（细胞生物学专业论文）叶绿体基因转移以及转运肽编码序列产生机制的初步研究.pdf

首都师范大学硕士论文 摘要 叶绿体是植物吸收、转换光能的重要细胞器，起源于早期具有光合能力的原 核生物与原始真核生物的内共生事件。基因从叶绿体到细胞核的水平转移伴随其 整个进化过程。高等植物叶绿体仅含约1 3 0 个基因，而其祖先光合细菌含3 0 0 0 多个基因：基因组比较发现拟南芥4 5 0 0 个核基因为光合细菌起源。甚至目前叶 绿体基因依然以很高的频率向核基因组转移。对该过程目前的认识是：叶绿体基 因某一拷贝先插入核基因组，之后通过重组交换等方式转移到合适的启动子后获 得表达，同时通过染色体重排、基因重组、碱基突变等方式进化出转运肽编码序 列，从而保证该蛋白能够在转运肽牵引下回到叶绿体。然而该解释无法说明短时 间内叶绿体同一基因在不同植物中独立平行地向细胞核的多次转移。我们认为叶 绿体基因水平转移的过程可能存在另外一种方式：首先基因在叶绿体内通过中性 突变或者其它方式进化出转运肽编码序列，再插入核基因组中一合适启动子之后 获得表达，之后蛋白在转运肽的导引下回到叶绿体行使其功能。 我们运用生物信息学手段，综合分析、预测筛选叶绿体基因组中编码蛋白的 基因，以预测的可能具有转运肽编码序列的叶绿体基因和肘b l d 基因为研究对象。 运用g f p 融合蛋白荧光定位等方法。脚铊的叶绿体定位证明寻找到了在叶绿体 中进化产生编码转运肽的d n a 序列的证据；该假设的成立为转运肽编码序列产 生机制提供了一个有益的补充，同时丰富了叶绿体在内共生过程中基因从叶绿体 到细胞核的水平转移的研究，具有重要的创新意义。 关键词：叶绿体进化；基因水平转移；转运肽编码序列；转运肽；瞬时表达； g f p ( 绿色荧光蛋白) 首都师范大学硕士论文 a b s t i a c t t h e 剐1 c b s t o 璐o fp l 勰t i d sd 既i 、他丘0 ma l d o s y m b i o s i s i ) l l r i n gt h ec o u r s eo f c v o l u t i ，g c n 髂h a v eb 湖呦s f c f r c d 胁也e 彻c c s 乜_ a lc h l 唧l 硒tt 0 也e 如d e u s t h i s 讲o o 髓洛w 蹈c a n e dal a t e r a l 里r e l l e 衄a n s f c r h i g h e rp l a n tc h l o 加l p l a 吼0 0 n t a i 璐 a b ( m t1 3 0g c n 鹤，w h i l ei 协孤l c 骼t o r q ，a n o b a c t e r i ah 勰m o t h a n3 ，0 0 0 球m 瞄t h c c c 髓p a r i s 0 咀b e t w e c ng 蛐锄龉s h o w c dt h a tn 髓d y4 ，5 0 0 加d e 缸g e n 嚣i n 彳加龇如阳括 s 黜t o 锄e 丘d m 研龃o b a c t c r i a u n t i l l n o w ，t h eg e n e 协m s f 醯s t m k 唧p 咄i n ah i 曲 f r e q u e n c y t h eb r o a d l y 钺：c i 印t c dm o d e l0 fl g ts t a t e dt h a ta p y0 ft h ec h i o r o p l 勰t 趾dm i 岫0 n d 血留e n ei m e g r a t e di n t ot h en u d e u s 星弦n o m e t h 髓l h e 肌d e 盯p y 伊a d u a l l ym u t a t e do rr e c o m b i n c dt oa c q 嘶t h c 脚盱e x p 麟晦妯缸dt a r g e t i n g s i 印a l st oa l l o wt h e 即c o d c dp r o t e i n st 0b es y n t b 船i z c d 彻c y t 0 u cr ! i b ) s 鲫e sa n d m i m p d n c d 细i t 0t h e 优鹭a n e l l cl e db yt h e 胁s i tp e p t i d e w h e a st h i sh w t h e s i sf a _ i l e d t o 既p l a i nw b y n a i ng 蛐ei n d e p d e n u y 仃a 璐f e r r e dt om a n yd i 益e r e n tp l 趾t s n u d e 惦i nas h o ni n t c r v a l 研t hah i g h 丘e q u e n c y w et h o u g h tt h a tt h e 坞m a n yb e 锄t h c rp o 鼯i b i l i 哆0 盯h y p 口t h e s i si st h a tt h eo r g 纽e n eg e n e so b t a i nt h ep - t a r g c 血g q u 如b y 瑚血d o mn e u 叫m u t a t i o n0 fo t h e fm e t h d d s 丘璐t l y t h 明t h e 琳m e c o n t a i n i gt h et a r g e t i n g 鞭目u e n c ec o n t i 】n 珊i l l y 仃a n s f b 塔丘0 m0 r g a n e u et 0m l d e u sa n d e x p r e 辐e si n 如c l e 璐，t h ep f o d u c t 啪鹤b a c kt ot h co r g a m u e9 1 1 i d i n gb yt h ct r a n s i t p e p t i d e a tl a s t w bm a d eu s e0 fb i o i n 如匝m a t i c sm e t h o d s ，粕a l y z e da n d 跚托e 蛐e dp l 豳t i dc o d i n z p r o t e i n 曲a b a 伪t a b l i s h e db y 壕m a d e f t f o rp o t c n 廿a lt a r 蓼缸gp r c - s c q u 蛐c e w bt 0 i ) k 肘玩d 锄do t h e r m p r e d i c c e dc h l o m p l 弱t 鸯胁髂鹪o b j e c t st 0o b s e r y et h c 1 0 忸t i o no fg f pf i l s i o np r o t e i na n da c t u a l l yf o l d 衄e 鼬咀e 哦4 2i nc u o 】c ；0 p i a s t 毋江姗e l d i n gf o r 仃a 璐i tp e p t i d e t h i sw 翻kw 鹤c 0 哪m i 砌i nac r e a t i v ew a y 锄d c 0 咖曲u t 伪星弦a tt ou n c o v c rt h em e c h a n i s mo f 呦s i tp c p t i d eo r i g i n a t i o n 趾dt h e 口r i ) c e s so fg e n e 仃越s f b fh 姗c h k ) r o p l a s t st on u c l e u s k e yw o r d s ：p i 酗h d 盯o i u 恤峨i a t e m i 辞眦t 瑚s f e r 皿g - i ) ，t m 璐i t 辨p 廿d e ， p m - 协曜e t i i 唱s e q u 蚰，t r a n s i e n t 唧r 瞄s i o n ，g f p 首都师范大学硕士论文 缩略词一览表 b s ab o v i s 咖a l b 呲l i n牛血清白蛋白 c ：it r i c m o r 锄e 也柚c ：i s m y la l h o l氯仿：异戊醇 d ，r r 1 ，4 d i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 e b e l h i d i u mb 砌血i d c溴化乙锭 e d i ae 也v l e d i a m i n c t e 的u c c t i ca d d乙二胺四乙酸 k 蛆啪v d n卡那霉素 砸s m e t h v le s t e rs u 怕m t e脂肪酸甲酯磺酸钠 0 r fo p r d i l l g 劬m e s开放读码框 p a g e p o l y a 叫a m i d cg c le l e c 的p h 0 i s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p c rp 0 l v m e e 鹤ec h a i n 崩i c t i 聚合酶链式反应 p m s f p h y l m e t h y l l f o n y ln u o i i d c 苯甲基磺酰醇 r i fr 妇v c i n利福霉素 s d ss o d i 啪d o d e c y lb e 北如es u 蜘n a c c十二烷基黄酸钠 s p ps 仃伽1 a lp r o s s i n gp 印t i d _ a s e转运肽基质加工酶 s 虹s 吮p t o m y d n硫酸链霉素 j i 地1 恤a c c 如a c i dg l a d a l e d l a t 凼乙酸e d l - a 缓冲液 t et h s e i y i a1 拖e d l a 缓冲液 t e 淝d n ，n ，n ，n - t c t r a m e l h y le t h l e n e d i 眦i n e四甲基乙二胺 t r i s t r 曲y d r o x y m e t h 灿m i n 啪e t h 粕e三羟甲基氨基甲烷 x - g a l5 - b 咖佴c m o r o 3 血曲l y l - b - d - g a l a c t o p y m n o s i d c 5 - 溴4 氯- 3 蚓哚- b - d 硫代半乳糖 首都师范大学硕士论文 第一章引言 1 1 叶绿体的内共生起源 内共生起源学说认为线粒体和叶绿体分别起源于原始真核细胞内共生的细 菌和蓝藻。该学说认为真核细胞的直接祖先是一种巨大的、不需氧的、具有吞噬 能力的古核生物，它们靠吞噬糖类并将其分解来获得其生命活动所需的能量。在 生命演化过程中，这种古核生物将一种需氧的并含有进行三羧酸循环所需的酶系 的真细菌( n - p r o t c o b a c c e r i a 细菌) 和可以进行光合作用的蓝细菌吞噬进体内后，没 有消化掉他们，反而形成一种互惠的共生关系，经过常年的异化与同化作用的协 同进化过程，这种共生在细胞内的细菌与蓝藻就渐渐演变成了今天的线粒体和叶 绿体。 到目前为止，有很多研究证据支持线粒体和叶绿体是内共生起源的。比如它 们都是能自身复制的半自主结构，都含有自己的d n a 和独立的蛋白质合成装置， 包括结构上与真核细胞的细胞质核糖核蛋白体不同而与真细菌类相似的核糖核 蛋白体。与原核生物相似，叶绿体的d n a 以及动物细胞线粒体的d n a 均呈闭环 形等等。此外，线粒体、叶绿体的蛋白质合成装置在功能上还存在与真细菌相类 似的特点。 在漫长的进化过程中，叶绿体、线粒体逐渐丧失自主性而进化成为半自主性 的细胞器，在此基础之上的对质体基因的起源和进化研究是目前的一个热门研究 领域。叶绿体是真核细胞的细胞器，而它的d n a 及其基因表达系统都表现了典型 的原核性状，是研究真核基因和原核基因关系的好材料，并有助于探索生物的演 化规律。 1 2 叶绿体及其基因组的特点 在植物细胞内部存在着许多类型的质体，按所含色素可分为绿色的叶绿体 ( c h l o m p l 龉协) ，红色、橙色和黄色的有色体( c l 咖0 p l 嬲t s ) ，无色的白色体 0 e u o 叩l a s t s ) 以及黄化幼苗中的黄化质体( c t i o p l 弱t s ) 等。白色体不含任何色素，通 首都师范大学硕士论文 常作为同化产物的存储器，如储存淀粉的淀粉体( 蛐y l 叩l 船t s ) 、储存蛋白的蛋白 体0 m t e i n o p l a s t s ) 以及储存脂肪的脂肪体( e l a i o p l 弱协) 等，为了适应不同的环境，它 们分别在特定的细胞类型中完成特殊的功能( w h t e 塔姐dp y k e ，2 0 0 4 ) 。 叶绿体作为半自主性细胞器，到目前为止，已经完成多种陆生植物和藻类的 叶绿体全基因组的测序工作。现在已经知道，叶绿体d n a ( c t d n a ) 多以双链环状 分子形式存在，一般周长约4 0 q 5 u m ，分子量约9 0 m d a 已测序完成的陆生植物的 叶绿体基因组大小较一致，高等植物细胞每个叶绿体d m 含量约为 o 8 l o 。娟9 1 0 的范围，不同物种的叶绿体d n a 含量有几倍之差，但多数 植物叶绿体d n a ( 叫) n a ) 大小在1 2 睢1 6 0 k b 范围之间浮动，并且在基因含量结 构上也极其保守。 除个别植物外，大多数植物的c c 】d n a 分子中有两段反向重复的核苷酸序列， 这是大多数植物c u ) n a 所共有的特征，不同植物c c 功蛆大小的差异主要是由于 反向重复序列( i n v e n e dr c p c a t ，q 大小的不同而引起的。在两个反向重复序列之 间有一个大单拷贝区( 1 a r 伊咖西ec o p yr c g i ，l s c ) 和一个小单拷贝区( 啦a l l s i n 出ec o p yr c 西o n ，s s q ，前者一般长约8 0 k b ，后者长约2 0 k b 。不同植物的叶 绿体基因组大小不同，这些不同首先表现在两个m 区上，其次是s s c 上。因此， s u 酊u r a 将叶绿体基因组分成3 类：第一类缺乏瓜( g r o u pi ) ，第二类含有 瓜( g r o u p i i ) ，第三类含有串联重复的瓜( g r o u p ) 。同时叶绿体d n a 还有一个特 点，就是它的d n a 分子还与包被的内膜相连，这一特点与原核细胞d n a 相似。 叶绿体基因组中的基因在漫长的进化历程中，有许多转移到了核中，遗留在 叶绿体中的基因是功能必需的一些基因，有巨大的拷贝数( 一个叶绿体中，基因 拷贝数可达上百个；一个细胞中，基因的拷贝数可达上万个) ，而且它们都来源 于原核生物，具有原核生物基因的特点。叶绿体基因多为多顺反子转录单位，这 些转录单位中基因的排列顺序高度保守。 叶绿体平均编码约1 0 0 个蛋白，编码蛋白的基因可分为三大类：与叶绿体 光合作用有关基因；如：合成光反应中心亚单位的粥m z 等；与叶绿体基 因表达有关的基因；合成核糖体蛋白的，p f 2 ，芦j j ，翻译起始因子加阴等；其 它生物合成及相关基因；合成分裂相关蛋白的 f 跏d m 舾等。 2 首都师范大学硕士论文 1 3 细胞器基因组缩减和基因到核的转移f m 吣f c r ) 1 3 1 基因到核的转移 i 证据： 将拟南芥基因组与蓝细菌基因组进行比对分析，发现有大约4 5 0 0 个基因与蓝 细菌基因有相近的同源性，推测蓝细菌基因随着进化已经大部分整合到植物真核 细胞的细胞核中，一小部分基因保留在叶绿体中，还有一部分基因是编码叶绿体 膜蛋白并作用在分泌途径上的( m a n i n ，c ta 1 2 0 0 2 ；k i s t 2 0 0 3 ；砸衄血s ，e ta 1 2 0 0 4 ) 。由此，d y a l l 等人( 2 0 0 4 ) 认为，在1 0 0 亿年前某个时候，一个含线粒体的真 核细胞通过吞噬蓝细菌与其建立了内共生关系。经过不断的进化，那些真核细胞 的后代中出现了绿色植物，那个被吞噬的蓝细菌就进化成了植物中的叶绿体。 内共生体的基因组缩减是其转化为细胞器过程中关键一步。和蓝细菌编码约 3 0 0 0 种蛋白相比，线粒体基因组简化为编码3 6 7 个蛋白( g m y e ta 1 ，1 9 9 9 ) ，叶绿 体编码5 0 2 0 0 个蛋白( g l o c k n e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。我们目前可见的缩减了的、由常见 基因组成的线粒体和质体基因组揭示了远古发生了快速的基因转移和丢失( g m y e ta 1 ，1 9 9 9 ) ，许多内共生体的基因丢失，大部分保留下来的则转移入细胞核。 在进化过程中，基因从原始祖先的叶绿体基因组转移到细胞核，在那里获得 有效表达，之后在细胞质核糖体中合成的蛋白在转运肽引导重新回到细胞器。这 个特异的基因平行转移叫做内共生基因转移( b 舢，2 0 0 3 ) 。该过程在自然界中似 乎很普遍，如前所述，拟南芥中约1 8 的核基因似乎来源于光合细菌，在其他高 等植物的染色体上也发现叶绿体d n a 的存在( a y l i 晚姐d 凰咖1 i s ，1 9 9 2 ) 。 3 首都师范大学硕士论文 然而，基因从内共生体到细胞核的转移 不仅仅是个远古事件，在种子植物的线粒体 和叶绿体中都发现了近期的、高频率的、有 功能的基因转移( m i l l 锄c ta 1 ，2 0 0 1 ；a d a m s 粕dp a l m e r ，2 0 0 3 ) 。虽然基因转移大量发生 在真核的类群里，有报道显示在酵母中一个 选择标记的基因发生了高频率的由线粒体 到细胞核的转移f 1 1 1 c 幡n e s s 锄df 0 x ，1 9 9 0 ；) 。 同样，植物中也观察到叶绿体基因以相当高 频率的转移到细胞核。两个小组同时在实验 室中观察到这种现象但u 她ge ta 1 ，2 0 0 3 ； s t e g c m a 姐e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。h u 粕g 小组发现， 仅一代，烟草1 6 ，0 0 0 粒花粉细胞中就发生 一起叶绿体基因转入细胞核的事件； 图1 1 质体基因组的基因转移和基因组缩减 s t e j ；e m 锄小组也得到相似的结论，在 5 ，o o o ，0 0 0 个烟草叶片细胞中就有一个细胞发生了叶绿体基因转入细胞核的事 件。他们的实验以及最近其他发现不仅为我们研究基因从细胞器到细胞核的动态 转移揭开了新的篇章，而且具有更深远的进化意义。 在s t e g e m 锄的试验中，标记基因中的内含子在转移之后并未消失，因此排 除了认为叶绿体基因以c d 口a 为中间形式转移的可能。在一些核中发现了线粒 体和叶绿体的祖先基因组中的大片段基因，证明d n a 有可能全体转移( m a r t i 2 0 0 3 ) 。另一方面，核基因组中存在源于编辑过的线粒体的转录本的基因，揭示 了在线粒体到核的基因转移中砌叮a 、d n a 都有可能作为中间形式删u g e n ta n d p a l m e r ，1 9 9 1 ) 。 为什么细胞器中还保留了一些基因? 是为了保留基因组复制和r n a 表达及翻译 的完整机制吗? 酵母线粒体蛋白的分析表明，约2 5 参与到保留一个仅包含编码 8 个高疏水性的膜蛋白( 以避免错误定位) 的基因组( s i c k m 锄e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。其中之 一的细胞色素c 氧化酶2 亚基( c 0 x 2 ) 在大部分真核生物中是线粒体编码的，但在 某些豆科植物的线粒体和细胞核中发现都有拷贝，表明这个基因是一个近期的转 4 首都师范大学硕士论文 移。细胞核编码的c ( x 2 比线粒体编码的具有更低疏水性，这是它的基因产物输 入线粒体所必需的。 意义： 基因不断地从细胞器到核的流动可以更好地引起新的生物发生，而这一积极 意义似乎并未得到充分的认识。如何证明呢? 让我们把时钟调回到大约1 5 亿年以 前，想象第一个获得了光合细菌作为内共生体的植物细胞，并认为该光合细菌正 是叶绿体的最早祖先。相比较于现代的叶绿体，第一个内共生体的内外膜上不可 能含有可以识别及剪切转运肽的蛋白输入装置，但它一定有能力给宿主供应一部 分光合细菌基因组的基因，当一个内共生体偶然溶解的时候，这种情况就很可能 发生( b o l t e re ta 1 ，1 9 9 8 ) 。当内共生体没有能力输入转移基因的蛋白产物时，最初 的阶段会是一个基因从内共生体向宿主的单项向流动阶段，其结果是会造成输入 基因与宿主本身已经存在的基因之间对编码细胞质蛋白的竞争a b 0 9 0 m d ，1 9 7 5 ) 。 只要输入基因的蛋白产物的功能不差于已经存在的基因，输入基因就会倾向于替 代其同源的已存在基因，因为如果第一个转移没有成功，第二个第三个就会继续， 也许第2 5 0 0 0 个就会成功，或者一直继续。只要有大量的内共生体在细胞里，他 们的d n a 就会作为一个取之不尽的资源向宿主供应。只有当一个蛋白输入装置 产生，内共生体才能不仅是供应而是真正向其宿主输出基因( 从而使细胞器基因 组缩减) 。 m 基因功能转移的条件： 有效的基因转移需要基因插入到活性启动子附近或者重新获得宿主基因使 用的启动子。因此，只有当系统进化出一个可以让基因编码的产物回到原初细胞 器q m o r g 龃e n c ) 行使功能的输入机制之后，转移的基因才能由双拷贝( 原初细胞 器及核) 变为单拷贝( 核) 的形式存在。 因此基因的功能转移需要满足两个需要；一是核中要存在质体基因的拷贝序 列( 0 0 p y i n 曲，第二点是核中表达的转移基因产物回到质体中相应的位置 5 首都师范大学硕士论文 ( a d d r c s s i n g ) 。另外，质体中的基因拷贝最终将被清除，因为观察到的是大部分质 体基因只在核中存在一个拷贝。 故功能置换的关键步骤可以概括为：复制一个拷贝，转移入核基因组，插入 合适的启动子之后，表达出蛋白在转运肽牵引下回细胞器行使功能，位于细胞器 基因组中的拷贝因突变而丢失( 即核基因把质体基因置换) 。也有另一种观点认 为，一旦一个质体编码基因的一个拷贝转移到核基因组，如果质体中的拷贝因为 突变而失活，那么核基因中的拷贝就被固定( 丘x a t i o n ) 下来。而叶绿体、线粒体基 因组相比核基因组明显高的突变率无疑会强化这种固定作用( 突变高还是低? ) 。 因此，突变需要在核基因把质体基因置换之前发生。 1 3 2 编码蛋白如何回到原初细胞器行使功能 1 3 2 1 转运肽的特点 叶绿体中的蛋白质大部分来自于细胞质。这些由细胞质的蛋白质合成体系所 产生的蛋白质前体，在共n 端都有一段名为转运肽的氨基酸序列，其作用是负 责将该蛋白质运入叶绿体。迄今已研究过的核编码的叶绿体蛋白质的m 鼢魄都 有一个5 的帽子( i n 7 寸的p o l y a 序列) 。首先被发现的是r 曲i s 小亚基前体的转 运肽，以后又发现多种。同一种蛋白质的转运肽在不同植物中不同，而且无明显 的保守性，转运肽由几十个氨基酸残基组成，它相转运肽链进入叶绿体被膜的内 膜时需要j 皿。转运过程大概分两步，第一步是被转运的多肽与叶绿体表面的受 体结合，第二步是前体穿过两层被膜，然后在基质中由一种蛋白酶进行加工，除 去转运肽。 一旦蛋白跨越了双层膜，基质中的肽酶就会将转运肽切除，使成熟蛋白在基 质中折叠或是继续它在叶绿体中的转运。有一些要被运输到类囊体膜或类囊体腔 的蛋白，需要有一个二等分的转运肽，一个用于跨叶绿体膜的转运，一个用于跨 类囊体膜的转运。 核编码的叶绿体蛋白由细胞质进入叶绿体后，可能到达6 种不同的区域，即 3 种膜( 内、外被膜和类囊体膜) 和3 种亲水区域( 基质、类囊体腔和被膜的内、外 6 首都师范大学硕士论文 膜之间) 。这些蛋白质必须在到位后才能被组装。例如，o e e ( 放氧蛋白) 的亚基 就要穿过3 种膜和2 个亲水区到达内囊体腔；集光色素蛋白要穿过两层被膜和基 质到达内囊体膜上；而r u b i s 小亚基则只要穿过两层被膜到达基质。这些被编 码的叶绿体蛋白到位的信号在转运肽上，转运肽中有引导蛋白质进入叶绿体的信 息和到达终点的信息。例如，用o e e l 的转运肽可把它运到叶绿体基质中。 把类囊体膜中的蛋白质整合到膜上的信号不在转运肽上。例如l h c ( 集光色 素蛋白1 的转运肽能将u i c 本体引导到叶绿体基质中但不能使之整合到膜上，用 重组系统进行的实验表明，如欲将u i c 本体整合到膜上则重组系统中除应有类 囊体膜外，还应有a 皿和叶绿体基质中的一种可溶蛋白因子。h 孤d 等把l h c 本体的转运肽拼接到r l l b i s c 0 小亚基上，即可使它在体外进入分离的叶绿体中 如果把r u b i s c 0 小亚基的转运肽拼接到u i c 本体上，它也能进入叶绿体，并在 被加工后整合到类囊膜上而且与叶绿素组装成u i c 所以u i c 的转运肽与 r u b i s 小亚基的转运肽功能相同，都是把被转运的肽导入叶绿体基质中，那些 将被整合到类囊体膜中的蛋白质则需经过加工后才能被整合。 到目前为止，研究得最多的转运肽是r u b i s c 0 小亚基的，已有来自不同种植 物的和来自同一种但位于不同基因族中的r u b i s 小亚基的近5 0 种转运肽的氨 基酸序列被测定，还有2 0 多种其他蛋白质的转运肽被测序，这些序列很少相似， 其原因可能是叶绿体表面有许多种转运肽的受体，也可能转运肽的特性不决定于 其一级结构，而是它们共同的二级结构对于行使功能是重要的。已知0 e e l 的转 运肽共有8 5 个氨基酸残基，其n - 端的5 8 个残基与c 端的2 7 个残基功能不同， 前者负责穿过被膜，后者负责穿过类囊体膜。 更有趣的是转运肤不仅可将核编码的蛋白质运入叶绿体，而且可以被拼接到 外源蛋白质并将它们运入叶绿体。这些结果充分说明被携带的多肽的到位只与转 运肽有关，而与它本身的结构和性质无关。 因有些细胞器定位蛋白并不含有定位序列，故核编码蛋白可以依据是否含有 可剪切的转运肽而分为两部分。大多数情况下，核编码定位于叶绿体的质体蛋白 的n j 喘含有转运肽序列是其定位于叶绿体所必需的( k 笋妇蛐da j n e ，1 9 9 9 ； v 硎1 i m e c h t 姐ds o l l 2 0 0 0 ；b m c c ，2 0 0 1 ) ，虽然最近也发现了质体蛋白缺少转运肽 7 首都师范大学硕士论文 的情况 a t h i n 嬲a b 印a t h ie ta 1 ，1 9 9 4 ；m i r 嬲e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。相反，大部分定位在叶绿 体外膜的蛋白缺少可剪切的转运肽( l 胱c ta 1 ，2 0 0 1 ，2 0 0 4 ；t uc ta 1 ，2 0 0 4 ；h o 缸a 衄 缸dt h e 昌2 0 0 5 ) 。 虽然已经有许多关于转运肽的研究，但是其机制还不是很清楚。前转运肽的 长度、氨基酸组成和序列都不同，在不同高等植物中叶绿体蛋白的前转运肽各不 相同，其长度一般介于2 0 一1 0 0 个氨基酸残基之间，富含亲水的和疏水的结构 ( z b 趾gc ta 1 ，2 0 0 回。c t 甲在氨基酸顺序、长度、组成上有很大分化( v h c i j e t a 1 ，1 9 8 9 ；b m c e ，2 0 0 1 ；z h 卸g 硒dg l 猫e r ，2 0 0 回。但是两个特点还比较明显：c t p 倾 向于包含较多的羟基氨基酸残基，比如丝氨酸、苏氨酸、辅氨酸，而天冬氨酸、 谷氨酸的含量比较低( v h c i j n ee ta 1 ，1 9 8 9 ；z h 趾g 龃dg l 弱盯，2 0 0 2 ) 。c 1 1 p 的一个 最显著的特点是其通常比较长，认为c 皿包含许多复合的结构域，在蛋白质输入 叶绿体内外两层膜时行使不同的功能( v o nh c i j c ta 1 ，1 9 8 9 ；p n e ta 1 ，1 9 9 5 ； r e 璐i n kc ta 1 ，1 9 9 8 ，2 0 0 0 ) 。 线粒体和叶绿体的前导序列是低保守性的，而且没有特异的氨基酸r i m o n c ta 1 ，2 0 0 3 ) 。相反，氢化酶体的定位前导序列虽然短却有很高的初级结构的保守 性( d y a l l 锄dj o b n s o n ，2 0 0 0 ) 。在二级质体中，如印i c o p l a s t ，多了另外两层膜的结 构使它有两个前导序列包括编码进入分泌途径的信号肽及“传统的”、跨过 质体两层内膜的转运肽( a d 锄s 觚dp a i m e r ，2 0 0 3 ) 。 1 3 2 2 膜上蛋白转运装置 许多叶绿体中的蛋白是由核基因编码的，然后通过特定的转运机制，使叶 绿体相关蛋白跨过叶绿体的双层膜进入叶绿体中。s o u 等人( 2 0 0 2 ) 认为，在叶绿 体双层膜上存在一种由外膜易位子c ) 和内膜易位子c ) 组成的蛋白复合物 转运通道，一些蛋白就是通过这个通道被转运进入叶绿体中的。1 b c 由4 个亚单 位组成，t | c 由6 个亚单位组成，其中每一个亚单位都是由一个小的基因家族编 码的( j a d 蝎o n - c o n s t 蛆弛d 融鲫a 2 0 0 1 ) ，单个基因的缺失有时不会影响整个蛋 白转运机制的完成。有些伴侣蛋白会与面c 连接，帮助含有转运肽的蛋白通过转 运通道。 8 首都师范大学硕士论文 定位于基质中的叶绿体前体蛋白在基质中加工，加工开始于转运前体蛋白 的n 末端从1 k 复合物进入基质时。基质加工肽( s 廿o m a l 舯嬲豳g 脚t i d a 辩，s p p ) 与前转运肽有很强的亲和作用，其直接作用于前转运肽c 端的1 睢1 5 个氨基酸 序列，将前转运肽从前体蛋白上切断。切下来的前转运肽的降解也依赖于s p p 降 解。 一旦前体蛋白被s p p 加工后，前体蛋白需要被基质中的分子伴侣折叠成具 有功能的结构，成为成熟的蛋白。在基质中折叠转运多肽链的分子伴侣有： h s p 7 0 、c p n 6 0 和q m l 0 。分子伴侣结合于基质表面阻止前体蛋白聚集和起始折 叠。 定位于类囊体腔的腔蛋白经过基质后，要跨过类囊体的膜结构。蛋白从基质 转运进入类囊体目前认为有四条途径。这四条途径分为：依赖于信号识别颗粒 ( s r p ) 的途径、自发插入膜的途径、s 途径和t a t 途径。其中前两种途径是将蛋 白定位于类囊体膜上，蛋白属于膜蛋白；后两种途径是将蛋白定位于类囊体腔内， 蛋白属于腔蛋白。蛋白进入类囊体腔后，靶定信号肽s c c 和1 a t 在腔内被类囊体 加工酶1 1 p p ( 也y l a k o i d a lp r o c e 蟠i n gp e 鲥d a ) 切断。 1 3 3 转运肽编码序列的产生机制 1 3 3 1 分子进化的研究理论 6 0 年代早期“分子进化钟”的发现与6 0 年代末期“中性理论”的提出是本 世纪进化学的重大事件，是古老的进化学与新生的分子生物学两者“杂交”的产 物。 自从6 0 年代初发现分子进化钟一“分子进化速率在不同种系中恒定”以来， 人们又陆续发现蛋白质中氨基酸的置换是随机而非模式性的；d n a 在哺乳动物种 系的总变异速率远远高于形态上的变异速率并远远超出人们的预期的大于0 5 核苷酸基因组年；蛋白质电泳表明物种内存在大量的变异即广泛的种内多态 性，且这些多态性并无可见的表型效应，与环境条件亦无明显相关。以上这些都 是新达尔文主义与综合进化理论所难以解释的。 9 首都师范大学硕士论文 面对上述问题，日本群体遗传学家木村资生( m o t 0 0l 【j m 啪) 提出：( 1 ) 进化 过程中的核苷酸置换其绝大部分是中性或近似中性的突变随机固定的结果而不 是正向达尔文选择的结果：( 2 ) 许多蛋白质多态性必须在选择上为中性或近中 性，并在群体中由突变引入与随机灭绝间两者的平衡维持。 上述论著问世遭遇到经典进化学家的强烈批判。他们认为新的分子生物学数 据完全可以用新达尔文主义的原理来解释。直至现在，选择论者与中性论者的争 议仍在继续。这两大学派的本质区别可通过它们各自对突变基因如何在物种内置 换旧基因这一进化过程的不同解释来洞悉。 每一置换刚出现时在群体内均为稀有的突变等位基因，随后扩散至整个群体 并被固定，即频率达1 0 0 9 6 。选择论者认为：一个突变的等位基因在物种内扩散， 就必需具有某些选择上的优势，如在选择上为中性，就必需与一选择上具优势的 基因紧密连锁，通过“搭车”而达到较高频率。与此相反，中性论者认为：一些 突变在没有任何选择优势的情况下也能自身在群体中扩散。如果一突变体在选择 上等同于已存在的等位基因，其命运将取决于随机机会，其频率存在上下起伏， 因为在每代每一雌、雄个体所生的大量配子中只有很少数配子最终被“采用”以 形成合予以及相应的个体，并出现在下一代中。在这种随机漂变( 瑚d o md r i 中， 绝大部分突变等位基因随机丢失，但有一少部分在群体中被固定下来。如果中性 突变在分子水平上普遍存在，且随机漂变在很长时间( 如百万年) 一直延续，群体 的遗传组成将发生显著性改变。群体中出现的任何中性突变其最终固定的概率都 等于其原始频率，其固定的平均时间四倍于有效群体的大小( 它近似等于每一代 参与繁殖的个体数，通常远小于物种的个体总数) 。中性理论并非认为中性基因 无功能，而仅是认为不同的等位基因在促进个体的生存与生殖方面是有等同的效 果。此外，还需强调个体基因突变与群体基因置换的差别，因为只有后者才与分 子进化相关。 从中性学说的立场看，保守替换的性质，只需注意到两种氨基酸间的差异越 小，它们等于选择等价而不是突变有害的概率就越大，就很容易加以解释。因此， 选择上呈中性的替换在类似的氨基酸间则概率越高，而这类氨基酸的进化替换由 于随机遗传漂变则出现得更为频繁。 首都师范大学硕士论文 在阐明分子进化中突变型替换是否保守的同时，有越来越多的证据表明，功 能上较不重要的分子或某一分子较不重要的部分，其进化( 以突变型替换表示) 比那些较重要的要快些。中性论和选择论间的差别，在它们对快速进化的分子( 如 血纤蛋白肽) 或分子的某部分( 如胰岛素原的c 肽) 进行解释时，可以最清楚地看 出，按中性学说解释，它们在功能上不重要，因而大多数突变是中性的，突变通 过随机漂变而迅速积累。 综上，中性学说( 或者更确切地说是中性突变一随机漂变假说) 是分子生物学 与群体遗传学交融的产物。它不象传统的综合理论( 或新达尔文派的观点) ，它明 确主张：进化中大多数突变型的置换，不是由于达尔文选择，而是由选择上呈中 性或近中性的突变型的随机固定所致。它还断言，分子水平上大多数种内遗传多 态性，像以蛋白质多态性形式展现出来的那样，是选择上呈中性或近中性的，并 靠着突变输入和等位基因的随机清除或固定这两者之间的平衡而在物种中维持。 应该说，这一理论对于人们所认识的分子进化众多现象与规律的阐释比新达尔文 更为科学，且提出的多项预测被随后的实验研究所证实。与选择进化论者相比， 中性论者更多地注目于与功能无关的分子进化，不重视与功能相关的分子进化现 象与规律的探索和宏观进化。 1 3 3 2 转运肽编码序列( 前导序列，p 砷- s e q u 蚰嘲的产生 大多数细胞核编码的，在线粒体、氢化酶体、质体行使功能的前体蛋白，它 们的n 端前导序列与其准确定位输入的复杂步骤有很大的关系妯翘d j 0 b m o n ，2 0 0 0 ) 。因此，前导序列应与易位子( 咖s l o c o n ) 一同进化获得。 前导序列怎样附加到上百个基因之上呢? 在植物的线粒体和叶绿体中，一些前导序列被一些外显子分隔，表明外显子 漂移( 既s h u m i n g ) 和可变剪切q t c m a t i v es p l i d n g ) 可能是前导序列进化产生的 一种方式( m c f a d d 鸭1 9 9 9 ) 。另外，前导序列也可以通过启动子区域的复制和突 变获得。已观察到一些近期转移的线粒体基因清除之前转移的线粒体基因的前导 序列的现象( a d 锄s 锄dp a l m e r ，2 0 0 3 ) 。 1 l 首都师范大学硕士论文 另外有证据证明，线粒体的参与是原质体o m p l 嬲t i ( 1 ) 进化过程中的重要因 素。为了避免潜在的有害蛋白的错误定位或提升蛋白的双定位性( d u a lt a r g e t i n g 一 一既可在质体又可在线粒体中定位) 这两个明显矛盾的目的，线粒体和原质体两 个细胞器的蛋白输入机制显然需要协同进化。叶绿体和植物的线粒体的前导序列 有相似性，然而又有输入各自细胞器的特异蛋白0 讧c f a d d 1 9 9 9 ) 。有趣的是， 叶绿体转运肽可以定位蛋白到非植物的线粒体，表明了质体的转运肽序列可能进 化产生于线粒体的前导序列( p c e t e 璐觚ds m a u ，2 0 0 1 ) 。另外，植物线粒体的t o m ( 外 膜定位系统) 受体感受前导序列编码的前体蛋白和非植物的线粒体中的 相应受体有很大不同，这可能是为了避免错误定位。然而，双定位的蛋白被证明 可能使用一前一后串连的或者不明确的前导序列。 线粒体中也含有结合m 】必a 的核糖体。大多数线粒体中的m m 呵a 是原核起 源的，而真核起源的m 】r n a 更倾向于在细胞质中的核糖体上合成。原核起源的 m r n a 对线粒体的倾向性定位可能作为早期的定位机制影响之后的蛋白的信号 定位( m a r cc ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 迄今为止，科学家认为基因从叶绿体转移到细胞核可能分为3 个步骤( m a n i n 缸dh 锄越n ，1 9 9 8 ；b e r g 龃dk l l r l 卸d 2 0 0 0 ) 。首先，叶绿体中某基因的一个拷贝 转入细胞核。因为每个植物细胞含有5 0 一2 0 0 个叶绿体，每个叶绿体含有1 0 5 0 个 d n a 分子，所以叶绿体中依然存在具有正常功能的该基因的拷贝，因而细胞的生 命活动不受影响。在这一阶段叶绿体与细胞核中同时含有该基因的拷贝，但位于 核基因组中的拷贝没有功能。第二，该基因在核基因组中的拷贝通过突变或者基 因重组、染色体重排等方式逐渐进化出叶绿体转运肽编码序列并获得表达( d y a l l ， e ta 1 2 0 0 m ，所编码的蛋白在转运肽序列的作用下回到叶绿体发挥其功能。此时， 该基因叶绿体中的拷贝与细胞核中的拷贝均具有正常功能。第三，由于该基因细 胞核中的拷贝发挥作用，叶绿体拷贝逐渐突变丧失功能，并从叶绿体中丢失，最 终该基因细胞核中的拷贝完全替代了叶绿体基因组中的拷贝，从而完成了基因的 水平转移( m a r t i n 锄dh e n m 姐n ，1 9 9 8 ；b c r ga n dk l m 柚d ，2 0 0 0 ；h e 皿ee ta 1 ， 2 0 0 1 、。 首都师范大学硕士论文 1 3 3 3 研究方法一蛋白的细胞定位方法 随着人类基因组图谱及其初步分析结果的报道，以及多种模式生物、重要生 物基因组全序列的完成，基因组学的研究已经从结构基因组学( s 细l c t l 啪】 g 衄o l i 嘲开始过渡到功能基因组学c i l l l c t i 伽i a lg e m i 璐) 研究。功能基因组学代表 基因分析的新阶段，其主要目的是基因功能的研究，而基因的功能与其在细胞内 的定位密切相关，对基因的细胞定位研究可以使我们更容易认识基因在细胞中所 起的作用。常用的有以下几种定位方法： l 利用生物信息学进行蛋白质的初步定位： 生物信息学作为一门交叉科学，已经成为当今生命科学乃至整个自然科学的 重大前沿领域之一，它是基因组和蛋白质组学研究中必不可少的工具，利用生物 信息学中提供的丰富网络软件预测资源，就可以对蛋白质的空间结构以及细胞定 位和功能等进行预测。以下介绍几个基因细胞定位的软件包及其网址： t a f g c t p 0 卸：f w 啊c b s d t l l d 】【触r v i s 仍r g e 酬) ：能够根据真核生物蛋白n 末 端的序列，比如叶绿体转运肽、线粒体前转运肽、膜蛋白的跨膜序列或者是分泌 蛋白的信号肽等，来预测其细胞定位；同时也能够预测信号肽潜在的切割位点。 准确性、敏感性、权威性较高哪u d s s e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 c h l o r 0 p o n p ：脚唧w c b s d t l l d k s ，i o ，c b l o r o p ) ：能够预测蛋白序列中的叶绿 体转运肽，以及潜在的叶绿体转运肽的切割位点( o l o f l i m 锄u e l s s c ta 1 1 9 9 9 ) 。 i p s 0 r 1 聃t t p ：伽m 啊p s o n 0 r g d ：是由p s 0 r 1 ：o r g 提供的进行植物蛋白质细胞 定位预测的程序( e m 枷e l s s 0c ta 1 2 0 0 0 ) 。 p r e d o t a l 伯t t p 西i n f o b i o g c n 倒p r c d o t a 叻：预测植物蛋白四种细胞定位，对序 列长度有一定限制，称能对叶绿体和线粒体的转运肽有较好的区分，但对于外膜、 内膜、膜中间定位蛋白等并非经典输入途径的蛋白不可判断。提高准确度的同时 降低了一些敏感度。 m i t o p r o ( h t t p 腑m i p s b i o c h 锄m p g d c c 酵- b i 嘶m j m e d g e 咖i 锄t c r ) ：通过 计算蛋白的n _ 末端区域，预测线粒体的定位序列，以及潜在的切割位点( c l a r 璐 m ge ta 1 1 9 9 国。 首都师范大学硕士论文