（细胞生物学专业论文）ubiquilin2蛋白调控p选凝素胞内运输机制研究.pdf

型堕圭塑生塑丝堂皇塑堕生物学研究所博士学位论文u b i q u i l i n - 2 蛋白调控p - j 应 一论文摘要 1 中文摘要 目录 3 3 2 英文摘要一一一一一一4 二论文目录一一一6 三论文：u b i q u i l i n 一2 蛋白调控p 一选凝素胞内运输机制研究一8 1 引言一一8 2 材料与方法 3 实验结果 2 2 3 3 7 4 讨论一6 7 四参考文献 7 2 五缩略语一一一8 6 六发表论文目录 七致谢 8 7 8 8 研究论文 u b i q u i li n 一2 蛋白调控p 一选凝素胞内运输机制研究 i 、i 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文 u b i q u i l i n - 2 蛋白调控p - 选凝素胞内运输机制研究 中文摘要 摘要 机体内发生炎症反应的早期，血管内皮细胞受炎症因子的刺激，细胞内p 选凝素迅速 从储存颗粒韦伯氏小体中被分泌到细胞膜表面上。并与中性粒细胞上的p 选凝素配体 p s g l 1 相互结合以介导炎症早期中性粒细胞在血管内皮细胞上的滚动。随后p 选凝素 又迅速从细胞膜表面内吞回细胞中，其中一部分p 选凝素被运送到溶酶体中进行降 解；一部分又重新被运送到细胞膜上；一部分还可能会被运送到其储存颗粒中。这一 系列的运输过程中都有哪些蛋白来调控p 选凝素仍不是很清楚。我们用酵母双杂交系 统发现了一种能够- q p 选凝素的胞内区直接结合的新蛋白u b i q u i l i n - 2 。并且发现了 u b i q u i l i n 2 蛋白负责与p - 选凝素结合的结构域以及p 一选凝素胞内区结合u b i q u i l i n - 2 蛋 白的关键氨基酸位点。在细胞中我们发现，部分p - 选凝素能够被招募至l j u b i q u i l i n - 2 所 形成的类自噬体的聚积状态的细胞结构中。过量表达的u b i q u i l i n - 2 蛋白可能是通过抑 s m j p 选凝素进入溶酶体降解而稳定了p 选凝素的蛋白水平。与此同时，细胞膜表面的 p 选凝素水平也明显上调。大量表达的u b i q u i l i n - 2 蛋白会抑s s j p 选凝素的内吞。小鼠 体内实验中，具有竞争抑制作用、能够自主进入细胞的p 选凝素胞内区短肽明显抑制 了急性腹膜炎中白细胞向腹腔的迁移，以及体内显微实验中白细胞在血管内皮细胞上 的滚动。由此推论u b i q u i l i n - 2 蛋白很可能在p 选凝素从储存颗粒处外排到细胞膜上过 程中起正调控作用。 关键词：p 选凝素、u b i q u i l i n 2 、外排、内吞、白细胞滚动、炎症 u b i q u i l i n 一2i si n v o l v e di nr e g u l a t i n gt r a f f i c ko fp - s e l e c t i n a b s t r a c t s h u j u e l a n ( c e l lb i o l o g y ) d i r e c t e db yj i a n g u og e n g t h el e u k o c y t e r e c e p t o r p s e l e c t i n a p p e a r sr a p i d l y a tt h es u r f a c eo f e n d o t h e l i a lc e l l sf r o mw e i b e l - p a l a d e b o d y i nt h e e a r l yi n f l a m m a t o r y r e s p o n s e t h eb i n d i n go fp - s e l e c t i nw i t hi t sl i g a n dp s g l 一1f r o ml e u k o c y t e s t r i g g e r st h er o l l i n go fl e u k o c y t e so nt h ev a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s u p o nr a p i d i n t e m a l i z a t i o n ，p - s e l e c t i ni sp a r t l ys o r t e dt od i f f e r e n tp a t h w a y ss u c ha s r e c y c l i n gp a t h w a y , l y s o s o m a ld e g r a d a t i o np a t h w a y , r e s t o r ep a t h w a y t h e a d a p t o rp r o t e i nf o rp - s e l e c t i ne x o c y t o s i sa n de n d o c y t o s i si sn o tc o m p l e t e l y w ei d e n t i f i e do n ep r o t e i n u b i q u i l i n 一2c o u l di n t e r a c tw i t hp s e l e c t i n ， c y t o p l a s m i ct a i ld i r e c t l yb yu s i n gt h e hs y s t e m w ea l s oc o n f i r m e dt h e e x a c td o m a i nr e s p o n s i b l ef o ru b i q u i l i n - 2 b i n d i n gt op s e l e c i t n ，a n dt h e s p e c i f i ca d ja c e n tc r i t i c a la m i n oa c i d sr e s i d u e sf o rp - s e l e c t i nb i n d i n gt o u b i q u i l i n 一2 w h e np - s e l e c t i na n du b i q u i l i n 一2w e r ec o e x p r e s s e di nc e l l s ，p a r t o fp - s e l e c t i nw o u l db es o r t e dt ot h e s p e c i a la g g r e g a t e ds t r u c t u r e o f u b i q u i l i n - 2 ，w h i c hw e r e s i m i l a rt o a u t o p h a g y o u rs t u d ys h o w e d t h a t u b i q u i l i n 一2 c o u l de n h a n c et h et o t a l p r o t e i n l e v e lo fp - s e l e c t i n t h r o u g h i n h i b i t i n gp - s e l e c t i nb e i n gs o r t e dt ol y s o s o m ef o rd e g r a d a t i o n a tt h es a m e t i m e ，t h el e v e lo fp s e l e c t i np r o t e i no nc e l ls u r f a c ew o u l db ei n c r e a s e d i n a d d i t i o n ，u b i q u i l i n - 2c o u l di n h i b i tt h ee n d o c y t o s i so fp s e l e c t i n t h er e s u l t - 4 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文 u b i q u i l i n 2 蛋白调控p 选凝素胞内运输机制研究 o fi nv i v oe x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tc o m p e t i t i v ei n h i b i t o rc o u l do b v i o u s l y i n h i b i tl e u k o c y t e sg o i n gt h r o u g he n d o t h e l i a lc e l l si na c u t ep e r i t o n i t i sm o d e l i nt h ee x p e r i m e n to fc r e m a s t e r , t h ec o m p e t i t i v ei n h i b i t o ra l s oi n h i b i t e d l e u k o c y t e sr o l l i n go nt h ec e l l s u r f a c eo fv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s i n c o n c l u s i o n ，o u rs t u d ys u g g e s t e du b i q u i l i n 一2p r o b a b l yw a si n v o l v e di n u p r e g u l a t i n g p s e l e c t i n d u r i n g i t s e x o c y t o s i s f r o mw e i b e l - p a l a d et o e n d o t h e l i a lc e l ls u r f a c e k e yw o r d s ：p s e l e c t i n ，u b i q u i l i n 一2 ，e x o c y t o s i s ，e n d o c y t o s i s ，r o l l i n g ， i n f l a m m a t i o n 5 皇科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文u b i q u i l i n 2 蛋白调控p 选凝素胞内运输机制研究 引言 论文目录 材料与方法 试剂与抗体一 细胞培养一 人脐带静脉血管内皮细胞分离与培养 载体构建与基因克隆 8 22 22 22 2 3 融合蛋白的表达与纯化 免疫沉淀 免疫印迹 免疫荧光染色 f r e t - b i a c o r e3 0 0 0 一 g s tp u l ld o w n 实验 细胞总r n a 抽提 反转录 2 3 2 6 26 27 27 2 8 2 8 28 2 9 29 t a t 融合蛋白表达与纯化 内吞实验 3 0 全细胞e l i s a 法 酵母双杂交实验 人血小板的分离与裂解 小鼠急性腹膜炎模型 3 1 3 l 3 2 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文 u b i q u i l i n 0 2 蛋白调控p 选凝素胞内运输机制研究 体内显微镜实验 实验动物 实验结果 3 2 3 2 3 3 i 酵母双杂交系统筛选到p 一选凝素胞内区结合蛋白一u b i q u i l i n 一2 一一3 3 2 p 一选凝素胞内区可与u b i q u i l i n - 2 蛋白质直接结合 3 u b i q u i li n - 2 蛋白中间结构域对于二者的结合是必需的 3 4 35 4 p 一选凝素胞内区4 个紧邻的氨基酸残基介导p 一选凝素与u b i q u i l i n - 2 的结合3 8 5 u b i q u ili n 一2 与p 一选凝素胞内区结合的亲和力3 9 6 u b i q u il i n 一2 在h u v e c 以及诸多肿瘤细胞中均有表达4 1 7 u b i q u ili n 一2 与p 一选凝素可发生共定位并且也能发生f r e t 8 u b i q u ili n 一2 蛋白所形成的细胞结构特性 9 p 一选凝素及其胞内区片段并不发生泛素化 4 2 4 5 4 9 1 0 u b i q u i l i n 一2 可稳定p 一选凝素蛋白水平并可上调p 一选凝素在细胞膜上表达5 l 1 1 u b i q u i l i n 一2 可抑伟l j p - 选凝素胞内区内吞5 4 5 81 2 h u v e c 细胞中内源性的u b i q u i l i n - 2 蛋白能与p 一选凝素发生共定位 1 3 t a t 序列融合的可竞争性抑s t j u b i q u i l i n - 2 与p 一选凝素结合的短肽可在h u v e c 细胞 中阻断u b i q u i l i n 一2 蛋白对p 一选凝素转运调控59 1 4 t a t 融合短肽能在体内动物实验模型中明显阻断u b i q u i l i n - 2 蛋白促进p 一选凝素运 转到血管内皮细胞膜表面的作用 讨论 参考文献 6 3 6 7 7 2 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文u b i q u i l i n - 2 蛋白调控p - 选凝素胞内运输机制研究 引言 选凝素家族蛋白包括：p 一选凝素( p - s e l e c t i n ) 、e 一选凝素( e s e l e c t i n ) 和l 一选凝素 ( l - s e l e c t i n ) 等三种蛋白。选凝素为典型的i 型穿膜糖蛋白，结构包含胞膜外区、穿膜 区和胞浆区 卜9 三部分。选凝家族各成员膜外部分结构类似，且具有较高的同源性。 如图1 所示：首先，其外侧氨基端约1 2 0 个氨基酸残基为钙离子依赖的c 型外源凝集 素结构域( c a l c i u md e p e n d e n tl e c t i nd o m a i n ) ，可结合碳水化合物基团，是选凝素 分子的配体结合部位；其次，紧邻外源凝集素结构域的是表皮生长因子样结构域 ( e p id e r m a lg r o w t hf a c t o r 一1 ik ed o m a in ) ，约含3 5 个氨基酸残基，e g f 样结构域 虽不直接参与配体的结合，但对维持选凝素分子的构型是必须的；最后，近胞膜部分 是2 9 个由约6 0 个氨基酸残基构成的短小重复序列( s c r s ，s h o r tc o n s e n s u sr e p e a t s ) ， 它们与补体调节蛋白( c o m p l e m e n tr e g u l a t o r yp r o t e i n ) 类似，与补体受体c r i ， c r 2 等以及c 4 结合蛋白c 4 b p 等结构具有同源性 1 0 。 - - 屯( ：二 i c 簟，一q i 哪yp mr p 脯 州n - 确啊叫蛳摹- 图1 ：选凝素家族蛋白结构示意图。 人和小鼠体内，选凝素家族蛋白的基因均定位于第一号染色体上，并按p l e 的 顺序组成长约3 0 0 k b 的基因簇 1 1 。编码转录启始位点、凝集素结构域、e g f 样结构 羹焉； m 聃 m d d 吐 b b 培 髓 的 的 l b 艮 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文 u b i q u i l i n - 2 蛋白调控p o 选凝素胞内运输机制研究 域、每一短重复序列和跨膜区的外显子与选凝素分子的模块结构一一对应。而每一选 凝素的胞内区则由两个不同的外显子编码 1 2 ，1 3 。虽然许多蛋白分子结构中都能找 到c 一型凝集素结构域、e g f 样结构域或短的重复序列，但只有选凝素将这些结构域组 装在一个分子内。这可能表明每一结构域对选凝素的功能有特殊的贡献，并且，它们 在分子内的排列对其功能的发挥也可能具有重要的作用。 利用单克隆抗体免疫组化方法人们研究了选凝素在正常组织血管中的表达。其中 p 一选凝素在人体大多数组织如肝、肺脏、结肠、胃以及肾上腺组织血管中均有表达， 而胰内血管阳性表达较少，肾脏和心脏未见p 一选凝素表达。且p 一选凝素主要分布在 中等以上血管内皮细胞中，毛细血管一般不表达。正常情况未受刺激时，p 一选凝素 在肾上腺、肺脏、胃和结肠等多数组织中含量很低甚至不表达，而在炎症等病理状况 下，受炎症因子等刺激p 一选凝素表现为高表达并参与多种疾病变化过程。 通常情况下，p 一选凝素储存在血小板的仅颗粒和内皮细胞的韦伯氏 ( w e i b e l - - p a l a d eb o d y ) 小体。细胞受刺激活化后，这些颗粒膜与质膜融合，导致p 一 选凝素迅速外排到细胞膜表面( 内皮细胞需数分钟，血小板仅需数秒钟) 。凝血酶、 组胺、蛋白激酶c 活化剂、补体片段或a d p ( 血小板中) 都可活化细胞，引起颗粒膜 与质膜融合，导致颗粒内膜蛋白p 一选凝素和胞内其它成分( 如，y o nw i l l b r a n df a c t o r ) 几分钟内表达在细胞膜表面 1 4 。p 一选凝素的表达在约5 - 1 0 分钟内达到最高水平， 在随后的3 0 一6 0 分钟内迅速发生内吞或被胞外蛋白酶切断成可溶性的p 一选凝素于血 液中。虽然内皮细胞中的p 一选凝素、e 一选凝素都能被迅速内吞，但只有p 一选凝素可 从内吞体再循环进入反面高尔基网，随后被转运到w e i b e i - p a l a d e 小体中储存。除了 这一途径外，大部分p 一选凝素和所有内吞的e 一选凝素都会被转运到溶酶体消化降解 1 5 。实验证明p 一选凝素在细胞内的分选机制与其胞质尾序列密切相关 1 6 ，1 7 。将 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文u b i q u i l i n - 2 蛋白调控p - 选凝素胞内运输机制研究 e 一选凝素的跨膜区和胞内区替换成p - 选凝素蛋白的结构后所形成的融合蛋白可被定 向转运到p 一选凝素的储存颗粒中 1 8 。p 一和e 一选凝素的胞质尾区都有酪氨酸残基， 这可能会是潜在的靶向信号位点。综上所述，表达在活化细胞表面的p 一选凝素的归宿： 内吞或脱落( s h e d d i n g ) ，内吞的p 一选凝素有些在溶酶体内被降解，有些重新储存在 储存颗粒中，有些甚至可能重新循环回复到细胞膜上。所有这些p 一选凝素不同的代谢 途径都由其胞内区受不同蛋白的调节造成的。也正是因为有这些途径，在活化内皮细 胞和血小板表面p 一选凝素表达很短暂。这种动态表达模型对p 选凝素的功能可能有重 要的调节作用。 p - 选凝素的诱导表达有两种不同的机制。除了上面提到的一些刺激因子能够在短 时间内刺激p 一选凝素上调表达在细胞膜上以外，另外还有一类刺激剂能够在长时相内 刺激p 一选凝素的表达。肿瘤坏死因子一0 【( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - a 。t n f - i x ) 最初发 现可以同时在转录水平和蛋白表达水平诱导小鼠、牛内皮细胞p 一选凝素的表达，与其 ， 调节e 一选凝素表达的机制类似 1 9 ，2 0 。然而，脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s ) 、 肿瘤坏死因子仅( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r i x ) 和白介素一1 p 不能刺激人脐静脉内皮细 胞p 一选凝素的表达。相反，白介素一4 和制癌蛋白m ( o n c o s t a t i nm ) 发现能诱导p 一 选凝素持续7 2 小时的转录和表达 2 1 。并且，制癌蛋白m ( o n c o s t a t i nm ) 还能刺激 ) 一选凝素从储存颗粒转运到细胞表面 2 2 。制癌蛋白m ( o n c o s t a t i nm ) 通过间隔式 在不同时段分别刺激p 一和e 一选凝素的表达以增强白细胞与内皮细胞的粘附。从诱导 表达的时相来看最初是p 一选凝素的表达，随后是e 一选凝素，最后又是p 一选凝素。调 节选凝素分子在细胞膜表面的表达对控制白细胞渗出非常重要。因为炎症过程的一个 重要特征是白细胞粘附、穿越血管内皮细胞，向炎症部位渗出。而白细胞与内皮细胞 的最初粘附就是由选凝素分子来介导的。并且在细胞因子、炎症介质以及其它因素的 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文 u b i q u i l i n 2 蛋白调控p - 选凝素胞内运输机制研究 作用下，通过细胞粘附分子表达的水平和构象的变化，可改变细胞粘附能力。 在正常情况下，内皮细胞膜表面并不表达p - 和e 一选凝素。炎症刺激因子活化内 皮细胞后可诱导这两种选凝素分子表达在膜表面。这可以保证p 一、e 一选凝素只在炎症 部位组织的内皮细胞膜表面表达，而不会在组织中随意发挥其功能。在三种选凝素蛋 白中，l 一选凝素却是例外，它在白细胞上是组成性表达。这一特点正好符合它介导持 续淋巴细胞归巢的功能。在炎症反应中，l - 选凝素介导白细胞一内皮细胞粘附的功能 则通过调节其配基的表达来控制。 e n d o m 一湖 _ 心艮 i n m g r i n 啼 f n d o e l o i i o t i v , l n i o n i a u k o e v w t 憎p p i 口 i l e l _ ；- t i n | c e l l - c e l l d l h e m d o n ：c e l lj , , c u o m l e u l o e n i n l m a c ：l k ：) nb e l w 蝴c e l la d h e 毫, i o nm d _ 嘲曩d u 嘶gi n i l i a o fb u k o c y wbo n c l o b 涮i a l i b 。 图2 ：p 一选凝素在不同程度上参与炎症发生过程的示意图。 有很多的研究证实三种选凝素都参与体内的白细胞滚动，引发白细胞与内皮细胞 的最初粘附。体外试验显示，模拟体内血液流动，e 一选凝素可以支持中性粒细胞与内 皮细胞的粘附 2 3 ，2 4 。p _ 、e 一选凝素这两种在内皮细胞上表达的选凝素在体内被证 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文 u b i q u i l i n - 2 蛋白调控p - 选凝素胞内运输机制研究 实是白细胞滚动的受体 2 5 。内皮细胞表面的p 一和e 一选凝素不仅能够介导中性粒细 胞沿内皮细胞滚动，同时也能支持牛的丫6t 细胞和人的0 【p 、丫6t 细胞在血流切力 下的滚动 2 6 ，2 7 。除了淋巴细胞和中性粒细胞外，其它的白细胞也利用选凝素作为 滚动受体。体外实验证明，l _ 选凝素和p 一选凝素可共同介导单核细胞沿肿瘤坏死因子 ( t n f ，t u m o rn e c r o s i sf a c t o r ) 活化的内皮细胞滚动 2 8 。嗜酸性粒细胞滚动主要 依赖于l 一选凝素，而非e 一选凝素 2 9 ，3 0 。然而，另据报道，三种选凝素都在嗜酸性 粒细胞的募集中起作用 3 1 。大多数与p 一选凝素结合的白细胞都能识别e 一选凝素。 从体内选凝素介导白细胞滚动的实验数据可以推断，三种选凝素在白细胞进入炎症组 织的过程中起重要作用。然而，淋巴细胞归巢是唯一单独由l 一选凝素介导的过程，e 一、 p 一选凝素未被报道在此过程中起作用。小鼠腹膜炎模型中，实验显示三种选凝素各自 的抗体可以阻断中性粒细胞浸润至化学刺激引发的腹膜炎症部位。并且同时阻断l 一 和p 一选凝素的效果比阻断e 一选凝素的效果更显著 3 2 。前人还通过研究三种选凝素 ， 的基因敲除小鼠表型来进一步研究选凝素的功能重要性。表一列出缺失任一选凝素基 因的小鼠突变体功能缺陷表现。 豫 舻l ，l 馘蜉嗽t l 壮i a 翰瞄i 曩时电l 饥绫玩缝旗掰分奎隧溉阮心謦鬃鼗褥跨罐壤躺徽) 辟夺勉擞贰 巍鬓j ：。程i 需哆l 内敝l l 墨神秘觐麓u 妇l 蠡硝， 表一：选凝素基因敲除小鼠功能缺陷表现。 p 一选凝素敲除的小鼠表现出中性粒细胞迁入化学致炎的腹膜的数目减少，尤其在刺激 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文 u b i q u i l i n 2 蛋白调控p - 选凝素胞内运输机制研究 的早期1 - 2 小时 3 3 。l 一选凝素基因敲除的小鼠，其淋巴细胞的归巢明显下降。在巯 基乙酸致炎的反应中，淋巴细胞的滚动和中性粒细胞迁入腹膜数目下降。l 一选凝素的 缺失还影响了小鼠的正常免疫反应 3 4 ，3 5 。与l 一选凝素和p 一选凝素不同，e 一选凝 素敲除小鼠的炎症反应未表现出明显的异常 3 3 。仔细研究e 一选凝素敲除小鼠，发现 这些小鼠粒细胞无慢速滚动( s l o w r o l l i n g ，约5 1 x m s ) 3 6 。同时阻断这些小鼠的 p 一选凝素，它们表现出严重的功能缺失，导致迁入腹膜炎的中性粒细胞数目急剧下降 和延迟超敏反应( d e l a y e dt y p eh y p e r s e n s i t i v i t y ，d t h ) 的水肿形成速度减慢。而 在正常的小鼠体内，抗p 一选凝素的抗体则无此作用 3 7 。这提示p 一选凝素和e 一选凝 素在功能上有交叉重叠。由于三种选凝素的基因紧密连锁在1 号染色体的一个约 3 0 0 k b 的基因簇里。这使得获得双敲除或三敲除的小鼠难度很大。尽管如此，人们还 是做成了双敲除e 一和p 一选凝素的小鼠 3 8 。与单敲除小鼠不同，双敲除小鼠对细菌 感染更敏感，大多数敲除小鼠会发展为口粘膜和皮肤的慢性炎症损伤。在肺炎链球菌 ( s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e ) 滴注刺激腹膜炎4 小时内，中性粒细胞的募集被完全阻 断，而2 4 小时以后，迁移的中性粒细胞数目与野生型的相同。这一数据有力说明p 一、 e 一选凝素介导早期的粘附而l 一选凝素则在较晚期介导中性粒细胞的迁移。 组织因子( t i s s u ef a c t o r ，t f ) 又称组织凝血活酶( t i s s u et h r o m b o p l a s t l l n ) 或组织凝血活酶因子( t i s s u et h r o m b o p l a s t i l nf a c t o r ) ，即凝血因子i i i ( f a c t o ri i i ) ， 它是一种跨膜糖蛋白，分子量为4 5 k d ，由2 6 3 个氨基酸残基组成。组织因子是唯一不 存在于正常人血浆中的凝血因子。该蛋白在脑、肺、胎盘等组织中含量丰富，而且组 织因子可在单核细胞、血管内皮细胞及多种组织细胞内合成。但在正常人血浆中并无 组织因子存在，在正常生理情况下，单核细胞及血管内皮细胞均无组织因子表达释放。 而在组织损伤、感染、内毒素血症及肿瘤等病理状态下，细菌脂多糖、白介素一l 、肿 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文 u b i q u i l i n 2 蛋白调控p - 选凝素胞内运输机制研究 瘤坏死因子及佛波酯等多种刺激剂均可诱导单核细胞及血管内皮细胞表达组织因子， 且均可使组织因子释放入血，从而启动凝血过程，导致血管内发生凝血 3 9 。在活化 的血小板可以诱导单核细胞表达组织因子的研究基础上，c e l l 等人研究了p 一选凝素 对单核细胞表达组织因子的影响 4 0 。研究发现：p 一选凝素能剂量依赖性诱导单核细 胞表达组织因子。在稳定表达p 一选凝素的c h o ( 中国仓鼠卵巢细胞，c h i n e s eh a m s t e r o v a r yc e l l s ) 细胞中能刺激单核细胞表达有前凝血剂活性的组织因子，而稳定表达 e 一选凝素的c h o 细胞或者正常的c h o 细胞则无此作用。相反，p 一选凝素抗体能特异 的抑制p 一选凝素和稳定表达p 一选凝素c h o 细胞的这种诱导单核细胞表达有前凝血剂 活性的组织因子的效应。其诱导机制为：与稳定表达p 一选凝素的c h o 细胞共同培养 后的单核细胞中会合成组织因子m r n a ，并在细胞表面表达组织因子。当然，p 一选凝 素和细菌脂多糖相比，其单独上调单核细胞表达组织因子的效力微乎其微。在血管损 伤部位，由p 一选凝素诱导的低水平组织因子表达可能对体内形成纤维蛋白具有重要 意义。p 一选凝素不仅能使单核细胞表面表达组织因子，而且能介导血小板和内皮细胞 与单核细胞、中性粒细胞的结合，最终导致炎症与血栓形成。由此可见，在血管损伤 部位，p 一选凝素与单核细胞的结合很可能是启动凝血机制的一部分。 肿瘤细胞与内皮细胞、细胞外基质粘附，是肿瘤细胞在血液中转移不可缺少的环节。 文献报道选凝素在此过程中也起了重要作用。k i m 等人用p 一选凝素、r a 9 2 双敲除小 鼠研究了p 一选凝素对肿瘤生长和转移的影响 4 1 。研究发现皮下接种人结肠癌细胞株 l s l 8 0 和t - 8 4 ，敲除鼠的肿瘤块较正常小鼠小得多。 3 h 胸腺嘧啶核苷代谢标记人结 肠癌细胞l s l 8 0 ，三小时后，正常小鼠肺、肝和肾等器官的放射强度均明显高于缺陷 鼠，这些数据提示血原性肿瘤细胞的迁移很可能在一定程度上是依赖p _ 选凝素的。体 外实验证明p 一选凝素还可介导经凝血酶处理的血小板与l s l 8 0 形成玫瑰花结。并且， 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文u b i q u i l i n 2 蛋白调控p 选凝素胞内运输机制研究 这种作用能被c a 2 + 的螯合剂消除。这种抑制作用类似于用o s o p a s e 处理l s l 8 0 ， o s g p a s e 能选择性地从细胞表面消化粘蛋白( m u c i n ) 。从p 一选凝素敲除鼠体内分离到 的血小板不能与l s l 8 0 形成玫瑰花结。提示这种依赖粘蛋白的细胞相互作用主要是由 p 一选凝素介导的。此外，包含p 一选凝素脂质体可与多种癌组织例如肺癌、神经母细胞 瘤、结肠癌和乳腺癌等以及相应细胞株相结合，同样p 选凝素单抗可抑制这种粘附作 用。另外肿瘤转移中，选凝素能识别并能结合肿瘤细胞表面糖抗原。由此可见，在肿 瘤转移中选凝素通过介导内皮细胞、血小板与癌细胞粘附发挥了重要作用。 鉴于以往对p 一选凝素的功能深入研究，人们意识到该类粘附分子在常见疾病一炎 症以及重大疾病一肿瘤转移中的重要生理意义。近年来，越来越多的研究者们想了解 在细胞内尤其在血管内皮细胞，血小板内，p 一选凝素是如何被调控上膜，或者迅速内 吞进入降解系统，以及其它胞内运输循环系统的呢? 我们通过酵母双杂交系统，利用 人p 一选凝素胞内段为诱饵，筛选人白细胞c d n a 文库，得到一系列能与p 一选凝素胞内 ， 段相互结合的蛋白。其中之一为人u b i q u i l i n - 2 蛋白。 泛素( 简称为u b ) 是一种高保守的蛋白质，其由7 6 个氨基酸组成。泛素可以游离形 式存在也可与细胞内其他蛋白质共价结合形式存在。在真核细胞中，泛素作用于底物 蛋白质的赖氨酸基团，使底物蛋白与多聚泛素链共价结合。随后，该底物蛋白质即被 2 6 s 蛋白酶体降解。由蛋白酶体介导的蛋白质降解是真核生物体内的一种主要的非溶酶 体蛋白降解途径。蛋白酶体主要由两部分组成，其中包括1 9 s 调控复合物以及2 0 s 核 心复合物。人们发现在生物体内存在许多泛素样蛋白，并把它们分成两大类：其中l 型泛素样蛋白例如，s u m o - 1 ，n e d d 8 等这一类蛋白主要是一些小分子物质，它们能够像 泛素一样以共价键形式结合在底物蛋白上。而另一类分子被称为2 型泛素样蛋白：这 类蛋白分子并不像1 型蛋白那样能与底物蛋白形成共价键结合。其中的典型代表就是 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文 u b i q u i l i n - 2 蛋白调控p 选凝紊胞内运输机制研究 u b i q u i l i n s 蛋白 4 2 。u b i q u i l i n s 蛋白的发现源自上个世纪末，人们在研究d n a 合成 抑制因子d a n 蛋白时，在成年大鼠的肺组织e d n a 文库中通过酵母双杂交系统成功筛选 到一种泛素样蛋白d a 4 1 能与之相结合。通过进一步的研究发现了该种蛋白在不同生物 种属的同源物。例如人的h p l i c 一1 ( 即u b i q u i l i n 一1 ) ，h p l i c 一2 ( 即u b i q u i l i n 一2 ) 蛋白， 小鼠的p l i c - i ，p l i c 一2 蛋白，青蛙的x d r p i 蛋白，以及酵母的d s k 2 蛋白等都是大鼠 d a 4 1 对应的各种同源物。人d a 4 1 ( 即u b i q u i l i n 1 ) 与大鼠d a 4 1 在氨基酸序列上有很 高的同源性，这些提示这类蛋白的结构及功能在进化过程中具有很高的保守性 4 3 ，4 4 ， 是一类发育保守的基因家族。 人类u b i q u i l i n s 基因家族主要可分为三类：u b i q u i l i n 一1 ，一2 ，及u b i q u i l i n - 3 u b i q u i l i n 一1 几乎可在所有的细胞或组织中检测到，尤其在脑下垂体，肾上腺，肾脏， 胸腺，以及胎盘中有高表达。人们通过荧光原位杂交( f l u o r e s c e n ei ns i t u f i s h ) 方法发现u b i q u i l i n - 1 的基因定位在人基因组中9 号染色体 上。u b i q u i l i n 一2 与u b i q u i l i n 一1 具有7 2 的同源性，w u 等人n o r t h e r nb l o t 检测了 小鼠胚胎组织器官中u b i q u i l i n 2 同源蛋白p l i c 一2m r n a 表达水平，发现其主要集中 在脑组织以及光滑肌肉组织中表达。通过g e n e b r i d g er a d i a t i o nh y b r i d s 方法发现 u b i q u i l i n - 2 基因定位在人基因组中x 染色体上。人，鼠的u b i q u i l i n - 3 则只在睾丸 中特异性的表达 4 5 。人类该基因定位在1 1 号染色体上。u b i q u i l i n s 蛋白在体内可 以形成双体分子，但是无论是单体还是双体蛋白都可发挥不同的功能。该基因家族编 码的蛋白均含有以下结构特点：这些蛋白均含有n 一末端泛素样结构域( u b ld o m a i n ) ， c 一末端泛素关联结构域( u b ad o m a i n ) ，以及一个n p x j 多重复模式( x 可为任何氨基酸， j 为疏水氨基酸) 的中心区域 4 6 。 到目前为止，人们对u b i q u i l i n s 蛋自家族的功能研究还不是很透彻。但u b i q u i l i n s 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文 u b i q u i l i n - 2 蛋白调控p - 选凝素胞内运输机制研究 蛋白目前所有的功能研究进展大部分都集中在u b i q u i l i n - 1 蛋白上。而对于其它 u b i q u i l i n 一2 ，u b i q u i l i n 一3 蛋白的研究则相对来说则少很多。但一般来说，人们在 研究u b i q u i l i n 一1 时总是会一并来探讨u b i q u l i n - 2 蛋白是否也有类似的功能作用。 结果显示在某些功能中，两者是具有相同的作用效果，而在另外一些功能中，两者并 不能产生相同的功能效应。 最初，人们发现u b i q u i l i n s 类蛋白的大鼠同源物d a 4 1 在静息态细胞中的m r n a 表达水平很低，但在细胞进入细胞周期s 期时m r n a 水平则显著提高。同时该蛋白能 与细胞中的d n a 合成抑制因子d a n ( 该蛋白在体外证明具有对细胞生长或肿瘤生长的 抑制活性) 以及表皮生长因子样蛋白s ( i - 5 ) 相互结合来调控细胞周期进程以及细胞的 生长 4 3 。后来又发现u b i q u i l i n s 蛋白u b i q u i l i n - i 能与一种通过调控蛋白翻译， 转录，膜转运以及蛋白降解来控制细胞周期进程和细胞生长的m t o r 蛋白特异性结合 4 6 。这两者的结合也给人们提示了u b i q u i l i n s 蛋白可能具有调控细胞生长，细胞 周期的功能。此外，u b i q u i l i n s 蛋白酵母同源物还参与纺锤体的复制，抑制c y c l i na 的降解，并以此来调控细胞周期。 人们对u b i q u i l i n s 蛋白在连接蛋白酶体系统与蛋白泛素化系统中的作用也有所研究。 研究表明，u b i q u i l i n s 蛋白既能与e 3 泛素蛋白连接酶，也能与泛素化的蛋白质相结 合。而且其还能与蛋白酶体的s 5 a ( s 5 a 是1 9 s 复合物的一个亚基，其介导蛋白质的降 解) 相结合 4 7 。u b i q u i l i n s 类蛋白的u b l 、u b a 结构域两者都分别能与蛋白酶体相结 合。同时该类蛋白还能和蛋白酶体以及泛素连接酶三者相互结合形成大的复合物，由 此可干扰细胞内一些依赖泛素的蛋白酶体底物( 例如：p 5 3 ，ikba ) 蛋白的降解 4 8 。 从u b i q u i l i n s 蛋白的结构特点与泛素结构域类似的角度来看，人们首先推测该类蛋 白的功能也可能与泛素类似，既有利于蛋白酶体降解相关泛素化蛋白。而事实上通过 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文 u b i q u i l i n - 2 蛋白调控p - 选凝素胞内运输机制研究 研究表明，u b i q u i l i n s 蛋白并不一定促进目的蛋白的降解。相反，该类蛋白不但可以 保护目的蛋白免受蛋白酶体的降解，甚至可以促进目的蛋白的聚集。 近年来，人们越来越多的发现u b i q u i l i n s 蛋白与阿尔茨海默氏疾病有着密切的关 联。比如，在阿尔茨海默氏( 早发性老年痴呆症) 病人及帕金森病人的脑部，u b i q u i l i n s 类蛋白( u b i q u i l i n 一1 和u b i q u l i n 一2 ) 能以单体活性形式与由于蛋白突变导致早发性 老年痴呆症的p r e s e n i l i n l 和p r e s e n i l i n 2 蛋白相结合，并促进p r e s e n i l i n 蛋白在 相应神经细胞中的聚集 4 9 。过量表达u b i q u i l i n 蛋白能够减少p r e s e n i l i n 蛋白的 泛素化及其蛋白降解 6 5 。同时，u b i q u i l i n s 蛋白能够调控p r e s e n i l i n 蛋白水解， 以及能够调控与p r e s e n ili n 蛋白发挥其活性相关的一系列蛋白比如，g a m m a 一分泌酶 复合体，p e n - 2 及n i c a s t r i n 蛋白在细胞内的蛋白水平 5 0 。不仅如此，u b i q u i l i n l 蛋白还可调控阿尔茨海默氏疾病相关联的另一因子：淀粉样前体蛋白( a p p ) 研究表 明u b i q u i l i n 一1m r n a 水平的变化可直接影响到细胞中淀粉样前体蛋白a p p 在细胞内 的运转以及该蛋白的成熟情况，进而影响淀粉b 一蛋白的分泌 5 1 。值得关注的是， 新近美国科学研究者们通过统计学分析论证：u b q l n l ( 人u b i q u i l i n 一1 ) 基因的遗传 变异是加重阿尔茨海默氏疾病的一个诱因。可有趣的是这一研究结果却很快陆续被其 他科学研究者们一一否定了 5 2 ，5 3 ，6 6 ，6 7 ，6 9 ，7 3 ，7 4 。为什么不同的研究者们得出不 同的结论呢? 是否应该将u b i q u i l i n - i 的家族中的其它同源蛋白的基因变异一并考虑 进来研究呢? 到目前为止，u b i q u i l i n 基因变异与阿尔茨海默氏疾病的发展关系还有 待迸一步的探讨。除阿尔茨海默氏疾病以外，u b i q u i l n l 蛋白还在人成神经细胞瘤中， 与对于嗅觉以及外周自主神经发育非常重要的转录因子蛋白h a s h 一1 相互结合并调控 该转录因子在细胞中的蛋白水平。这一点对于人们进一步认识成神经细胞瘤有着新的 提示 5 4 。而且，u b i q u i l i n 蛋白还与病变大脑内的神经原纤维紊乱以及l e w y 小体的 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文 u b i q u i l i n 2 蛋白调控p - 选凝素胞内运输机制研究 包含体相关联 5 5 。u b i q u i l i n 一1 ，u b i q u i l i n 一2 二者均可与t o l l 结合蛋白( t o l l i p ) 这一类的蛋白质相关联( 这些蛋白质通常是聚集并相互制约的) 。在杭廷顿