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三株具有抑菌作用的海洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 三株具有抑菌作用的海洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 摘要 有益菌【_ p r o b i o t i c s ) 作为生物防治的手段应用于水产养殖体系中，用来改 善养殖生态环境并取得了成效。人们在水产养殖中应用有益菌，将其既用作饲料 添加剂来调节养殖动物肠道微生态平衡，又用于加入水体起控制养殖池微生物生 态区系的作用，此外还用于改善养殖水体的水质条件。有益菌的应用可以调节和 改善养殖环境微生态平衡，控制和减少养殖动物爆发性病害的发生，提高养殖动 物的的免疫力，增强其抗病能力，因此成为国内外研究的热点。， 本试验对从健康斑节对虾( p e n a e u 8m o n o d o n ) 幼体分离的菌株l 1 及从养 殖水体中防污附钢片的微生物粘膜中分离的菌株l 2 和l 3 ，采用琼脂扩散法进行 体外拮抗试验，测定其抑菌图谱。这三株海洋细菌均对鲈鱼病原鳗弧菌w l ( v i b r i oa n g u i l l a r w ) 表现出较强的抑菌作用。根据细菌形态和生理生化特 征和1 6 sr d n a 序列分析，鉴定这三株海洋有益菌菌均属假交替单胞菌属 ( p s e u d o a l t e r o m o n a s ) ，其中l l 是橙色假交蕾单胞菌 ( p ，p “j d 4 ，f 已r d m d 珂口占a u r a n t i a ) ，l 2 是p s e u d o a l t e r o m o n a sp i s c i c i d a ，l 3 与柠檬假交替单胞菌( p s e u d o a l t e r o m o n a sc i t r e a ) 的亲缘关系最近。 采用玻璃纸覆盖平板法制各菌株l l 、l 2 和l 3 的胞外产物，优化培养条件， 结果表明：菌株l 1 在2 8 下培养4 8h 、菌株l 2 在2 2 下培养4 8h 、菌株l 3 在2 5 c 下培养2 4h 制备的胞外产物抑菌活性最高。对其胞外产物进行凝胶层析 部分纯化后，进行温度、p h 和蛋白酶k 处理，结果表明热处理、酸碱处理和蛋 白酶消化均可使其活性丧失，表明菌株l l 、l 2 和l 3 的胞外活性物质含蛋白质。 关键词：海洋有益菌抑菌活性假交替单胞菌属( p s e u d o a l t e r o m o n a s ) 胞外产物蛋白质 兰株具有抑菌作用的海洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 i d e n t i f i c a t i o na n di n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h ee x t r a c e l l u l a r p r o d u c t so fm a r i n eb a c t e r i a a b s t r a c t t h er e s e a r c ho fp r o b i o t i c sf o ra q u a t i ca n i m a l si si n c r e a s i n gw i t ht h ed e m a n df o r e n v i r o n m e n t - f r i e n d l ya q u a c u l t u r e t h ep r o b i o t i c sw e r ed e f i n e da sl i v em i c r o b i a lf e e d s u p p l e m e n t st h a ti m p r o v eh e a l t ho fa q u a t i ca n i m a l s ，a c c o m m o d a t et h eb a l a n c eo f g a s t r o i n t e s t i n a lm i c r o o r g a n i s m so ff i s ha n ds h e l l f i s ha n di l l c l e a s et h er e s i s t a n c et o d i s e a s e so ft h e i rh o s t t h er e s e a r c ho np r o b i o t i c su s e da sb i o c o n t r o li nt h ef i e l do f a q u a c u l t u r eh a sb e e nb e c o m i n gt h ef o c u si np r e s e n t m 部f i n eb a c t e r i al 1w a si s o l a t e df r o mh e a l t h yl a f v a eo fp e 万钟耶m o n o d o n 。1 2 a n d1 3s t t a j nw a si s o l a t e df r o mm i c r o b i a lb i o f i l m so fa n t i s e p t i es t e e lp i e c e s b y1 6 s r d n as e q u e n c ea n a l y s i sa n dt h em o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ，m a r i n eb a c t e r i al iw a si d e n t i f i e dt ob ep s e u d o a l t e r o m o n a sa u r a n t i a 。 l 2w a si d e n t i f i e dt ob ep s e u d o a l t e r o m o n a s 口缸c c i d aa n dl 3w a si d e n t i f i e dt ob e p s e u d o a l t e r o m o n a sc i t r e a t h ee x t r a c t i o no fa n t i b a c t e r i a le x t r a c e l l u l a rp r o d u c t s ( e c f ) w a sc o n d u c t e db y t h em e t h o dc e l l o p h a n ep l a t et e c h n i q u e t h eo p t i m u mi n c u b a t i o nc o n d i t i o nt oo b t a i n e c pw i t ht h es t r o n g e s ta n l i m i c r o b i n la c t i v i t yw a ss t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h eo p t i m u mc o n d i t i o nw a s2 8 c ，4 8hf o rl is t r a i n ；2 2 ，4 8hf o rl 2s t r a i n ；a n d 2 5 2 4hf o rl 3s t r a i n t h ee x t r a c e u u l a rp r o d u c t sw i t ha n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo f 只a u r a n t i as t r a i nl 1 ， 只p i s c i c i d as t r a i n l 2a n d 置c i t r e as t r a i nl 3w a sp u r i f i e d b yg e lf i l t r a t i o no f s e p h a d e xa n ds d s - p a g e t h ec h a r a c t e r so fi n h i b i t o r ys u b s t a n c e so fl i 、l 2a n dl 3 s t r a i nt o w a r d s p h 、t h e r m a l 、p r o t e a s eku e a t m e n t i n d i c a t e dt h ea n t i b a c t e r i a l e x t r a c e l l u l a rp r o d u c t i o nw a sd e t e r m i n e dt oh ep r o t e i n k e y w o r d s ：m a r i n ep r o b i o t i c s ；a n t i m i c r o b i a la c f i v i t y ；p s e u d o a l t e r o m o n a s ； e x t r a c e l l u l a rp r o d u c t sa e c p ) ；p r o t e i n 三株具有抑菌作用的海洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 第一章综述 病原性弧菌一直是经济鱼类、对虾、贝类死亡的重要原因之一“。1 。长期以 来，人们主要依赖大量抗生素和各种化学药物，来防治养殖动物的细菌性疾病。 在2 0 世纪4 0 年代，抗生素作为饲料添加剂已广泛应用于畜禽养殖业中，并有力地 推动了畜禽养殖业的发展，这是一个不争的事实。然而近2 0 年来，抗生素作为饲 料添加剂却引发了争议，抗生素虽然在一定程度上可抑制或杀死病原菌，但是其 副作用也十分明显。一方面，可以增加细菌的耐药性，产生耐药性菌株噙”；另 一方面，可以破坏和干扰养殖环境中的正常微生物区系。导致微生态平衡失调盯 “；另外，药物会在生物体内残留。给人类健康带来直接威胁嘲。 为了改变这一状况，除了提倡良好的科学管理( 如合理营养、改善水质，低 放养密度等) 以及使用疫苗外，生物防治( 即利用微生物治理微生物，用微生物 治理环境。改善养殖动物的生活环境，提高动物的非特异性免疫力，从而促进养 殖动物健康生长) 的方法，引起国内外学者的共同关注，已成为一个新的研究热 点n 。一伽人们开始尝试在养殖过程中应用有益菌( p r o b i o t i c s ) 进行生物防治，旨 在调剂和改善养殖环境微生态平衡，控制和减少养殖动物爆发性病害的发生，提 高养殖动物的免疫力，增强其抗病能力，促进水产养殖业健康稳定发展。 1 有益菌的概念 有益菌( p r o b i o t i c s ) 一词最早由l i l l e y 和s t i l l w e u “酊在1 9 6 5 年首先提出， 将其定义为“由一种微生物分泌，刺激另一种微生物生长的物质”。这一概念并 不全面和确切，因此许多学者相继提出了有关有益菌的不同定义。p a r k e r “”认为 是“维持肠道内微生物平衡的微生物或物质”，明确了有益菌的作用并指出其中 可能含有抗生素和短链脂肪酸。之后，f u u c r “”引入“活的微生物”的限定，将 有益菌明确定义为：“能通过改善肠道微生物平衡而对动物施加有利影响的活的 微生物饲料添加剂”。 在水产养殖应用中，有益菌既用作饲料添加剂来调节养殖动物肠道微生态平 衡”1 ，又可加入水体起控制养殖池微生物生态区系的作用，此外还用于改善养 三株具有抑菌作用的晦洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 殖水体的水质条件。m o r i a r t y 2 1 将有益菌的定义扩展为“用于处理养殖池的微生 物水体添加剂”g a t e s o u p e 矧则具体提出有益菌是“通过某种方式施用从而进入 宿主肠道并保持活性，可改善动物健康的活的微生物细胞”。根据该定义，他将 微生物制剂在水产养殖中的作用分为两类：一是改善养殖水体的水质状况，称之 为生物修复( b i o r e m e d i a t i o n ) ；二是拮抗病原菌，增强养殖动物的抗病能力，促 进动物生长发育；在此基础上，依据微生物能否在动物肠道短暂滞留或繁殖，又 将拮抗病原的分为两种：微生物在动物肠道内最终命运无法确知的称为生物控制 ( b i o e o n l r 0 1 ) ，而那些能在动物肠道内短暂滞留或定植的微生物才可称之为有益 菌。 有益菌不仅作用于肠道还作用于动物的鳃和皮肤的表面，甚至对栖息的水环 境也起作用。因此，l a u r e n t 提出在水产养殖中有益菌的定义应该包括4 个方面： 1 能够调节与动物有关的或水生环境中的微生物群落：2 能够提高动物对饵料 的利用或提高饵料中的营养价值的活的微生物饲料添加剂；3 能够提高动物对 病害的抵抗力；4 能够改善养殖的水质状况。同时细菌可以提供基础营养( 单 细胞蛋白) ：使活细菌在动物体内，不与其它细菌相互作用，与环境无关，与宿 主无相互作用。虽然对有益菌还没有统一明确定义，但是作为有益菌的基本条件 是改善微生态平衡，促进养殖动物的健康。 2 有益菌的作用机理 处于同一生态系统中的不同菌群在其生态位竞争中采用不同的策略。许多 细菌和其他微生物可在环境中分泌抗生素，能很快杀死其他微生物嘲；有的细菌 产生细菌素，可杀死与其亲缘关系相近的种；也有的在生态系统中是优势菌， 是营养竞争的胜利者，使他们在自然环境中占有生存优势。 f u l l e r “”曾提出有益菌的作用机制包括三方面：l 通过竞争营养、附着位点 或产生拮抗物质来抑制病原菌的数量；2 通过提高或降低酶的活性来改变微生 物代谢途径；3 增强机体免疫功能。虽然有益菌对水产养殖动物的有利影响往 往是通过几种机制协同作用的结果，但通过竞争营养、附着位点或产生拮抗物质， 是其主要作用，而拮抗物质的产生是有益菌能够抑制病原菌生长的重要因素。 2 三株具有抑菌作用的海洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 动物肠道是由好氧与厌氧微生物、或兼性厌氧微生物组成的复杂微生态体 系，对养分及其它外源和内源物质的代谢起着重要作用。菌群之间，菌群和宿主 之间存在相互依赖和相互制约的关系。肠道正常微生物菌群是土著微生物群，是 微生物与其宿主在共同进化过程中形成的。由于环境或摄食等因素变化的影响， 肠道微生物群并非总能处于正常或适宜的状态，这是有益菌作用的依据。 2 1 抑制病原菌的生长 在养殖水体和养殖动物消化道内，有益菌通过与病原菌竞争营养物质、生 存和繁殖空间，从而抑制病原菌的生长。另外，由于有益菌能在宿主体表或体内 粘膜上皮生长繁殖，形成阻碍病原菌入侵的一道微生物屏障；而有益菌在其生长 代谢过程中，产生脂肪酸和乳酸，降低环境中的p h 和髓，产生过氧化氢或细 菌素或抗生素等，抑制病原菌的生长繁殖。 2 1 1 分泌抑菌物质 擎 通常细菌之间拮抗作用的表现有：抗生素、细菌素、铁载体，溶菌酶、蛋 白水解酶、过氧化氢酶或通过有机酸改变p h 值伫刀。这些因素可以单独或相互联 合作用产生影响。尽管有关产生抑菌物质菌株的报道很多( 表1 ) ，但大多数都 只是根据体外拮抗试验进行推测而已【雄捌。对抑菌物质进行提纯和分析的有关报 道，多集中于芽孢杆菌和乳酸菌产生的细菌素髀矧。 表l 水生动物病原微生物的拮抗菌 t a b l e1a n t a g o i s mo fa q u a t i cm i c r o b e st oa q u a t i ca n i m a lp a t h o g e n s 3 三株具有抑菌作用的海洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 c n l p p 盯等嗍用饱和硫酸铵沉淀金黄色葡萄球菌的去细胞发酵液，经c m 3 0 0 阳离子交换层析后，c 4 反向层析等分离纯化操作，提取到分子量为3 3 3 8 d a 的多 肽细菌素b a e r l 。 l e e 等删对能抑制硅藻生长的海洋细菌a 2 8 发酵液进行超滤( 截留分子量为 1 0k d a ) 、阴离子交换柱层析( p o t o sh q m ) 制备和p a g e 电泳，分离提纯到分 子量为5 0k d a 的富含丝氨酸的胞外蛋白酶。 h o l m s n o m 等啪1 报道p s e u d o a l t e r o m o n a st u n i c a t e 的胞外抑菌活性物质至少 有5 种。包括：专性抑制无脊椎动物幼虫的耐热的、分子量约5 0 0d a 的极性小分 子；分子量3 - 1 0k d a 的专性抑制海藻生长的热敏感极性物质；分子量为1 9 0k d a 的专性抑制细菌的大分子蛋白。 g a u t h i e r 和f l a t e a u c ”1 从海藻的细菌区系中分离到一株藤黄交替单胞菌 ( a l t e r o m o n a sl u t e o v i l a c e u s ) ，可产生一种具有抑菌活性的聚阴离子多糖。i 七m o s 等。”报道从潮间带藻类上分离到的假交替单胞菌属的海洋细菌，可产生小分子量 的抑菌活性物质。 2 1 2 营养竞争 假单胞菌属的细菌通常通过与病原菌竞争游离铁离子，从而抑制病原菌的 生长繁殖，保持养殖水体或养殖动物消化道内的微生态平衡，促进动物健康生长。 s m i t h 和d a v e y 啪3 发现荧光假单胞菌( p s e u d o m o n a sf l u o r e $ c e n $ ) f 1 9 1 3 能通过 竞争培养基中的游离铁离子，竞争排斥杀鲑气单胞菌( a e r o n o n a ss a l m o n i c i d a ) ， 减少养殖鲑鱼病害发生的几率。m y 等“和g r a m 等“1 1 也先后报道荧光假单胞 菌通过竞争铁离子抑制病原菌的生长。p y b u s 等报道鳗弧菌( 1 忍b r i oa n g u i l l a r i u m ) 能产生铁载体与病原菌病海鱼弧菌争夺铁离子抑制病原菌的生长。 2 1 3 竞争生态位或附着位点 养殖环境中养殖动物的消化道组织表面成为有益菌和病原菌竞争的主要附 着位点。细菌若要在鱼的肠道生存，在内膜和细胞壁表面吸附的能力非常重要。 因此，有益菌抑制对病原菌第一步的抑制作用可反映在对附着点受体的竞争。 o l s s o n 等澜用体外拮抗试验证实在鱼的肠道黏液中，从大菱鲆肠道分离的 细菌比鳗弧菌具有更强的附着和生长能力。j o b o r n 等在体外进行细菌附着黏 液的试验，结果表明肉杆菌可附着于红鳟肠道黏液或用牛血清蛋白处理过的表 4 三株具有抑菌作用的海洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 面。o l s s 还进一步发现细菌附着于粘液的能力比对照表面强，而且大菱鲆肠 道土著菌能特异性附着其肠道粘液，从皮肤粘液分离的细菌附着能力则较差。结 果表明，细菌可以通过对肠粘膜表面位点受体的竞争，有效阻止病原菌。 2 2 提供营养成分或分泌消化酶 有益菌及其代谢产物含有丰富的蛋白质、氨基酸和维生素，这些都是养殖动 物所必需的营养成分；另外，肠道中有益菌的分泌酶也能促进消化肠道内营养成 分的消化和吸收。 双歧杆菌和乳酸菌等m 能合成多种氨基酸和维生素供宿主利用；米曲霉能合 成a 一淀粉酶；黑曲霉主要产生a 一淀粉酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、b 一葡聚糖酶、果胶酶和植酸酶。产生的这些酶类能够促进宿主对营养物质的消化 和对一些抗营养因子的消除。有益菌降低肠道p h 值，有利于铁、钙等元素的吸 收，促进b 族维生素和维生素k 的合成。 节 d o u o h e t 和l a n g d o n 将细菌c a 2 作为饲料添加剂投喂太平洋牡蛎幼虫，提 高了幼体的存活率和生长率。推测这可能与饲料中添加细菌c a 2 有关，细菌c a 2 为幼体提供了藻类中缺少的必需营养元素，或产生了可供幼体食物消化的酶，从 而促进了幼体的生长 _ ， m a e d a 和u “耵用细菌、硅藻、鞭毛藻为微生物食物团饲养蟹苗，结果食 物团中细菌、硅藻、鞭毛藻数目相继减少，荧光染色证明蟹苗消化道内有摄入的 微生物食物团块，这说明蟹苗以微生物食物团为开口饵料。因此，微生物食物团 在水产养殖动物幼体食物链中起重要作用，为幼体生长发育提供了营养。 a n s h u 和功s i t a 嘧1 等从土壤浸出液中分离出一株假单胞菌p s e u d o m o m s a e 埘g i n o s a ，经过q 琼脂糖、苯基琼脂糖柱层析和s d s p a g e 电泳后，分离纯化 出一种碱性蛋白酶，大小约3 5 ，0 0 0d a ，具有弹性蛋白酶活性可以降解苔红素一 弹性蛋白。 2 3 提高养殖动物免疫功能 有益菌除了竞争性排斥病原菌外，还通过产生非特异性免疫调节因子，提高 动物免疫功能，增强其防病抗害能力。 三株具有抻茁作用的晦洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 有益菌主要通过三条途径刺激动物的免疫系统：1 优势厌氧菌在肠壁形成 一层菌膜，可以阻止外来细菌与肠壁特异性受体结合，从而阻断了外来细菌的入 侵，提高机体抗感染能力，对宿主起到保护作用；2 其代谢产物释放出的抗原 物质( 脂多糖、肽聚糖、和d n a 等大分子物质) 被动物吸收后直接刺激动物免 疫系统；3 通过影响胃肠道微生物群落的平衡间接影响免疫系统。 脂多糖常见于假交替单胞菌属和交替单胞菌属嗽剐等革兰氏阴性细菌。 v i n c e n t 等叫从蠕虫中分离出一株交替单胞菌a l t e r o m o n a s s t r a i nh y d l 5 4 5 ， 分泌含酸性糖成分的脂多糖。该脂多糖可以络合环境中的重金属离子，从而净化 宿主的生存环境。另外，脂多糖还可以阻止其它病原菌的附着，从而保护宿主。 有益菌还能提高体液免疫反应，促进肠道的免疫屏障；刺激宿主对病原菌的 非特异性反应，通过降低过敏反应来调整宿主对病原菌的免疫反应 5 0 3 。添加双 歧杆菌等有益菌，能提高机体免疫水平，增n i g a 、i g g 、i g m 等免疫球蛋白水平 和吞噬细胞活性，有助于治疗肝、肠疾病，提高机体抗肿瘤的能力。乳酸杆菌能 产生免疫调节因子，刺激局部免疫反应。潘康成等网认为，动物口服有益菌后， 能调整肠道菌群，使肠道微生态系统处于最佳平衡状态，活化肠粘膜内的相关淋 巴组织，使s i g a 抗体分泌增强，提高免疫识别力，并诱导t 、b 淋巴细胞和巨 噬细胞等产生细胞因子，增强机体免疫力。 2 4 改善水质 随着微生态学的深入研究，人们认识到水环境中不仅存在有害微生物，而且 还存在有益微生物，因此人们开始研究利用水中的有益微生物来改善水质，防治 水产动物疾病，提高产量瞄钔。 水产养殖业中，长时间养殖常使养殖水域底部，尤其是池底部积累大量的残 余饵料、排泄废物、动植物残体以及有害气体( 氨、硫化氢等) ，这些物质往往导 致水质败坏，使水产动物受到毒害。研究发现，养殖水体中的某些有益微生物的 代谢具有氧化、氢化、硝化、反硝化、解磷、硫化及固氮等作用，能将上述有机 物质分解为二氧化碳、硝酸盐、硫酸盐等。这样既能在不中断养殖过程的情况下， 清除有害物质，净化水质，又能为单细胞藻类的繁殖提供营养物质，促进藻类繁 殖。这些藻类的光合作用，又为池内养殖动物的呼吸，有机物的分解提供氧气， 三株具有抑蕾作用的海洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 从而形成一个良性的生态循环，有利于水产动物的生长同时由于这些有益微生 物的大量繁殖，在池内形成优势种，可抑制病原微生物的繁殖，减少疾病发生滞l 。 目前光合细菌是研究最多、水产养殖中应用最广的有益菌。光合细菌具有独特的 光合作用，它能比藻类更广泛的利用光能，能直接消耗利用水中有机物、氨态氮， 还可以利用硫化氢，并可通过反硝化作用去除水中的亚硝酸氮等污染物，它虽然 不产生氧气，但可以通过降低水中的c o d 间接增加水中溶氧。此外，光合细菌 还能直接或间接作为饵料生物，有利于防治水产动物疾病 6 0 6 2 l 。郑耀通等嘲在 固定化光合细菌净化养鱼水质试验中得出，固定化光合细菌在除去水环境中的氨 氮、有机质、降低c o d 和增加溶解氧等方面有明显的优越性。丁爱中等嗍对于 光合细菌调控水产养殖水质的研究发现，光合细菌在水产养殖中具有良好的水质 调节作用，既能调节水体的p h 值在适宣的范围内，减缓水中的溶解氧含量的降 低，又能降低水中对鱼虾有害的氨氮等物质。 芽孢杆菌，是普遍存在的一类好气性细菌，革兰氏染色呈阳性，多属芽孢 杆菌属。该类菌无毒性，能分泌出活性强的蛋白酶等多种酶类，在其生命过程中 又能以孢予体形式存在，易于生产和保存。能有效地改善水体各项水化学指标， 起到改善水质的作用，在水产养殖上具有广阔前景 6 5 - 6 7 张庆等 6 8 1 在试验中每隔 2 5 d 向罗非鱼养殖水体中添加以芽抱杆菌为主的微生物复合菌剂能明显改善水 质条件，有效降低氨氮与亚硝酸盐，营造良好的水质，促进罗非鱼的生长。李健 6 9 1 等向幼虾养殖池添加微生态制剂，能显著降低养殖池的c o d ，增加水体透明 度薛恒平u o 等将用芽抱杆菌、光合细菌、蛭弧菌等制成的“益生菌王，按1m g k g 投入养虾池内，每星期1 次，共计3 次，结果试验池对虾病毒病发病时间 较对照组延迟l o 天，产量提高4 0 ，用于文蛤的3 个池塘均未发病，而对照组 的3 个池塘发病率为3 0 - - 5 0 。 3 有益菌在海水养殖中的应用 近2 0 年来，水产养殖业迅速发展，工业化高密度养殖规模日益扩大，与此 同时，未处理的养殖废水和工业、生活污水的排放使近岸海水受到的污染程度日 益加剧，养殖生态环境遭到破坏，致使养殖业病害发生日益频繁，给水产养殖业 造成严重损失。据不完全统计，每年全国发生中等程度以上的养殖病害面积占养 7 三株具有抑蕾作用的海洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 殖总面积的1 5 一2 0 ，产量损失超过1 0 0 万吨。目前主要使用广谱抗生素来 控制病害的发生，而过度的使用抗生素药物不仅使细菌耐药性增加，破坏和干扰 养殖环境的正常生物区系，导致微生物的生态失调，产生二重感染，还使抗生素 在生物体内残留，人类长期摄入含残留抗生素的食品，可导致慢性中毒等，对人 类健康造成潜在的危害t 7 1 - 7 3 1 。高密度工业化水产养殖业中，因为要保持一定的水 温和各种物化条件的稳定，加之为节约成本，不希望大量换水。在这样一个相对 密闭的水环境中，如何高效在线去除各种含氮污染物特别是去除对养殖动物有强 烈毒性的氨氮和亚硝酸盐氮，是研究者要解决的关键问题之一删。 近年来，人们开始尝试在养殖水体中使用有益菌来改善养殖生态环境并取得 了成效。人们在水产养殖中应用有益菌，将其既用作饲料添加剂来调节养殖动 物肠道微生态平衡，又用于加入水体起控制养殖池微生物生态区系的作用，此外 还用于改善养殖水体的水质条件。有益菌的应用旨在调节和改善养殖环境微生态 平衡，控制和减少养殖动物爆发性病害的发生，提高养殖动物的的免疫力，增强 其抗病能力，促进水产养殖业健康稳定发展。 在欧美、日本、印度尼西亚和泰国等国家的水产养殖业中，有益菌已经得到 广泛的应用，已经开始产生了巨大的经济效益，我国虽然研究较晚，但发展迅速， 广东、浙江等地的不少养殖户已经在水产养殖中应用有益菌，并取得了较好的效 果，有望成为未来水产养殖动物病害防治的一个重要方向。 4 微生态制剂的使用方法 有益菌在海水养殖中的使用方法有t z ：1 注射或浸浴生物体；2 作为饲料 添加剂加入饲料中；3 直接加入水环境；4 通过饵料动物间接作用于养殖动物 幼体。尽管这四种方法有一定的使用范围，但在实践中都取得过良好的效果。 4 1 注射或浸浴 将微生态制剂直接与动物接触，能在较短时间内刺激动物免疫系统产生反 应。这种方法适合于大的动物，而对体型小的动物剂量不好掌握，同时注射造成 的损伤会使病原菌有机可乘。此法应注意使用剂量和浓度。剂量适宜才能最大限 度的刺激动物的免疫机制。 4 2 饲料添加剂 8 三株具有抑菌作用的海洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 作为饲料添加剂，随同饲料一起进入机体内发生作用r r 6 1 。这一方法目前应 用较多，其优点是操作简单、劳动强度小、效果显著。但作为添加剂的微生态制 剂，其成分必须具有较好的稳定性和耐受性，要求在饲料制粒过程中不使其生理 活性丧失。 4 3 直接施入水体 将微生态制剂直接加人养殖地，要注意环境是否适合有益菌的生存和繁殖。 如水体加人了抗生素等化学物质，就会降低微生态制剂的作用效果。微生态制剂 的加入量要求使有益菌成为优势菌，在养殖水体才能发挥最大的作用，因此如果 中间换水和使用消毒剂，应在换水后或使用消毒剂几天后补加首次使用的剂量。 4 4 饵料动物携带 在饵料动物的养殖中，将有益菌加入其养殖水体或食物中，通过其摄食过 程携带上有益菌，养殖动物在摄食过程中，可将饵料动物携带的有益菌带入宿主 肠道中，并使其存活或定植，从而对养殖动物幼体施加有利影响。但是这种方法 还不够成熟，而且有益菌在轮虫体内的最终命运也不清楚。并且通过饵料动物携 带的细菌数量较难控制和检测。 5 结语 目前，虽然对有益菌还没有明确的定义，但已经有越来越多种类的细菌被 筛选作为潜在有益菌。对于有益菌的研究，现在主要应用在水产养殖疾病预防方 面。特别是在动物性饵料、甲壳动物、软体动物和鱼类养殖中取得了较大的进步 在正常条件或环境中( 即不存条件致病菌的情况下) ，使用有益菌作为生物控制 手段，其作用效果并不明显；但是当感染性疾病爆发时，有益菌的存在就至关重 要，起着不可替代的重要作用。 有益菌的研究和应用已经日趋成熟，可开发利用的菌株也不断增加。但是仍 有许多方面的研究傲的不够深入：一是没有足够的证据充分证明有益菌在实践中 有效。这些研究成果通常认为体外试验结果在养殖动物体内也是有效的，但是仍 然需要对细菌之间的竞争作用进行深入的研究。许多有益菌的试验结果，仅局限 于单一菌株使用。多种细菌制成的混合制剂可以适应不同条件的需求，而且混合 制剂本身是一个多功能的微小区系，因而生物控制中，多种细菌协调作用的效果 9 三株具有抑菌作甩的海洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 比单一细菌的效果明显。 对于有益菌在今后开发研究的重点应该是：1 从细胞水平和分子水平上进 一步深入研究有益菌的作用机理：2 通过基因工程手段获得能“永久性”定居 在肠道的有益菌和“多功能性”的有益菌混合制剂。除了有益菌稳定性研究外， 如何提高菌体的耐酸性、胆汁耐受性和提高产酶能力，将成为研究的难点和重点； 3 加强有益菌与低聚糖类添加剂的协同效应和作用机理的研究。 参考文献 1 e m m ye v i b t i o s i s ：p a t h o g e n i c i t ya n dp a t h o l o g y , ar e n e w a q u a c u l t u r e ，1 9 8 7 ，6 7 ：1 5 2 8 2a u s t i nb ，d a a u s t i n b a c t e r i a lf i s hp a t h o g e n s ，d i s e a s eo ff a r m e da n dw i l df i s h ，t h i r d e d i t i o n s p r i n g e r - p r a x i s ，l o n d o n , 1 9 9 9 3 l i g l a n e rd v ，t a b e l l ，r m r e d m a n ，l l m o h n c y , j m n a t i v i v i d a d ，a r u k y a n la p o e r n o m o ar e v i e wo fs o m em a j o rd i s e a s e so fe c o n o m i cs i g n i f i c a n c ei np e m e i dp r a w n s s h r i m po f t h e a m o r i c a sa n d h d 啊i f i e ，i n ：d i s e a s e s i n a s i a n a q u a c u l t u r ei ( e d s m s h a r i f f , r es u b a s i n g h e ，j a r t h u r ) ，f i s hh e a k hs e c t i o n , a s i a nf i s h r i e s s o c i e t y , m a n i l a p h i p p i n e s ，1 9 9 2 , 5 7 - 8 8 4 v a n d c u b c r g h cj ，yl i ，l v e r d o n c k , j l lp s o r g e l o o s 。h s x u j s w i n g s h b r i o s a s s o c i a m dw i t hp e n a e u sc 脚n p w 妇( c r u s t a c e a ：d e e a p o d a ) l a r v a ei nc h i n e s es h r i m ph a t c h e r i e s a q u a c u l t u r e ，1 9 9 8 ，1 6 9 ：1 1 5 - 1 1 9 5 m u s o g ak 。m h i g a s h i , h k e i t o k u t h ei s o h d o no fi n t e s t i n a lm i e r o f l o r ao ff a r m e dr e d s e a b r e a m ( p a g r u sm a j o r ) a n db h c ks e a b r e a m ( a c a n t h o p a g r u ss c h l e g e h ) a tl a r v a la n d j u b e n i l es 扭g 蹦a q 强c l f 黜，1 9 8 7 ，6 5 ：7 9 - 8 8 6l ij 。，。w t - r i m 甜a l a n t i b i o t i cr e s i s t a n c ea n dp i s s m i dp r o f i l e so fh b d oi s o h t e s f r o mc u l t u r e ds i l v e rs 魄b r e a m , s p a r u as a r b a m a r i n ep o h u t i o nb u h e t i n , 1 9 9 9 ，3 9 ( ： 2 4 5 2 4 9 7 n i c o l a s ，l ，e r o b i c 。d a u s q u e b a c t e r i a lf l o r aa s s o c i a t e dw i t hat r o p i cc h a i nc o n s i s t i n go f m i e r o a l g a e 。r o t i f e r sa n dt u r b o tl a r v a ls u r v i v a la q u a c u l t u r e , 1 9 8 9 8 3 ：2 3 7 - 2 4 8 8s t l o mb j 九o l a f s e n t h ei n d i g e n o u sm i c r o f l o r ao fw i l d - c a p t u r e dj u v e n i l ec o l di nn e t - l n 1 0 三株具有抑菌作用的海洋细菌的鉴定及其胞外产物的研究 r e a r i n g ，i n ：m i c r o b i o l o g yi np e o c i l i t h e r m s ，e l s e v i e rs c i e n c ep u l l a h e r ( b i o m e d i c a ld i v i d i o n ) ， a m s t e r d a m ，1 9 0 0 ，1 8 1 1 8 5 9g a l t e re s ，c l s a m o s ，j a l a n e i c em l p u b l i e ，a n i m a la n de n v i r o n m e n t a lh e a l t h i m p l i c a t i o n so fa q u a c u l t m e e m e r g i n f e c t d i s ，1 9 9 7 ，3 ( 4 ) ：4 5 3 - 4 5 7 1 0t a n a s o m w a n gv t n a k n i , zn i s h i m u r a , 莨m u r o g a w b r i o i n h i b i t i n gm a f i b a c t e r i a i s o l a t e df r o mb l a c k6 9 c rs h r i m ph a t c h e r y f i s hp a t h o l ，1 9 9 8 ，3 3 ( 5 ) ：4 5 9 4 6 6 11 r i q u e l m ec 。r a t a y a ，n v e r g a m ，a r o j a s ，m g u a i t a , m c a n d i a p o t c n t m lp r o b i o t i c 1 2 1 3 s t r a i n si nt h ee n i t u r eo ft h ec h i l e a ns c a l l o p ，a r g o p e c t e np u r p u r a t u s ( l a m a r e k , 1 8 1 9 ) a q 山，1 9 9 7 。1 5 4 ：1 7 2 6 易亚平，傅童生。微生态制剂的研究动态。饲料与营养，2 0 0 5 ，3 ；1 4 一1 6 。 b m m u c e y , v e c o y a e i m p r o v e dg r o w t hg a t ea n dd i s e a s er e s i s t a n c ei nf a r m e dh a l i o t i s m i d a et h r o u g hp r o b i o t l at r e a t m e n t a q u a c u l t u r e 。2 0 0 5 ，2 4 5 ：2 4 9 - 2 6 1 1 4b e r g h0 b a c t e r i aa s s o c i a t e dw i t he a r b , l i f e s n t g e so fh a l i b u t h i p p o g l o s s u sh i p o g l o s s u al 。 i n h i b i tg r o w t ho f ap a t h o g e n i cl _ 蕾b r os p j o u r n a lo ff i s hd i s e a s e ，1 9 9 5 。1 8 ：9 3 9 6 1 5l i l yd m 。r h s t i l l w e np r o b i n t i o sg r o w t hp r o m o t i n gf a c t o r sp r o d u c e db ym i c r o o r g a n i s m s 1 7 1 8 s c i e n e e , , 1 9 6 5 1 4 7 ：7 4 7 7 4 8 p a r k e rr b p r o b i o t i c s ，t h eo t h e rh a l fo ft h ea n t i b i o t i c ss t o r y a n i t a n n t r h e a l t h , 1 9 7 4 ，2 9 ： 4 8 f u l l e rr p r o b i o t i c si nm a n da n i m a l s ，ar e v i e w j a p p tb u c t e r i o t 。1 9 8 9 ，6 6 ：3 6 5 3 7 8 m o n i c ao 。ed m ，a n dgn m i a ，e l a l o r a la d m i n i d t r a t i o no ft w op r o b i o t i c ss t r a i n s ， l a c t o b a c i l l u sg a s s e dc e c t 5 7 1 4a n dl a c t o b a c i l l a sc o r y n i f o r m i sc e c t 5 7 1 1 ，e n h a n c f 4 tt h e i n t e s t i n a l f u l l o i l o f h e a l t h ya d u l t s i n t e r n a t i o n a l j o f f o o d m i c r o b i o l o g y , 2 0 0 6 , 1 0 7 ：1 0 4 - 1 1 1 m a r t i n ，r o l i v a r e s m 。m a f u l m l ，盯a l 。c h a r a c t e r i z a t i o no f4r e u t e r i n p r o d u c i n g l a c t a b a c i l l z ac o r y n i