毕业设计(论文)开题报告-微藻中总油脂的提取与富集

本科生毕业设计（论文）开题报告 题 目： 微藻中总油脂的提取与富集 学 院： 生命科学与食品工程学院 系 生物技术系 专 业： 生物工程 班 级： 生工092 学 号： 5602209078 姓 名： 沈峰 指导教师： 万益琴 填表日期： 2013 年 04 月 02 日 一、选题的依据及意义： 近年来注意格式，修改成首行空两格，行距你看看要求吧，另外文中的所有数字都要改成times new roman，国际市场石油价格不断高企，我国从1993年起已经成为一个石油进口国。进口原油不但用去大量外汇，而且主要从局势不稳定的中东地区进口，一旦有突发事件发生，就会造成石油供应减少或中断，将严重威胁国家安全和国民经济的发展。并且油脂与人类的关系越来越密切,无论是作为生物柴油的原料还是加工成为保健食品,油脂都具有至关重要的作用。目前,油脂的主要来源仍然是植物以及动物脂肪,但是这种传统的油脂来源已经不能完全满足人们食用、工业等生活中的各种需求。 在世界能源形势日趋紧张的大背景下，寻找一种绿色的可持续发展的新能源，成为各国普遍关注的科学问题。其中利用海洋微型藻类制取柴油、乙醇等，已在日美等国科学界开始探索。我国也应立即启动微藻制油技术的研究，以应对“后石油时代”的能源危机。据了解，我国的有机碳组成中，海洋藻类占了，藻类是一种数量巨大的可再生资源，也是生产生物质能源的潜在资源，其中微型藻类的含油量非常高，可以用于制取生物柴油。 中国海洋大学管斌认为，利用藻类生物质生产液体燃料，对缓解人类面临的粮食、能源、环境三大危机，有着巨大的潜力，对于减少对石油的依赖、保证国家能源安全具有深远意义。 微藻是能够进行光合作用的微生物,它可以利用阳光、水和CO2 合成自身所需要的物质。许多微藻含油量极高,据保守估计,每年每公顷微藻可生产30 00050 000 L 油脂,而富油植物如棕榈和麻风树等每年每公顷的油脂产量仅13002 400 L;微藻还具有环境适应能力强、生长周期短、生物产量高 和不占用农业用地等特点,因此,微藻油脂越来越受到国内外学者的广泛关注。2、 国内外研究现状及发展趋势（含文献综述）： 目前微藻生物柴油生产正由实验室转向小规模工厂化生产。国际微藻生物质高峰论坛于2007年11月在旧金山召开。目前数家公司正在进行微藻生物柴油商业化试生产。1、 利用细胞工程技术制备微藻及生物柴油 清华大学缪晓玲等通过异养转化细胞工程技术获得了高脂含量的异养小球藻细胞，其脂含量高达细胞干重的55（质量分散），是自养藻细胞的4倍。此外，清华大学还应用细胞培养技术（异养发酵技术）控制有机与无机C、N的供给，获得叶绿素消失、细胞变黄的异养小球藻。异养小球藻细胞中油脂类化合物大量增加，蛋白质含量下降。与未经转化的自养藻相比，异养藻细胞和粗脂肪含量提高了4倍以上。中科院植物研究所和中科院水生生物研究所的科研人员借鉴美国的经验教训，在较短的时间内，通过基因工程开发出了高产的油藻品种。青岛海洋大学经过十几年的淡水及海水藻类物质的研究，也已积累了丰富的海洋藻类开发和产业化的经验。2 、利用分子生物学和基因工程技术制备微藻 19781996年，美国能源部从微藻中开发可再生燃油的科技项目中投资2500多万美元。美国能源部的研究项目已经确切证实了硅藻具有极高的生长能力，确定了微藻在单位面积及单位时间上比陆生作物能提供更多的能量。更重要的是，微藻生产不必占用粮食生产土地。美国的研究首先从收集微藻样本开始，通过筛选、表征，再进行统计分析，得出制约微藻产量和产油量的关键因素，并探明了微藻细胞的生理和生化特征，最终采用分子生物学和基因工程技术，改变微藻细胞的生理结构，制备出高产量、高含油量的工程微藻，并实现了工业放大。 除了美国能源部的相关研究之外，美国圣地亚哥国家实验室在美国LiveFuels公司资助下，已经进行了将近7年的研究，其研究内容也是关于利用分子生物学反应工程技术，来增加微藻细胞的含油量和产量，其目标是到2010年可得到经济可行的生物柴油。目前，他们已经积累了丰富经验，制得的海藻油与大豆油类似，完全可以用来生产生物燃料。经研究发现，海藻可以在不适合种植庄稼的土地上种植，甚至可以生长在咸水里。他们通过对一种特种海藻的研究表明，仅需美国土地的0.3就可生产出满足全美国需要的运输用燃料，且与商用海藻如螺旋藻相比，该工程微藻油脂含量要丰富得多。三、本课题研究内容本论文的主要内容是在筛选得到小球藻的纯培养物的基础上，对小球藻进行一定量的扩大化培养，再经过离心干燥等步骤获取小球藻干粉。对采用有机溶剂法提取小球藻干粉的中性总脂，并对利用各种不同溶剂萃取和，利用超声波因素进行单因子试验，等方法对油脂进行提取富集，验证从而得到得油率最高最好的小球藻中性总脂的提取和富集油脂的方法。具体内容如下：1、纯种小球藻培养物的获得和对筛选出的小球藻进行大量的繁殖培养；具体操作为：1) 小球藻菌种的分离和纯化。固体培养基的配制：小球藻常用的培养基为BG11培养基，1 L培养基中需加入的成分种类和数量及保存液如下： BG11 ( Blue-Green Medium) 成分 数量 保存液 (1) NaNO3 100 mL/L 15.0 g/L dH2O (2) K2HPO4 10 mL/L 2 g/500 mL dH2O (3) MgSO47H2O 10 mL/L 3.75 g/500 mLdH2O (4 ) CaCl22H2O 10 mL/L 1.8 g/500 mL dH2O (5 ) 柠檬酸 10 mL/L 0.3 g/500 mL dH2O (6 ) 柠檬酸铁铵 10 mL/L 0.3g/500ml dH2O (7 ) EDTANa2 10 mL/L 0.05g/500ml dH2O (8) Na2CO3 10 mL/L 1.0g/500ml dH2O (9) A5 （Trace mental solution,微量元素） 1ml/L H3BO3 2.86g/L dH2O MnCl24H2O 1.86g/L dH2O ZnSO47H2O 0.22g/L dH2O Na2MoO4.2H2O 0.39g/L dH2O CuSO4. 5 H2O 0.08g/L dH2O Co(NO3)2.6 H2O 0.05g/L dH2O 利用1M NaOH or HCl调节pH至7.1，琼脂粉的加入量为培养基的1.5 %。具体步骤： 1、培养基保存液的配制，按照前面列出的BG11的培养基保存液的浓度配制各种保存液。2、 每个250 ml的三角烧瓶，按照上面培养基的配方，配制100 ml BG11的固体培养基（调pH至7.1）。3、 用锡纸包扎瓶口，放入高压灭菌锅中在121 处理20 min。4、 取出培养基，倒入两个9 cm平皿中（每个皿倒入20-30 ml的培养基，步骤4和5均需在在超净工作台上操作），待其冷却并适当的干燥。5、 接种环蘸取藻液接种物（接种物的制备：取培养l0天左右的对数生长末期的新鲜藻液，经5000rpm离心15min，后弃去上清，用培养液洗涤一次，再以培养液悬浮用于接种(实验操作在无菌条件下进行)，密密划线。6、 倒置于28 光照培养箱中进行培养。2) 小球藻扩大化培养1、在1000 ml 的烧杯，按前一个实验中的BG11的配方，配制500 mlBG11液体培养基，调pH至7.1。每个500 ml瓶中装入200 ml BG11的液体培养基，150 ml的三角瓶装入50 ml。2、 用锡纸包扎瓶口，放入高压灭菌锅中在121 处理20 min。3、 用灭菌的牙签挑取生长较好的单株的小球藻放入装有l mL ddH20并灭菌过的Eppendorf管中，混合物用枪头吹打均匀。4、 将吹打均匀的球藻移入装有50ml BG11液体培养基中，25 光照振荡培养（230 r/min）过夜。 5、 各取25 ml培养后的藻液加入到装有200 ml BG11液体培养基进行培养。6、 正常的培养条件：25 ，230 rmin，24 h全光照（强度为3500 lux）振荡培养。2、培养得到的小球藻细胞的收获和干燥；3、小球藻干粉中的总油脂的提取（有机溶剂法）；4、利用超声波等方法对其进行作用，。4、 本课题研究方案本实验设计基于当前能源短缺的国际形势，拟通过大量培养已经纯化过的目前正在应用于生产生物柴油的普通小球藻藻株，并对小球藻油脂进行提取与富集。但这些藻株的产油率情况还不是很清楚，所以将其进行收集以得到适应的小球藻干粉，采用几种不同的有机溶剂提取等方法，并利用超声波进行处理，提取不同藻株中的总油脂，计算不同溶剂萃取条件下的产油率。最后对这些数据进行综合分析，从而可以验证几种溶剂中效率最高的有机溶剂。5、 研究目标、主要特色及工作进度： 研究目标：通过不同的溶剂萃取，加上超声波的作用验证哪个提油效果好。 主要特色：1、 对环境无污染 微藻能够有效地利用太阳能，通过光合作用固定二氧化碳，将无机物转化为氢、高不饱和烷烃、油脂等能源物质；而且微藻生物能源可以再生，燃烧后不排放有毒有害物质，对大气二氧化碳没有净增加。 2、 微藻的来源丰富 微藻的种质资源丰富，不会因收获而破坏生态系统，可大量培养而不占用耕地；另外，它的光合作用效率高，生长周期短，倍增时间约3-5天，有的藻种甚至一天可以收获两季，单位面积年产量是粮食的几十倍乃至上百倍。而且微藻脂类含量在，这是陆地植物远远达不到的，可用于生产生物柴油或乙醇，还可望成为生产氢气的一条新途径。 3、 微藻的产油率高 微藻的产油效率相当高，在一年的生长期内，一公顷玉米能产升生物质燃油，一公顷大豆能产升，一公顷油菜籽能产升，一公顷棕榈树能产升，而一公顷的微藻能产生物质燃油升。 据专家介绍，微藻的个体小，木素含量很低，易被粉碎和干燥，用微藻来生产液体燃料所需的处理和加工条件相对较低，生产成本低。而且微藻热解所得生物质燃油热值高，平均高达33MJ/kg，是木材或农作物秸秆的1.6倍。 工作进度第一、二周主要工作：查阅有关的相关文献，了解本毕业设计项目的目的意义及可能用到的实验技术手段，在老师的指导下初步确定试验方案。：第三、四周）学生主要工作：开始进入实验室，了解实验室的一些规章制度，初步掌握各项实验技术手段，熟悉各种可能的实验操作过程，准备实验材料和试剂。第五、六周）学生主要工作：对小球藻进行大量的培养。 第七、八周）学生主要工作：经过离心和干燥收集小球藻干粉。第九、十周、）学生主要工作：利用几种不同的有机溶剂和超声波对小球藻的油脂进行提取。、第十一周至毕业论文工作结束、学生主要工作：收集数据，结合文献，撰写论文。、 6、 参考文献： 【1】张根旺生物柴油的生产及发展前景粮油食品科技。【2】任庆功，阎杰，丘泰球，等超声作用下碱催化大豆油酯交换反应制备生物柴油化学与. 生物工程。【3】董月生物柴油现状与发展.化学工程与装备，【4】韩笑天，郑立。孙珊，等海洋微藻生产生物柴油的应用前景海洋科学，【5】缪晓玲，吴庆余微藻油脂制备生物柴油的研究太阳能学报。【6】刘斌，陈大明，游文娟，等微藻生物柴油研发态不同氮源形态和植物激素对小球藻USTB01生长及叶黄素含量的效应 王素琴，闫海，张宾亿，吕乐，林海 科技导报 2005,23(12) 【7】小球藻(Chlorella vulgaris)产油脂最佳培养条件的筛选 梁咏恩，彭少泓，谢旋，王莹 河南师范大学学报（自然科学版）2010,38(6)【8】小球藻培养条件的优化 季祥，张智慧，张雪艳，蔡禄 安徽农业科学 2009,37(34)【9】从小球藻中提取和富集多不饱和脂肪酸的研究 陈炜，王保刚，李晓东，白永安，张敏 大连海洋大学学报 2 0 1 0年6月第25卷第3期 【10】小球藻提取物的生物活性研究 刘海琴，韩士群 海洋科学 2005,29(9