（细胞生物学专业论文）人乳过氧化物酶（lactoperoxidase）转基因小鼠模型的建立.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注 和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研 究成果，也不包含为获得山东师范大学或其他教育机构的学位 或证书使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：王谱岩 签字日期：2 0 0 4 年4 月勰日 导师签字：u 甲 签字日期：2 0 0 4 年立 7 u 、 in?j ju 日 止嗽 山东师范大学硕士学位论文 人乳过氧化物酶转基因小鼠模型的建立 人乳过氧化物酶转基因小鼠模型的建立 中文摘要 乳腺生物反应器是一种利用动物转基因技术在乳腺细胞中表达多肽药物、工 业酶、疫苗和抗体等蛋白的技术。该技术具有低投入高产出的特点，其效率是利 用以大肠杆菌和动物细胞培养技术的一百倍，是一种非常有潜力的高新技术。1 9 8 7 年，s i m o n s 等人在转基因小鼠乳腺中首次成功地表达羊乳球蛋白基因，并且小鼠 奶样中的蛋白含量高达2 3 克升，大约是动物细胞表达蛋白的4 0 0 倍以上。该技 术一经出现就得到迅猛的发展。许许多多的著名科学家都认为这将是畜牧业前所 未有的革命。可能会给社会带来巨大的经济效益。尤其，随着动物克隆技术成熟， 转基因技术得到了更充分的发展。这将使乳腺生物反应器的大规模生产更加现实， 因此一场围绕该技术的国际性竞争将是必然。 本项研究主要是建立在乳腺细胞中高效表达人乳过氧化物酶( l p o ) 基因的转 基因小鼠模型。人乳过氧化物酶属于哺乳动物亚铁血红索超家族，广泛存在于各 种哺乳动物乳汁及其它分泌物中，在过氧化氢存在的情况下可以氧化硫氰酸和其 它一些物质，通过这种反应乳过氧化物酶就可以杀死或抑制细菌，同时清除氧自由 基。因此它除了可以抑杀细菌、预防疾病外又是一种延缓衰老的天然保健品，是 哺乳动物防卫系统中重要的组成部分。它的价值已经越来越为人们所重视，现今 已经在乳制品的保藏、饲料添加、临床医学上得到广泛应用。 人乳中乳过氧化物酶占人乳中所有蛋白总量的0 0 0 4 ，活性约为牛乳的1 2 0 。 随着对奶制品需求的增加，奶制品的品质也越来越受到人们的关注。利用乳腺生 物反应器的方法改造奶牛、奶山羊，使生产出的奶成分近似于人奶，既有营养的 功能，又有药用的功能。这种奶可以使孩子长得高大，促进大脑和神经发育，增 强免疫功能，这种新型保健品一定会有广阔的前途。我们的研究就是以小鼠为动 物模型进行乳腺特异表达外源人乳过氧化物酶酶的研究。 为了获得乳腺高效表达人乳过氧化物酶的小鼠模型，我们构建了p b c l 一h l p o 人乳过氧化物酶基因表达载体，核期小鼠胚胎制备转基因小鼠 载体p b c l 一h l p o 由山羊b e t a c a s e i n 启动子指导，还包含鸡b a t a - g l o b i n 隔 离子、及外显子1 、2 和内含子1 。利用显微注射方法注射原共出生2 8 只，用p c r 和s o u t h e r n 杂交的方法检测在出生5 只为转基因小鼠，转基因阳性率约为1 8 。 为检测转基因小鼠的乳样中人乳过氧化物酶的表达情况，根据人乳过氧化物 酶的三级预测结构，设计合成多肽c s a i dk l d l s p w a s vk n ，与k l h 偶联后免疫大白 兔，取抗血清用e l i s a 法检测，效价达5 0 0 万倍，完全可以用于转基因小鼠乳样 的w e s t e r n 检测。 关键词：人乳过氧化物酶、转基因小鼠、乳腺生物反应器 分类号：q 2 9 1q 7 8 4 山东师范大学硕士学位论文 人乳过氧化物酶转基因小鼠模型的建立 e s t a b l i s h m e n to ft r a n s g e n i cm o u s em o d e le x p r e s s i n g h u m a nl a c t o p e r o x i d a s e a b s t r a c t t h em a m m a r yg l a n db i o r e a e t o ri st h et e c h n i q u et h a t ak i n do fu s i n g a n i m a lt r a n s g e n i ct e c h n o l o g yt oe x p r e s sp r o t e i n s ，i nm a m m a l j a nc e l l s ，s u c h a sp b a r m a c e u t i c a lp o l y p e p t i d e ，i n d u s t r ye n z y m e ，v a c c i n e ，a n t i h o d y a n de t c t h i sp o t e n t i a lt e c h n i q u ei sc h a r a c t e r i z e db yp r o d u c i n gh i g ho u t p u ti nl o w c o s t ，i t se f f i c i e n c yi sa s1 0 0t i m e sa st h a to fc u l t i v a t i n g e c h e r i c h i a c o l ia n da n i m a lc e t i s i n1 9 8 7 ，t h es i m o n sf i r s ts u c c e s s f u l l ye x p r e s s e d s h e e pm i l kg l o b u l i ng e n ei nm a m m a r yg l a n d so ft r a n s g e n i cm i c e w h a t sm e r e ， t h ec o n c e n t a t i o no ft h i sr e c o m b i n a n tp r o t e i ni su pt o2 3g 1 ，w h i c hi sa b o u t 4 0 0t i m e sh i g h e rt h a nt h a te x p r e s s e db ya n i m a lc e l l s t h et e c h n i q u ea d v a n c e d w i t hr e m a r k a b l es p e e ds i n e ei t sa p p e a r m a n yf a m o u ss c i e n t i s t sa l lc o n s i d e r i t i sa nu n d r e c e d e n t e dr e v o l u t i o ni na n i m a l h u s b a n d r yw h i c hm a yb r i n g t h es o c i e t ye n o r m o u se c o n o m i cr e s u l t s e s p e c i a l l v w i t ht h ed e v e l o p m e n t o fc l o n e ，t h et r a n s g e n i ct e c h n o l o g ya l s oh a sg o tw e l ld e v e l o p e d t h i sw i i i m a k et h e l a r g e s c a l ep r o d u c t i o no ft h em a m m a r yg l a n d sb i o r e a c t o rm o r e r e a l i s t i c ，t h e r e f o r ea ni n t e r n a t i o n a lc o m p e t i t i o na r o u n dt h i st e c h n i q u e w i l lb ei n e v i t a b l e t h i sr e s e a r c hi st oe s t a b l i s ham o d e lo ft r a n s g e n i cm i c ew h i c hc a n e x p r e s sh u m a nl a c t o p e r o x i d a s e ( l p o ) e f f i c i e n t l yi nm a m m a r yg l a n dc e l l s m a i n l y l a c t o p e r o x i d a s eb e l o n g s t om a m m a l i a nh e m e p e r o x i d a s e s u p e r f a m i i f ，i tc a nw i d e l yb e f o u n di nm i l ka n do t h e rs e c r e t o r yf l u i d i tc a no x i d a t et h i o c y a n a t ea n do t h es u b s t r a t e su n d e rt h ec i r c u m s t a n c e so f h 2 毡，b y t h i s r e a c t i o n ，h u m a n1 a c t o p e r o x i d a s e c a nk i l lo ri n h i b i tt h e g e r m s ，a n de l i m i n a t eh 2 0 z a tt h es a m et i m e i nc o n s e q u e n c e ，i ti sa l s oa n a t u r a lh e a l t hc a r e g o o d sw h i c hc a l ld e l a y s l o wd e a t hi na d d i t i o nt o p r e v e n t i n gd i s e a s eb yr e p r e s s i n ga n dk i l l i n gb a c t e r i u ma n di sa ne s s e n t i a l c o m p o n e n to ft h ed e f e n c es y s t e mi nm a m m a l i a n i t sv a l u ei sm o r ea n dm o r e v a l u e e db yp e o p l e ，n o w a d a y s ，i th a sb e e nw i d e l yu s e di n k e e p i n gi ns t o r e o fd a i r yp r o d u c t s 、f o d d e ri n c r e a s i n g 、a n do nt h ec li n i c a lm e d i c i n e 。 l a c t o p e r o x i d a s ew h o s ea c t i v i t yi sc o r r e s p o n dt o1 2 0o fc o w sr e p r e s e n t s a b o u t0 0 0 4 o ft h et o t a lp r o t e i ni nc r u d eh u m a nm i i k w i t hi n c r e a s ei nm i l k c o n s u m p t i o n s ，t h eq u a l i t yo fm i l ki sm o r ec o n c e r n e d i ti st h r o u g hm a m m a r y g l a n db i o r e a c t o rt h a tm i l ko fb o v i n ea n ds h e e pm a yb e c o m es i m i l a rt oh u m a n m i i k ，w h i c hh a sn u t r i t i o n a la n dm e d i c a lf u n c t i o n t h er e c o n s t r u c t i r em i l k i sap r o m i s i n gp r o d u c t ，w h i c hp r o m o t e sc h i i d r e ng r o w t ha n dd e v e l o p m e n to f n e r v es y s t e ma n db r a i na n di m m u n i t ya b i l i t y o u rr e s e a r c hi st oe s t a b l i s h t r a n s g e n i c m o u s em o d e lw h i c h h i g h l ye x p r e s s e sr e c o m b i n a n th u m a n l a c t o p e r o x i d a s ei nm a m m a r yg l a n d i no r d e rt oe s t a b li s h t h em o k i s e m o d e i ，p b c i - h l p ow a sc o n s t r u c t e d 山东师范大学硕士学位论文 人乳过氧化物酶转基因小鼠模型的建立 t r a n s g e n i cm i c ew e r eg e n e r a t e db yf e r t i l i z e do o c y t em i c r o i n j e c t i o nw i t h t h ec o n s t r u c t s p b c i h l p oe x p r e s s i o n v e c t o ri s c o m p o s e d o fc h i c k e n b e t a g l o b i n i n s u l a t o r ，g o a tb e t a - c a s e i np r o m o t e r ，b e t a c a s e i ne x o n1 、2 ，b e t a - c a s e i n i n t r o nl ，t h eh u m a nl a c t o p e r o x i d a s e e n c o d i n gr e g i o na n d3 t e r m i n a t i o n r e g i o n a sf o rp b c h l p oe x p r e s s i o nv e c t o r ，2 8m i c ew e r eb o r n ，a n d5 p o s i t i r e t r a n s g e n i cm i c ew e r ei d e n t i f i e db yp c ra n dc o n f i r m e db ys o u t h e r nb l o t t i n g a n a l y s i so ft a i ld n a t h ei n t e g r a t i o nr a t ei s1 7 8 6 i no r d e rt oe x a m i n a t er e p r e s s i o no fh u m a nl a c t o p e r o x i d a s ei nt h em i l ko f t r a n s g e n i cm i c e ，b a s e do nt h et h i r dc l a s sp r e d i c tc o n s t r u c t i o no fh u m a n 1 a c t o p e r o x i d a s e ，p o l y p e p t i d ec s a i dk l d l s p w a s vk ni ss y n t h e t i s e di nt h e d e s i g n ，u n i t e dw i t hk l ha n dt h e ni m m u n i t e dw h i t er a b b i t s ，e x a m i n a t e d a n t i b o d yg o tf r o mt h er a b b i t si nt h ew a yo fe l i s a sl a w t h ee f f e c tp r i c e i su pt o5m i l l i o nt i m e s ，t h a ti st o s a y ，i tm a yb eu s e di nw e s t e r n b l o t t i n ge x a m i n i t i o nt h em i l ko ft r a n s g e n i cm i c ec o m p l e t e l y 。 k e y w o r d s ：h u m a n1 a c t o p e r o x i d a s e 、t r a n s g e n i c m i c e 、m a m m a r yg l a n db i o r e a c t o r c a t e g o r y ：q 2 9 1q 7 8 6 山东师范大学硕士学位论文 人乳过氧化物酶转基因小鼠模型的建立 第一章文献综述 第一部分乳过氧化物酶的研究现状 乳过氧化物酶( l p o ) 是一种多功能的防御蛋白，是哺乳动物防卫系统中重要 的组成部分。它能抑制许多微生物生长、代谢活动或直接杀死病原微生物：乳过 氧化物酶系统( l p s ) 是种天然的，具有实际应用价值的抗菌体系。乳过氧化物 酶在动物界中广泛存在，牛和人哺乳期的各个阶段的乳中都有乳过氧化物酶表达 ”。牛乳过氧化物酶是牛乳中仅次于黄嘌呤氧化酶含量最多的酶类，达3 0 m g l ；人 乳中乳过氧化物酶占人乳中所有蛋白总量的0 0 0 4 ，活性约为牛乳的1 2 0 ：迄今 发现豚鼠的乳中乳过氧化物酶含量最高。1 9 4 3 年，t h e o r e l l 及a k e s s o n 从乳中将过 氧化物酶分离纯化，并命名为乳过氧化物酶( l p o ) 。除乳汁外，其它分泌物中也发 现有乳过氧化物酶存在，如唾液、泪液、子宫颈粘液及鼻腔分泌物中等，在一些 粘膜表面也有乳过氧化物酶存在。例如小鼠的乳汁和子宫分泌物都不含有乳过氧 化物酶，但其泪腺中乳过氧化物酶含量较高”。 乳过氧化物酶在杀死或抑制细菌的一系列反应同时可以清除对机体有害的氧 自由基，因此它除了可以抑杀细菌、预防疾病外又是一种延缓衰老的天然保健品。 它的价值已经越来越为人们所重视，现今已经在乳制品的保藏、饲料添加、i 临床 医学上得到广泛应用。 一乳过氧化物酶的基因结构 人乳过氧化物酶基因长2 9 8 k b ，包含l _ 5 k b 上游调控区、1 2 个外显子和1 1 个内 含子，其编码区长2 1 3 6 b p ，形成的蛋白长7 1 2 个氨基酸残基“。人l p o 基因的一个很 显著的特征是在内含子2 的5 。末端，有一段很长的a c 区：( a c ) 。其( 嘌呤一嘧 啶) 。序列能形成左手双螺旋( z 形式的d n a ) ，这段序列可能在基因表达和同源重组中 起作用。将人l p o 基因的外显子i i 、内含予1 l 和外显子1 2 组成的基因片段导 入c o s 细胞，内含子1 1 仍能正确剪接，表明内含子1 1 是有功能的。以人基因组d n a 为模板设计引物，进行p c r 扩增，将扩增出的外显予“一1 2 间片段测序，发现内含 子1 1 是以g c 开始的，不符合g t a c 规则，其它外显子内含子的连接都符合g t a c 原则；而以牛基因组d n a 为模板扩增包含内含子1 1 的牛l p o 基因片段，测序结果 表明，牛l p 0 基因内含子1 1 是以g t 开头的”。人体中还有一些基因的内含子也不遵 守g t - - a c 原则，已报道的有人肌肉乙酰胆碱供体y 亚单位的前体”、人细胞色素 p 4 5 0 ( s c c ) 、人c u z n 过氧化物歧化酶”、鸡和鸭o 球蛋白的基因“”。在 鸟类a 样球蛋白中，a 。球蛋白的数量比a 球蛋白的数量少，这可能是因为a 。球蛋 白的表达受r n a 剪接的调节；在兔b 一球蛋白基因中，当g t 被人工变异为a t ，r n a 剪接 也能发生在g c 上“”；鼠。晶状体球蛋白基因的r n a 剪接可能发生在g t 或g c 上，但 是发生在g c 上的机率较小“”；同样，人l p o 基因的r n a 剪接位点为g c ，其表达量较 低；而牛l p o 基因的r n a 基因剪接位点为g t ，其表达量较高“”。因此，l p o 的表达 水平可能要受r n a 剪接的调节 人初乳中古有l p o ，但在生产一周后降低到几乎检测不到“”，其表达可能受生 产前后表达水平变化较大的一些激素和因子的调节。把入l p o 启动子的核苷酸序列 7 山东师范大学硕士学位论文 人乳过氧化物酶转基因小鼠模型的建立 与乳中的一些因子、调节乳汁分泌的因子及与生产相关的激素比较，发现鼠的i g a 类型的骨髓瘤蛋白( 在乳中大量存在，有促进分泌功能) ”、牛泌乳刺激素( 一 种主要的泌乳调节因子) “”、人脑下垂体激素( 能诱导子宫收缩和乳汁分泌) “6 的基因中都有与人l p o 启动子相似的序列。在鼠酪蛋白( 乳蛋白中的一种主要成 分) 启动予中也有相似的序列，这个区段可能是糖皮质激素反应元件“”，表明人 l p o 的表达要受糖皮质激素的调节。人l p o 启动子的核苷酸序列与雌激素反应元件 的序列相似”；实验鼠的雌激素依赖性乳房瘤含有过氧化物酶活性的颗粒“”o ，说明人l p o 基因的表达也受雌激素的调节。与人l p o 不同的是牛l p o 的活性能保 持较高水平，因此，深入研究人与牛l p o 的启动子结构和功能的差异具有重要意义。 二哺乳动物亚铁血红素超家族 乳过氧化物酶、髓过氧化物酶( m p o ) 、嗜曙红细胞过氧化物酶( e p o ) 、甲状腺 过氧化物酶( t p o ) 共同组成了哺乳动物亚铁血红素超家族。前三者在机体的防卫 机制中起重要作用。以人为例，m p o 和e p o 分别存在于嗜中性粒细胞和嗜曙红细胞 中，氨基酸序列有6 1 的同源性，l p o 编码区的核苷酸序列与m p o 、e p o 的同源性分 别为6 1 和6 3 ，三者氨基酸序列同源性为5 1 ”，其活性区的同源性更高，在结构 上起重要作用的氨基酸，如酯键、钙离子结合位点附近及米端的组氨酸等都非常 保守。l p o 亚铁血红素活性位点周围7 范围内有8 4 的氨基酸序列与m p 0 相同”； 而且l p o 基因在染色体上的位置与m p o 基因相邻，两者以尾对尾方式排列，e p o 的基 因也在m p o 基因附近；而且三者基因组织形式也很相似”，所有这些都表明这 三种过氧化物酶基因可能由一个共同的基因进化而来；这三者的基因都在染色体 1 7 上，丽t p o 的基因位于染色体2 上，而且t p o 基因的组织形式也与前三者明显不同 ”“，这或许表明t p o 的基因进化途径与其余三种乳过氧化物酶不同。人l p 0 5 ，端 启动子序列包括一个类t a t a 框( a a t a t t a ) 和个典型的八聚体转录因予( o l 、f ) 识别区( a t t t g c a t ) ，分别在起始密码子a t g 上游l l o b p 和7 4 3 b p 处这与m p o ，e p o 不 同，这可能与它们在不同组织中特异性表达密切相关“1 。 人m p o 、e p o 先分别合成包含p r e 和p r o 序列的| j i 体蛋白，其中p r e 序列有信号肽 功能”使过氧化物分泌到过氧化物酶体”。两者的前体蛋白都分为两个亚 单位：n 一末端的轻链和c 一末端的重链，成熟的m p o 包括两条重链和两条轻链，由 二硫键联结形成四聚体 ( 0 ) 。 ”。分子量1 4 5k d a ”：而成熟的e p o 是由一条 重链和一条轻链形成的二聚体”，分子量为7 0k d a 。人l p o 的信号肽可能是翻 译起始密码子a t g 后有大约2 0 个a a 的一段疏水序列”1 ，牛和人的l p o 都由一条多肽 链组成，分子量分别为7 8 k d a 和8 0k d a 。l p o 、m p o 、e p o 年f l t p o 都是含有亚铁血红 素的过氧化物酶，各种过氧化物酶的血红素结合位点出细胞色素c 过氧化物酶决定 结合位点包含一个组氨酸1 。k i m u r ae ta l 通过对t p o 和m p o 细胞色素c 过氧化物 酶氨基酸序列比较，认为t p o 的组氨酸1 0 7 可能是一个血红素结合位点相应的组氨 酸残基也能在人l p o ( 组氨酸3 8 3 ) ，m p o ( 组氨酸3 9 0 ) 和e p o ( 组氨酸3 8 8 ) 找到，而且 组氨酸周围的序列也比较保守，表明这是l p o 、m p o 和e p o 的血红素结合位点”。 三乳过氧化物酶的结构与功能 1 乳过氧化物酶的结构 乳过氧化物酶由一条多肽链组成，n - 端为亮氨酸，含有一个血红素基团。通 8 山东师范大学硕士学位论文 人乳过氧化物酶转基因小鼠模型的建立 过钙离子的鳌合作用形成稳定结构。血红素基团通过1 一，5 - 甲基分别与谷氨酸和天 冬氨酸相连，5 一羟甲基可能在1 一羟甲基之前形成”。交联过程与髓过氧化物酶 ( m p o ) ，嗜曙红细胞过氧化物酶( e p o ) 不同，这可能是导致它光学性质、氧化能力、 底物特异性等与m p o 、e p o 不同的主要原因。最新研究表明，苯丙氨酸在l p o 发 挥其功能的过程中扮演着重要的角色，有阴种可能的作用方式：1 、苯丙氨酸可能 在卟啉环的取代作用或者在s c n 一氧化作用中对l p o 的结构起稳定作用，也可能两种 方式同时存在：2 、通过控制亚铁血红素的氧化还原程度来起作用”。 2 乳过氧化物酶的功能 乳过氧化物酶系统的抗菌作用 乳过氧化物酶本身没有抗菌作用，但与h 。0 。，s c n 一可共同组成具有抑菌和杀菌 作用的体系，这一体系称之为乳过氧化物酶系统( l p s ) 。许多微生物细胞的结构和 成分如外膜、细胞壁、传输系统、糖酵解酶系、核酸等，都可被l p s 改变。2 0 年来 的研究表明，充分激活的l p s 可以抑制和杀死革兰氏阴性、过氧化氢酶阳性细菌， 如李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌以及其它一些 有害的革兰氏阴性菌，但对各种类型的哺乳动物细胞却没有任何毒副作用。李斯 特菌为食物中毒菌，空肠弯曲菌为可致人类急性肠炎的重要致病菌，大肠杆菌和 沙门氏菌也均为常见致病微生物，这充酶阴性细菌，但却不能杀死它们，例如乳 酸菌”。 清除氧自由基 乳过氧化物酶在h 。0 。存在的情况下，可以氧化多元酚，芳香胺，和某些无机化 合物。通过这种反应，乳过氧化物酶就可以清除氧自由基，氧自由基是威胁人类 健康和衰老的最大敌人，研究表明：氧自由基和大部分常见的主要疾病都有关系。 从人类死亡率最高的心脑血管疾病，到最可怕的癌症，以及对人类造成最大威胁 的爱滋病，都与自由基有关。衰老的自由基理论认为：衰老是氧自由基对细胞成 分的有害进攻造成的，维持体内适当水平的抗氧化剂和自由基清除剂可以延迟寿 命和推迟衰老。由此可见，乳过氧化物酶对预防疾病和推迟衰老是十分重要的。 四乳过氧化物酶系统的作用机理 l p o 、m p o 、e p o 的作用机制非常相似，我们以l p s 为例简要介绍其作用过程： l p o + h 2 0 。一复合物i + 1 t 2 0 复合物i + 卤化物( 或类卤化物) 一l p o + 次卤酸 产物次卤酸是一种细胞毒素，能与蛋白交联，抑制酶和细胞因子的活性，在免疫 监视和机体的防卫机制中起重要作用。复合物i 还能以另外一种形式来完成其氧 化作用”： 复合物i 十a 一一复合物i i 十a 复合物i i + a - - - l p o + a 十h 2 0 其中a 一为非特异性底物，当前乳过氧化物酶的抗菌作用足一个热门话题，其作 用方式为：如果a 是硫氰酸盐，其反应为： l p o s c n 一+ h 她一o s c n 一+ h , o h z 0 2 氧化s c n 一生成次硫氰酸( h o s c n ) ，h o s c n 被解离，主要以次硫氰酸根离子 ( o s c n 一) 形式存在，l p o 的催化导致o s c n 一的积累，活性物质o s c n 一能使蛋白质的 巯基氧化，这样蛋白质上的酪氨酸、色氨酸、组氨酸残基也就被修改了，从而钝 9 山东师范大学硕士学位论文 人乳过氧化物酶转基因小鼠模型的建立 化了一些有活性的具有同化作用的细菌酶，阻断了细菌的新陈代谢及增殖能力， 从而达到抑菌的目的2 ”。另一方面，在完成上述反应的过程中，氧自由基也以h z o z 的形式在l p o 的催化下被清除。 五乳过氧化物酶的应用 1 用作“冷杀菌”工艺 l p s 的应用主要基于它的抗菌、抑菌特性，目前已经广泛应用于原料乳、巴氏 消毒乳、酩乳、酸乳、乳浊液以及化妆品的保减。乳过氧化物酶的等电点较高 ( p h 9 2 ) ，在弱酸性条件( p h 5 6 5 ) 下活性较强( w e v e r ，e t a l 1 9 8 2 ) ，但稳 定性差些( c a r m e n ，e t a 1 9 9 0 ) 。l p o 热稳定性相当高，其活性在加热到6 3 ， 保持3 0 分钟的条件下仍存有7 5 的活性，热处理温度小于或等于7 5 时，l p o 活性 相对比较稳定，但在较高的温度下，l p o 活性显著降低，一般来说，8 0 下加热几 分钟后，l p o 活性存留极微。作用最佳的温度为3 5 一4 0 ，这对高温地区鲜奶的 长时自j 采集和运输具有实际意义。更重要的是，乳过氧化物酶系统对人体无毒害 作用，牛乳饮用前的常规加热消毒处理，就可将残留的o s c n 一全部消除”。乳过 氧化物酶系统在巴基斯坦，墨西哥，肯尼亚和斯累兰卡等国已成功的用来保存鲜 牛乳。 2 用作饲料添加剂 乳过氧化物酶系统作为天然的抗菌系统，已成为哺乳动物抗菌感染的防卫系 统的一部分。新出生的牛犊和人类都具有这一系统，间接的提供了乳过氧化物酶 系统重要性的证据。母乳为新生儿提供的不仅是营养物质，而且也提供保护性的 抗菌因予，但由于在犊牛的代乳料加工过程中，这些因予大多受热变性而失去作 用，用乳过氧化物酶系统代替抗生素添加于猪、牛等动物的饲料中饲喂家畜，结 果表明，与对照组相比，犊牛的采食量及生长速度都有明显改善，腹泻也大大降 低”。 3 乳过氧化物酶系统用于临床医学 许多病原菌引起牛乳房炎，主要有缺乳链球菌、泌乳障链球菌、会黄色葡萄 球菌，其次还有牛棒状杆菌及些肠杆菌等，引起环境性乳房炎的微生物有大肠 杆菌及乳房链球菌，乳过氧化物酶体系可抑制这些微生物的生长繁殖。乳过氧化 物酶可能是通过抑制或杀死人体内的病毒，也可能是通过降低了人免疫缺陷病毒 编码蛋白质的转录从而利于肿瘤的治疗，l p o _ _ g 0 ( 葡萄糖氧化酶) 一1 9 体系 已被用于肿瘤治疗并取得较好效果。 此外，乳过氧化物酶还可还可用于化妆品，眼药水，口腔卫生及伤口处理等 方而。国外已有添加乳过氧化物酶系统的牙膏销售，这种牙膏是台有乳过氧化物 酶与葡萄糖氧化酶、溶菌酶等成分，具有良好的市场。 由于s c n 一天然存在于很多食品体系中，有关l p s 及其组分在医药、功能性食品中的 应用i j l 景十分广阔。深入研究乳过氧化物酶的功能及乳过氧化物酶系统的作用机 理，不仅有利于我们在已有基础上更好地利用其为人类造福，随之而来的经济价 值和社会效益也相当可观。 第二部分转基因动物的研究进展 i o 山东师范大学硕士学位论文 人乳过氧化物酶转基因小鼠模型的建立 所谓转基因，就是用实验方法，将人们所需要的外源基因导入到动物体内， 这种外源基因与动物本身的染色体整合，这时外源基因就能随细胞的分裂而增殖， 在动物体内得到表达，并能稳定的遗传给后代。最早采用动物转基因方法是 1 9 7 6 年j a e n i s c h 利用反转录胚胎的方法进行转基因。最早采用原核注射方法开展 动物转基因的是g o r d o n ( 1 9 8 0 年) ”，p a l m i t e r ( 1 9 8 2 年) 将大白鼠的生长激素基 因注射f u 4 , 白鼠受精卵内，并经移植和胚胎发育成功的培育出体型明显大于正常 小鼠的超级鼠”，这一成果在当时引起轰动。之后，人们又成功获得了转基因大 鼠、鸡、猪、鱼、兔、羊、牛、蛙等。由于转基因动物具有潜在的巨大经济效益， 因此，目前已成为生物技术研究领域的一大热点。 一转基因动物的制作方法 转基因动物的制作方法目前主要有原核期胚胎的显微注射、逆转录病毒载体 法、精子载体法、e s 细胞介导法、人工酵母染色体( y a c ) 法、p g c s 技术、转基 因克隆动物技术等，此外，还有基因打靶法、染色体片段注入法、电脉冲法、原 生殖细胞介导的转基因技术等。 1 原核期胚胎的显微注射法 0r w 一神* 。“r u e t0 激：嚣絮：i 鬈 0 勰嚣黧：麓。 苷方法由美国人g o r d o n 发明，是目前应用比较广泛，效果比较稳定的转基因 导公的方法之一( g o r d o n1 9 8 0 ) 。其基本原理是通过显微操作仪将外源基因直接用 注射器注入受精卵的原核内，利用受精卵繁殖中d n a 的复制过程，将外源基因整 燃 f 山东师范大学硕士学位论文 人乳过氧化物酶转基因小鼠模型的建立 合到d n a 中，发育成转基因动物。小鼠的卵核微注射已经很普遍，但是在家畜上 由于卵的不透明性而使这种技术不能有效利用，用微分干涉显微镜( d i c ) 可辨别 兔和绵羊的卵核。猪，牛卵母细胞的不透明性比较严重，即使d i c 也不能分辨卵 核，为了克服这一障碍，可以将猪，牛的卵以1 5 0 0 0 9 速率离心，使原生质分层， 原核或核留在清晰的赤道层内，这样用d i c 就能很容易的看到卵核，并进行核 注射。影响显微注射结果的因素有：第一，操作者的熟练程度。对一批受精卵来 说，每次注射时间以控制在2 5 m i n 以内为好。用显微操作是在模拟体内生理环境 的体外培养基中进行的，长时间注射使受精卵过度暴露在室温及空气中，培养基 的p h 值及渗透压改变，即受精卵生存的微环境发生改变，从而影响受精卵的质量。 第二，注射基因的浓度。从理论上讲，目的基因的整合效率与注射基因的浓度成 正比，注射基因的浓度越大，整合机率越高，但整合机率越高，基因整合部位越 多，毒性越大，出现致死的机率也越大，因此，应综合考虑，选择适当的基因浓 度。第三，目的基因在宿主中是否表达以及表达量高低主要取决于目的基因本身 所具的顺式调控元件。虽然原核注射法作为最主要的一种转基因手段在生物医 学的各个领域发挥重要作用，但也有不足之处：一是整合效率低，成本比较高。 小鼠整合成功率只有1 左右，家畜及其他动物成功率更低。二是不能定点整合， 具有随机性。外源基因被注入原核后，其插入染色体是完全随机的，可以插入到 受体基因组中的任意位置，容易导致内源有利基因结构破坏，失活或激活有害基 因( 如癌基因) 。三是所用注射针很细，故不能操作大片段外源基因的重组体。 2 逆转录病毒感染发育早期的胚胎 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度的病毒颗粒，人为感染着 床前或着床后的胚胎，也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵 育，以达到感染的目的。通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组d n a 中 去，这是最早使用的动物转基因方法，其基本原理是：当反转录病毒的r n a 进入 细胞后，反转录成d n a ，依靠反转录病毒的整合酶极其末端特异的核苷酸序列，d n a 可以整合到染色体上，从而将所携带的外源目的基因插入到染色体上。以逆转录 病毒为载体导入外源基因时。外源基因多属单拷贝整合，这一点有别于显微注射 法和精子载体法。应用该方法，s a l t e r 等用禽白血病毒感染早期的鸡胚胎制作了 转基因鸡“”，h a s k e l l 等制作了转基因牛“”。用该方法生产转基因动物具有整合 率高且技术难度不大，成本低等优点，但也有以下几点缺点：一是反转录病毒作 为载体具有致癌性。二是外源基因的大小受到反转录病毒颗粒大小的限制，般 小于l o k b 。三是反转录病毒介导的转基因会影响外源基因的表达。 3 精子载体法 这是一种直接用精予作为外源d n a 载体的基因转移方法，精子直接与外源d n a 混合培养，外源基因可直接进入精子头部，受精后能发育成转基因动物。r o t t m a n 等对此方法进行了改进：将外源d n a 与精子共同孵育之前，用脂质体包埋，脂质 体与d n a 相互作用，形成脂质体一d n a 复合体，这种复合体比较容易和精子细胞膜 融合，从而进入细胞内部“”这种改进以后的精子载体法在转基因鸡的制作上获 得了满意的结果，对1 2 龄鸡胚用s o u t h e r n 印记杂交法检测发现转基因阳性率为 2 6 ，最理想的一次阳性率高达9 2 。实验还显示外源d n a 并未整合入宿主基因组， 而是以附加体的形式存在于染色体之外，所以真正的楚合阳性率并不见得高于前 面介绍的两种方法。袁仕善( 1 9 9 7 ) 对其又进一步发展，使用了阳离子脂质体介导技 术，操作方便，重复性好，转基因率高。l a v i t r a n o 等( 1 9 8 9 ) 用此法得到了转基因 小鼠“，同年a r z z o 在海胆上，m i l o n e 在猪上获得成功。s p e r a n d i o ( 1 9 9 6 ) 以精 1 2 山东师范大学硕士学位论文人乳过氧化物酶转基因小鼠模型的建立 子为载体采用人工受精方法，分别获得8 2 头和1 4 5 头崽猪，其中阳性猪分别为5 头和8 头。p e r e z ( 1 9 9 8 ) 用精子作载体获得转基因牛。该方法优点是：注射针直径 大，可以操作大片段外源基因的重组体。另外，有些动物的台子含有丰富的脂肪， 不易观察，而该方法就没有这一问题，因此，有广泛的应用前景。 4 胚胎干细胞( e s ) 介导法 胚胎干细胞是早期胚胎经体外分化抑制培养建立的多能性细胞系，体外培养 时保持未分化状态，可以传代增殖。e s 细胞在发育上类似于早期胚胎的内细胞团 细胞，当被注入囊胚腔后，可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成。 因此，将外源d n a 导入胚胎干细胞就可实现基因的转移在转基因领域e s 细胞是 公认的研究基因转移、基因定位整合的一类极有前途的实验材料。从胚胎分割出 胚胎干细胞，通过转录将外源基因导入细胞内，再将其转入植入前胚胎的胚泡腔， 带有外源基因的胚胎干细胞可嵌入宿主囊胚的内细胞团中参与胚胎发育，将来 出生的动物其生殖系统可能整合上外源上外源基因，通过杂交繁育可得到具有纯 合目的基因的个体，即转基因动物。用这种方法制作转基因小鼠阳性率接近 1 0 0 但遗憾的是到目前为止，世界范围内只有小鼠干细胞的建系方法比较成熟， 而大家畜干细胞系的建立方法目前还不够成熟。 5 人工酵母染色体法 人工酵母染色体( y a c ) 载体是近年来发展起来的新型载体，具有克隆百万碱 基对级的大片段外源d n a 的能力。1 9 9 2 年，通过该法获得了具有百万碱基对外源 d n a 的转基因小鼠此法的优点是：保证巨大碱基的完整性，保证所有顺式作用因 子的完整并与结构基因的位置关系不变，保证较长的外源片段在转基因动物研究 中整合率提高鉴于基因的完整性，目的基因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基 因整合的位置效应。 6 p g c s 技术 脊椎动物的原始生殖细胞( p r i m o r d i a lg e r mc e l l s ，p g c s ) 介导的转基因技 术在原理和方法上与e s 细胞技术相似起源于性腺以外的组织，而后在胚胎发育 的早期迁移到性腺组织。八十年代中期有研究者就发现两栖类动物( 蟾蜍x e n o p u s l a e v i s ) 的p g c s 在个体发育早期的分化并不是不可逆的( w r l i e ，1 9 8 5 ) ，此外有 研究表明上皮细胞的基膜( b a s e m e n tm e m b r a n e s ，b m ) 对p g c s 的迁移具有重要作 用( j a n e t ，1 9 8 5 ) 。p g c s 介导的转基因技术在原理和方法上与e s 细胞技术相似， 应用p g c s 技术在制作转基因家禽方面有明显的优势。b r i n s t e r 等尝试了在公畜个 体之间转移精原细胞的可行性，研究者将z f i a c z 系供体小鼠的p g c s 植入c 5 7 b l 6 s t l 杂交一代小鼠的曲精细管，之后的研究结果表明经移植后的p g c s 能够发育 成具有受精能力的精子细胞，并产生了后代( b r i n s t e r ，1 9 9 4 )。n a i t o 等应用 此方法制作了转基因鸡( n a i t o ，1 9 9 4 ) 。 大家畜p g c s 可否象小鼠e s 细胞那样抑制分化并增殖，到目前还不能得出确切 结论，如果能，这将为动物转基因带来一场不小的革新。这项技术结合基因定位 整合技术极有可能在较短的时间内得到转基因家畜纯品系。 7 转基因克隆动物法 转基因克隆动物技术