（细胞生物学专业论文）amf基因在食管鳞癌细胞株中的表达及功能初步分析.pdf

霉，： 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者： 产天p 日期：知洳年r 月一日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者： 严易茂 日期：九伽年夕月易日 摘要 摘要 食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤的第六位。而我国 是食管癌的高发区，尤其以太行山周边的河北、河南及山西的部分地区为重。 尽管目前临床已采取了一系列的综合治疗手段，但患者平均5 年的生存率仍然 较低，分析其主要原因是食管癌的转移性。因此，如何降低食管癌转移的发生 率，对于改善食管鳞癌病人的临床治疗效果将会有很大帮助。 1 9 8 6 年，l i o t t a 等在黑色素瘤细胞株的细胞培养基中发现了一种能够刺激小 鼠3 1 3 成纤维细胞运动的蛋白质，命名为自分泌运动因子( a u t o c d n em o t i l i t yf a c t o r , a m f ) 。最近研究发现，a m f 与其受体结合后，能够刺激细胞运动。目前在口腔 鳞癌、胃癌、乳腺癌及肝癌中均发现了它的异常高表达，且其表达水平与肿瘤 的淋巴结转移、血管侵润及肿瘤分期等密切有关。但有关a m f 在食管鳞癌细胞 中侵润转移的研究尚未见报道。因此本研究的主要目的是构建a m f 基因的绿色 荧光蛋白载体及真核表达载体，分别转染食管鳞癌细胞株，对a m f 基因在食管 鳞癌细胞株中的表达进行定位，并对a m f 基因在食管鳞癌细胞株发生、发展中 的作用进行初步研究，为食管鳞癌细胞株的分子靶向治疗提供理论依据。实验 结果表明，在转染p e g f p c 1 - a m f 后，a m f 基因在胞质内有表达，表明a m f 基因定位于细胞质。此外，w e s t e r nb l o w i n g 检测发现与未转染组及p c d n a 3 1 ( + ) 空载体转染组相比，转染p c d n a 3 i ( + ) - a m f 后食管鳞癌细胞株p - c o f i l i n 蛋白的 表达明显升高，蛋白表达差异具有统计学意义( p 0 0 5 ) 说明a m f 基因的引 入能够明显促进肿瘤细胞的转移，提示a m f 基因有可能成为治疗食管鳞癌的一 个潜在的分子靶点。 方法 l 总r n a 的提取及鉴定 根据l n v i 灯o g c n 公司t r i z o l 试剂说明书从人食管鳞癌细胞株中提取总r n a ， 并鉴定r n a 的浓度、纯度和完整性。提取后用5 0 m 无r n a s e 的水溶解。 2a m f 基因的克隆及鉴定 根据g e n b a n k 上登录的a m f 的c d n a 全长序列分别设计引物。以提取的 总r n a 为模板，r t - p c r 根据t a k a r ar t - p c r 试剂盒说明书进行。将扩增出 摘 要 的p c r 产物分别连接到t 载体上，测序。测序结果与g e n b a n k 上的a m f 基因 序列进行比对分析。 3a m f 基因真核表达载体的构建及鉴定 测序鉴定正确的重组质粒用引物对应的酶切位点进行双酶切，回收正确的 片段。同样对真核表达载体p c d n a 3 1 ( + ) 及绿色荧光蛋白载体p e g f p c 1 进行相 应的酶切，回收载体片段。用t 4d n a 连接酶分别连接上述回收的片段，连接 产物转化感受态大肠杆菌d h 5 a 细胞，涂板，过夜培养，挑克隆，提质粒，双酶 切鉴定。 4 转染 食管鳞癌细胞株e c 9 7 0 6 、e c a l 0 9 和e c 1 接种于6 孔板中培养，按 l i p o f e c t a m i n e ，m 2 0 0 0 转染试剂说明书使用真核表达载体及p e g f p c i a m f 及 p c d n a 3 1 ( + ) a m f 进行转染，以未转染的细胞、转染空载体p e g f p c 1 和 p c d n a 3 1 ( + ) 的细胞作为阴性对照。 5 荧光显微镜下观察e g f p a m f 融合蛋白的细胞定位 p e g f p c i a m f 转染e c 9 7 0 6 、e c a l 0 9 和e c 1 细胞2 4h 后，用显微荧光摄 像照相系统观察e g f p a m f 融合蛋白在食管鳞癌细胞中的定位。 6r t - p c r 检测 应用t r i z o l 试剂提取转染前后细胞总r n a ，取2 嵋总r n a 进行逆转录， p c r 扩增a m f ，以1 3 a c t i n 为内参，每个样本重复3 次。p c r 产物经l 琼脂 糖凝胶电泳，凝胶成像系统摄像，g e n et o o l s 软件进行灰度分析并统计学处理。 7w e s t e r nb l o t t i n g 检测蛋白表达 用蛋白裂解液分别提取未转染，转染空载体p c d n a 3 1 ( + ) 和重组载体 p c d n a 3 1 ( + ) a m f 细胞的蛋白，用b r a d f o r d 法测定蛋白浓度。使用w e s t e r n b l o t t i n g 法检测三组食管鳞癌细胞株中a m f 和p - c o f i l i n 蛋白的表达差异，并用 g e n et o o l s 进行蛋白相对表达量灰度值分析。上述实验均分别重复三次。应用 s p s s l 3 0 统计软件进行统计学处理，统计学数据用均数标准差( x s ) 表示， 两样本均数比较采用t 检验，多个样本均数比较应用单因素方差分析( o n e - w a y a n o v a ) ，p o 0 5 有显著性。 结果 l 总r n a 的鉴定 一 提取的总r n a 完整性好，无降解，r n a 的纯度和完整性符合r t - p c r 要求。 摘 要 2r t - p c r 的鉴定 r t - p c r 结果显示，扩增出的特异d n a 条带大小约为1 7 0 0b p ，与预期结果 相符。 3a m f 基因真核表达载体的鉴定 鉴定正确的目的基因与相应表达载体相连后经相应酶切，于1 0 琼脂糖凝 胶电泳检测连接产物，可以分别看到与其长度相符的载体带和目的条带。 4a m f 基因的细胞定位 将空质粒p e g f p c i 和重组质粒p e g f p c 1 - a m f 分别转染食管鳞癌细胞 e c 9 7 0 6 、e c a l 0 9 和e c 1 ，2 4h 后荧光显微镜下观察。转染空质粒p e g f p c 1 的 细胞，绿色荧光分布于整个细胞，而转染重组质粒p e g f p c i - a m f 的细胞，绿 色荧光定位于细胞质。 5r t p c r 鉴定 r t - p c r 结果显示，与对照组相比，p c d n a 3 1 ( + ) - a m f 转染株中扩增出a m f 基因的目的片段量明显增加，证明a m f 基因已成功转入e c 9 7 0 6 、e c a l 0 9 和e c 1 细胞。 6 真核表达载体瞬时转染食管鳞癌细胞株w e s t e r nb l o t t i n g 结果 ， 用鼠抗组氨酸标签的抗体作为一抗，山羊抗小鼠i g g 抗体作为二抗进行 w e s t e r nb l o t t i n g 分析，同时用b - a c t i n 作阳性对照。结果显示p c d n a 3 1 ( + ) - a m f 转染株在2 5 3 2k d 处有特异条带，证明含有6 个组氨酸标签的a m f 蛋白已经 表达。 与未转染的食管鳞癌细胞株相比，转染p c d n a 3 1 ( + ) 及转染 p c d n a 3 1 ( + ) 一a m f 的食管鳞癌细胞株中p - c o f i l i n 蛋白的表达均有增加，具有统 计学意义( 尸 ，1 8 ，r n a 使用1 0 的琼脂糖凝胶电泳检测呈现出清晰的2 8s r r n a ，1 8sr r n a 特征条带和较弱的5sr r n a 条带( 图2 4 ) ，表明提取的总r n a 完整性好，不存在降解，r n a 纯度和完整性完全符合r t - p c r 要求。 1 6 图2 4 人食管鳞癌细胞株总r n a 琼脂糖电泳结果 1 ：e c 9 7 0 62 - e c a l 0 93 - e c - i 2 3 2 r t - p c r 扩增a m f 基因的鉴定 利用特异性引物，以人食管鳞癌细胞株c d n a 为模板扩增得到的p c r 产物， 在l 的琼脂糖凝胶电泳中检测产物得到一条清晰的条带( 图2 5 ) ，片段大小约 为1 7 0 0b p ，与预期结果相符。 lmm 23 2 0 0 0 b p 1 - 图2 5a m f 扩增结果 1 - e c 9 7 0 62 - e c a l 0 93 - e c - 1 m - d n a1 0 0 0 0b pl a d d e r 1 7 a m f 基因的克隆与真核表达载体的构建 2 3 3 重组载体的酶切鉴定 目的片段分别与真核表达载体p c d n a 3 1 ( + ) 和绿色荧光蛋白载体p e g f p - c i 相连接，得到的产物经双酶切( 肺刀d i e c o ri ) 后，用1 琼脂糖凝胶电泳检 测，在紫外线背景下可见与载体带和目的基因大小相符的、清晰的强荧光条带， 表明目的基因已正确连接至载体上( 图2 6 ) ，然后进行测序。 m1234 图2 6 重组载体双酶切鉴定结果 l ：p e g f p - c i - a m f 环形质粒 3 ：p c d n a 3 i ( + ) - a m f 环形质粒 m ：d n a1 0 0 0 0b pl a d d e rm a r k e r 2 3 4 测序分析 2 ：p e g f p - c 1 a m f 双酶切 4 ：p c d n a 3 1 ( + 圳f 双酶切 2 3 4 1测序 随机从每个片段转化的克隆中挑选两个鉴定插入正确的克隆，选用m 1 3 正 向和反向引物进行测序，比较所得序列，纠正p c r 过程中产生的错误碱基，确 定p c r 产物序列。 2 3 4 2 序列分析 挑取鉴定正确的阳性克隆，用m 1 3 正反引物送上海生物工程公司进行双向 18 a m f 基因的克隆与真核表达载体的构建 测序，所得插入片段长度与理论值相符。测序结果与g e n b a n k 数据库中a m f 基因序列进行比对，结果显示所插入的基因序列与g o n b a n k 上公布的基因序列 完全一致，说明所插入的基因为a m f 基因( 附录) 。 2 4 讨论 2 4 1 提取高质量r n a 的注意事项 在分子生物学实验中，分离提取纯净的、完整的高质量r n a 是很重要的， 而且是进行基因表达分析的基础。能否分离得到高质量的、全长的r n a 是所有 r n a 实验中最关键的因素之一。一般来说，提取的总r n a 主要包括核糖体r n a ( r r n a ) 和转移r n a ( t r n a ) 。总r n a 在溴化乙锭( e b ) 存在时，用l 琼 脂糖凝胶电泳鉴定，在紫外灯下可清楚的看到三条荧光带：2 8 sr r n a 、1 8 s r r n a ，及一条由t r n a 、5 8 sr r n a 和5 sr r n a 组成的较为模糊迁移较快的带。 如果提取的r n a 纯净、完整无降解，2 8 sr r n a 的亮度应是1 8 sr r n a 亮度的两 倍，并且这两条带没有弥散现象。 r n a 酶的污染是r n a 实验失败最为常见和主要的原因，r n a 酶很稳定并 且广泛存在于我们生活和工作的环境中，因此，在实验中应注意以下事项，以 避免r n a 酶的污染。1 塑料制品的处理方法：首先在玻璃烧杯中注入去离子 水，加入焦碳酸二乙酯( d e p c ) 使d e p c 的终浓度为0 1 ( 注意：d e p c 有致 癌之嫌，须在通风柜中小心操作) ，将准备好的待处理塑料制品放入一个可高温 灭菌的容器中，注入刚配制的d e p c 水溶液，使塑料制品的所有部分都浸入到 溶液中；然后放到通风柜中，3 7 或室温下处理过夜；将过夜的e d p c 水溶液 小心倒入废液瓶中，用铝箔封住用d e p c 水处理过的塑料制品的烧杯，然后高 温高压蒸气灭菌至少3 0m i n 。利用上述处理方法，可以去除器皿上痕量的d e p c ， 以防d e p c 经过羧甲基化作用对r n a 的嘌呤碱基进行修饰；用合适的温度( 8 0 - - 9 0 ) 烘烤制品至干燥，置于干净处，以备用。2 玻璃和金属制品的处理方法：因 为实验室用的普通玻璃器皿和金属器皿经常有r n a 酶污染，所以使用前必须在 1 8 0 c 下干烤8h 或2 5 0 c 烘烤3h 以上。另一种处理方法，使用0 1 的d e p c 水溶液过夜浸泡。3 电泳槽的处理方法：用于r n a 电泳的电泳槽应先用去污 剂清洗干净，再用蒸馏水冲洗，再用乙醇干燥，然后再灌满3 的h 2 0 2 溶液， 放置于室温1 0m i n ，最后用o i d e p c 处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能预 1 9 a m f 基因的克隆与真核表达载体的构建 留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放于指定地点，作为 r n a 实验专用仪器。4 移液器的处理方法：移液器也是r n a 酶的来源之一。 要严格按照移液器制造商的要求对移液器进行处理，不然会造成移液器的损坏。 在一般情况下，直接采用用d e p c 配制的7 0 乙醇擦洗移液器的内部和外部， 这样处理基本达到要求。因为移液器金属退头器是r n a 酶的一个重要来源，所 以在实验前最好把它取下。5 溶液：应用高压灭菌的水和r n a 研究专用的化 学试剂来配制溶液，用干烤过的药匙来称取试剂，将配制的溶液装入到无r n a 酶的玻璃器皿中。可能的话溶液应用0 1 d e p c 水在3 7 至少处理1 2h ，然 后再1 0 0 加热1 5m i n 或在1 0 3 4 x1 0 5 p a 的高温高压下蒸气灭菌3 0m i l l ( d e p c 可与胺类迅速发生化学反应，因此不能用来处理含有t r i s 一类的缓冲液，可保 存几瓶新的或未开封的t r i s 晶体以备配制无r n a 酶的溶液) 。6 研究人员：r n a 酶广泛存在于人的皮肤上，研究人员的手有可能成为最主要的潜在污染源。因 此，在准备分离和分析r n a 的材料和溶液时，以及在涉及r n a 的一切操作过： 程中，都应戴一次性p e 手套，接触未经处理的玻璃器皿和其他物品以后，手套 就有可能沾染上r n a 酶，因此在进行r n a 实验时应勤换手套。 i 2 4 2p c r 扩增的结果 _ i p c r 技术的基本原理类似于d n a 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序 列两端互补的寡核苷酸引物。p c r 由变性、退火和延伸三个基本反应步骤构成：鳍 1 模板d n a 的变性：模板d n a 经加热至9 4 左右一定时间后，使模板d n a 双链或经p c r 扩增形成的双链d n a 解离，使之成为单链，以便其与引物结合， 为下轮反应做准备；2 模板d n a 与引物的退火( 复性) ：模板d n a 经加热变性 成单链后，温度降至5 5 左右，引物与模板d n a 单链的互补序列配对结合；3 引物的延伸：d n a 模板与引物结合物在t a q d n a 聚合酶的作用下，以d n t p 为 反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模 板d n a 链互补的半保留复制链，重复循环变性、退火和延伸三个过程，就可获 得更多的“半保留复制链 ，而这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一 个循环需2 , - - , 4r a i n ，2 3h 就能将待扩的目的基因扩增放大几百万倍。到达平 台期( p l a t e a u ) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 p c r 反应五要素：参加p c r 反应的物质主要有五种即引物、酶、d n t p 、模 板和m 矿。其中引物是p c r 特异性反应的关键。设计引物应遵循以下原则：1 引 a m f 基因的克隆与真核表达载体的构建 物长度：1 5 3 0 b p ，常用2 0 b p 左右。2 引物扩增跨度：以2 0 0 5 0 0 b p 为宜， 特定条件下可扩增长至1 0 k b 的片段。3 引物碱基：c r + c 含量以4 0 6 0 为宜， g + c 太少扩增效果不佳，g + c 过多易出现非特异条带。a t g c 最好随机分布， 避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。4 避免引物内部出现二级结构， 避免两条引物间互补，特别是3 端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特 异的扩增条带。5 引物3 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格 要求配对，以避免因末端碱基不配对从而导致p c r 失败。6 引物中有或能加上 合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有合适的酶切位点，这对酶切分析或分 子克隆有很大好处。7 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无 明显同源性。 在本研究中，设计上游引物时，除了加入肺力d i 酶切位点外，还加入了6 个组氨酸标签，为a m f 基因转染食管鳞癌细胞株后，鉴定转染是否成功打下了 良好基础。 2 4 3 连接体系的优化 一般情况下，目的片段与载体片段的摩尔比例在3 1 0 ：1 之间，载体的用量 约为5 0n g 左右，反应体系为1 0 2 0p i 为佳。目的片段与载体片段的摩尔比例 是连接成功与否的关键，因此在本研究中，为了提高连接成功率，同时采用了 不同的摩尔比连接体系，其中目的片段和载体片段的摩尔比例分别为1 ：1 ，3 ：1 ， 5 ：1 和7 ：1 ，1 6 过夜连接，连接产物分别转化感受态细胞，取得了很好的转化 效果。 2 4 4 真核表达载体的构建 p e g f p c l 和p c d n a 3 1 ( + ) 真核表达载体是目前较常用的、转染效率较高的 两种载体。本部分所构建的p e g f p c 1 - a m f 绿色荧光蛋白重组载体，可以在进 一步的研究中对a m f 基因进行细胞定位，而p c d n a 3 1 件a m f 真核表达重组 载体，可以进一步转染食管鳞癌细胞株，从而为探讨a m f 基因在食管鳞癌细胞 中的作用打下良好基础。 2 5 小结 1 根据g e n b a n k 上已经登陆的a m f 基因的e d n a 全长序列，设计了l 对 2 l a m f 基因的克隆与真核表达载体的构建 特异性p c r 扩增引物，并且分别在上游引物的5 端加上了h i n d l i i 和6 个组氨酸 标签，在下游引物加入了e c o ri 酶切位点； 2 通过适当的p c r 反应条件扩增出了a m f 基因序列。经过b l a s t 比对分 析发现，该序列与g o n b a n k 上公布的基因序列相同； 3 成功构建了包含a m f 基因的绿色荧光蛋白表达载体p e g f p - c 1 - 削虾； 4 成功构建了包含a m f 基因的真核表达载体p c d n a 3 1 ( + ) - a m f 。 a m f 基因在食管鳞癌细胞株中的功能初步分析 3a m f 基因在食管鳞癌细胞株中的功能初步分析 食管癌是一种发病率和死亡率都很高的恶性肿瘤，在发展中国家尤其我国 又是最常见的恶性肿瘤之一虽经过多年的研究和临床技术的提高，使得食管 癌预后有了突飞猛进的改善【l 】，但其5 年生存率仍然没有明显的提耐2 1 。导致生 存率和死亡率低下的原因多种多样，其中主要原因是肿瘤转移。而肿瘤转移是 一个序贯过程，它包括：癌细胞与基底膜的粘附，基底膜的降解，癌细胞穿透 基质进入血管和淋巴倒蚓。很明显，寻找影响食管鳞癌转移的细胞因子，针对 有效的分子靶点进行肿瘤治疗，对于提高我们目前的治疗手段是十分必要的。 近年研究发现，a m f 与其受体结合之后可以激活r h o 信号途径。而微丝微 管的解离聚合是由r h o 家族的小g t p 激酶调节，这些小g t p 激酶将细胞外化学 信号传递至下游信号分子，最终作用在细胞骨架蛋白上，从而影响微丝微管的 解离聚合状态，最终影响细胞的运动能力【37 1 。c o f i l i n 是一种f a c t i n 结合蛋白， 通过调节自身的磷酸化水平，改变细胞骨架的微丝微管的解离聚合状态，从而 影响细胞运动能力【3 引。因此，本部分通过将包含a m f 基因的绿色荧光蛋白表达 载体p e g f p c 1 a m f 转染食管鳞癌细胞株，观察其在细胞中的定位；使用瞬时 转染法，转染真核表达载体p c d n a 3 1 ( + ) a m f ，然后通过r t - p c r 和w e s t t c r n b l o t t i n g 方法，检测食管鳞癌细胞株中a m f 基因和对磷酸化c o f i l i n 蛋白表达的 影响，旨在探讨a m f 基因在食管鳞癌细胞株中发生发展作用及其相关机制。 3 1材料 3 1 1 主要仪器设备 h e r a c 0 2 培养箱 垂直电泳槽 酶标仪 n i k o n 显微镜 f s 3 0 0 塑料薄膜封口机 d y y - i i i 稳压稳流电泳仪 倒置显微荧光摄像照相系统检测 德国g m b h 公司 北京六一实验仪器 美国b i o - t e c hi n s t x u m e n t s 公司 日本n i k o n 公司 温州华联包装食品机械有限公司 北京六一实验仪器厂 日本n i k o n 公司 a m f 基因在食管鳞癌细胞株中的功能初步分析 p o w e r r a c 2 0 0 半干式电转移槽美国b i o r a d 公司 3 1 2 主要试剂与试剂盒 胰蛋白酶( t r y p s i n ) g i b c o 公司 胎牛血清( f c s )g i b c o 公司 考马斯亮兰g 2 5 0 ( c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u eg 2 5 0 ) 美国a m g i e s c o 公司 l i p o f c c t a m i n e t m 2 0 0 0i n v i t r o g e n 公司 丙烯酰胺( a c r y l a m i d e )美国s i g m a 公司 二甲基亚砜( d m s o )美国s i g m a 公司 p 琉基乙醇美国s i g m a 公司 t e m e d 美国s i g m a 公司 亚甲叉丙烯酰胺二美国s i g m a 公司 过硫酸铵( a m m o n i u mp e r s u l f a t e )美国s i g m a 公司二 二氨基联苯胺( d a b ) 北京中衫生物技术有限公司 硝酸纤维素膜北京益利精细化学品有限公司 3m m 滤纸美国w h a t m a n 公司拿 尼龙膜美国g e l m a n 公司 感光胶片扬州贾桥照相用品厂 定影液扬州贾桥照相用品厂尊 显影液扬州贾桥照相用品厂 试剂盒 蛋白提取试剂盒美国p i e r c e 公司 抗6 x h i st a g 抗体北京中杉金桥生物技术有限公司 兔抗人p - c o f i l i n美国s a n t ac r u z 公司 兔抗人l b - a c t i n美国s a n t ac r u z 公司 e c l 发光液北京中杉公司 二抗北京中杉金桥生物技术有限公司 无内毒素质粒小提试剂盒北京天根生物技术有限公司 本章中所采用的其他仪器设备与第二章相同。 a m y 基因在食管鳞癌细胞株中的功能初步分析 3 1 3 常用试剂的配制方法 同第二章。 3 1 4 细胞系 同第二章。 3 1 5 细胞培养所需试剂 p b s ：ll 三蒸水中加入n a c i8g ，k c l0 2g ，k h 2 p 0 40 4g ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 2 8 8g 调节p h 值到7 4 ，并高压灭菌。 r m p i1 6 4 0 培养基、胰蛋白酶和胎牛血清均购自g - i b c o 公司。 3 1 6w e s t e r nb l o t t i n g 所用的试剂 ( 1 ) 3 0 丙烯酰胺贮存液：称量2 9g 的丙烯酰胺和lg 的n n 亚甲基双丙 烯酰胺，溶于6 0m lm i l l i p o r e 纯水中，加热至3 7 全部溶解，然后加纯水至1 0 0 i i l l ，最后用w h a t m a n 一号滤纸过滤，置于棕色瓶中，4 保存备用； ( 2 ) 1 0 s d s ：称量1 0g 的s d s ，溶于8 0 m lm i l l i p o r e 超纯水中，待全部 溶解后，用浓盐酸调p h 值至7 2 ，后加纯水至1 0 0m l ，室温保存； ( 3 ) 1 0 过硫酸铵：称量1g 的过硫酸胺，溶于l om lm i l l i p o r e 超纯水中， 待全部溶解后，过滤，4 保存( 一周内使用) ； ( 4 ) 5 x t r i s 甘氨酸电泳缓冲液( 1 2 5m mt r i s ，1 2 5m 甘氨酸，0 5 s d s ， p h8 3 ) ：称量1 5 1 5g 的t r i s 碱，9 3 7 5g 的甘氨酸和5g 的s d s ，全部溶于5 0 0 m l 蒸馏水中，待全部溶解后，室温保存。使用时，用蒸馏水稀释为l 缓冲液； ( 5 ) 1 5m i r i s c i ( p h8 8 ) ：称量1 8 1 6g 的 i r i s 碱，溶于8 0m lm i l l i p o r e 超纯水中，待全部溶解后，用浓盐酸( 约4m 1 ) 调p h 值至8 8 ，后加纯水至1 0 0 “，高压灭菌后，4 保存备用； ( 6 ) 1 0m t r i s c i ( p h6 8 ) ：称量1 2 1g 的t r i s 碱，溶于8 0m lm i l l i p o r c 超纯水中，待全部溶解后，用浓盐酸( 约4 m 1 ) 调p h 值至6 8 ，加纯水至1 0 0 m l ， 高压灭菌后，4 保存备用； ( 7 ) 2 x s d s 样品缓冲液：1 0 0m m t r i s c i ( p n6 8 ) ，1 0 0m m3 - 巯基乙醇， 舷s d s ，0 2 溴酚兰，2 0 甘油，0 2 5mt r i s - h c l ( p n6 8 ) 2 5m l ，s d s2g ， b 巯基乙醇5i i l l ，1 溴酚兰lm l 和甘油1 0i n l ，加蒸馏水至5 0m l ，4 保存： a m f 基因在食管鳞癌细胞株中的功能初步分析 ( 8 ) l x 凝胶上样缓冲液：称量0 6 0 5 0g 的t r i s c i ，0 7 7 2 5g 的d t t ，2g 的 s d s 和l o i i l l 甘油，加蒸馏水至1 0 0 m l ，4 保存； ( 9 ) 考马斯亮兰染色液( 0 2 5 考马斯亮兰r 2 5 0 、4 5 甲醇和1 0 乙酸) ： 称量0 2 5g 的考马斯亮兰r 2 5 0 ，溶于4 5m l 甲醇中，待完全溶解后，加1 0 “ 冰醋酸，然后加蒸馏水至1 0 0m l ； ( 1 0 ) 脱色液：分别量取1 0 0r n l 醋酸和5 0 i i l l 乙醇，然后用8 5 0 m l 去离子 水充分混合，后使用； ( 1 1 ) t b s t 缓冲液：分别称量8 8g 的n a c l 和lm i r i s h c i ( p h8 0 ) 2 0m l ， 溶于8 0 0m l 去离子水中，待充分混匀后，加入0 5m lt w e e n 2 0 ，充分混匀后定 容至ll ，4 保存； ( 1 2 ) 膜转移缓冲液( 4 8m mt r i s ，3 9m m 甘氨酸，2 0 甲醇，0 0 3 7 s d s ) ： 分别称量2 9g 的 i r i s 碱，1 4 5g 的甘氨酸和0 1 8 5g 的s d s ，溶于2 0 0m l 蒸馏 水中，加1 0 0 m l 甲醇，用蒸馏水加至5 0 0 m l ，41 2 保存；玉 ( 1 3 ) 封闭缓冲液：称量5g 的脱脂奶粉，加入到1 0 0m l 的t b s t 缓冲液 中，充分混匀，4 保存待用( 本封闭液应该现用现配) 。 a m f 基因在食管鳞癌细胞株中的功能初步分析 置5m i n ； ( 6 ) 向离心管中加入7l n l 溶液p 4 ，立即温和地上下翻转6 - 8 次，充分混 匀，此时会出现白色絮状沉淀。室温放置约1 0 r a i n ，1 0 0 0 0r p m 离心5 - 1 0 m i n ， 将溶液全部倒入过滤器c s 中，慢慢推动推柄进行过滤，滤液收集在干净的5 0l n l 的离心管中： ( 7 ) 向滤液中加入o 3 倍滤液体积的异丙醇( 异丙醇过多容易导致r n a 的 污染) ，上下颠倒混匀，转移到吸附柱c p 5 中( 吸附柱放入5 0 “收集管中) ： ( 8 ) 室温1 0 0 0 0r p m 离心2m i n ，然后倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新 放回收集管中； ( 9 ) 向吸附柱中加入1 0n l i 漂洗液p w ，室温1 0 0 0 0r p m 离心2m i n ，弃掉 收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； ( 1 0 ) 重复操作步骤9 ； ( 1 1 ) 向吸附柱中加入3n l l 的无水乙醇，室温1 0 0 0 0r p m 离心2 m i n ，倒掉 废液； ( 1 2 ) 将吸附柱c p 5 重新放回收集管中，室温1 0 0 0 0r p m 离心5m i n ，目的 是将吸附柱中残余的漂洗液去除； ( 1 3 ) 将吸附柱c p 5 置于一个干净的5 0m l 收集管中，向吸附膜中间部位 悬空滴加l 2i i l l 洗脱缓冲液t b ，室温放置5m i n ，然后1 0 0 0 0r p m 离心2m i n ， 最后将5 0m l 离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1 5m l 离心管中，保存于 - - 2 0 冰箱中。 3 2 1 2 荧光表达载体的转染 注意事项：严格按照无菌技术进行操作，按脂质体l i p o f e c t a m i n e t m2 0 0 0 说 明书进行转染。 将2 x1 0 s m le c 9 7 0 6 、e e a l 0 9 和e c 1 细胞接种于6 孔板上，r p m i1 6 4 0 完 全新鲜培养基过夜培养。分别转染真核表达载体和空载体，阴性对照孔则加入 5 0 0i x l 无血清培养液。置于3 7 和5 c 0 2 培养箱中，培养2 4h 后收集细胞。 第一天：将处于对数生长期的细胞用p b s 冲洗两遍，然后加入适量的0 2 5 胰蛋白酶消化液，使其完全消化，再加入适量培养基终止其消化。显微镜下记 数培养细胞，并将其以2 x 1 0 5 m l 接种到六孔板中，使细胞密度在第二天达到 8 0 9 0 融合；置于3 7 和5 c t h 培养箱内培养过夜； a m f 基因在食管鳞癌细胞株中的功能初步分析 第二天：以六孔板为标准，制备转染试剂： 除去旧的培养基，用无血清无双抗培养基洗涤培养板中的细胞一次，加入2 m l 新鲜含血清的培养基； 在一个干净、无菌的离心管中，加入2 5 0 肛l 无血清无抗生素的双无培养基， 再加入1 0 肛l 的转染试剂，上下混匀，然后室温孵育5r a i n ； 在离心管中，先加入2 5 0p l 无血清无抗生素的双无培养基，再加入4 昭的 含有目的片段的质粒，室温孵育5m i r a 将上述b ) ，c ) 的溶液混合，轻轻混匀室温孵育2 5r a i n ； 第三天：在荧光显微镜下进行观察，进行细胞定位或收集细胞，准备进行 进一步的分析。 一 3 2 1 3 细胞定位 使用日本n i k o n 公司显微荧光摄像照相系统，检测食管鳞癌细胞株的： e g f p a m f 融合蛋白的表达与a m f 基因的细胞定位。观察绿色荧光的荧光滤色 块参数为： e x c i t a t i o nf i l t e r4 3 5 10 ( m b e 3 4 2 3 2 ) ，d i c h t o i em i r r o r d m 4 5 5 ( m b e 3 4 2 7 0 ) ，b a r r i e rf i l t e rn b a 4 8 0 ( m b e 3 4 5 3 5 ) 。 、， 3 2 2 真核表达载体转染食管鳞癌细胞株 3 2 2 1 无内毒素质粒的大量提取 科 具体方法同本章。 3 2 2 2 真核表达载体的转染 具体方法同本章。 3 2 3 p c d n a 3 1 ( + ) a m f 转染株的鉴定 3 2 3 1r t - p c r 检测 3 2 3 2 转染株细胞总r n a 的提取 具体方法同第二章。 3 2 3 3 细胞总r n a 的鉴定 2 8 a i v i f 基因在食管鳞癌细胞株中的功能初步分析 具体方法同第二章。 3 2 3 4e d n a 第一链的合成 具体方法同第二章。 3 2 3 5p c r 反应条件 具体方法同第二章。 、 3 2 4w e s t e r nb l o t t i n g 分析 3 2 4 1 总蛋白的制备 使用蛋白裂解液去提取对数期生长细胞的总蛋白，用b r a d f o r d 法去测定蛋 。白质的浓度，加入2 上样b u f f e r ，混匀后沸水浴煮5r a i n ，冷却，- 2 0 保存备 用。s d s p a g e 电泳及w e s t e r nb l o t t i n g 分析食管鳞癌细胞株中a m f 蛋白及 p - c o f i l i n 蛋白的表达。 3 2 4 2 制作蛋白标准曲线 ( 1 ) 试剂： 1 标准蛋白质溶液的配制：牛血清白蛋白f a s a ) ，配制成1 0m g m l 和o 1 m g m l 的标准蛋白质溶液； 2 考马斯亮兰g 2 5 0 染料试剂：称取1 0 0m g 考马斯亮兰( 3 - 2 5 0 ，溶于5 0m l 9 5 的乙醇后，再加入1 2 0m l8 5 的磷酸，用去离子水稀释至ll 。 ( 2 ) 操作方法： 1 制备空白对照溶液，在o 1m l 去离子水中加入5m l 的考马斯亮兰g 2 5 0 ： 2 按下表制备一系列有一定浓度梯度的蛋白质标准液，即给各试管分别加 入1 0m g r r a 的标准蛋白质溶液0 、o 0 1 、o 0 2 、0 0 4 、0 0 6 、0 0 8 和0 1 “，然 后用去离子水补充到o 1i n l 。最后各试管中分别加入5 0n l l 考马斯亮兰g 2 5 0 ， 每加完一管，立即在旋涡混合器上混合( 注意不能太剧烈，以免产生大量气泡而 难于消除) ； 3 加完试剂5m i n 后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在 5 9 5n m 处的光吸收值a 5 9 5 ，空白对照为第l 号试管，即0 1l i i l 去离子水中加 入5 0m l 的考马斯亮兰g - 2 5 0 ； 2 9 a m f 基因在食管鳞癌细胞株中的功能初步分析 4 用标准的蛋白质量( m g ) 为纵座标，用吸光度值a 5 9 5 为横座标，作图，即 得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a 5 9 5 值，即可查出 未知样品的蛋白质含量。 表3 1 考马斯亮兰法实验表格 3 2 4 3 s d s p a g e 电泳 ( 1 ) 样品处理：2 x b u f f e r 样品缓冲液与蛋白提取液等体积混合，混匀后，j 在沸水浴上煮沸5m i n ，冷却，4 保存备用或8 0 存放； ( 2 ) 制胶：配制1 0 分离胶5m l ，混匀后加入1 5 x 1 5c m 凝胶板中，胶厚 1 0m i l l ，用纯水压线，室温聚合3 0m i n ( 胶聚合好的标志是胶与水之间形成清晰 的界面) ；待完全聚合后，倾去上层液体，用滤纸吸去残余液体。配制5 浓缩 胶2m l ，灌注上层，插入成型梳后室温聚合3 0r a i n 。s d s p a g e 凝胶的配制如 表3 2 所示； 表3 - 2s d s p a g e 胶的组分 a m f 基因在食管鳞癌细胞株中的功能初步分析 ( 3 ) 电泳：在每个凝胶孔中，加样品2 0 l 或总蛋白量为5 0 嵋，留一孔加 入预染的标准蛋白m a r k e r 。电压8 0v ，待示踪剂通过浓缩胶后，改用15 0v 电 压，在4 条件下，电泳3 4h 。电泳缓冲液为甘氨酸缓冲系统； ( 4 ) 染色：电泳后的凝胶可以在考马斯亮兰染液中染色过夜，用脱色液脱 色，每2h 换液1 次，直至背景清晰透明，在1 0 甘油溶液中4 保存，用于观 察蛋白条带是否清晰整齐。也可以直接转膜检测蛋白的表达； ( 5 ) 转膜：s d s p a g e 电泳后，凝胶在转移缓冲液中平衡1 5m i n 。剪与胶 相同大小的硝酸纤维素膜( n c 膜) 和3m 滤纸8 张( 膜上和膜下各4 张) ，均放入 膜转移缓冲液中，浸泡1 5 3 0r a i n 。首先放上4 张滤纸，然后放入n c 膜，再放 上胶，最后放上4 张滤纸，在左上角进行标记，放置每一层时，均要排除各层 之间的气泡，以免影响转移效果，胶负膜正，于b i o r a d 半干式电转仪中转印， a m f 转膜条件为2 0v ，3 0m i n tp - c o f i l i n 蛋白转膜条件为8v ，1 0m i n ；p - a c t i n 转膜条件为1 5v ，1 6 m i n | ( 6 ) 转膜后膜和胶的染色：染膜是看膜上是否有蛋白转移过来，染胶是为 了验证胶上的蛋白是否全部转移到膜上。用丽春红进行染膜，取下膜后放入盘 中加入丽春红染液，然后用水洗脱至条带清晰； ( 7 ) 封闭：转移后的n c 膜置于封闭液中，室温封闭lh ； ( 8 ) 靶蛋白与第一抗体反应：抗h i st a g 抗体、p - c o n f i l i n 抗体及j 3 - a c t i n 抗 体稀释浓度均为1 ：2 0 0 ，将膜置于用封闭液稀释的一抗中，4 过夜结合。然后 用t b s t 洗3 次，每次1 0m i n | ( 9 ) 与第二抗体反应：将膜置于含1 ( w v ) 脱脂奶粉的t b s t 稀释的二抗 中，二抗稀释比例为1 ：1 0 0 0 0 。室温轻摇孵育2h 。t b s t 洗涤3 次，每次1 0m i n ； ( 1 0 ) 曝光t 按照e c l 发光液试剂盒的说明书配制工作液，将膜放于工作 液中作用lr a i n ，然后压片曝光，观察结果； 1 与二抗结合后的n c 膜与超敏发光液结合； 2 在暗室中将膜放入曝光盒中，在膜上盖上胶片，曝光3 0s , - 3 0m i n ： 3 将胶片放入显影液中显影l 5m i n ； 4 水洗胶片； 5 将胶片放入定影液中定影5m i n 以上； 6 水洗。观察结果，照相。 3 l a m f 基因在食管鳞癌细胞株中的功能初步分析 用l b - a c t i n 抗体作为上样对照。w e s t e r nb l o t t i n g 结果的灰度值分析采用g e n e t o o l s 软件完成。 3 2 5 统计学处理方法 r t - p c r 和w e s t e r nb l o t t i n g 结果应用g e n et o o l s 进行灰度值分析，上述实 验均分别重复三次。应用s p s s l 3 0 统计软件进行统计学分析处理，统计学数据 用均数标准差( x s ) 表示，两个样本均数比较采用t 检验，多个样本均数 比较应用单因素方差分析( o n e - w a y a n o v a ) ，p 0 0 5 具有显著性差异。 3 3 结果 3 3 i 总蛋白含量的测定 l l 置白浓度 图3 1 蛋白质含量测定的标准曲线 首先配制不同浓度的b s a 标准液，绘制标准曲线。取各待测样品2 m ，按 上述方法配制，用7 2 1 型分光光度计，于5 9 5 n m 波长处，对照管调节零点，测 定各管的吸光度，依据标准曲线的计算公式计算蛋白的浓度。 3 3 2a m f 基因的细胞定位 将空质粒p e g f p c 1