（细胞生物学专业论文）拟南芥tua2基因参与aba胁迫下种子萌发过程的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇堡盛些盘堂或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：多场岩 签字日期：知年钿2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑三垦壅些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑兰堡盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：乡，胸膨 签字日期： 导师签名：渭内五 幻z 日签字日期： 纠年 钿2 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 微管蛋白是一种在真核细胞中普遍表达的蛋白，由q 微管蛋白( t u a ) 和1 3 微管 蛋白( t u b ) 组成的微管蛋白异二聚体构成。在拟南芥中共有6 种不同的t u a 基因 亚型和9 种不同的t u b 基因亚型。许多研究证实，不同的微管蛋白基因亚型在特定的 发育阶段或组织细胞中高效表达，随着外界环境胁迫表达量也会发生变化。因此，微 管蛋白基因不仅仅是持家基因，也参与众多的信号应答反应。 本研究以t u a 2 基因亚型表达变化的突变体为材料。利用反向遗传学的方法，运 用遗传转化，t a i lp c r ，半定量p c r 等技术进行t u a 2 参与a b a 胁迫下种子萌发过 程的研究。 主要结果如下： 1 通过生理检测我们在若干个t - d n a 插入突变体中发现了一个对a b a 敏感的突 变体。运用t a i lp c r 的方法找到了t - d n a 的插入位点位于t u a 2 基因上游启动子区， 并发现该位点的插入导致突变体中t u a 2 基因表达量提高。另外我们在s a l k 库也找 到了相应位点的突变体。并通过遗传转化的方法得到了三种不同株系的t u a 基因超 表达体。 2 构建了t u a 2 基因的亚细胞定位转基因表达载体，运用基因枪转化的方法将 t u a 2 基因和钮p 融合基因在洋葱表皮瞬时表达，结果显示t u a 2 主要在细胞膜上 分布。 3 通过对a b a 胁迫下种子萌发率的检测发现t u a 2 基因突变体，超表达体均出 现了种子萌发的延迟。推测t u a 2 可能参与了a b a 对种子萌发的调控过程。 4 通过r t - p c r 的方法对a b a 途径相关基因表达量进行分析的结果显示，与野 生型相比突变体的h a b 和a b l 基因在a b a 处理下的表达量明显降低，暗示了t u a 2 可能参与了a b a 信号系统的负调控过程。 关键词：拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) ；q 微管蛋白( t u a ) ；脱落酸( a b a ) a u t h o r ：l i uh a i - h a i m a j o r ：c y t o b i o l o g y a d v i s i o r ：p a ny a n - y u n a b s t r a c t r a b as t r e s s t u b u l i ni sak i n do fp r o t e i nw h i c hg e n e r a l l ye x p r e s s e si ne u k a r y o c y t e ，a n di ti sm a d e u po ft u b u l i nh e t e r o d i m e r sc o m p o s e db y c tt u b u l i na n d1 3t u b u l i n t h e r ea r e6d i f f e r e n t t u a s u b g r o u p sa n d9d i f f e r e n tt u bs u b g r o u p si na r a b i d o p s i s m a n ye x p e r i m e n t a lr e s u l t s s h o w e dt h a td i f f e r e n tt u b u l i n s u b g r o u p sn o to n l ye x p r e s s e de f f e c t i v e l yi ns p e c i f i e d d e v e l o p m e n t a ls t a g e a n dt i s s u e ，b u ta l s oc h a n g et h e i r e x p r e s s i o n l e v e lu n d e r e n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s t h u s ，t u b u l i ni sak i n do fh o u s e k e e p i n gg e n e ，a n di tp a r t i c i p a t e d i nm a s s e so fs i n g a lr e s p o n dr e a c t i o n o u rr e s e a r c hu s e dt h et u a 2m u t a n to ft u a 2s u b g r o u p sa sm a t e r i a l ，a n dw e u n d e r t a k e dt h er e s e a r c ho fg e r m i n a t i o nu n d e rt h et u a 2 一p a r t i c i p a t e da b as t r e s sb yr e v e r s e g e n e t i c s ，g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ，t a i lp c r ，s e m i q u a n t i t a t i v e - p c ra n d o t h e rt e c h n o l o g y t h em a j o rr e s u l t ss h o w e da sf o l l o w ： 1 w ef o u n da na b a s e n s i t i v em u t a n tf r o ms e v e r a lt - d n ai n s e r t i o nm u t a n t sb y p h a e n o t y p eo b s e r v a t i o n t h e nw ef o u n dt h et - d n a i n s e r t i o ns i t e ( 1 0 c a t e di nt h eu p s t r e a m p r o m o t e rr e g i o no ft u a 2 ) w i t ht a i lp c r ，a n dt h el e v e lo ft u a 2g e n e t i ce x p r e s s i o nr a i s e d i nt h i st - d n ai n s e r t i o nm u t a n t i na d d i t i o nw eo b t a i n e dt h em u t a n ti n s e r t e di nt h e c o r r e s p o n d i n gs i t ef o r mt h e s a l kl i b r a r y ，a n d g o tt h r e eo v e r e x p r e s s i o nm u t a n t si n d i f f e r e n ts t r a i n sb yg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n 2 w ec o n s t r u c t e dt u a 2t r a n s g e n i ce x p r e s s i o nv e c t o rf o rs u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n ， t r a n s i e n t e de x p r e s s e dt h ef u s i o ng e n eo ft u a 2a n dg f pb yp a r t i c l eg u nt r a n s f o r m a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et u a 2m a i n l yd i s t r i b u t e da tc e l l u l a rm e m b r a n e 3 b yo b s e r v a t i o no fg e r m i n a t i o n r a t eu n d e ra b as t r e s s ，t h et u a 2m u t a n ti sf o u n d ， a n dt h eo v e r e x p r e s s i o n m u t a n ta l le m e r g e dap h a e n o t y p eo fg e r m i n a t i o nd e l a y e d w e s u p p o s e dt h a tt u a 2m a yp a r t i c i p a t ei nt h eg e r m i n a t i o nr e g u l a t i n gp r o c e s so f a b a 4 w ea n a l y z e dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fa b a p a t h w a yr e l a t e dg e n eb yr t - p c r ，f o u n d t h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fm u t a n th a db e e nd e p r e s s e dc o m p a r e dt oh a ba n da b li nw i l d t y p eu n d e ra b as t r e s s i ti m p l i e dt h a tt u a 2m a yp a r t i c i p a t e di na b an e g a t i v er e g u l a t i o n p r o c e s s k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；a t u b u l i n ；a b s c i s i ea c i d a m p d e p c g f p i r i s u t r ： x g a l i p t g k a n m s e b e d t a a b a t u a t u b 英文缩写表 a m p i c i l l i n d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n t r i s 一( n y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e u n t r a n s l a t e dr e g i o n 5 - b r o m o 4 c h l o r o - 3 i n d o l y l l 3 - d - g a l a c t o p y r a n o s i d e i s o p r o p y l - d d t h i o g a l a c t o p y - r a n o s i d e k a n a m y c i n m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d a b s c i s i ca c i d a - - t u b u l i n - - t u b u l i n 目录 1 引言1 1 1t u a 的生理功能和研究现状1 1 2t u a 2 与信号传递2 1 3 本试验的研究目的和意义一2 2 材料与方法3 2 1 试验材料3 2 1 1 植物材料3 2 1 2 菌株、酶、质粒、试剂3 2 1 3 仪器设备3 2 1 4 培养基配方4 2 2 试验方法4 2 2 1 拟南芥的种植4 2 2 2 拟南芥t u a 2 突变纯合体的鉴定5 2 2 3t a i lp c r 5 2 2 4a b a 胁迫条件下的拟南芥表型观察6 2 2 5 拟南芥r n a 的提取及c d n a 合成6 2 2 6 载体构建及转化7 2 2 7 基因枪转化洋葱表皮9 2 2 8 激光共聚焦显微镜观察9 3 结果与分析1 0 3 1t d n a 插入x 基因的突变体表型检测1 0 3 2 运用t a i lp c r 方法查找a b a 敏感株突变体的t d n a 插入位点1 1 3 3 突变体t u a 2 2 的p c r 鉴定及表达分析1 3 3 4t u a 2 基因表达载体的构建。1 4 3 4 1p c a m b i a l 3 0 0 - p r o ：t u a 2 一觎p 载体的构建1 4 3 4 2p c a m b i a l 3 0 0 - p r o ：t u a 2 载体的构建1 5 3 5p c a m b i a l 3 0 0 - p r o ：t u a 2 g f p 载体的基因枪转化及观察1 5 3 6 转基因拟南芥的筛选和鉴定1 6 3 7 超表达体的表性分析1 7 3 8t u a 2 突变体中a b a 途径相关基因的表达1 9 z i 讨论：! ( ) 4 1 启动子区对基因表达的调控2 0 4 2t u a 2 基因高表达增加拟南芥种子萌发对a b a 胁迫的敏感2 0 4 3t u a 2 可能参与逆境下a b a 信号途径负调控过程一2 1 5 结论2 3 参考文献2 4 在读期间发表的学术论文2 9 作者简历3 0 致谢31 拟南芥t e a , ? 基因参与a b a 胁迫下种子萌发过程的研究 1 引言 微管是真核生物细胞的重要组分之一，它与微丝，中间纤维一起构成了细胞骨架 e l i 。微管在细胞的形态建成、分裂分化、信号分子的传递、物质的运输、细胞极性的 决定等方面起着至关重要的作用嘲。 1 1t u a 的生理功能和研究现状 微管由q 微管蛋白和1 3 微管蛋白共同组成 3 3 09 2 年s t e v e n 等人发现拟南芥中至 少有6 种表达的t u a 基因亚型和9 种表达的t u b 基因亚型，它们在遗传上具有很高 的保守性，基因结构极其相似，其中t u a 2 基因与t u a 4 基因的相似度甚至达到了9 0 以上h 1 。不过在随后的研究中发现这些高度相似的基因在植物体内表达时却存在着相 当大的不同。例如拟南芥b 微管蛋白t u b l 主要在根中表达，而t u b 5 在叶中大量表 达；q 一微管蛋白t u a l 在雄蕊和成熟花粉中表达量最高，而在成熟植株的根和叶中却 基本不表达b 1 。t u a 4 在植物生长发育的各个阶段和大部分器官中均有很高的表达量， 而与其相比，t u a 2 基因仅作为一个半组成性表达基因存在 。g u s 染色结果显示 t u a 2 基因在种子中表达量最大但仍不明显，在其他生长旺盛的幼嫩分生组织如根尖 和茎尖中表达较多，在衰老组织几乎看不到t u a 2 基因的表达 7 3 0x a v i e ru r i b e 等人 发现在玉米和烟草中t u a 2 基因仅在特定分化的组织如根尖，花中表达，这说明了植 物体内t u a 2 基因的表达受到发育过程的调控哺1 。植物体为何存在这么多结构如此相 近的基因，这些基因在植物的生长过程中又发挥了怎样的作用，成为了人们日益关注 的问题。 在生长发育的过程中植物细胞必须形成不同的形态来适应环境和功能的需要，而 这一过程与微管密切相关。微管在维持细胞生长的方向性上具有不可替代的作用。特 异性的药物处理能够使植物细胞形态发生异常 9 3 0 而微管相关蛋白的突变则能引起植 株生长状况的不稳定，而造成根，茎，叶的螺旋生长 1 0 3 。 微管也是植物细胞骨架重要的组成部分，自身处于动态的解离聚合过程，它又可 以和胞内许多物质结合从而起到运输和传递信号的作用e 1 1 o 周希明等人研究发现用 微管特异性药物处理细胞后胞内内向钾电流发生紊乱，说明微管正常的生理活性是维 持细胞钾通道所必需的n 列。h u a n g 等用促进微管聚合的药物预处理能够抑制气孔开 放及原生质体膨胀，表明微管也参与了这一生理过程【1 3 1 。张永梅等认为微管骨架系统 重排影响气孔开关运动可能是通过钙信号系统联系在一起的【1 4 1 。 此外，在许多细胞应答反应过程中，众多的信号传递链都与细胞骨架结合蛋白 a d f c o f i l i n 、p r o f i l i n 等有关，它们被认为是连接上游信号因子和下游细胞骨架动态 转变的传递者【l5 1 。 上述结果都表明微管骨架是信号转导过程中的重要的组成部分。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 2t u a 2 与信号传递 t u a 2 基因与植物许多信号系统息息相关。2 0 0 2 年k a r i n eg a l l a r d o 等人发现在拟 南芥赤霉素缺失突变体种子萌发的过程中，与正常的野生型相比，t u a 2 蛋白积累水 平存在下降的趋势，而t u a 3 和t u a 5 却没有明显的变化【l6 1 。在对磷脂酸靶位点的 研究发现t u a 2 蛋白也是磷脂酸的结合蛋白之一【l7 1 。对油菜种子吸水萌发过程中基 因转录模式的分析中可以看到在用p e g 和p b l 4 2 9 ( 一种a b a 类似物) 处理后t u a 2 基因表达量明显下降，这也暗示了t u a 2 基因可能参与了植物对渗透胁迫的响应过程 1 8 。d a v i d 等人用硫醇盐处理拟南芥后发现t u a 2 基因表达量上升，说明t u a 2 与 植物体内蛋白的硫化过程存在联系【1 9 】。t u a 2 在拟南芥对外界盐胁迫和对根瘤菌的响 应过程中表达量发生变化，暗示其可能参与了这些胁迫应答反应砒。另外t u a 2 还是b r 信号系统中重要的表达蛋白1 2 2 】。 1 3 本试验的研究目的和意义 综上所述，关于微管蛋白家族的生理功能和参与的信号途径的研究尚在起步阶 段。虽然已检测出微管蛋白各家族基因的组织定位，但将各亚型基因的生理作用还有 待研究。药物学研究可以得到大量的微管蛋白的参与的生理过程的信息，但不能深入 到基因水平，难以探讨其作用机理。而拟南芥t u a 基因亚型的高度相似性也给从基 因入手研究各亚型的功能带来困难。反向遗传学可以特异地改变某单个基因的表达变 化，本实验即得到一个t u a 2 亚型基因表达变化的突变体，通过对突变体的表型观察， 结合遗传转化、胁迫刺激和r t - p c r 等生化和分子生物学手段，初步揭示t u a 2 基因 可能参与了调节a b a 胁迫的应答反应的生理作用，不仅丰富植物a b a 信号系统调 节生长发育的理论研究，也为澄清t u a 家族各成员的生物学功能打下基础。 2 拟南芥t u a 2 基因参与a b a 胁迫下种子萌发过程的研究 2 1 试验材料 2 i i 植物材料 2 材料与方法 野生型拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 生态型为c o l u m b i a ( c 0 1 ) 型，本室保存。t u a 2 基因的插入突变体t u a 2 1 为t - d n a 移位得到，t u a 2 2 来自s a l ki n s t i t u t eg e n o m i c a n a l y s i sl a b o r a t o r y 。其中t d n a 的插入位点如图1 ，2 所示。 t 4 孙1 a 嗽 图1 ：t u a 2 1 基因突变体中t - d n a 插入位置 f i gl ：t - d n ai n s e r tp o s i t i o no f t u a 2 - 1m u t a n t 瑚 l 越娃 r 啉 3 嘲 图2 ：t u a 2 2 基因突变体中t - d n a 插入位置 f i g2 ：t - d n ai n s e r tp o s i t i o no f t u a 2 - 2m u t a n t 2 1 2 菌株、酶、质粒、试剂 大肠杆菌( d h 5 口) 、p c a m b i a l 3 0 0 双元载体为本室保存。各种限制性内切酶、 t a qd n a 聚合酶、p m d l 9tv e c t o r 试剂盒、t 4d n a 连接酶、异丙基硫化一1 3 - 半乳糖 苷( i p t g ) 均为t a k a r a 公司产品；p f u d n a 聚合酶为天根生化科技( 北京) 有限公司 产品；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均为北京庄盟生物基因技术有限责任公司产品。 寡聚核苷酸引物的合成及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 2 1 3 仪器设备 p c r 仪( t 1t h e r m o c y c l e r ) 为b i o m e t r a 公司出品； 离心机以及各种量程的移液枪为e p p e n d o r f 公司出品； 电泳仪为北京六一仪器厂产品； 凝胶成像系统是b i o r a d 公司； b c n 1 3 6 0 b 生物洁净工作台为哈尔滨东联电子技术有限公司产品； 基因枪型号为p d s 1 0 0 0 h es y s t e m ，为美国b i o r a d 公司产品； 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 激光共聚焦显微镜的型号为l s m 5 1 0m e t az e i s s ； 显微镜型号为c x 3 1 ，为o l y m p u s 公司产品； 体式显微镜型号为s z x l 6 ，为o l y m p u s 公司产品； 2 1 4 培养基配方 a h o a g l a n d 营养液及m s 培养基见参考文献【2 3 】 b l b 培养基配方( g 1 0 0 m l ) ：胰化蛋白胨1 0 ，酵母粉0 5 ， n a c l l 0 ，琼脂粉1 8 ， 用1 n n a o h 调p h 至7 0 。 c y e b 培养基配方( g 1 0 0 m l ) ：牛肉膏o 5 ，酵母膏o 1 ，蛋白胨o 5 ，蔗糖0 5 ， m g s 0 4 7 h 2 0 ，琼脂粉1 5 ，用1 n n a o h 调p h 至7 4 。 2 2 试验方法 2 2 1 拟南芥的种植 拟南芥种子经深层消毒( 2 5 次氯酸钠，1 0m i n ，无菌水洗3 次) 后，4 c 暗中 春化三天，播种在固体m s 培养基【2 4 】上，转移至光照培养箱 2 2 ，1 6 8h ( l d 光强 1 3 0 1 m a 0 1 m - 2 s d ) 中培养。1 肛1 4 天后( 幼苗长出2 , 4 片真叶) ，将幼苗移栽到浸透 h o g l a n d 营养液【2 5 1 的蛭石中，相同温度和光照条件继续培养，每周浇灌一次h o g l a n d 营养液。 2 2 2 拟南芥t u a 2 突变纯合体的鉴定 2 2 2 i 拟南芥基因组d n a 小量提取【2 6 】 基因组d n a 小量提取缓冲液e d w a r d sb u f f i e 的配制：t r i s h c l 2 0 0 m m ； n a c l 2 5 0 m m ；e d t a 2 5 m m ；s d s o 5 ( m v ) 。 提取步骤如下： a 取新鲜组织放于1 5 m l e p 管内，用塑料研柞研磨1 0 1 5 s ； b 加入4 0 0 m l 的e d w a r d sb u f f i e ，再轻轻研磨一下，洗净研柞上的组织； c 混匀5 s ，提取物室温放置，直到所有样品都研磨完毕； d 12 0 0 0 r p m ，4 c 离心l m i n ； e 取上清3 0 0 m l ，加入等体积的异丙醇，彻底混匀，室温放置2 m i n ； e4 c 离心5 m i n ，然后室温风干1 0 1 5 m i n ； g 加入2 0 m l 无菌水或t e 溶解d n a ，作为p c r 反应模板或放置4 c 保存。 2 2 2 2 突变体纯合体的p c r 鉴定 4 拟南芥t u a 2 基因参与a b a 胁迫下种子萌发过程的研究 以2 u l 基因组d n a 为模板，根据h t t p ：s i g n a l s a l k c d u 网址提供的信息，选取t - d n a 插入位点( 图l ，2 ) 的两侧的基因序列设计正、反向引物( l b 和r b ) ，利用t - d n a 左臂引物l b b l 与l b 或r b 引物对进行p c r ，鉴定t u a 2 的t - d n a 插入纯合突变体； 用正、反向引物扩增以检测基因序列的完整性。如果只有l b b l 与r b 引物能扩增出 条带，则为突变纯合体；只有l b 、r b 引物能扩增出条带，则为野生型；若两者都能扩 出，则为杂合体。p c r 所用的引物如下： l b ： 5 t c a t aaa c g c c c t t c t 3 r b ：5 g a ( 、t g a c a a g a c t g t t g g3 l b b l ：5 g c g t g g a c c g c t i g c t g c a a c t3 2 2 31 n 丑i lp c r 2 2 3 1突变体基因组d n a 提取 参见方法2 2 2 1 2 2 3 2 引物选择 a 选择t a i lp c r 特异性引物： l b b l 1 ：5 c c g t g t t c t c t c c a a a t g a a a t g l b b l 2 ：5 a c c c a t c t c a t aa d aa c g t c a t g c l b b l 3 ：5 g t r c c g a a a t c g g c a a a a t b 选择随机兼并引物： a d i 1 ： 5 ( a g c t ) t c g a ( g c ) t ( a t ) t ( g c ) g ( a t g t t a d l 2 ： 5 n g t c g a ( g c ) ( a t ) g a n a ( a t ) g a a a d i 3 ： 5 ( a t ) g t g n a g ( a t ) a n c a n a g a a d l 4 ： 5 a g ( a t ) g n a g ( a t ) a n c a ( a t ) a g g 2 2 3 3p c r 过程 参见参考文酬2 刀 2 2 3 4d n a 片段的回收和测序 3 3 3 3 3 3 3 取p c r 产物进行1 2 琼脂糖凝胶电泳，使用北京庄盟公司的d n a 凝胶回收试 剂盒回收所需片段，回收产物送至上海生工测序。 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 2 4a b a 胁迫条件下的拟南芥表型观察 2 2 4 1a b a 胁迫条件设置 配制好的m s 培养基高压蒸汽灭菌( 1 2 1 。c ，2 0 m i n ) 后加入a b a 使其终浓度为 0 8 9 m ，分装到培养皿中。种子播种后，打开皿盖，无菌风吹m 至表面干燥，封口， 然后放到培养室( 2 2 。c ，光照强度6 0 0 0 一8 0 0 0 1 x ，1 6 8 h 光暗周期，相对湿度3 0 ) 培 养，每个处理3 个重复，每天观察萌发统计相关数据。 取正常m s 培养基上生长2 周幼苗，用含1 0 0 i _ t m m a b a 的液体m s 培养基和空 白对照分别培养l h 后取掣2 引，以备提取r n a 。 2 2 4 2 表型观察 萌发率的统计：在培养基上萌发达到1 0 0 天数时统计各种处理的萌发率，以胚 根伸出种皮为准。 2 2 5 拟南芥r n a 的提取及e d n a 合成 2 2 5 1 提取r n a 的试验器具预处理 提取r n a 用的枪头、枪头盒、e p 管等均先用氯仿浸泡处理，然后o 1 2m p 湿热 灭菌1h ，重复三次，以便彻底去除r n a s e 可能造成的污染。研磨样品用的研钵，研 棒等用9 5 的乙醇高温灼烧，然后用液氮冷却。检测r n a 的电泳槽用0 1 的d e p c 水处理过夜。 2 2 5 2 拟南芥r n a 的提取 植物材料r n a 的提取用小量植物总r n a 快速抽提纯化试剂盒。操作步骤如下： a 取约6 0m g 材料，在液氮中研磨成粉沫。 b 将研磨好的粉沫转入1 5m le p 管中，加入1m l l i d 液，高速振荡2m i n ，然 后至于冰上直到所有的材料都研磨完毕。 c 室温静置5m i n 后，加入2 0 01 t l 氯仿。用力颠倒混匀，静置分层，1 2 0 0 0g 离 心5m i n 后，取水相到1 5m l e p 管。 d 力日入一半体积的7 5 乙醇，彻底混匀后，全部移入吸附柱，离心3 0s ，倒掉收 集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中。 e 加入5 0 0r t l r p 液( 试剂盒提供) ，离心3 0s ，收集管中的液体。 f 加入5 0 0l , t l w 3 液( 试剂盒提供) ，静置1m i n ，离心1 5s 。 g 将吸附柱放到一干净的收集管中，加入5 0 0l , t lw 3 液，离心1 5s 。 h 倒掉收集管中的液体，离心1m i n 。 6 拟南芥t u a 2 基因参与a b a 胁迫下种子萌发过程的研究 i 将吸附柱放到一个干净的1 5m le p 管中，在吸附膜中央加入5 0 扯l 纯水( 试 剂盒提供) ，室温静置1r a i n ，离心1r a i n ，将1 5m l e p 管( r n a ) 储存于一2 0 c 。 提取的r n a 即可作为反转录的模板。 2 2 5 3c d n a 合成 表l ：c d n a 合成的体系 元素 m g c l 2 l0 x r t b u f f e r r n a s ef r e ed d h 2 0 心n 甲m i x t r u e r n a s ei n h i b i t o r a m vr i 舅，e 嘲w a s c r i p t a s e o l i g o & - a d a p t o rp r i m e r 总体积 2 i l l l l 1 7 5 儿 l l 0 2 5 i i l 0 5 止 0 5 i l l l op l 反应条件：4 8 3 0s ；9 9 5m i n ；5 c5m i n 。 2 2 5 4 基因转录本与表达水平检测 以提取的r n a 为模板，参照t a k a r a 公司的一步法反转录试剂盒说明进行i 盯一 p c r ，略有改动。产物进行1 o 琼脂糖凝胶电泳，回收片段。送至上海生工测序。 按照2 2 5 2 的方法分别提取突变体，超表达体及野生型的r n a ，以各基因特异 的引物进行r t p c r ，检测基因的表达情况。内参基因a c t i n 的引物设计，参照d i t t 等【2 ，所扩条带用来检测提取的r n a 的完整性以及电泳时各样品间c d n a 上样量的 一致性。所用引物序列如下： t 2 f ： t 2 r ： f a c t i n ： r a c t i n ： 5 t a g c a t c a a a c a g c t c t g 5 c t g aa n 兀aa g c t g g g l 7 t t g g 5 g t t c g c a g c t g g g a a g a t a a g g 5 t c c a g a t g a c a c a t c a t g a 2 2 6 载体构建及转化 2 2 6 1 根据t u a 2 基因序列设计特异性引物 3 3 3 3 a ：p 1 3 0 0 - p r o ：t u a 2 载体的构建： 为后续的载体构建工作方便，分别在上下游引物上加勋d 和s a i l 酶切位点。 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 f ：5 a c g c g a g c t c t g c g a g a t g g a a g a t c a t c g r ：5 a c g c g t c g a c t c a g g g a t g g a t c c t c g t c t aa 声汀 3 3 b ：p 1 3 0 0 - p r o ：t u a 2 g 即载体的构建： 由于要加g | 即报告基因后再加n o s 终止子，用于做基因的亚细胞定位，所以要 去掉基因本身的终止密码子；为后续的载体构建工作方便，分别在上下游引物上加 砌d 和s a i l 酶切位点。 f ：5 a c g c g a g c t c t g c g a g a t g g a a g a t c a t c g r ：5 a c g c g t c g a c g t a c t c c t c t c t c c t t c a t c a t c c t c 2 2 6 2t u a 2 基因序列的特异性扩增 3 3 用于扩增的体系为5 0l a l ，为减少p c r 过程的错配几率，同时又能有效的保证扩 增效率，我们采用t a q 酶和高保真p f u 酶及各自对应的缓冲液各占1 2 的原则进行扩 增。体系如表2 ： 表2 ：p c r 体系 元素体积 基因组 l o x t a qb u f f e r 1 0 聊b u f f e r d d h 2 0 d n l l p 上下游引物( 各) p f u t a q 总体积 目的片段的扩增 5 止 2 汕 2 i i l 2 l 此 3 2 皿 3 2 止 0 2 皿 o 2 肛l 4 0 皿 反应条件：9 4 * ( 25m i n ；【9 4 * ( 23 0s ；5 8 。c4 5s ；7 2 * ( 2lr a i n2 0s ； 3 0c y c l e ；7 2 ( 2 1 0 m i n 电泳检测正确则对目的片段进行胶回收，所用的试剂盒是庄盟公司的琼脂糖凝胶 d n a 回收试剂盒。 2 2 6 3t u a 2 基因的测序 将回收的目的d n a 片段加a 并连接t 载体，。转化d h 5 a 感受态细胞。挑选阳 性克隆送上海生工测序部进行测序。 8 拟南芥t u a 2 基冈参与a b a 胁迫下种子萌发过程的研究 2 2 6 4 双元载体的构建和转化 将测序正确的t u a 2 片断从t - v e c t o r 上用相应的限制性内切酶切下来，电泳回 收，连接到双元载体p c m b i a 1 3 0 0 上，转化大肠杆菌( d h s a ) 。提取质粒做酶切鉴 定，将构建正确的载体转化至农杆菌g v 3 1 0 1 ，用于拟南芥的遗传转化。 2 2 6 5 拟南芥遗传转化及鉴定 参见参考文献2 羽。 2 2 7 基因枪法转化洋葱表皮 质粒p c m b i a l 3 0 0 p r o ：t u a 2 一g ! 即用基因枪转化法转化洋葱内表皮，用于基因 亚细胞定位的研究。 具体方法参见参考文献【2 9 】。 2 2 8 激光共聚焦显微镜观察 将上述打过基因枪的洋葱表皮放于2 2 。c 、连续光照条件下培养4 0h ，然后将洋 葱表皮置于p i p e s - k o h 缓冲液( 2 0m m ，p h 7 o ) 中浸泡4h ，随后在l s m 5 1 0m e t a z e i s s 型激光扫描共聚焦显微镜上进行观察。观察条件为：5 1 4n n l 激发光，激光强 度为3 0 。 9 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 3 结果与分析 3 1t - d n a 插入x 基因的突变体表型检测 本研究室工作目标为拟南芥磷脂酶c 基因参与植物生长发育和胁迫反应的功能 研究，因此首先对获得的十余种不同亚型磷脂酶c 基因t - d n a 插入突变体进行了生 长表型和对胁迫刺激反应的检测。在检测过程中，发现一株在种子萌发时对a b a 敏 感的株系p 1 7 。图3 显示该株系在不同浓度a b a 胁迫下种子萌发的速率，其中w t 为野生型对照，p 1 1 为另外一个亚型基因的突变体。在正常培养条件下，三种植株的 种子萌发率相似( 图3 a ) ，在0 5 p m a b a 胁迫下，与野生型和p l l 相比，p 1 7 突变体 种子的萌发更慢，在第五天时野生型的种子萌发率为9 2 ，p 1 1 为8 4 ，p 1 7 仅为2 5 ( 图3 b ) ；在0 8 9 m a b a 胁迫下，胁迫现象更加明显，第五天时野生型和p l l 的种 子萌发率都达到了9 0 ，而p 1 7 仅为1 4 ( 图3 c ) 。结果显示，p 1 7 与野生型相比在 a b a 胁迫下种子萌发出现延迟，并且具有浓度依赖性。 量 暑 知 口 静 刽 蜜 a 卜c o n t r o iv 盯 m c o n t r o lp 1 7 一_ c o n t r o l p l l 拟南芥t u a 2 基因参与a b a 胁迫下种子萌发过程的研究 上述结果经过3 次重复确认后，我们检测了p 1 7 亚型的磷脂酶c 基因的表达量 的变化，结果发现，p 1 7 基因突变体中该基因的表达量与野生型相比没有任何变化， 即该基因与种子萌发的表型不连锁，该株系在a b a 刺激下种子萌发的表型可能是由 其他基因导致的。 本实验室所得种子均来源于s a l ki n s t i t u t eg e n o m i ca n a l y s i sl a b o r a t o r y ，文献报道 s a l k 库里的t o 代种子在经过连续几代的繁种后，会有一定几率会出现t - d n a 移位 甚至丢失的现象口们。在随后的试验中我们发现p 1 7 仍然具有卡纳抗性，所以初步断 定p 1 7 仍然拥有t - d n a 序列，只是产生了t o d n a 移位的现象，影响了其他基因的表 达，产生了上述现象。a b a 对种子萌发的影响，是a b a 信号途径调节的生理变化之 一日，是研究a b a 信号途径常用的实验体系。因此我们拟采用t a i lp c r 的方法找 到新的插入位点。 3 2 运用t a i lp c r 方法查找a b a 敏感株突变体的t - d n a 插入位点 热不对称性p c r ( t h e r m a la s y m m e