t e m ) 电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作 光源，用电磁场作透镜。电子显微镜是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜 代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。电 子与物质相互作用会产生透射电子，弹性散射电子，能量损失电子，二次电子等 等。电子显微镜就是利用这些信息来对试样进行形貌观察、成分分析和结构测定 的。电子显微镜有很多类型，主要有透射电子显微镜( t e m ) 和扫描电子显微镜 ( s e m ) 两大类【6 3 1 。 透射电子显微镜( t e m ) 是最常用的电子显微镜，由电子枪、电磁透镜系统、 荧光屏( 或照相机) 、镜筒、镜座、变压器、稳压装置、高压电缆、真，空泵系统、 操纵台等部分组成。电子枪相当于光学显微镜中的光源，供应和加速从阴极热钨 丝发射出来的电子柬。电镜所用的电压一般在2 0 - - - - 3 0 万伏特，才足以使电子枪 里的电子以高速飞出。电子通过聚光透镜，达到标本上，因为标本很薄，高速电 子可以透过，并且由于标本各部分的厚度或密度不同，通过的电子就有疏密之分。 电压需要严格稳定才能使成像稳定，很小的电压改变就会引起严重干扰。像的亮 度可以通过电子枪来控制。 l o 上海师范人学硕十学位论文第一章文献综述 电磁透镜组相当于光镜中的聚光器、物镜及目镜系统。电子束通过各个电磁 透镜的圆形磁场的中心时可被会聚而产生像。电镜的透镜系统由4 组电磁透镜组 成，包括聚光透镜、物镜、中l 、日j 透镜和投射透镜( 目镜) 。可改变聚光透镜的电流 使电子束对标本聚焦并提供“照明”。物镜靠近标本的焦点上。通过物镜、中问 镜和投射镜的三级放大，能在一定的距离处得到高倍的放大像，最终形成的像投 射到荧光屏上。在荧光屏部位可换用黑白胶片以制取相片底板。改变电磁线圈中 的电流量从而使电磁透镜