（细胞生物学专业论文）pyg02相互作用蛋白的纯化鉴定及功能初探.pdf

摘要 摘要 p y g o p u s ( p y g o ) 是近年来发现的w n t 信号通路的新组分。在哺乳动物中p y g o 有两 个同源基因：p y g o l 和p y 9 0 2 ，后者的分布较为广泛。p y g 0 2 蛋白定位于细胞核内，它 有两个结构域，分别是位于c 一端的p h d 锌指结构域和位于n 一端的n h d 结构域。p y g 0 2 通过p h d 结构域与b c l 9 和b - c a t e n i n 构成复合体，共同促进转录因子t c f 对w n t 靶基 因的转录激活。p y 9 0 2n h d 结构域的功能尚不明确，有研究者认为它具有转录激活作用。 近期研究显示，在哺乳动物中p y 9 0 2 可能还介导w n t 非依赖性的信号转导。 串联亲和纯化技术( t a p ) 是在目的蛋白一端导入两个特异性的蛋白标签，经过两 步亲和纯化，获得在生理条件下与目的蛋白相互作用的蛋白质，随后用质谱技术进行鉴 定。它集合了亲和纯化和免疫共沉淀两种技术的优点，可以获得高纯度、高浓度的目的 蛋白复合物，简便快捷。 本研究利用串联亲和纯化和质谱联用的方法，从稳定表达外源性p y g 0 2 蛋白( 带 p r o t a 和c b p 标签) 的d l d - 1 结肠癌细胞中，分离得到两个与p y g 0 2 相互作用的新蛋白： m e d l 2 ( m e d i a t o ro fr n ap o l y m e r a s ei it r a n s c r i p t i o ns u b u n i t1 2 ) 和p i k 3 c 2 a ( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 一4 一p h o s p h a t e 3 - k i n a s ec 2 d o m a i n c o n t a i n i n ga l p h a p o l y p e p t i d e ) 。进一步的免疫共沉淀实验证实，p y g 0 2 通过n h d 结构域与m e d l 2 结合。 随后的荧光素酶实验显示，m e d l 2 过表达或用s i r n a 阻遏m e d l 2 蛋白表达，对p y 9 0 2n h d 结构域的转录激活活性均无明显影响；而当用s i r n a 阻遏m e d l 2 蛋白表达时，p y 9 0 2p h d 结构域的转录激活活性显著增强，这暗示m e d l 2 可能会阻抑p h d 结构域的转录激活活性， 而这种活性很可能与染色质重塑有关。 关键词：p y g 0 2 ；串联亲和纯化；m e d l 2 摘要 a b s t r a c t p y g o p u s ( p y g o ) i san e wc o m p o n e n to fw n ts i g n a l i n gp a t h w a y i nm a m m a l s ， p y g og e n eh a st w oh o m o l o g s ：p y g o la n dp y 9 0 2 p y 9 0 2i sw i d e l ye x p r e s s e di nv a r i o u s t i s s u e s p y g 0 2p r o t e i nl o c a t e si nt h en u c l e u s i th a st w od o m a i n s ，w h i c ha r e p h dd o m a i ni nt h ec - t e r m i n a la n dn h dd o m a i ni nt h en - t e r m i n a l p y g 0 2f u n c t i o n s d o w n s t r e a mo f1 3 一c a t e n i n i tb i n d sw i t hb c l 9t h r o u g hi t sp h dd o m a i n ，t h e nf o r m s ac o m p l e xw it hb c a t e n i n ，a n dt h et h r e eo ft h e mc o a c t i v a t et r a n s c r i p t i o n a l f a c t o rt c ft oa c t i v a t ew n tt a r g e tg e n e s s of a r ，t h ef u n c t i o no fn h dd o m a i ni s s t i i iu n k n o w n ，b u ts o m er e s e a r c h e r sc o n s i d e ri to ft r a n s a c t i v ea c t i v i t y r e c e n t s t u d i e ss h o wt h a tp y 9 0 2m a ym e d i a t ew n t i n d e p e n d e n ts i g n a lt r a n s d u c t i o n si n t a n d e ma f f i n i t yp u r i f i c a t i o n ( t a p ) t e c h n o l o g ya d d st w os p e c i f i cp r o t e i n t a g st ot h ec o rn t e r m i n a lo ft h et a r g e tp r o t e i n a f t e rt w o s t e ps p e c i f i c a f f i n i t yp u r i f i c a t i o n s ，p r o t e i n sw h i c hi n t e r a c tw i t ht h et a r g e tp r o t e i nu n d e r p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n sc o u l db eo b t a i n e da n di d e n t if l e db ym a s ss p e c t r o m e t r y b yi n t e g r a t i n gc l a s s i c a la f f i n i t yp u r i f i c a t i o nw i t hc o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ， t h et a pt e c h n o l o g ya c q u i r e sh i g hc o n c e n t r a t i o na n dp u r i t yo fi n t e r a c t i v ep r o t e i n c o m p l e x e sv i as i m p l ea n dr a p i dp r o c e s s e s w ep u r i f yt w on e wi n t e r a c t i v ep r o t e i n sf r o mad l d 一1c o l o nc a n c e rc e l l 1 i n e w h i c hs t a b l ye x p r e s s i n gp r o t a c b p p y g 0 2f u s i o np r o t e i n ，u s i n gt a n d e ma f f i n i t y p u r i f i c a t i o na n dm a s ss p e c t r o m e t r yt e c h n o l o g i e s t h et w oc a n d i d a t e sa r em e d l 2 ( m e d i a t o ro fr n ap o l y m e r a s ei it r a n s c r i p t i o ns u b u n i t1 2 ) a n dp i k 3 c 2 a ( p h o s p h a t i d y li n o s it o l 一4 一p h o s p h a t e3 一k i n a s ec 2d o m a i n c o n t a i n i n ga l p h a p o l y p e p t i d e ) a f t e r w a r dw ec o n s t r u c te u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i d so fp y g 0 2 s h d a n dm e d l 2 ，t h e nt r a n s f e c tt h e mt o2 9 3 tc e l l1i n e ，a n dw ef i n dt h a te x o g e n o u s p y g 0 2 c o u l db i n d w i t he x o g e n o u sm e d l 2t h r o u g hi t sn h dd o m a i n s u b s e q u e n t l u c i f e r a s ea s s a y ss h o wt h a t ，b o t ho v e r e x p r e s s i o no fm e d l 2p r o t e i na n ds i r n a i n d u c e ds i l e n c i n go fm e d l 2g e n eh a v e 1 i t t l ei n f l u e n c eo nt h et r a n s a c i t i v e a c t i v i t yo fp y 9 0 2n h dd o m a i n ，w h i l es i l e n c i n go fm e d l 2g e n ep r o m o t e st h e 摘要 t r a n s a c i t i v ea c t i v i t yo fp y 9 0 2p h dd o m a i n ，s u g g e s t i n gm e d l 2c o u l di n h i b i tt h e t r a n s a c i t i v ea c t i v i t yo ft h ep h dd o m a i n ，w h i c hm a yh a v ear e l a t i o n s h i pw i t h c h r o m a t i nr e m o d e l i n ga c t i v i t i e sd u r i n gt r a n s c r i p t i o n a lp r o c e s s e s k e yw o r d s ：p y g 0 2 ：t a n d e ma f f i n i t yp u r i f i c a t i o n ：m e d l 2 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导f ，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为( 力谤安 ) 课题( 组) 的研究成果，获得( 力罅望 ) 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在( 菇掳宴) 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ：秀菇 丽年彩月岱日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ， ( ) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“”或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：力荭 彳年2 月j y 日 前言 _ 上- - 一 刖舌 一、经典w n t 信号通路与b - c a t e n in 蛋白 经典w n t 信号通路是一条影响细胞生长发育的关键信号通路。1 9 8 2 年在小鼠乳腺癌 中首先发现了w n t 基因，最初被命名为i n t - i 。小鼠乳腺癌病毒( 删t v ) 的逆转录插入常 会激活这个基因的表达。w n t 基因在进化过程中高度保守，它是果蝇体节极性基因 w i n g l e s s 的同源基因【l j 。正因为i n t - i 和w i n g l e s s 在序列和功能上具有相似性，所以将 i n t 一1 更名为w n t - i 。 通过遗传异位显性实验确定了各组分在w n t 信号级联中的顺序，从而绘制出信号级 联发生的最初图景：w i n g l e s s 激活d i s h e v e l l e d ，使后者阻抑激酶s h a g g y ，导致a r m a d i l l o 的激活。果蝇中所发现的蛋白质在进化中具有保守性，在许多不同的物种中( 如小鼠和 人) 都存在直系同源物。在脊椎动物中，w n t 激活d i s h e v e l l e d ，d i s h e v e l l e d 使g s k 3 ( s h a g g y 在脊椎动物中的同源物) 失活，从而激活b - c a t e n i n ( a r m a d i l l o 在哺乳动物 中的同源物) 。 b - c a t e n i n 通过不同的结构域分别在细胞粘附和w n t 信号通路中起双重作用。它是 粘附连接的一个组分，n 一端为细胞间粘附所需；c 一端对它在w n t 信号通路中的功能起关 键作用【2 】。在一段相当长的时间内，b c a t e n i n 都被认为是w n t 信号通路中最下游的组 分。直到发现b - c a t e n i n 结合的t c f l e f p a n g o l i n 转录因子家族，我们才清楚的了解w n t 信号如何对下游基因产生影响【3 ，4 1 。随后又发现了另外一些w n t 信号通路的组分，所以如 今我们可以描绘出一幅较为详细的w n t 信号级联网络图。 图11w r i t 信号通路网络 f i g u r e 1 1w n ts l g n a l l n gn e t w o r k 当w n ；号不存拒叫，o1 ，“l 一硬存神于牯附连接巾，作山e - - “i d hl _ rjn 铤秆体 的个成员束介导细胞朴| 】 ! ! 质内h _ c a t e n l n 的毓被一个活性复f ? i 4 q f i 二 仵低水、r 这个复合体包折：r t hr 澈哺( ；s k 2b 、支架蚩白舨l n 、肘涮抑制蛋r | 心c 和酣蛋白激 嗨i ( c k i ) 一“_ | 游离的bc a t o n 】n 存打吁胞质，便马r 被蛋r 胁体坪样抻。p 雌t e n ir l 乜仃何叫个高腹侏守的储眩化似一- ，s 弧$ 3 7 、t 4 l 和s , 5 ，起训c k i 磷畦化j0 m i 化血， 从而引发( - s k 3h 磷酸化0 出t t 的 0 他位点 6 1 。磷酸化的”? 剌孙7 化r i l 做f 岫x 蛋白 h i r c p u ! 刖后并健日c c ：l i 1 泛桊化并介导口( h i in 让蛋广嗍体l 释解”。，在游高 p 弋，【1 m 缺乏的陆，玎l 、，n p j ( r l c hr ) 家族战见结沦，仃效抑l 川靶墓内转泶”j 。 日u 再 w n t 蛋白到达细胞膜后结合到其受体f r i z z l e d 及l r pi - ： 11 - 1 3 ，从而使d i s h e v e l l e d ( d v l ) 阻抑a x i n 、a p c 和g s k 3 对b c a t e n i n 进行磷酸化【1 4 】，最终导致b c a t e n i n 在胞质 积聚，并通过一种尚未明了的机制迁移到核内【1 5 ，16 1 。在核内，b c a t e n i n 结合t c f 转录 因子家族，生成一个功能性的转录因子复合体，从而激活靶基因( 如c m y c 1 7 1 、t c f 一1 【1 8 1 及e p h b - 2 ”1 ) 的转录，激活机制至今还未完全阐明。 w n t 信号级联的失调与癌症密切相关。8 0 的结肠癌都显示a p c 失活【2 0 1 。突变的a p c 失去调控下游b c a t e n i n 的能力，导致游离口一c a t e n i n 的积聚并转移到核内，靶基因异 常激活。在具有野生型a p c 的余下2 0 的结肠癌病例中，约5 含有b c a t e n i n 突变【2 l 】，致 使介导b c a t e n i n 降解的g s k 3 磷酸化位点失活。在许多其他组织的肿瘤( 包括黑素瘤、 胃癌、毛囊肿瘤) 中也发现了诸如此类的1 3 一c a t e n i n 突变 2 2 , 2 3 】。 b c a t e n i n 的n 一端含有g s k 3 - b 位点，调节其自身的泛素化【2 4 ，2 5 l ；中部结构域由 1 2 个a r m a d i l l o 重复片段组成，介导1 3 - c a t e n i n 与- c a t e n i n 、e - c a d h e r i n 、a p c 、 a x i n 和t c f 结合；c 一端包含有效的转录激活结构域【2 6 1 。b - c a t e n i n 可作为多种协同因 子的结合支架，通过顺序或协同的方式来改变w n t 目标启动子的转录活性。b - c a t e n i n 的c 一端部分可与诸如t a t a - b i n d i n gp r o t e i n ( t b p ) 、m e d i a t o rs u b u n i t1 2 ( m e d l 2 ) 、 p a r a f i b r o m i n h y r a x 等蛋白结合，从而使b c a t e n i n 与基本转录元件相连，也可与 c r e b 结合蛋白( c b p ) 、p 3 0 0 、b r a h m a 相关基因1 ( b r g l ，s w i s n f 复合体成员) 、模拟 开关染色质重塑a t p 酶i s w l 、转化转录域相关蛋白( t r r a p ) 、混合谱系白血病z e s t e t r i t h o r a xl 的s u ( v a r ) 增强子( m l l s e t l ) 等结合，从而使t 3 - c a t e n i n 与染色质重塑 活性关联。与b - c a t e n i nn 一端结合的蛋白有p o n t i n 、r e p t i n 、l e g l e s s ( l g s ) ，b - c a t e n i n 通过l g s b c l 9 与p y g o 蛋白p h d 锌指间接结合。 图卜2b c a t e n l n 相互作用蛋白 f i g u r el 一2 p r o t e i n si n t e r & c 【i n gw l t hb c a t e n i n 0 自j c s s c nso ubd a ixp y g o p u s d t h c w n ls i g n a l i n gp a t h 、a y ：a 抓c r lo f c 0 1 n c c t i o n s 1 c ms2 0 0 83 0 ( 5 l ： 4 4 8 一4 5 6 0 一c n o n ln 川能直接或通过p o n t in 5 2 2 7 1 间接与t a t a 结介蛋白( b p ) 结合”i ，使 得t c f b c a t e n in 与堆本转录元件直接棚q 作用，从而澈活粑璀凼的转录，h 种意 见认为，bc a t l n 与自l 蛋自厶酰举转移酶c ”( c ic e b 结合蛋n ) 相n ? 用，后崭结 z l ：时i ( 1 o 巫复片段10 的c 端。通过与t c f 一日_ ，i m i 复合体! n 棚作t t j ，c b p 拙绑在d n aj ，升r ，r 能局部乙酰化恢小体自l 蚩白，从而使染也赝的构型处于种“开放” 状巷，继l m j 能促进j e 他转录冈予的结介，并使常规转j 7 c 什得以接近启动于，激活 转录m3 。然i f j 些证计指出，b 删l e n i n 通过仙djc b p 的机= | j | _ 激活转球，根 据以前的硎宄结m 缺乏c b i 结合域的pc a t e n in 突变休仍然 有啬| ；分转录擞活活性， 暗小口c 。ll6 7 n 1n f i j 端含有爿外的转录激活单位川，小仪如此【b i 对口弋邮】n 介 导的转求激活活一阱同作用，l5 存 丁小爿：分t c f 靶革圳f 一陆况。 i 2 1 。项近驯的研 究显h ：，hc “ c n lr 】，b r g i s w i s n f 染包赝1 瞳型复。r 休的恢心 ：【1 分存存功能 队的；。i 介1 l j = 【| s w i s x ：复合体参与【生l i 八聚佛从d 政f 解嗣的过十￥i “i ，州促 j ! 蛔资门八浆”、“d x 、】渭”1 ，摊洲s w i s n t l 复台体参j 札片肫的 j 功了i 哇域内棱 小体改娈的】b 成这使徘其他转求r 生择易接近i ) x a ，从1 j 卫行敛的激；l 靶萆【 一的转 求，c n ，业r i 刈l j 一ur i n 介甘的靶j + 姒件求澈活汀的l w 强设r 近较力“，hj p 均而言仅使其活性增加2 - - - 3 倍，这暗示了很可能这些因子共同作用以获得有效的靶基 因激活效果。 众所周知，在无活性信号时，l e f t c f 蛋白通过与g r o u c h o 等共阻遏因子结合使w n t 靶基因保持沉默，而w n t 信号级联的激活会使b c a t e n i n 取代共抑制因子原来的位置 【3 6 1 。近来也有证据表明如下观点的合理性，即b - c a t e n i n 自身也能与共阻遏因子和转 录抑制因子结合，包括i c a t 、c h i b b y 、g l i s 2 和t i s 7 ，可能还有b r i n k e r d 7 小】。共激活 因子及共阻遏因子同1 3 - c a t e n i n l e f 复合体的竞争性或协同性结合，会导致截然相反 的染色质重塑行为 组蛋白乙酰转移酶( h a t ) ，或者组蛋白去乙酰酶( h d a c ) 募集至w n t 目标启动子，这也许就是b c a t e n i n l e f 复合体调控转录活性的根本机制。除了 l e f t c f ，近期有研究显示1 3 - c a t e n i n 也能作为其他转录因子的协同激活因子，如同源 域蛋白p r o p l t 4 习及核激素受体h “扪。此外，核激活受体共激活复合体的一些组分，如 g a c 6 3 ，可增强l e f t c f 依赖性激活作用【4 7 5 2 1 。1 3 一c a t e n i n 数目众多的相互作用蛋白， 表明w n t b - c a t e n i n 靶基因的转录需要敏锐的生理调控，也在一定程度上暗示了这种 调控发生时的顺序特异性。 迄今为止，关于b c a t e n i n 细胞定位的调控、以及它是如何转移到核内的相关机 制并不是很了解。研究显示，b c a t e n i n 的核输入与i m p o r t i n s 和经典的n l s 受体无 关，可能直接与核孔复合体相互作用并由其介导【5 3 彤】。有证据表明，b c a t e n i n 经常 性的在核内及胞质间穿梭。它的细胞定位可能是由两种因素之间的竞争所决定的：a p c 所介导的连续性的核输1 5 6 , 5 7 】，以及与t c f 结合后滞留在核内。研究人员希望通过遗传 筛选和蛋白质相互作用筛选，找到新的功能蛋白，以求更深入的了解w n t 信号通路的效 应机制。 二、p y g o 蛋白 2 0 0 2 年，三个不同的实验室分别在独立的遗传筛选中发现了同一个w n t 通路的新组 分p y g o p u s ( d p y g o ) s s - 6 0 l 。另一个实验室则在筛选中找到了l e g l e s s ( l g s ) ，随后利用酵 母双杂交的方法发t 见d p y g o 与l g s 存在相互作用6 。l e g l e s s 蛋白由1 4 6 4 个氨基酸组成， 它含有三个同源结构域：h d i 、h d 2 和h d 3 ，其中h d l 结构域介导l e g l e s s 与p y g o 结合，h d 2 结构域则介导l e g l e s s 与a r m a d i l1 0 相互作用。d p y g o 功能性缺失引发的缺陷型，- - l j w g 刚舌 或a r m 缺失引发的表型极其相似。在以上几个实验中，含有d p y g o 无效等位基因或缺失p h d 结构域的亚等位基因的突变果蝇，都存在和w g 信号缺失一致的胚胎及成体表型。遗传上 位和细胞生物学实验显示，d p y g o 位于a x i n 和a r m 的下游，而分子生物学分析显示，d p y g o 的功能性缺失在多个发育部位都会引起w g 靶基因表达的缺失。所有这些发现引出一种观 点，即d p y g o 不同于b - c a t e n i n - l e f 复合体的其他转录协同因子，它是w g a r m 信号通路 的核心组分。但是，在d p y g o 突变的果蝇中，w g 转录活性及某些w g 靶基因的表达仅仅被 削弱而未完全被抑制【5 9 1 ，提醒我 1 d p y g o 可能并非是w g 信号通路所不可或缺的。 在众多b c a t e n i n 的结合蛋白中，p y g o 蛋白成为近期寻找w n t 信号功能机制的分子 效应物的焦点。果蝇研究发现，d p y g o 仅在w g 信号中发挥作用【5 蹦1 1 。随后的分析提出这 样一种机制，即p y g o 的作用可能是把b - c a t e n i n 滞留在核内【6 2 6 4 1 ：然而相当多的数据显 示，p y g o 除了使b - c a t e n i n 锚定在核内之外，还对后者具有基本转录激活因子的功能【5 8 ， 5 9 ，6 1 ，6 5 石7 】。奇怪的是，在小鼠中敲除p y g o 基因并不能产生和w n t 信号缺失一致的表型突 变【6 & 7 0 1 。所有这些研究说明，哺乳类p y g o 蛋白对w n t 通路只起增强而非核心作用。 近期关于小鼠p y g o 的研究发现，哺乳动物的p y g o 含有两个同源物，p y g o l 和p y 9 0 2 5 8 6 0 ，6 1 ，7 1 1 。小鼠p y g o 基因在已知w n t 信号对其发育起重要作用或根本不起作用的区域均有 表达【6 ”1 1 。p y 9 0 2 表达缺失、或p y g o l 和p y 9 0 2 表达均缺失的小鼠，与w n t 信号缺失小鼠在 某些表型上具有一致性，但也具有一些不同于后者的特性。p y 9 0 2 单独敲除和p y g o l 、 p y 9 0 2 均敲除的小鼠在发育上并没有明显的差异【6 9 1 ，这表明之前有关表型的研究主要反 映的是p y 9 0 2 在这些途径中的功能。在小鼠体内的实验显示，p y 9 0 2 敲除或其表达削弱的 突变小鼠，未表现出像b - c a t e n i n 基因敲除小鼠一样严重的缺陷型【7 2 , 7 3 】。此外，w n t 3 a 缺失或t c f l 和l e f l 表达均缺失的融合突变小鼠所表现出的早期发育缺陷【7 4 1 ，在p y 9 0 2 缺 失的小鼠中也未观察到。众所周知，肠干细胞形成和毛囊发育这两个过程都需要活跃的 w n t 信号盼7 刀，但这两者都几乎不受p y 9 0 2 缺失的影响【7 0 1 。显而易见，哺乳类p y g o 基因对 w n t 信号通路参与的发育途径并不是必需的。 但是，p y 9 0 2 基因敲除的胚胎引起的肺形态发生缺吲7 们，让人们想起d k k l ( w n t 抑制 物) 的诱导表达对发育的小鼠肺上皮细胞的影响【7 8 1 。以前的研究表明，肺形态发生需要 b c a t e n i n l 7 9 】，提示在这个过程中p y 9 0 2 的功能缺失与经典w n t 信号的削弱是一致的。在 l e f l 缺失或d k k l 过表达的小鼠中乳腺发育受到削弱【8 0 】，而p y 9 0 2 缺失小鼠表现出乳腺形 态发生的缺陷【8 。在发育的肺和乳腺中，w n t 信号削弱能通过b a t - g a l 表达的降低明显地 识别出来，后者是经典w n t 信号在体内的报告基因1 7 0 引1 。在发育的。肾脏中p y 9 0 2 对经典w n t h u 舌 信号同样起重要作用，p y 9 0 2 吖一胚胎中输尿管芽形态发生缺陷，伴随w n t 报告基因表达的 缺失【6 9 ，8 1 1 。尽管普通发育过程的若干步骤都需要w n t 信号，但各个步骤对p y g o 酐j 需求却 大相径庭。在小鼠与果蝇中存在的明显差异，也许正契合了哺乳动物体内复杂的基因调 控。 哺乳类p y g o 基因也具有w n t t 乍依赖性的功能。p y 9 0 2 敲除会削弱p a x 6 基因( 为晶状体 发育所需) 的表达，从而影响晶状体的形成【6 引。p y 9 0 2 作用位点雨 w n t 报告基因表达位点 在空间上的分离，以及p y 9 0 2 和b c a t e n i n 突变体之间晶状体表型的差异，使人们得出 这样的结论，耳p p y 9 0 2 介导的晶状体发育调控并不依赖于p y g o 在w n t b - c a t e n i n 信号途 径中的作用。而之前的研究曾把w n t t 依赖性功能归于w n t 信号的核心效应物： b c a t e n in 和t c f l e f | 8 2 8 4 1 。 1 p y g o 与肿瘤 绝大多数的结肠癌都有a p c 或b - c a t e n i n 突变，导致w n t 信号的异常高活性。p y g o 基因在含有a p c 突变的结肠癌细胞中的下调，会降 氐w n t 报告基因的表达【6 0 1 ，暗示内源性 p y g o 蛋白在这些癌细胞中调节信号输出。w n t 信号的失调也与乳腺癌有关。人p y 9 0 2 的表 达在某些乳腺癌细胞系和肿瘤中上调，而且p y 9 0 2 水平的降低会削弱乳腺癌细胞生长、 导致c y c l i n d l ( w n t 靶基因之一) 表达量下斛8 5 】。超过5 0 的乳腺癌表现出染色体l q 2 1 ，- - q 2 2 区域的扩增【8 6 1 ，而p y 9 0 2 基因就定位在这个区域。上皮性卵巢癌有w n t 激活和失活两 种亚型，而在这两种亚型口h p y 9 0 2 均过表达f 8 7 】。p y 9 0 2 下调无论在w n t 激活还是失活的肿 瘤细胞系中均会阻抑细胞生长。 p y g o 作为转录激活协同因子 p y g o 含有两个结构域，分别是位于n 一端的n h d 结构域和位于c 一端的p h d 锌指结构域。 研究指出，p y g o 通过p h d 结构域经f h l g s b c l 9 与9 一c a t e n i n 结合，促进w n t 靶基因的转录 激活。 21 n h d 结构域 图卜3p y g o 蛋白的结构域 f i g u r e1 3d o m a i n so fp y g o 、 ir )r r d 口 含有完整n i i i 似f i d 区域功能陛缺大的d p y g o 突变果蝇，并没有和d p y g o 敲除的突变蚪 样严重f f j 表皮表则”8 8 o 缺乏h i d 的d p y g o 区域与盐肚火活的d t c ：( 小含 a r m 口一c a t c h i n 结合域) d 绁成的融合蚩白，其广泛表达自e 够部分托枚d p y g o 或a r m 完受果蝇的肯状缺辑型。将仅编码x p y g on 1 1 d 的n r n a 注射到爪蟾删冶，可使之具有和 注射过缸肚激活的w n tr m 的胚胎榭似的w nl 活陆。然而并1 l - f ) i 柏w n t 靶牲川都能被n t l d 模块的过表达激活，暗示x h d 也许存红肿动子特并陛的作用模式， 多个实验i i f 叫，p y g on h d 且角转录馓活活性。d p y g o 、一端结构域( 含n h d ) 舟与g a l 4 f d m 结合域或品眺失活的d t c f 柱i 连时，能够( 12 9 3 t 卸1 胞巾馓涌报告堆冈的转录i ”i ，晴 ；j 2 ”i n h d 直接与d n a 结活陀相联时，可以引发转录活性。z ：聚部2 细胞巾，当n i d 与d m 接棚莲时，会n 内溉忖 r n 、i , g s 或d p y g o 水1 r 无法榆驯刮的 况。卜，激沂撤卉基因的 转采1 6 ”。全长p y g o 蛋白存内源d i y g o 缺失的转丛凶细胞克隆中能够触；d w g 靶蛙闽 s e n s e lo s s 的表选，、| | i j 保： 氨基酸序列中的个点突变( f 9 9 ) 川会帜消列这个弘凶的 澈沂，呵足此同时，它肘【g s 的纠胞核定位并未产生屁酱彬l l 目畔，项研究显小，报 告笨因活性及果蝇生存能力的拯擞部商艘依赖n h d 结构城内的卟搛、) 的、p f 瓠牡陵模 块9 “。与z 相矛盾的是n p l l 模块编码序列错义；= 三娈构建体的过表达f j 够 司；救表皮形成 m 缺陷州。i | j ! 可能n gr ，叫i d 的n p 残基_ _ l 刘柴此而非伞剖p y e ( 计_ | 戈过雕，址作川，这或l 7 i ： 源于小刚的发育逃传背景，也n 丁能是i l i 于人i 高水t 过丧选所被。近数谢够示，n 槊蚍唾液臁r f ，甚争柏w “，寸缺失的隋况f ，n i f l i t ! i 为r _ ) y g n lj “i ( 1 ， f 作j 所需，并h 这种棚作f h 依杜 n i i ? 模块”。i ，这个发现提r 利_ 徙，bj 圳c n in 】 _ 依赖睦的 y g o i c l l 复合体也许在w g 信r 4 火活的情况f 雎有调拧苹小启动j 7 活挑的能力，n h d j 刈 舟n 七一t e 1 1 t 攸赖肢代秘睛批f 激衍转，业的乍化o l h ，仍篇让进步的俐f ij 。 2 2p h d 结构域 d p y g op h d 锌指的一个点突变，会产生同基本w g 信号组分缺失所引起的表型相似的 齿状表型【5 8 l 。p h d 锌指的广泛表达可在d p y g o 突变胚胎中恢复分节的表皮模式【8 8 】。w g 靶基 因活性实验显示，p h d 参与a r m 介导的转录激活。w g 靶基因( 包括e n 、w g 、d 1 1 ，以及u b x b 基因上w g 反应元件的增强子活性) 的表达在缺乏p h d 的d p y g o 突变胚胎中显著下降【6 0 , 6 1 】。 p h d 锌指是与l g s b c l 9 相互作用的充要条件1 6 i 】，锌指中介导p y g o 与l g s b c l 9 结合的 残基对拯救d p y g o 突变胚胎的齿状缺陷很重要【站1 。这些残基对于d n a 绑定的p y g o 在瞬时转 染实验中激活报告基因表达的能力也甚为重要【8 舯。在全长蛋白的背景下，p y g op h d 经由 l g s b c l 9 结合并可能通过以下几种途径来增强靶基因转录：1 ) 使n h d 接近 1 3 一c a t e n i n l e f 转录激活复合体，也可能是靶d n a ，从而为转录激活提供便利；2 ) 把 1 3 一c a t e n i n 锚定在核内从而提高核内b c a t e n i n l e f 复合体的水平。含有p h d 但不含 n h d 、接近于全长的p y g o 蛋白绑定在d n a 上能刺激报告基因活性【5 8 】，暗示某些条件下p h d 可独立于n h d 增强转录活性。 那么，p y g o 蛋白的p h d 锌指除了结合l g s b c l 9 夕b ，是否还具有其他功能呢? 研究显 示，当p y g on h d 经由其他方式接近b c a t e n i n 时【6 1 ，6 7 ，8 9 1 ，p h d 和l g s 便可有可无了，似乎 p h d 只有结合l g s b c l 9 和b c a t e n i n 的作用。但是，缺陷蛋白高水平的过表达，可能会 产生和生理水平的野生型蛋白程度相似的功效，所以在分析错误表达或过表达数据时要 采取审慎的态度。有几个为报告基因活性所必需的氨基酸，很明显并不参与p y g o l g s 相互作用【8 8 1 ，暗示p y g o 蛋白涉及l g s b c a t e n i n q 依赖性的相互作用。 总之，功能性研究的数据说明，p y g o 蛋白的p h d 和n h d 模块对于在生理条件下最大限 度的激活w g w n t 靶基因起着重要和不可或缺的作用，但在过表达时，它们各自都能在某 种程度上补偿对方的缺失。p y g o 或许既可以通过w g w n t 应答性转录经由p h d 结合 b c l 9 1 3 - c a t e n i n l e f ，又可以通过w g w n t q e 依赖性转录经由n h d 与l e f t c f 结合，来参 与l e f t c f 介导的激活。有研究者提出，在w g w n t 信号中，p y g o 可能交换或固定与 b - c a t e n inc 一端结合的共激活因子。 当前研究显示出w g w n t 信号通路对p y g o 基因需求的进化分歧。哺乳类p y 9 0 2 只在某 些需要w n t 的发育过程占据重要地位，而果蝇p y g o 则几乎为所有w g w n t 介导的进程所需， 意味着p y g o 在哺乳动物中的功能还有待发掘。 阿i j 舌 三、串联亲和纯化 随着基因组研究获得了突破性的巨大进展，人们开始把注意力转向后续蛋白质组的 研究，以求更进一步诠释生命现象。蛋白质组的研究包括细胞内全蛋白的表达谱、翻译 后修饰、细胞定位及蛋白质相互作用网络等多个方面，是一项非常复杂的工程。近年来 生物质谱( m a s ss p e c t r o m e t r y ) 技术的快速发展，尤其是电喷雾质谱( e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ，e s i m s ) 和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 ( m a t r i x - a s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o ni o n i z a t i o nt i m eo ff l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y ， m a l d i - t o f - m s ) 技术的日益成熟，为蛋白质组学提供了高效、准确、大规模的研究平台。 研究人员借助经典的生化纯化方法，联合生物质谱技术来鉴定蛋白质复合体的各个组 分，从而深入了解蛋白质的功能机制。 传统的生物化学纯化方法要根据不同蛋白质的生化特性来选择适宜的纯化方式，而 蛋白质组学需要大规模的分析蛋白质复合体，所以需要一种能够通用的纯化方式，并且 这种纯化方式得到的蛋白量要足够用于质谱分析。另外，由于细胞内存在一些低丰度蛋 白质，它们构成的复合体容易被细胞内高丰度的结构蛋白或管家蛋白所掩盖，使用传统 的生化方法很难纯化到这类低丰度蛋白质复合体。传统的亲和层析方法，是利用蛋白质 复合体中的一种蛋白质作为诱饵，固定在基质上，使含有相互作用蛋白质的细胞或组织 裂解液通过层析柱，从而纯化出与诱饵相互作用的蛋白质。但前提是必须获得足够多的 有活性的重组蛋白，而且这种方法