（细胞生物学专业论文）ankrd17在细胞周期调控中的功能研究.pdf

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c y c l i n a i 融合蛋白的表达纯化，以待通过体内、体外结 合实验和体外激酶反应证实其是否为c y c i i n a c d k 2 的功能性底物。同时，筛选 a n k r d l 7 基因有效的r n a i 逆转录病毒载体，以待构龟k n k r d l 7 蛋白缺失的h c t l l 6 的稳定细胞株，并观察a n k r d1 7 在细胞周期中的功能。 关键词：a n k r d l 7 ；c d k 2 ；c y c l i n e ；c y c l i n a ；c e l lc y c l e 分类号：q 2 9 1 i i j 泰师范丈学摩学位论文 a b s t r a c t c e l lc y c l ep r o g r e s s i o ni s 删p a l l yg o v e r n e db yc y c l i n - d e p e n d c mk h a s tt h a tb i n d s w i t hc e l lc y c l e - s p e c i f i cr e g u l a t o r ys u b u r d t sk n o w na sc y c l i n s as p e c i f i cp h a s eo f t h e c e l lc y c l ei su n d e rt h ec o n t r o lo fa s p e c i f i cc l a s so fc y c l i n c d kc o m p l e x p r e v i o u s s t u d i e sh a v ef o u n dt h a ts o m ep r o t e i n si n t e r a c t i n gw i t hc y c l i n c d k 2c o m p l e xp l a ya c r i t i c a lr o l ei nc e l lc y c l ep r o g r e s s i o n w h t h em e c h a n i s m st h a tc y c l i n c d k 2 c o r o p l c xr e g u l a t e sc e l lc y c l ep r o g r e s s i o na 地n o tf u l l y 蚰d 口g c o o dp 8 r t l yb e c a u s ef e w s u b s t i - a t e so f t h sc o m p l e xh a v eb ei d e n t i f i e d m y l a b h a d i s o l a l e d a p r a t d n a n k r d l 7 t h a t i n t e r a c t s w 池c d k 2 b y t a n d e m a f f u f i t y p u r i f i c a t i o n ( t a p ) s o r o er e s u l t sh a v es u g g e s t e dt h a ta n k r d l 7i sas u b s t r a t eo f c y c l i n e c d k 2i nh u m a nc e l l s t h i ss t u d yw a et h e r e f o r ed e s i g n e dt oo b s e r v et h e e f f e c t so ft h ep r o t e i na n k r d l 7o nc e l lc y c l ep r o g r e s s i o n f i r s t , t 口e x a m i n et h e e x p r e s s i o no fa n k r d l 7m r n a i ns e v e nk i n d so fh u m a nd i f f e r e n tf i s s sa n dt h e m r n a i m o f a n k r d l 7 t h r o u g h o u t t h ec y c l e i n u l l t u o i l r c e l l h c t l l 6a n d n o r m a l c e l l 2 b sb yr t - p c r t h er e s u l t ss u g g e s ta n k r d l 7i sc o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o ni nd i f f e r e n t k i n d so fh m n a nt i s 鲫e sa n da p p e a r st ob ee x p r e s s e di na l lp h a s eo ft h ec e l lc y c l ei n 2 b sa n dh c t l l 6c e l l t h es e c o n d , t oc o n $ = t r t l c tc u k a r y o t i ce x p r e s s i n gv e c t o ro f h u m a na n k r d l 7a n dt h e nt e s ti t se x p r e s s i o ni nh u m a nc o l o r e c t a lc a n c e rc e l ll i n e h c t l l 6 t oa n a l y z et h ef l m b 五o no f a n k r d l 7w h e ni ti n t e r a c t sw i t hc y c l i n f j c d k 2 c o m p l e xo nc e l lc y c l ep r o g r e s s i o ni nh c t i 1 6b ys e l e c t i o no fe g f pp o s i t i v ec e i l s w h i c hw o r ec o t x a n s f e c t e dw i t hp b b l 4a n dp d e s t - f l a g - a n k r d l 7v c c t o i s t h er e s u l t s s u g g e s to v e r e x p r c s s i o na n k r d l 7i n c r e a s et h es - p h a s ep o p u l a t i o n , t h ep r o t e i nm a y p l a yar o l e a tt h eg i sb o u n d a tt h es a m et i m e ，t oc o n s l m c mp r o k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o ro fc y c l i n a l ，e x p o s e da n dp u r i f i e d t h ef u s i o n p r o t e i n g s t - c y c l i n a i f o ri n v e 蚯g 曲gf h b 目w h e t h e ra n k r d l 7i sa s s o c i a t e dw i t h c y d i n m c d k 2 i nv i v oo rw h 。l ：h e fi ti sa l s oas u b s t r a t eo f t h i sk 3 n a s * c o m p l e x t h e 姒t of i n d 醴阿v er e c o m b i n a n tr c 自- o v l r u sv d 2 t o r se x p r e s s i n gs r n af o ra n k r d l 7 g e n ek n o c k d o w na n d t h e nt oe s t a b l i s ha n k r d l 7 m d i d e ms t a b l ec e l ll i n ef o ra n a l y m g 2 山东师范大学硕士掌位论文 t h ee f f e c to f a n k r d l 7 g e n ei nc e l lc y c l ep r o g r e s s i o n k e yw o r d s ：a n k r d l 7 ；c d k 2 ；c y c i i n e ；c y c l i n a ；c d lc y c l e c a t e g o r yn u m b e r ：q 2 9 1 3 山东师范大学硬士掌位论文 文献综述 细胞周期是生命活动中的一个重要过程，对它的研究己成为现代生命科学 研究的一个重要内容。细胞周期过程的推进依赖于各级调控因子对细胞周期精 确而严密的调控，而这些调控因子的核心是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 ( c y c l i n - d e p e n d e n t k j 2 1 e ，c d k ) 及其正、负性调控因子一细胞周期蛋白( c y c l i a ) 和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子( c d i ) 。细胞周期调控异常，将导致细 胞进入病理状态，如细胞转化、癌变等。因此，阐明这些调控因子在其所组成 的级联调控网络中的作用与地位。是认识细胞分裂、增殖、分化与癌变等生命 现象的基础。更重要的是，细胞信号转导过程及其调控机制的研究对于揭示人 类重大疾病的分子机制，改进抗癌药物的设计和治疗以及制定基因治疗法的新 战略有着重要的意义。 1 1 细胞周期 细胞周期是指细胞从上一次有丝分裂结束至下一次有丝分裂结束的全过程， 依次分为d n a 及蛋白质合成作准备的g l 期、d n a 合成期s 期、为有丝分裂 作准备的( 3 2 期、有丝分裂期m 期4 个时相及g 1 ，s 与g 2 m 两个时相过渡期 细胞在经过m 期后可进入静止态g o 期，后可在丝裂原的刺激下于g l 早期进 入细胞周期。在g i $ 与g 2 m 过渡期存在着两个限制点( c h e e l q ，o i n t ) ，分别 决定细胞是否进入s 期和m 期。目前己发现许多蛋白参与细胞周期的调控，其 中细胞周期蛋白( c y c l i n ) 和细胞周期蛋白依赖性激酶( c d k ) 在此过程中发 挥着极其关键的作用 4 山东师范丈学颈士学位论文 圈1 ：细胞周期 1 2 参与细胞周期进程的主要组分 现已发现的与细胞周期调控有关的分子很多，主要有3 大类：细胞周期蛋 白( c y e l i n ) 、细胞周期蛋白依赖性激酶( c y e l i n - d e p e n d e n t k i n a s e 。c d k ) 、细胞 周期蛋白依赖性激酶抑制因子( c y c l i n - d e p r n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r , c k i ) 1 2 1 细胞周期蛋白c y c iin s 1 9 8 3 年 f t m o t h yh u n t 首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质 的含量随细胞周期副烈变化，在每一轮间期开始合成，g 2 m 期达到高峰，m 期结束后突然消失，下轮间期又重新合成，故命名为周期蛋白( c y c h n ) 。现已发 现的哺乳动物周期蛋白有9 大类，主要有c y c l i n a 、b ( 1 、2 ) 、c 、d ( 1 、2 、3 ) 和e 等，不同周期蛋白分子在结构上存在一定差异，但都有一个高度保守的细 胞周期蛋白盒( c y c l i n b o x ) 序列和降解盒( d e s t r u c t i o n b o x ) 结构，前者结合c d k ， 后者参与自身降解。各种周期蛋白的含量在细胞周期中里周期性变化，能与在 整个细胞周期中表达相对恒定、相应的c d k 结合，通过形成复合物并激活其活 性，对细胞内特定底物进行磷酸化，发挥生物学功能。随后通过泛素依赖性的 蛋白酶水解途径降解失活。其中在g l 期和g 1 s 交界处发挥作用的有 c y c l i n d 、e 等；c y c l l n a 、b 与g 2 m 转换和细胞分裂括动有关 c y c l i n d ：cy e l i n d 既是细胞周期运行的起始因子，又是生长因子的感受器。 c y c l i n d 分为c y c l i n d l 、c y e l i n d 2 、c y e l i n d 33 个亚型，其中c y c l i n d l 研究的 最多。通常，处于g o 期的细胞在生长因子的作用下。通过蛋白r a s 、有丝分裂 原激活蛋白激酶( m i t o g c na c t i 、，砷e dp r o t e i nk i n a s e ，m a p k ) 等信号传导途径使 c y c l i n d 在g 1 早期表达增加，c y c t i n d 与细胞中存在的c d k 4 和c d k 6 结合， 通过c y c l i n d - c d k 4 c d k 6 通路调控细胞越过g l 期限制点( c h c c ：b 确口刁。 m o t o k u m 等p 】发现，c y c l i n d 在正常细胞调控和癌变过程中均发挥重要作用，其 过表达可激活c d k 4 和c d k 6 的活性，缩短g 1 期，一定程度上降低细胞增殖 对有丝分裂原的依赖，造成细胞周期调节性失控和细胞异常增殖，导致肿瘤的 山东师范大学硕士学位论文 发生。 c y c l i n e ：c y c l i n e 基因定位于1 9 q 1 2 q 1 3 ，有4 个外显子，编码3 9 5 个氨基 酸的核蛋白，相对分子质量5 0 k d a 半衰期仅3 0 分钟，有一个8 7 个氪基酸组 成的c y c l i nb o x 与c d k 结合，c 端较长，有富含脯氢酸、谷氨酸、天冬酰胺、 苏氨酸残基的区域，与蛋白的更新降解有关c y c l i n e 表达始于g l 中期，峰值 位于g 1 s 交界处，c y c l i n e 的合成受e 2 f 和c - m y c 共同激活，当c y c l i n d 与 c d k 4 c d k 6 结合后，使r b 蛋白磷酸化，释放转录因子e 2 f ，诱导c y c l i n e 和c d k 2 的表达，并形成对r b 蛋白磷酸化的反馈回路，使r b 进一步磷酸化， 细胞越过g l s 期转折点。当细胞进入s 期，c y c l i n e 水平急剧下降，c d k 2 转而与c y c l l n a 结合，在下一个时相发挥生物学功能。c y c l i n e 的异常表达与一 些肿瘤发生和预后有关，在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、食道癌，胃癌、 膀胱癌、星形细胞瘤1 4 l 、胶质瘤嘞及自血病等多种肿瘤中都有过表达，且与肿瘤 细胞侵袭能力强、易转移、恶性度高等特性密切相关g , - 9 。许多实验表明c y c u n e 的过表达或基因扩增在多种肿瘤中存在，并不受细施周期调节而持续存在。因 此，其在肿瘤中的癌基因角色越来越被学者们认同，在临床上已逐渐被作为一 种病理诊断和预后的独立或联合指标之一。 最近研究发现，c y c l i n e 除了作为c d k 的激活荆外，在哺乳动物的细胞g - o s 期的部分功能是c d k 非依赖性的。实验以c y c l i 止n u l l 细胞为实验材料， 在该细胞中c d t i 经常附着在染色质上，阻止m c m 重复解旋酶 ( r e p l i c a t i v eh e u c a s e ) 整合入d n a 复制前复合物中，使细胞不能启动d n a 合 成。而在存在c y e l i n e 但丧失c y c l i n c d k 2 复合物激酶活性的细胞中，c y c l i n e 突变体会部分恢复m c m 在g 0 - s 期在染色体上的附着并推动细胞周期向s 期的 转变。进而推测c y d i n e 能通过与c d t l 和m c m 生理学上的相互作用，以非 激酶依救的方式进行细胞周期的调控 l o - 1 4 6 山豪师蓖大学硕士学位论文 图2 ：c y c l i ne 在c - 0 s 周期转换中的作用 c y c l i n a ：c y c l i n a 属s 期和m 期的周期蛋白，它的高表达与其他周期蛋白 一样，与细胞增殖失控和肿瘤发生有关。c y c l i n a 基因家族有c y c l i n a l 和 c y c l i n a 2 ，两者在序列上有4 8 的同源性。c y c l i a a 2 基因首先由w a n g 等”8 在 原发性肝癌细胞中与乙肝病毒( h b v ) d n a 整合的部位上检测到，相对分子质量 为4 8 5 k d a 。c y c l i n a 2 在g 1 晚期出现可分别与c d k 2 和c d k i 结合，实验 表明c y c l i n a 2 在s 期能促进d n a 合成，促进细胞越过g 2 m 期转折点，进 入m 期。在许多组织中，c y c l i n a l 和c y c l i n a 2 基因表达并不同步，说明两者 的功能不能相互替代。目前还未能将c y c l i n a 确定为原癌基因，但许多研究表 明，肿瘤组织中c y c l i n a 表达显著高于非肿瘤组织。 其他c y c l i n s ：c y c l i n b 在晚s 期和g 2 期合成，与c d k l 结合在g 2 s 期 促进细胞进入m 期，失活于分裂中、晚期，是m 期的周期蛋白。有关c y c l i n c 的研究较少，目前尚不知与之结合的c d k 和作用于细胞周期的哪个时相。 山东师穗大学硕士擘位论文 1 2 2 周期蛋白依赖性的蛋白激酶c o k s 细胞周期蛋白依赖性激酶( c d k ) 是一类重要的丝氨酸，酪氨酸蛋白激酶家 族，其与c y c l i n 形成复合物发挥其激酶活性，其本身为催化亚基，c y c l i n 为调节 亚基，对细胞周期的启动及各时相的转换进行关键性调控目前发现的周期蛋 白依赖性的蛋白激酶( c y c l i n - d e p e n d e mk i m s e ，c d k ) ，在动物中有7 种，即 c d k i 一7 ，它们之间非常保守，具有4 5 0 5 的同源性i l q 。c d k 2 5 参与( 3 1 向s 期转换，其中只有c d k 3 不与任何c y c l i n 结合，c d k 5 可以与没有c y c l i n 结构的一种c d k 调节亚基p 3 5 结合而被激活。 本文讨论的重点是周期蛋白依赖性蛋自激酶c d k 2 。c d k 2 可分别与 c 和l i n e 、c y c u n a 和o y c l i n d 结合，分别在g i s 期、s 期和g 2 期一直发挥作 用。c d k 2 是启动d n a 复制的关键性激酶，也是g 2 期运行的必要条件。 c y c l i a e c d k 2 结合成复合物是在细胞周期的g 1 期后期，是决定细胞是否能 从g l 期向s 期转换的关键步骤，在此过程中，视网膜母细胞瘤蛋白( r b ) 发 挥着重要的作用，其为c y c i 戳d k 2 的底物，也为g i $ 时相转变的调节因 子r b 有低磷酸化和磷酸化两种状态t g f - j 3l 可使r b 由磷酸化变成低磷 酸化状态( 生长抑制形式) ，在此状态r b 与转录因子e 2 f 结合。阻止g i s 转 换及d n a 合成。当c d k 2 对r b 过度磷酸化将导致细胞周期失控，引起细胞 恶性增殖，导致肿瘤的发生。c y c l i n e q 2 d k 2 复合物还可通过招募中心体蛋白 来调控线虫受精卵发育的极性。其中c y c l i n e 负责调控线虫细胞的不对称分裂 及终极分化命运由此推测可能存在一种新的分化机制，即c y c l i n e - c d k 2 复 合物通过中心体调节秀丽小杆线虫的皮层分化极性【l 嘲。 c d k 2 不仅与细胞周期的调控机制有关，而且与细胞死亡的调控机制有关 c d k 2 能在体内和体外特异性的磷酸化f o x o i ( f o ) ( 0 1 是调控细胞存活的关 键性的转录调控因子) ，磷酸化的f o x 0 1 能使d n a 损伤的细胞停留在由c h k l 和c h k 2 蛋白激酶调控的细胞周期检验位点，使受损的细胞无法进入正常的细 胞周期，这表明c d k 2 和f o x o i 之间的相互作用能够引发d n a 损伤引起的细 脆程序性死亡嗍 尽管如此，近年来研究对c y c l i n e 和c d k 2 在细胞周期中的关键性地位提 山东师范丈学硕士掌位论文 出了质疑。研究表明缺失c d k 2 蛋白及其檄酶活性并不能削弱肿瘤细胞周期的 进程p o - “l ，相反缺失c y c l i n e l 或c y c l i n e 2 的小鼠发育正常，但缺失 c y c l i n e l c y d i n 巳2 的小鼠由于胎盘缺陷无法存活p ”。与此同时，目前已经发现 一些分子与c y c i i n e c d k 2 激酶复合体相互作用而调节细胞周期的过程，如 p r b 2 p 1 3 0 f “ 4 4 l ，p 3 0 0 4 1 - 4 3 1 、p 2 2 0 n p a t l 4 “ 等，但与c y c l i n c d k 2 及 c y c f i n s c d k l 调控细胞周期相关的详尽的信号传递网络尚未明晰。因此研究 c d k 2 及与其相互作用的底物蛋白对揭示细胞周期调控的信号传导机制及揭示 细胞死亡奥秘都有着极其重要的意义。 1 2 3 周期蛋白依赖性激酶抑制因子c k i 细胞中还具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子( c d k i n h i b i t o r ，c k i ) 对 细胞周期起负调控作用。目前发现的c l c l 分为两大家族： 。 1 ) i n k 4 0 n b i b i t o ro f c n c4 ) ，如p 1 6 i n k 4 a 、p 1 5 i n k 4 b 、p 1 8 i n k 4 c 、p l g i n k 4 d ，特异 性抑制c d k 4 c y c r nd l 、c d k 6 c y e l i nd 1 复合物。 2 ) k i p ( k i n a s ei n h i b i t i o np r o t e i n ) ：包括p 2 l c i p l ( c y d i ni n h i b i t i o np r o t e i n1 ) 、 p 2 7 k i p l ( k i n i n h i b i t i o np r o t e i n1 ) 、p f 7 k i p 2 等，能抑制大多数c d k 的激酶活 性，i p 2 i c i p l 还能与d n a 聚合酶6 的辅助因子p c n a ( p r o l i f e r a t i n gc d ln u c l e a r a n t i g e n ) 结合，直接抑制d n a 的合成( 图3 ) 。 图3 ：p 2 1 c i p l 抑制c d i ( 和p c n 9 山东师范大学硕士学位论文 1 3 细胞周期调节的分子机制 真核生物的细胞周期进程是由一系列调控因子有序的聚合和激活来调节控 制的。细胞周期调控以检测点( c h e c k p o i n 田为其结构基础，通过正负调控因子作 用，保持动态平衡，来保证细胞周期的正常进行。细胞周期中存在多个检测点， 如g 1 s 、0 2 m 、m 中期艇后期等。目前研究较多的是g i i s 和g 2 m 检测点。 0 ) g ：s 检测点调控 c y c l i n d 、c y o l i n e 、c y c l i n a 依次在g 1 早期、g 1 中晚期和s 期表达，与 c d k 4 或c d k 6 形成复合物，c y c l i n e 、c y c l i n a 也可与c d k 2 形成复合物。c d k 4 第1 7 2 位苏氮酸残基及c d k 2 第1 5 位酪氨酸和第1 6 0 位苏氨酸残基磷酸化而使 复合物具有活性后，使r b 蛋白磷酸化失活，释放与之结合的转录因子e 2 f 等， 诱导d n a 复制相关基因转录，推动细胞通过g i s 检测点。另外， c y d i n e a c d k 2 在g l 后期的表达可促进细胞通过g l 期限制点而进入s 期， 而$ c f 介导的c y c l i n e 泛索化降解则使细胞停留在g l 期1 4 9 。c y o i i n a 肥- c d k l 的表达可促进细胞通过限制点而实现从g 2 期向m 期的转换，c y d i n a b - c d k l 表达下降后激活a p c 介导的s k # 泛素化降解可让细胞停留在g i s 期l s o 一目。 g i s 检测点的c k i 主要是i n k 4 家族，尤以p 1 6 i n k 4 a 最重要。它在g 1 期的 中期和晚期特异性的与c d k 4 或c d k 6 结合，阻断其与c y o l i n d 的结合，减少 r b 的磷酸化，细胞发生g 1 $ 阻滞，其作用依赖于功能性r b 蛋白的存在。 p 1 5 i n k 4 b 作用与p 1 6 i n k 4 a 相似，但可被转化生长因b1 ( t r a n s f o r m i n gg r o w t h f a c t o r , t g f - b 1 ) 诱导 5 2 “。所以，p 1 6 p 1 5 ，c d k 4 c y c l i n d 或c d k 6 c y c l i n d 、 r b 构成了g 1 s 检测点的调控途径之一i n k 4 家族的另两个成员p l g l n k 4 c 和 p 1 9 i n k 4 d 也可抑制c d k 4 c y c l i n d 或c d k 6 c y o l i n d ，诱发g 1 ，s 阻滞，但可 能是通过其他途径进行。另外，p 1 9 可与m d m 2 结合并使之降解，废除m d m 2 对p 5 3 的抑制。c 髓的p 2 i c i p w a f i 家族中，p 2 1 转录表达可被p 5 3 诱导，从 而抑制c d k 4 c y c l i n d ，参与g i s 检测点的负调控。故p 1 9 、m d m 2 、p 5 3 、p 2 1 、 c d k 4 1 c y c l i u d 和r b 组成了另个调控途径。p 2 7 k i p 2 抑制c d k 4 1 c y c l i n d 、 c d k 2 c y c l i n e 和c d k 2 c y c l i n a 的作用，可被t g f - b1 和细胞接触诱导，但其 具体作用途径不清楚。 山东坪箍大学硬士学位论文 当d n a 损伤时，细胞周期也会停滞，a t r 蛋白激活，进而澈活c h k l ， c h k l 抑制c d c 2 5 磷酸酶的活性，从而降低c y c l i n a b - c d k i 的活性，使细胞 停留在g 2 期；当m 期染色体分离而发生损伤时，a t m ，c h k 2 ，p 5 3 ，p 2 1 c i p l 依次激活，从而抑制c y c l i n a f - c d k 2 的活性，使细胞不能进入s 期s 町。 c ) g 2 ，】m 检测点调控 其核心是c d c 2 ( c d k i ) 基因，编码分子量为3 4k d a 的蛋白( p 3 4 c d c 2 ) ，激 活后磷酸化在m 期起关键作用的底物蛋白，如组蛋白h 、核内片层、中间丝等， 使细胞进入m 期。对p 3 4c d c 2 的调控网络组成了g 2 m 检测点。c y c l i n b l 在 g 2 m 转变点与c d c 2 形成c d c 2 c y e l i n b l ，即所谓的有丝分裂促进因子( m p f ) 。 酵母菌中存在p 3 4 c d c 2 的正性和负性调控。前者由c d c 2 5 基因产物在g 2 m 转变点使p 3 4 c d c 2 去磷酸化而激活，后者包括w e e l 和m i k l 基因产物。使 p 3 4 c d c 2 磷酸化失活。人类细胞申c d c 2 c y c l i n b l 则由c a k ( c d c 2 一a 击v a t i n g k i n a s e , c d c 2 活化激酶) 磷酸化激活。c a k 由c d k 7 ( 酵母菌中为m 0 1 5 ) 和c y c l i n h 组成p 2 1 c i p i w a f i 可能抑制c d c 2 c y c l i nb i 但其他g2 m 检测点负调 控途径研究尚少。 1 4 细胞周期调节因素与肿瘤发生 当细胞发生转化时，丧失某些细胞周期的控制点，特别是g 1 s 和g 2 m 交 界的控制点在细胞中缺失，使细胞生长和分裂对外界信号不敏感；或丧失对 d n a 损伤的反应性，使未经修复的d n a 复制，以致细胞突变积累，造成基因 不稳定和染色体异常，最终出现肿瘤表型；或使破坏的d n a 进入有丝分裂等 这些变化是细胞周期正性调节因素的异常表达或负性调节因素丧失的结果。现 已证实，在肿瘤细胞中这两类变化都存在。 1 。4 1c y o ii n - - c d k s 在肿瘤中的突变 研究显示，c y c l i n d l 和c d k 4 的基因扩增和过度表达是较常见的致癌性变化 b “而且与肿瘤的进展有关。早期研究，已观察到染色体1 1 中的倒位 ( i n v e r s i o n ) 使甲状旁腺激素( p t h ) 基因的5 。端调节性序列从l i p l 5 移至l l q l 3 ， 使c y c l i n d l c c n d l 基因位于p t h 基因启动子的控制之下，引起甲状旁腺增生 山东师范大学硕士学位论文 性病变陋以。此外，也发现c y e l i n d l 在部分乳癌、胃癌、食管癌、非小细胞肺 癌及喉鳞癌中呈过度表达，且与临床预后不良相关虽然曾在几株肿瘤细胞中 发现c d k 4 和c d k 6 的过度表达，但尚未见报道过人类肿瘤中c d k 4 基因的突 变。在大部分肿瘤中，c y c t i a e 的水平也呈现增高趋势，但并无证据表明c y c l i n e 本身是一种前癌基因。c y e l i a a 也参与致癌过程，在个由乙型肝炎病毒( i - i b v ) 诱发的肝癌细胞克隆中，发现b l b v 前s 蛋白质的插入部位在c r e l i a a 基因，并 产生一种嵌合性蛋白质，它不能在有丝分裂期以正常方式降解，从而可参与细 胞的转化。仅少数研究报道c y c t i n b l 和e 在白血病和实体瘤细胞株中呈不规则 表达。另外，肿瘤缨胞也可存在g 2 m 控制点缺陷，使被损伤或未完全复制的 d n a 来启动有丝分裂，这可能是致癌机制的关键变化，已经引起了广泛的关注。 1 4 2c k f 作为肿瘤抑制基因的突变失活 几种c k i 在细胞周期调节中的作用，以及在人类肿瘤中突变失活的事实， 提示它们可能为肿瘤抑制基因。其中第一个被确定的是p 2 i w a f l 基因，但p 2 1 基因鲍突变率非常低m 1 删，其主要的灭活机制可能是在表达水平上，其转录直 接由p 5 3 激活，而p 5 3 的突变在人类癌症中却很常见p 2 7 蛋白质的缺失对细 胞增殖的失调和对乳腺、前列腺、结肠、肺胃及食管等腺癌有着独立的预后 价值。 另一组c d i s 的成员p 1 6 和p 1 5 均位于9 号染色体的短臂上( 9 p 2 1 ) ，在许 多人类肿瘤细胞株中该区带均有同合性缺失和同杂合性缺失。在7 5 的肿瘤细 胞系中有p 1 6 基因纯合性缺失或突变，p 1 6 基因与细胞癌变关系异常密切， 在肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌中都有较高频率的p 1 6 基因的表达异常。p 1 6 突变在还在食管鳞癌嗍、胰腺癌【圃、胶质母细胞瘤、黑色素瘤嘲及间变性星型 细胞瘤中发现，故p 1 6 曾被命名为i v i t s l 基因【嘲( 意为多种肿瘤抑制基因) p 1 5 基因( m t s 2 ) 位于染色体9 p 2 1 紧靠p 1 6 附近，p 1 5 是t o f - b 介导的细胞 周期阻断的效应因子。在多型性胶质毒细胞瘤、非小细胞肺癌及膀胱癌中发 现p 1 5 和p i 6 的同合性缺失f 删，而含有同合性缺失的克隆都呈现出细胞异常增 生和选择性生长优势。 山东师范丈学硕士学位论文 1 5 细胞周期调节因素与癌症治疗 细胞周期调控的理论与肿瘤发生发展的关系是一个十分重要的研究领域。 研究表明，细胞的增殖、分化、衰老和凋亡均是细胞周期依赖性的。抑制肿瘤 细胞c ，d i 的表达【7 ”，上调c y d s 表达，均可选择性地抑制肿瘤组织c d y u s 的 活性，阻止肿瘤细胞的异常增殖同时保护正常细胞。这是肿瘤治疗的新思路。 现在i 艋床试验已经开始使用c d k 分子抑制剂。另外，细胞周期机制和细胞周期 关卡的组成已经提供了丰富的新抗癌药靶的来源。诸多文献中指出，细胞周期 信号分子为潜在靶点，如周期素、周期素依赖性蛋白激酶( c 阱矗) 、癌基因 m d n l 2 、蛋白酶体、细胞周期关卡激酶c h k l 和c h 也，在决定细胞周期进程、 细胞生或死中发挥重要作用。m d m 2 的s i k n a 、粉防己碱和力达霉素均可诱导 多种癌细胞的细胞周期停止。 m d m 2 - - s i r n a m j ，可通过特定的i i l d m 2 下调来增加p 5 3 的表达，诱导细胞 周期停止和凋亡，抑制体内肿瘤生长。此外，m d m 2 - - s i r n a 还能协同增加d n a 损伤后的抗癌活性。因此认为，m o l t 0 2 - - s i r n a 完全可作为一个有前景的基因特 异药物用于人类癌症的治疗。 粉防己碱作为一种抗癌的生物碱，可通过3 种不同的机制诱导g 1 早期的 停止。首先，它抑制c d k 2 c y c l i n e 和c d k 4 ，而不显著影响c d k 2 c y c l i n a 、 c d k i c y c l i n b 和c d k 6 ：此外，它诱导c d k 4 、c d k 6 、c y c l i n d l 和e 2 f i 的蛋 白酶体依赖豹降解；它还可增加p 5 3 和p 2 l 在野生型p 5 3h c t i1 6 细胞中的表 达。这些结果都表明，粉防己碱可终止癌细胞在g 1 期的分裂，包括下调e 2 f i 和上调p 5 3 p 2 1 的表达。 力达霉素抗肿瘤抗生素，可诱导经由c h k l ，c h 蛀途径的g 2 期停止，并在 p 5 3 突变的癌细胞中可被m a p k 部分激活；在野生型p 5 3 乳腺癌细胞中，力达 霉素还可通过联合机制诱导细胞在g l 和g 2 期停止，包括p 5 3 、位1 的诱导、 c h k 2 的激活和c y c l t nb i c d c 2 的下调。 近年来各国对抗癌新药的研究高度重视，抗癌药物的研究水平明显提高，有 关细胞周期调节基因的分网络与致癌作用之间的因果关系，以及不断发现和鉴 定新的细胞周期调节因素，细胞凋亡和肿瘤进展之间的联系等，对于阐明癌症 山末师范大学硕士学位论文 的发病机制，改进抗癌药物的设计和治疗。调节偏离正常细胞周期轨道的肿瘤 细胞回到正常轨道上来，将是今后抗肿瘤治疗的新策略之一。 第一章r t p o r 检测a n k r d l7 基因在人不同组织和细胞的不同 时相中的表达 1 实验材料 大肠杆菌株t o p l 0 、2 9 3 t 细胞、2 b s 细胞、h c t l1 6 细胞由本室保存。人 的七神正常组织块( 肌肉、脾、脑、肾、肺、肝、心) 由微生物所刘文军研究 员惠赠。 2 实验试剂 2 1 试剂 焦碳酸二乙酯( d e p c )s i g m a 公司 青霉素s i g m a 分装，美国 链霉素上海新亚制药厂 d m e m 培养基h y c l o n e 公司，美国 胎牛血清h y c l o n e 公司，美国 胰酶hyclone公司，美国 r n a 提取试剂盒t r i z o li n v i t r o g c n 公司 逆转录酶n e b ，美国 d n a 寡核昔酸引物和核酸测序都由由上海英骏公司完成。其它常规试剂为国产 分析纯试剂。 2 2 实验用液 溶液配制： d e p c 水：用体积分数为0 1 的d e p c 于3 7 温育1 2 h ，井高压灭菌。 1 4 山东师蓓大学硕士学位论文 7 5 乙醇：d e p c 水配置体积分数为7 5 乙醇。 5 0 xt a e 电泳缓冲液：取t r i s2 4 2 9 ，冰醋酸5 7 m l ，0 2 5 m o l le d t a ( p h 8 肪2 8 i i l l ，加蒸馏水至1 0 0 m l 。 1 x p b s ：1 4 0 确n a c l ，2 7 埘i l fk c l i 0 墒n a 2 h p 0 4 ，1 8 删f j q 2 p 0 4 ( p h l3 ) 2 3 分析工具软件和网址 p c r 引物设计软件：0 1 i g op r i m e r 5 0 d n a 序列分析软件：c h r o m a s d n a 序列数据库；u c b i g e n e b a n k n u c l e q t i d e s 3 方法步骤 细胞的复苏； 1 ) 将水浴锅加热至3 7 1 2 ，并预热d m e m 培养基。 2 ) 从液氮罐中取出冻存管，迅速将冻存管投入到已经预热的3 7 c 水浴锅中迅速 解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 3 ) 约1 - 2 r a i n 后待冻存管内液体溶解，将冻存管放入离心机1 0 0 0 转，离心5 m i n ， 用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。 4 ) 将冻存管的上层液体弃掉，将培养基中加入冻存管中吹打混匀，再将所有的 培养基都转到培养皿。 5 ) 大约几小时后，细胞贴壁后，更换