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乳酸菌快速检测方法的建立 摘要 乳酸菌是一群通过发酵糖类，产生大量乳酸的细菌总称。作为最具代表性 的益生菌，乳酸菌在食品发酵、饮品和饲料等领域有着悠久的应用历史。由于 它们的代谢特性和工艺学特性，需要在乳酸菌发酵食品生产过程中对它们进行 安全和质量控制，因此建立快速可靠的乳酸菌检测鉴定方法，对生产过程控制 以及产品质量检验具有重要意义。 本论文对5 株发酵乳酸菌菌株( 1 株植物乳杆菌、1 株干酪乳杆菌、1 株德氏乳 杆菌保加利亚亚种、1 株乳酸乳球菌乳脂亚种、1 株嗜热链球菌) ，分别设计了不 同的引物和探针，g x j t a q m 矗蹦实时荧光p c r 检测技术的进行了研究，包括引物 和探针的特异性、检测方法的灵敏度以及对乳酸菌饮料中乳酸菌的检测。同时， 本文还对变性高效液相色谱( p c r - d h p l c ) 检测技术进行了研究，对 p c r d h p l c 条件进行了摸索和优化，初步建立 p c r d h p l c 对乳酸菌的检测 方法。实验结果表明实时荧光p c r 的五组引物和探针均对其相应的乳酸菌进行了 有效的扩增，对其他近源菌属和远源菌属均无扩增信号出现，最低检测下限可 达至l j 2 4 c f u m l 。优化后p c r d h p l c 的条件为：d n a 澍曼度为5 0 r i g ；退火温度为5 5 ；柱温为6 1 ；梯度洗脱程序为a ：b ( 体积比) 为5 4 ：4 6 ( om i n ) - - 4 8 ：5 2 ( 0 5 m i n ) 一4 4 ：5 6 ( 1 8 m i n ) - - - 4 3 ：5 7 ( 3 0 r a i n ) - - 4 1 ：5 9 ( 4 3 m i n ) - - - 3 9 ：6 1 ( 5 5 m i n ) ；流速 为0 9 m l m i n 。本文所建立的两种快速鉴定检测技术，即运用实时荧光p c r 定性 检测和运用p c r d h p l c 检测5 种乳酸菌的技术，各具特点，实用性强，均可以 应用到实际的乳酸菌鉴定和检验工作中。 关键词：乳酸菌；实时荧光p c r ；变性高效液相色谱 乳酸菌快速检测方法的建立 a b s t r a c t t h el a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) c a nc o n v e r tt h el a c t o s ei n t ol a c t i ca c i d m o s to f t h e mw e r eu s e da ss t a r t e rc u l t u r e si nt h e m a n u f a c t u r i n gp r o c e s s e so fv a r i o u s f e r m e n t e df o o d s ，b e v e r a g e s ，a n df e e dp r o d u c t s b e c a u s eo ft h e i rp e c u l i a rm e t a b o l i c a n dt e c h n o l o g i c a lp r o p e r t i e s ，w en e e dt oc o n t r o lt h es a l t ya n dq u a l i t yi nl a b f e r m e n t e df o o d sp r o d u c t i o n r a p i da n dr e l i a b l ed e t e c t i o no fla bi so f g r e a ti n t e r e s t f o rb a s i ck n o w l e d g ea n da l s of o ri n d u s t r i a lp u r p o s e s i nt h i sp a p e r ，p o l y p h a s i ct a x o n o m yi d e n t i f i c a t i o no f5m i l kd e r i v e dl a c t i ca c i d b a c i l l u ss t r a i n s ( 1 l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m , 1 l a c t o b a c i l l u sc a s e i ，l l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s ，1 l a c t o c o c c u sl a c t i ss u b s p c r e m o r i s ，1 s t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u s ) w e r es t u d i e d w ed e s i g n e dp r i m e r sa n dp r o b e ss p e c i f i ct oc o n d u c tt h e t a q m a n t m r e a l t i m ep c r a s s a y s ，i n c l u d i n gs p e c i f i ct e s t i n g ，s e n s i t i v i t yt e s t i n ga n d d e t e c t i o no fl a bi nt h ela b b e v e r a g e s a ts a m et i m e ，a p p l i c a t i o no fp c r d h p l c t oi n d e n t i f yl a b ，w e o p t i m i z e dc o n d i t i o n so fp c ra n dd h - p l c t h e r e s u l ti n d i c a t e s t h a ts p e c i f i co fr e a l t i m ep c ri sg o o d ，a n dt h em i n i m u md e t e c t i o nl i m i tc o u l dr e a c h 2 4 c f u m l t h ef o l l o w i n go p t i m u mr u n n i n gc o n d i t o n si np c r - d h p l c s y s t e mw e r e u s e d ：c o l u m nt e m p e r a t u r eo f6 1 c ；a n da na n a l y t i c a lg r a d i e n tb u f f e rbo f4 6 f o r0 m i n ，5 2 f o r0 5r a i n ，6 1 f o r5 5 m i na taf l o wr a t eo f0 9 m i m i n a p p l i c a t i o no f r e a l t i m ep c rt od e t e c ta n d i n d e n t i f yl a b i sm o r er a p i d ，m o r es e n s i t i v ea n dm o r e s p e c i f i ct h a nc o n v e n t i o n a lc u l t u r em e t h o d a n dp c r - d i - i p l ci sr e p e a t a b l e ，h i 【g h a u t o m a t e d ，w h i c hc o u l dd e t e c t f i v el a ba to n c e a n dp c r d h p l ci saf a s t ， a c c u r a t ea n dr e l i a b l ed e t e c t i o no fl a c t i ca c i db a c t e r i a b o t ho ft h et w od e t e c t i o n t e c h n i q u e sc o u l db ea p p l i e dt ot h ei d e n t i f i c a t i o no fl a b k e y w o r d s ：l a c t i ca c i db a c t e r i a ；r e a lt i m ep c r ；p c r - d h p l c u 乳酸菌快速检测方法的建立 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。 论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或 发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均 已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：日期：2 护d g 2 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文 被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名： 指导教师签名：矽黔i 阿丕 日 期：易d 亭么乙 乳酸菌快速检测方法的建立 第一章文献综述弟一早义陬琢殓 1 1 乳酸菌定义及分布 乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i a , l a b ) 是对一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的 细菌的通称。在分类学上属于非正式、非规范的惯用名称，但因为它很容易被 人们所理解和接受而被广泛引用。乳酸菌菌体细胞呈杆状或球状，革兰氏染色 为阳性。乳酸菌为兼性厌氧菌，有的属于专性厌氧菌，能利用葡萄糖产生5 0 以上的乳酸，多数菌不能分解蛋白质。乳酸菌的乳酸发酵类型有两种，一种是 分解葡萄糖后，只产生唯一产物乳酸的同型乳酸发酵；另一种是分解葡萄糖后， 在产生乳酸的同时，还可以产生乙酸、乙醇、c 0 2 等其它代谢物的异型乳酸发 酵【1 1 。 乳酸菌是生物圈中的一个重要成员，广泛分布于自然界中。在土壤、湖泊、 河水植物、人类食品、动物饲料、人和动物的肠道及其它器官内，以及一些临 床样品中都发现有乳酸菌的存在。乳酸菌与人类的关系十分密切。不仅是人体 消化道中的重要有益微生物群，而且还被广泛应用于食品工业、医疗保健、饲 料发酵及畜禽疾病防治等方面【2 1 。 1 2 乳酸菌在伯杰氏系统细菌学手册中的分类 自1 8 5 7 年巴斯德发现乳酸菌以来，许多研究人员把对乳酸菌的分类作为研 究乳酸菌的重要课题。他们根据乳酸菌的形态学、生理生化学( 生长温度、营 养、糖发酵途径、代谢产物) 、血清学、抑制物试验、化学分类( 乳酸旋光性、 胞壁组成、醌类测定) 、基因型 d n a 的同种与异种、( g + c ) 含量1 和菌体细胞 壁组成等方面进行分类，此项工作一直到2 0 世纪6 0 年代才趋于确立。在6 0 年 代前，乳酸菌主要按细菌的形态、培养条件、糖的利用、代谢产物等进行分类； 6 0 年代后，增加了乳酸菌细胞d n a ( g + c ) 含量测定。9 0 年代以来，采用1 6 s r d n a 序列分析和基因探针、类脂分析和醌类等分析技术进行测定、分类【2 1 。根 据国际公认的分类系统伯杰氏系统，在伯杰氏系统细菌学手册( b e r g e y s m a n u a lo fs y s t e m a t i cb a c t e r i o l o g y ，简称系统手册) 第8 版中，目前在自然界已 发现的这类菌在细菌分类学上现在划分至少有2 3 个属，其中具有代表性的种属 有乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、乳球菌属( l a c t o c o c c u s ) 、链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 、 双歧杆菌属( b i f u t o b a c t e r i u m ) 、气球菌属( a e r o c o c c u s ) 、肉杆菌属 ( c a r n o b a c t e r i u m ) 、肠球菌属( e n t e r o c o c c u s ) 、明串珠菌属( l e u c o n o s t o c ) 、酒球菌 属( o e n o c o c c u s ) 、足球菌属( p e d i o c o c c u s ) 、四体球菌属( t e t r a g e n o c o c c u s ) 漫游 乳酸菌快速检测方法的建立 球菌属( 玩舶c c 淞) 等l 。 1 3 乳酸菌食品中的应用 乳酸菌的应用历史非常悠久，远在古代，人类就在食品酿造与加工上不自 觉地应用了乳酸菌。一些文明古国都有其独特的乳酸发酵食品。据记载，公元 前2 0 0 年，印度、埃及和古希腊人等已掌握了发酵乳的手工制作方法。在我国， 早在1 4 0 0 年前，后魏贾思勰在齐民要术中记载了酸奶的做法。但人类能够 科学地研究并利用乳酸菌却始于1 9 世纪中叶。随着微生物学、现代食品科学技 术和医学等学科的发展，人们深入了解了乳酸菌的特性和功能并发现它们对生 物体健康有潜在的有益作用【4 j 。由于乳酸菌具有改善食品风味，提高食品的品 质和营养等作用，所以在食品工业中被广泛地运用。 1 3 1 乳酸菌在发酵乳制品中的应用 目前，根据发酵乳制品的物理特征和其他特性，其产品可分为发酵乳、干 酪、乳酸菌制剂和酸乳粉等4 大类。其中发酵乳和干酪生产量最大。发酵乳是 指以乳( 全乳、部分脱脂乳、全脱脂乳、浓缩乳、还原乳、稀奶油) 为原料， 经均质( 或不均质) 、杀菌( 或不杀菌) 后，加特定的微生物发酵剂而制成的一 大类产品。其种类包括酸奶、发酵酪乳、酸性奶油、嗜酸菌乳、双歧杆菌乳、 牛奶酒、马奶酒等。干酪是采用产酸菌和产香菌的混合发酵剂共同培养发酵乳、 稀奶油、脱脂乳、酪乳等原料，同时加入凝乳酶，使其凝固后再除去乳清，制 成新鲜的未熟化或成熟的非液态发酵制品。它是另一大类发酵乳制品，大体上 分为3 类，即天然干酪、融化干酪和干酪食品，其中天然干酪最多【5 】o 虽然乳酸发酵食品具有悠久的历史，但只有近几年才对其有了较深刻的了 解。它的主要特点是：提高酸度，改善风味。乳酸菌产生乳酸、醋酸、丙酸 等有机酸，不仅赋予食品以酸味，同时还与乳酸发酵中产生的醇、醛、酮等物 质相互作用，形成多种新的风味物质，此外，在发酵过程中乳酸味还能消除某 些原料的异味；增加养分，提高营养价值。由于乳酸菌在代谢中可产生多种 氨基酸、维生素和酶，故所有乳酸发酵食品的维生素、氨基酸、无机盐等养分 含量都比未发酵的食品高。延长食品保存期，防止腐败。早在古代人们就知 道利用干燥、盐渍、发酵等方法保存食品。乳酸是乳酸菌代谢的主要产物，在 防止食品腐败变质中有重要作用。此外，在乳酸发酵过程中还形成其它一些抑 菌物质，如细菌素等。细菌素( b a c t e r i o c i n ) 对机体无毒性、无抗原性，可杀死 一些食品腐败菌，被认为是一种高效、安全的天然食品防腐剂【确】。因此，乳酸 乳酸菌快速检测方法的建立 发酵既是一种加工产品的方法，也是一种保存食品的方法。增强人体免疫力， 减轻疾病。乳酸菌在发酵过程中还可产生某些生物活性物质，能增强机体内巨 噬细胞的吞噬能力，因而提高了对病原菌的抵抗力。其医疗作用也逐渐被证实。 1 3 2 乳酸菌在肉制品中的应用 随着肉类加工技术的、微生物发酵肉类制品的研究不断深入，乳酸菌在肉 类制品中的应用日益广泛。我国已将发酵肉制品的研究开发列入国家“十五” 重大科技攻关项目【2 】。乳酸菌发酵过程中产生的乳酸菌素，能够抑制肉毒杆菌 及其它病原微生物的生长繁殖或产生毒素，减少了腐败，延长保质期；产生乳 酸，降低p h 值，当p h 值降至4 8 5 2 时，肌肉蛋白变性形成胶状组织，增加 肉块间的结合力，提高制品的硬度与弹性，使香肠具有可切薄片的特性；p h 值 的降低，促进亚硝酸盐的分解，使n o - 2 分解为n o ，一氧化氮与肌红蛋白结合， 形成稳定的亚硝基肌红蛋白，促进发色；由于形成了稳定的亚硝基肌红蛋白， 降低了亚硝酸盐残留量，减少了亚硝酸盐与二级胺反应生成致癌物质一亚硝胺。 制品在发酵过程中，由于蛋白质的分解，提高了游离氨基酸的含量和蛋白质的 消化率，同时发酵过程中形成了酸类、醇类、碳水化合物、杂环化合物、游离 氨基酸和核苷酸等风味物质，使制品的营养价值和风味都得到改善。发酵肉制 品生产中大多数采用啤酒片球菌和植物乳杆菌的单一菌种或两种菌的混合物 9 - 1 1 o 1 3 3 乳酸菌在果蔬发酵中的应用 乳酸菌通过同型或异型发酵，产生乳酸、醋酸、丙酸等有机酸，它们赋予 发酵果蔬制品柔和的酸味；同时，还能产生2 庚酮、2 壬酮对爽口清香有一定 的作用；产生的微量双乙酞赋予制品奶油香味；另外，还有低级饱和脂肪酸与 脂肪醇所形成的酯类具有香味。同时乳酸菌在发酵过程中产酸造成的酸性环境， 可抑制食品环境中一些腐败菌与病原菌的生长。根据加工工艺不同可将乳酸发 酵果蔬制品分为酱腌菜类、渍酸菜类、泡菜类、果蔬汁类及果蔬汁与牛乳混合 发酵的饮料。可用于发酵果蔬食品的乳酸菌主要有：嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、 肠膜明串珠菌、粪链球菌等【1 2 】。 1 3 4 乳酸菌在酿造工业的应用 乳酸菌可用于酿造酒类，乳酸菌产生的乳酸与乙醇酯化，生成白酒三大酯 类之一的乳酸乙酯，能提高白酒的质量。在葡萄酒酿造工业中，乳酸菌通过苹 果酸一乳酸发酵( m a l o l a c t i cf e r m e n t a t i o n ，m l f ) 过程，使葡萄酒的酸度降低， 乳酸菌快速检测方法的建立 大大降低酸涩感和粗糙感，使酒的果香和酒香突出，从而改善风味【协1 5 l 。生产 所用乳酸菌主要是乳酸杆菌、明串珠菌及乳球菌。 1 3 5 乳酸菌在其他领域的应用 除了在食品工业应用以外，乳酸菌在医疗保健、饲料发酵及畜禽疾病防治、 化工等方面也被广泛应用。 乳酸菌在医药领域中的应用主要集中在胃肠道疾病的治疗上。除治疗肠道 功能紊乱、维持肠道菌群平衡外，乳酸菌的抗肿瘤作用、拮抗作用、免疫赋活 作用、降胆固醇作用、抗辐射作用和对泌尿生殖系统的作用已受到了各国科学 家的重视，正在研究开发阶段。 主要用于生产青贮饲料、乳酸菌发酵饲料和乳酸菌饲料添加剂等。乳酸菌 在这方面的应用不但可以提高饲料的消化率、改善饲料的品质，还有利于饲料 的长期保存【1 6 l 。随着乳酸菌研究的日益深入，乳酸菌在饲料中的应用变得更加 广泛，新的饲料品种也在不断出现。 乳酸菌在发酵过程中可以产生乳酸，又称2 羟基丙酸( 2 h y d r o x y p r o p a n o i c ) 。 乳酸是具有重要工业价值的有机酸，广泛用于化工、轻纺和电子等工业部门中 1 2 j 。乳酸经化学催化，可以生产乙醛、丙二醇、丙烯酸和2 ，3 戊二酮等重要化 工原料。乳酸可以作为纺织品染色和印染的助染剂、增溶剂、p h 控制剂、酸化 剂、显色剂、吸附剂、真丝和人造丝的增亮剂，起增艳作用，增加纱的色泽。 在电子工业中，l 广乳酸衍生物可制造光刻材料和液晶。 1 4 乳酸菌的传统检测方法 由于在发酵生产中需要对性能好、产量高的生产菌株进行标记，对乳酸菌 发酵制品进行安全和质量控制以及对发酵过程中的微生物组成进行控制，所以 就需要对生产过程以及产品中的乳酸菌进行检测。检测乳酸菌的传统方法包括 乳酸菌的形态学观察、乳酸菌的生化鉴定和测定代谢产物等。 1 4 1 乳酸菌的形态学观察 乳酸菌的形态学观察是进行乳酸菌研究不可缺少的研究手段，包括如下3 种方法：平板菌落特征的观察。菌落的形态随培养基的组成、培养时间和温 度的变化而发生变化，所以用菌落形态认识乳酸菌时务必考虑这些因素；光 学显微镜观察。这需要对菌体细胞进行染色，革兰氏染色法是细菌鉴定中最重 要的一个染色法，它主要是由于革兰氏染色阳性细菌革兰氏染色阴性细菌的细 胞壁结构差异，对结晶紫一碘复合物的渗透性不同，而形成染色阳或染色阴性 乳酸菌快速检测方法的建立 反应；电镜观察。电子显微镜观察菌体形态及其表面结构都是通过扫描电镜 菌体细胞磷钨酸负染色的透射电镜进行的1 1 7 , 1 8 】，也有进行超切片的透射电镜研 究菌体的内部结构【1 9 】。 1 4 2 乳酸菌的生化鉴定 生化特征的测定，包括氧化酶、葡萄糖的氧化发酵测定、糖类或醇类的发 酵试验、乙醇的氧化、乙酸的氧化、产氨试验、硝酸盐还原试验、脲酶测定、 吲哚产生试验、氨基酸脱羧测定、明胶水解等3 0 种方法【1 1 。生化鉴定是依据表 型特征进行微生物学鉴的主要组成部分，曾在细菌鉴定中占有重要的地位，但 是由于操作麻烦并且容易被污染，一度限制了其在分类学的应用，随着细菌微 量生化鉴定管以及可自动化的生化鉴定条( 如改良的a p i i d 3 2 链球菌检测系统 s t r e ps y s t e m ) 的研发上市，又改变了这一趋势，但受辨识力所限，生化鉴定也 仅仅作为检测鉴定中的一个重要组成部分【冽。 1 4 3 测定代谢产物 乳酸菌的菌体组分或代谢产物在不同种属间存在差异，通过测定这些成分 的含量，可以进行菌种鉴定。如：乳酸旋光性的测定，乳酸菌含有的醌分析， 细胞壁肽聚糖组分和结构分析。另外，在厌氧细菌和兼性厌氧细菌属、种的鉴 定中，一个不可缺少的依据是糖类代谢的特异性终产物，如同型发酵的乳酸杆 菌主要产乳酸；异型发酵的乳酸杆菌则产生等摩尔的乳酸、乙酸、c 0 2 ；双歧 杆菌的代谢产物的摩尔比为3 ：2 的乙酸：乳酸及少量的甲酸和琥珀酸等。目前 应用于厌氧菌代谢产物的分析方法有不少，如层析法、裂解法、气相色谱法、 离子色谱法。而应用最广泛的是气、液相色谱法，其中在国家标准检验方法的 报批稿中，利用气相色谱法对双歧杆菌和乳酸杆菌进行属间鉴定已成为必做项 目之一。 1 5 乳酸菌的分子生物学检测方法 目前，乳酸菌鉴定仍沿用传统方法，主要是形态学观察、革兰氏染色和糖 发酵试验。但由于传统分析方法具有表型分析的重现率及辨识能力低、相似的 表型特性并不等同于相似的或者关系密切的基因型等缺点，因此基于表型试验 的常规技术并不能对乳酸菌株作出明确的鉴定【2 卜2 2 1 。一般来讲，准确地鉴定乳 酸菌至种的水平，至少需要1 7 种表型实验【2 3 1 ，因此建立简单快速的检测鉴定方 法势在必行。分子生物学技术为微生物的鉴定提供了新的快捷方法。随着对乳 酸菌基因组结构及系统发生关系的了解，分子生物学技术越来越多地被用于检 乳酸菌快速检测方法的建立 测鉴定工作中1 2 4 1 。 1 5 1 实时荧光p c r 技术 1 5 1 1 实时荧光p c r 技术原理 实时荧光p c r 技术于1 9 9 6 年由美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司推出，由于该技 术不仅实现了p c r 从定性到定量的飞跃，而且采用完全闭管检测，不需p c r 后 处理，避免了交义污染。定量p c r 仪采用激光器光源进行实时监测，保证高能、 稳定、无干扰的荧光激发，由一系列透镜、滤镜和一个双色镜组成的光学系统 将激发荧光聚焦到光谱仪上，光谱仪以间隔的方式将荧光按照波长的不同分开， 进入c c d 相机，序列检测应用软件从c c d 相机中收集这些荧光信号，对数据进 行分析。从检测开始到定量结束，整个过程耗时短，操作方便。这种方法采用 一个双标记荧光探针来检测p c r 产物的积累，可非常精确、重复地定量基因拷 贝数。 实时荧p c r 所用荧光探针主要是基于荧光共振能量转移现象( f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r m 3 设计的。当一个荧光分子( 又称为供体分子) 的荧 光光谱与另一个荧光分子( 又称为受体分子) 的激发光谱相重叠时，供体荧光分子 自身的荧光强度衰减，这种现象即是f r e t 。f r e t 现象发生程度与供、受体分 子的空间距离紧密相关，一般为7 1 0n l n 时即可发生f r e t ：随着距离延长，f r e t 呈1 0 8 显著减弱。f r e t 现象己广泛应用于生物人分子内和分子间相互作用等生 物学研究。 实时荧光定量p c r 所用荧光探针主要有三种：t a q m a n 荧光探针、杂交探针 和分子信标探针三种，其q b t a q m a n 荧光探针使用最为广泛。 t a q m a n 探针法是使用5 端带有荧光物质( 如：f a m 等) ，3 端带有淬灭物 质( 如：t a m r a 等) 进行荧光检测的方法。当探针完整时，5 端的荧光物质受 到3 端淬灭物质的制约，不能发出荧光。在p c r 反应的退火过程中，荧光探针 便会和模板杂交。在p c r 反应的延伸过程中，t a qd n a 聚合酶的5 一 3 e x o n u c l e a s e 活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。 通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测p c r 产物扩增量的目的。具体 原理见图1 - 1 。 乳酸菌快速检测方法的建立 探针 1 热变性，n 毒罢荧光物质汪淬灭鞠质1 r r一彩獠片5 ”8 il ；lll 。：1 ；lil ；lllll _ l 1 2 引物退火探钳与楼板魄热交 蔫= 群辈警1 1 r 移；彦一1 一一r _ r f ；l ；lll ：k 。lil ；1 0 llll l h 二9 3 延伸反应 嚣，誓 7 1 r t 一甲7 w 一什 il；lli1lll；illllll 妓、堂 1 1 - 1 r r r r 甲- r 气1 广r 下 ；lllillll；lil|lll 图1 1 实时荧光p c r 原理示意图 1 5 1 2 实时荧光p c r 技术在微生物领域的应用 到目前为止，实时荧光p c r 技术在国内外己经广泛应用微生物检测。赵敏 等人以短乳杆菌中的g y r b 基因为靶目标设计引物和探针，对啤酒中的短乳杆菌 进行检测【2 5 1 。m o n i q u eh a a r m a n 针对双歧杆菌1 6 2 3 sr d n a 设计了引物和探针， 定性并定量检测了，服用益生元( p r e b i o t i c ) 的婴儿的肠道中的双歧杆菌的种类 及其数量【刎。此外，实时荧光p c r 技术在国内外也广泛应用于致病菌的检测， 如金大智、曹际娟等选取单增李氏菌的h l y a 基因运用实时荧光p c r 技术检测 食品中单增李氏菌 2 7 1 ；j a m e sc m c a v i n 等使用实时荧光p c r 技术建立了灵敏 度高、特异性强的检测肺炎链球菌的方法【2 8 】等。 1 5 1 3 实时荧光p c r 技术其他领域的应用 实时荧光p c r 技术除了在细菌检测中广泛应用外，在其它方面也有应用。 如曹际娟等运用实时荧光p c r 技术检测肉骨粉中牛羊源性成分【2 9 】；c h i uc h i n y u a n 等使用实时荧光p c r 技术对人体细胞中的e r v 3 基因组进行定量检测【矧。 总之，实时荧光p c r 技术，在发明以来的短短几年间，己经广泛应用在分 子生物学的各个领域，给p c r 扩增技术带来了质的飞跃，它不仅可以将p c r 反 应产物定量，而且省去了常规p c r 后的电泳，可以直接在反应仪器上观察实验 结果。在减少p c r 污染的同时，增加了实验的安全性，使实验操作更加简便。 1 5 2 变性高效液相色谱( d h p l c ) 变性高效液相色谱( d h p l c ，d e n a t u r i n gh i g h p e r f o r m a n c el i q u i d 乳酸菌快速检测方法的建立 c h r o m a t o g r a p h y ) 是一种自动化的，能够应用于微生物群落分析、监测和鉴定的 新技术。d h p l c 主要用于d n a 序列多样性的检测，包括基因的插入、缺失、 单核苷酸多态性( s n p s ) 和微卫星序列分析。这种技术已经成功地应用于多种领 域，如人类疾病地诊断，微生物鉴定，甲基化分析，r n a 的分析以及基因克隆。 大部分的应用都是在变性条件下，通过异源双链核酸分子来检测相关的同源双 链核酸分子的基因多样性。 1 5 2 1d 卸p l c 原理 d h p l c 利用离子对反相液相色谱技术对核酸片段进行分离和分析。d n a 分子带负电荷，而分离用色谱柱的固相呈电中性疏水性，因此d n a 分子本身 不能直接吸附到柱子上。一种充当“桥梁”作用的分子一一离子对试剂 t e a a ( t r i e t h y l a m m o n i u ma c e t a t e ，三乙铵醋酸盐) ，可以帮助d n a 分子与柱子 固相填料表面分子结合，使t e a a 的阳性铵离子与d n a 相互作用，同时烷基 链与柱子的疏水表面相互作用，见图1 2 。这样d n a 分子越长，结合的t e a a 越多，与固相结合得越牢固1 3 1 】。羟基链与固相结合的强度会随着流动相中乙腈 ( a c e t o n i t r i l e ) 浓度的增加而减弱，d n a 片段越长，结合的t e a a 越多，越不 易被洗脱。因此d n a 片段大小分析是长度依赖性分离，而非序列依赖性分离。 变性温度是影响d n a 片段分析的一个重要因素，变性温度升高保留时间缩短， 在适宜的温度下可使d n a 双螺旋呈舒展状态，最大限度的暴露出用于离子对形 成的磷酸根基团，使d n a 分子与分离柱产生很强的相互作用，因此4 0 5 0 最适合做d n a 片段大小分析，随着温度的升高，分离效率迅速下降，较高的 温度常用于进行突变分析。 图1 2d h p l c 原理示意图 乳酸菌快速检测方法的建立 图1 - 3d h p l c 分析流程图 p c r d h p l c 检测方法流程：样品核酸的抽提，然后进行p c r 扩增；将p c r 产物用于d h p l c 分析，在合适的d h p l c 条件下d n a s e pc a r t r i d g e 中核酸片 段的洗脱、分离；w a v es y s t e ms o f t w a r e 对数据自动收集、分析和报告；对分 离的核酸片段收集；收集到的片段可迸一步进行扩增、纯化和测序。d h p l c 分 析流程见图1 3 。 1 5 2 2d h p l c 在微生物领域的应用 传统的微生物分析技术主要通过琼脂培养方法对细菌进行计数和鉴定，尤 其是对复杂的混合菌群的分析更是如此。这些方法的缺点除了耗时外( 1 2 7 2 小时) ，许多细菌还需要特殊的培养条件，如需要苛刻培养条件或厌氧条件培养 等，据估计，某些样本菌群中( 比如环境样本) 只有不到1 0 的细菌能培养成 功。由于传统方法的局限性，微生物学家正致力于通过分子遗传方法对不同微 生物样本进行鉴定和分析。w a v e 微生物分析系统是进行微生物分子分析的理 想工具，它不仅可用于细菌的识别鉴定和检测抗药基因突变，还可用于真菌， 病毒和寄生虫等研究领域。 w a v e 微生物分析系统是培养不依赖的混合微生物样本分析平台，不仅能 鉴定常见的微生物，还能鉴定不常见的，苛刻的，和厌氧的细菌。该技术简单、 快速、重复性好，样品分析当天就能出结果。系统自动收集各个分离的d n a 乳酸菌快速检测方法的建立 片段，并自动记录分析数据。自动的片段收集功能为测序提供模板以进一步确 认各种微生物。一旦特定样本中各种微生物的峰型得到鉴定，那么样本的峰型 谱可用于定性和定量监测样本中各种微生物的动态变化。 d h p l c 在微生物耐药检测中的应用 随着耐药性微生物的大量出现，针对传染性病原体的治疗策略制定和药物 研发变得越来越难。抗微生物治疗面临挑战的一个重要原因就是缺乏能够准确 识别致病微生物和耐药基因的有效临床手段。近来发展起来的能识别病原体和 研究微生物抗药性的分子生物学方法又为抗微生物治疗和药物研发建立了希 望。 d h p l c 技术可以准确地检测耐药性相关基因突变，已广泛应用于微生物耐 药基因突变检测，是基础研究和临床快速检测已知和未知致病细菌以及细菌耐 药性基因突变的可靠技术。孙照刚等人利用变性高压液相色谱( d h p l c ) 技术快 速检测结核分枝杆菌硝基因的突变，对结核分枝杆菌是否耐受氟喹诺酮类药 物做出初步判断d h p l c 。在1 0 1 株结核分枝杆菌临床分离株中，有4 9 株对2 m g l o f l x 敏感，5 2 株耐受。5 2 株耐药菌株中，有2 7 株能够通过序列测定和d h p l c 法得到准确判定【3 2 】。 从异源混合物中检测遗传突变基因对于监测感染过程中病原微生物耐药性 的变化至关重要。在没有选择压力的情况下，耐药突变基因的出现频率低于野 生型基因。而低频率的突变很难通过测序检测到，通过亚克隆后的测序结果会 偏向频率高的突变类型。d h p l c 技术能提高检测少数耐药突变的能力，进而促 进对耐药病菌引起的传染病的治疗。 d h p l c 在微生物基因分型和鉴定中的应用 许多病菌具有不同的基因型，它们的致病性差异很大，但是它们其它的特 性以及遗传基因都非常相似，使得细菌的准确分型面临很大的技术挑战。在一 场大范围疫情爆发中，从菌株水平确定病原菌是至关重要的，只有了解了致病 菌株才能正确选择抗菌药物，追踪病菌的来源等。d h p l c 通过对具有细微差异 的d n a 序列的分析可以从菌株水平识别病原菌。 从临床治疗的角度来看，准确确定致病微生物的种类具有重要的价值，它 可以保证用药的有效性。d h p l c 技术能有效的识别病原微生物。利用通用p c r 引物从多种细菌的1 6 sr r n a 基因中扩增含有高度变异序列的片段。将这些来 乳酸菌快速检测方法的建立 自不同种类细菌的扩增产物与参照菌株的扩增产物混和后进行d h p l c 检测， 会产生一个独特的色谱峰图，可以作为鉴定细菌种类的分子指纹【3 3 - 3 7 。 d h p l c 对混合微生物样品的分离鉴定 在日常的微生物的检测和鉴定工作中，常常是对混合样品中的微生物进行 鉴定。比如常见的污染食物的微生物有十几种，对于一个污染的食物样本，我 们需要对所有可能污染的病菌进行鉴定，因而需要一种简单，快速，灵敏的检 测技术。d h p l c 技术在这方面显示了其良好的应用价值。 d h p l c 能够有效、灵敏地检测和区分不同的基因序列。凭借d h p l c 这一特 点，可以用d h p l c 来区分细菌种间的1 6 sr r n a 基因的不同。p c r 扩增得到的1 6 s r r 雌因片段，结合到含有烷基化无孔的聚苯乙烯微粒的柱子上，以部分变性 的d n a 分子为基础，通过系统中离子对试剂，t e a a 和柱子基质的相互作用达 到分离鉴定的目的。在部分热变性和梯度溶液( 包括乙腈和t e a a ) 流动的影响 下，具有序列可变区和不同解链区的细菌d n a ，显示出不同的与柱子结合力。 结合时间的长短依赖于与柱子结合的双链的d n a 分子的数量。柱温较高时， d n a 片段部分变性，导致双链p c r 产物的减少，双链d n a 分子越来越少，样品 洗脱越快。由于d n a 片段的g c 含量影响d 湖链的热稳定性，因此，a t 碱基 含量高的p c r 产物比g c 含量高的p c r 产物，更容易发生热变性，洗脱的速度更 快。 利用d h p l c 灵敏检测d n a 序列差异的特性结合细菌1 6 sr d n a 基因分型 的原理，在属和种的水平上进行细菌鉴定，在部分难以鉴定的菌种间，辅以其 它细菌d n a 靶点进行进一步的分析，不同的细菌显示特异的d h p l c 峰型，从 而得到分离和鉴定。d o m a n n 等人运用d h p l c 技术，在非培养条件下，鉴定肾 移植病人尿路感染中的多种病原微生物【3 引。b a r l a a n 等人通过d h p l c 技术检测 分析，海洋环境微生物群落的变化1 3 9 】。 d h p l c 技术在微生物学研究中的应用并不仅限于细菌相关的工作。它也可 被用在真菌，病毒和寄生虫等研究领域，以识别微生物和检测抗药基因突变。 1 5 2 3d h p l c 在其他领域中的应用 d h p l c 这一新兴的变异检测技术一经诞生，即被许多实验室采用，大多用 以筛选候选基因中已知或未知变异。在最早成功地筛选出乳腺癌、卵巢癌相关 基因( b r c a l ) 的突变后【删，现d h p l c i a , 被用于肿瘤相关基因( t s c l 、t s c 2 、 a t m 、p 5 3 等) 、先天性长q t 综合征( k c n q l 、k c n h 2 ) 、隐睾病( g r e a t ) 、 乳酸菌快速检测方法的建立 血友病甲( f 8 c ) 、多发行硬化( m a g ) 等5 0 多种疾病( 候选基因) 的变异筛选中。 在肾脏疾病中，d h p l c 也已被用于常染色体显性遗传的多囊肾相关基因p k d l 和p k d 2 的突变筛选中【4 1 1 。 d e v a n e y 等运用d h p l c 在非变性温度下分析了人类酪氨酸基因第一内含子 h u m t h 0 1 区微卫星序列，得到了8 类等位基因的精确长度，这些等位基因含有 不同数量的重复序列，具个体特异性，将这些片段作为对照，利用在保留时间 上的微小差异来鉴别受检个体的特征。在司法案件中常利用该区域做身份鉴定 1 4 2 1o d h p l c 还被应用c p g 岛甲基化的分析1 4 3 喇j ，d n a 片段大小测定及寡核苷 酸的分析和纯化等许多基因组研究领域中。有学者进一步拓展了d h p l c 的功 能，用其检i 贝j j m r n a 4 5 - 4 1 1 。 1 5 3 其他分子生物学检测鉴定方法 除了上述分子生物学检测鉴定方法以外，还有一些分子生物学方法越来越 多应用在乳酸菌检测和鉴定中，例如指纹图谱法、寡核苷酸引物法、1 6 sr r n a 序列分析法等。 随机扩增d n a 多态性( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 是利用 短的随机引物( 通常为1 0 m e r ) 随机扩增乳酸菌基因组d n a ，在较低的温度下结 合到与之最同源的d n a 序列上，引物之间的区域得到扩增，p c r 产物经电泳后 形成多态性，可作为鉴定的依据。r a p d 是一个简单快速廉价的方法，但是其重 现性低，主要是因为反应条件的小小变化就可引起图谱的改变，因此r a p d 必须 在可控制的条件下进行，只有进行小心仔细的操作才能够确保结果的可重复性 【2 1 1 。已证实r a p d 分型用于大多数乳酸菌种内和种间特异性鉴定的可靠性 2 4 , , 略- s 0 1 。此外，多重k a p d ( r a p d 和多个随机引物) 已成功将乳杆菌分离株进行 鉴定【5 1 5 2 1 ，这更增强了黜谨d 技术在乳酸菌菌株水平鉴定的应用性，尤其是在 r a p d 与信息学联合应用的情况下【5 3 巧4 1 。除了廿d 外，d n a 指纹图谱技术还包 括，基因组d n a 限制性片段长度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 、脉冲场凝胶电泳( p u l s e d f i e l dg e le l e c t r o p h o r e s i s ， p f g e ) 、和核糖体分型( r i b o t y p i n g ) 5 5 - s 6 】。 核酸杂交法是测定核酸分子同源性和不同物种间亲缘关系的主要手段。普 遍认为拥有 7 0 d n a 相似性的菌种通常有超过9 7 的1 6 sr r n a 序列同一性。 一般认为，d n a - d n a 杂交同源性超过6 0 的菌株属同一个种，同源性超过7 0 乳酸菌快速检测方法的建立 则是同一亚种，同源性在2 0 6 0 范围内属于同一个属。但是1 6 sr r n a 序列同 一性却不能充分的保证两个分类单元同属一个种，这说明1 6 sr r n a 序列分析尚 不能够取代d n a - d n a 杂交来描绘菌种和计量种内关系。迄今，最佳辨识力的遗 传探针是种特异性的【2 4 1 。研究表明，乳酸菌1 6 s 2 3 s 基因间d n a 序列是超变量， 如缺乏t d n a 时其长度约为2 0 0 b p ，也具有充分的种属特异性，可设计p c r i j 物 用于乳酸菌的鉴定，比较1 6 s 2 3 s 基因间序列的相似性，是一种实用的菌株鉴定 方法，这些相对较短的序列不仅容易测序也容易比较【2 3 朋。 最可靠的鉴定就是进行核苷酸测序，同源性分析就是依据某一同源基因序 列的保守区域设计通用引物，对l a b 基因组d 删行p c r 扩增，随后进行扩增 子的测序，而后利用一些必要的计算机软件( 如c l u s t s a lw 、t r e ev i e w 、s e q u e n c e 、 p h i l i p s 和t r e e c o n 等) 将其与数据库( 如g e n b a n k 、e m b l 、d d b j 、r d p 和a r b 等