（细胞生物学专业论文）人骨髓间充质干细胞对神经干细胞增殖与分化培养的影响.pdf

四川大学硕士学位论文 声明 本人所呈交的学位论文是本人在导师悉心指导下完成的研究 工作以及取得的研究成果。据我所知，在文中除了加以标注和致 谢的地方外，不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得四川大学或其它教育机构的学位和证书而使用过的材 料。与本人一起工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中做了明确说明并表示致谢。 本学位论文成果是本人在四j i i 大学就读期间在导师的指导下取得 的，论文成果归四川大学所有，特此声明。 ，f ，少 即叹 獭尹 人师请撒申指 四川大学硕士学位论文 人骨髓间充质干细胞对神经干细胞增殖与 分化培养的影响 细胞生物学专业 研究生张勇刚指导教师胡火珍教授 摘要 目的问充质干细胞是一种具有多向分化能力的成体干细胞，在体 外能诱导分化成为成骨细胞，脂肪细胞，神经细胞等在实验中，间充 质干细胞移植能改善机体损伤修复。神经损伤是一种比较难修复的机体 损伤，神经干细胞移植能改善神经损伤的修复，神经干细胞与间充质干 细胞的共移植更能加快修复过程。因此推测间充质干细胞能对神经干细 胞产生影响，加快神经损伤的修复。为了验证我们的推测，我们设计了 体外共培养间充质干细胞与神经干细胞，研究间充质干细胞对神经干细 胞增殖和分化的影响，探讨其作用机制，为问充质干细胞的运用提供实 验依据。 方法培养人骨髓间充质干细胞和含小鼠神经干细胞的神经球，利 用于细胞的定义即自我更新和多向分化潜能进行鉴定培养出的细胞是干 细胞。利用腺病毒使培养的人骨髓间充质干细胞带上绿色荧光蛋白标记， 与培养的含神经干细胞的神经球共培养，观察通过神经球结构的变化， 细胞生长曲线和神经干细胞分化程度确定间充质干细胞对神经球在增殖 培养条件下的影响；通过检测神经干细胞向神经元，星形胶质细胞，少 突胶质细胞的分化能力改变确定间充质干细胞对神经干细胞在分化培养 条件下的影响。n i b p 是一种新发现的与n f kb 信号通路中的n i k 和 四川大学硕士学位论文 i k k 2 结合的蛋白，通过r n a 干扰( r n a i ) 技术降低神经干细胞中n i b p 的表达能阻止神经干细胞从神经球里的迁出，通过半定量p c r 检测间充 质干细胞对神经干细胞的n i b p 表达，研究间充质干细胞对神经干细胞影 响的机理。 结果培养出人骨髓间充质干细胞，成功诱导间充质干细胞向成骨 细胞，脂肪细胞，心肌样细胞分化；成功培养出含神经干细胞的神经球， 神经球里约由8 0 的细胞表达神经干细胞标记物n e s t i n ，培养的神经干 细胞能成功的诱导成神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞。间充质干 细胞与神经球在增殖条件下的共培养，神经球由于细胞迁移出神经球而 导致神经球离解，而运用间充质干细胞条件培养基在增殖条件培养神经 球，能得到同样的结果，说明间充质干细胞是通过分泌相关的细胞因子 影响了神经干细胞。在用间充质干细胞条件培养基在增殖条件下培养神 经干细胞，与对照相比，细胞的增殖能力没有改变；在用间充质干细胞 条件培养基在分化条件下培养神经干细胞，得出间充质干细胞分泌的相 关因子能增加神经干细胞向少突胶质细胞分化的能力，而减少向星形胶 质细胞分化的能力。n i b p 的低表达能使神经干细胞迁移能力降低，而间 充质干细胞能使神经干细胞的n i b p 表达增高。 结论间充质干细胞能通过分泌相关的细胞因子作用于神经干细 胞，使细胞n i b p 表达增强而增加神经干细胞的迁移能力，同时使神经干 细胞向少突胶质细胞分化能力增强，向星形胶质细胞分化能力减弱。 关键词：间充质干细胞神经干细胞共培养干细胞分化 4 四川大学硕士学位论文 h u n m a n m e s e n c h y m a l s t e mc e l l sf r o mb o n em a r r o we f f e c t t h ep r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fn e u r a ls t e mc e l l s m a j o r ：c e l l b i o l o g y g r a d u a t es t u d e n t ：z h a n gy o n g - g a n g s u p e r v i s o r ：h uh u o - z h e n a b s t r a c t o b j e c t i v e ：m e s e n c h y m a ls t e i nc e l l ( m s c ) i sak i n do fa d u l ts t e m c e l l ，a n di th a v et h ea b i l i t yo fm u l t i p o t e n td i f f e r e n t i a t i o n s m s c sc a nb e i n d u c e di n t oo s t e o g e n i cc e l l s ，a d i p o g e n i cc e l l s ，n e u r a lc e l l sa n ds oo ni nv i t r o f r o mt h er e s u l t so fe x p e r i m e n t s ，t h et r a n s p l a n t a t i o no fm s c sc a ni m p r o v e f u n c t i o n a lo u t c o m ea f t e ro r g a n i ci n s u l t s , b u tt h e r ea r c1 1 0e x p e r i m e n t ss h o w t h a tm s c so rc e l l sd i f f e r e n t i a t e df r o mm s c sc a ne x s i ti nt h el o c a t i o n so f t h e i n s u l t sf o rl o n gt i m e n e u r a li n s u l ti sv e r yh a r dt oh x 幻m e t h et r a n s p l a n t a t i o n o fn e u r a ls t e mc e l l s ( n s c s ) c a ni m p r o v ef u n c t i o n a lo l l c c 幻m eo fi t , a n d c o n - t r a n s p l a n t a t i o nn s c sa n dm s c s c 锄a c c e l e r a t et h ep r o c e s s w es u p p o s e t h a tt h em s c sc a ne f f e c tt h en s c s ，a n da c c e l e r a t en e u r a li n s l u t sr e c o v e r s o ， w ew a n tt oc o n - c u l t u r et h eh u n m a nm s c sf o rb o n em a r r o wa n dn s c sf o r m o u s e ，a n ds t u d yh o wt h em s c se f f c e tt h ep r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n f i m i o n o fn s c si nv i t r o me x p e r e n m e n t sw i uh e l pu st ou s eo fm s c si nc e l l t r a n s p l a n t a t i o n m e t h o d s ： c u l t u r et h em s c sf r o mh u m a nb o n em a r r o wa n d n e u r o s p h e r e sf o r mm o u s ew h i c hc o n t a i nn s c s u s i n gt h ed e f i n i t i o no ft h e s t e mc e l l s ，s e l f - r e n e wm u t i p o t a n t - d i f f e r e n t i a t i o n , t oc e r t i f yt h ec e l l sw e c u l u t r e da r es t e m c e l l s u s i n g t h ea d e n o v i r u sw i t he n h e n c e dg r e e n f l u o r e s c e n c e p r o t e i n ( e g f p ) t o m a r kt h em s c sf r o mh u m a n , a n d c o n - c u l t u r ew i t hn s c sf i o mm o u s e i nt h ec o n d i t i o no fn s c sp r o l i f e r a t i o n , s t u d yh o wt h em s c se f f c e tt h en s c sb yo b s e r v i n gt h ec h a n g e s o f n e u r o s p h e r e sa n dt h ep r o l i f e r a t i o no ft h en s c s ；i nt h ec o n d i t i o no fn s c s 四川大学硕士学位论文 d i f f e r e n t i a t i o n , s t u d yh o wt h em s c se f f c e tt h en s c sb yd e t e c tt h ea b i l i t i s eo f d i f f e r e n t i a t i o ni n t on e u r o n s ，o l i g o d e n d r o c y t e sa n da s t r o c y t e s n i b pi san e w p r o t e i nt h a tc a nb i n dt h ep r o t e i n so f n f - kbs i g n a lp a s s w a y - n i k a n di k k 2 u s i n gr n ai n t e r f e r e n c e ( r n a i ) g e n e r a t e d f r o ml e n t i v i r u sv e c t o r st o k n o c k d o w nt h en i b pi nn e r u o s p h e r e sc a nb l o c kt h ec e l l sm i g r a t i o nf o r m n e u r o s p h e r e s u s i n gr t p c rt od e t e c tt h ee x p r e s so fn i b pi nc o - c u l t u r e d n s c sa n dc o n t r o lt os t u d yt h em e c h a n i s mo fh o wm s c se f f c e tn s c si n p r o l i f e r a t i o nc o n d i t o n r e s u l t s ：w ec a ng e tt h em s c sf o r mt h eh u n m a nb o n em a l t o wa n d c a ni n d u c et h ec u l t u r e dm s c si n t oo s t e o g e n i cc e l l s ，a d i p o g e u l cc e l l sa n d c a r d i o m y c y o t e 1 i k ec e l l s w ec a nc u l t u r et h en e u r o s p h e r e sw h i t c hc o n t a i n n s c s ，a n dc a ni n d u c et h ec u l t u r e dn s c si n t on e u r o n s , o l i g o d e n d r o e y t e sa n d a s t r o c y t e s n e u r o s p h e r e sg a l ld i s a g g r e g a t i o ni nn s c sp r o l i f e r a t i o nc o n d i t i o n w h e nc o n - c u l t u r ew i t hm s c s ，a n do n l yu s i n gt h em s c se o n d i f i o l l a lm e d i u m a l s oc a nm a k et h en e u r o s p h e r e s d i s a g g r e g a t i o n i nn s c sp r o l i f e r a t i o n c o n d i t i o n f o r mt h er e s u l t sw ec a nl e a r nt h a nm s c sc a ne f f c e tn s c sb y s e c r e t es o m er e s e l u b l ec y t o k i n e 1 f 1 地p r o l i f e r a t i o na b i l i t yo fc n s sc 趾n o t c h a n g ew h e nc u l t r u e di nm s c s c o n d i t i o n a lm e d i u m n l cm s c sc o n d i t i o n a l m e d i u mc a ni n c r e a s et h ea b i l i t yo fd i f f e r e n t i a t i o nt oo l i g o d e n d r o e y t e s ，a n d d g c r c a c et h ea b i l i t yo fd i f f e r e n t i a t i o nt oa s t r o c y t e s b u tc a nn o tc h a n g et h e a b i l i t yo f d i f f r e n t i a t i o nt on e u r o n s n 玲m i g r a t i o na b i l i t yo f n e r o s p h e r e sc e l l s c a nb l o c kw h e nk n o c k d o w n i n gt h en i b pb yi 斟加a n dt h em s c s c o n d i t i o n a lm e d i u ma l s oc a nm a k et h ee x p r e s so f n i b pd i c r e a s e d c o n c l u s i o n ：m s c sc a ni n c r e a s et h em i g r a t i o na b i l i t yo fn s c sb y s e c r e t i n gs o m er e s o l u b l ec y t o k i n e ，w h i c hc a nu p r e g u l a t et h ee x p r e s so f n i b e m s c sc a ni m c a s et h ed i f f e r e n t i a t i o na b i l i t yo fn s c st oo l i g o d e n d r o c y t e s ， a n dd e c r e a s et h ed i f f e r e n t i a t i o na b i l i t yo f n s c st oa s t r o e y t e s k e yw o r d s ：m e s e n c h ) r m a ls t e mc e l l s ( m s c s ) n e u 强! s t e mc e l l s e o n - c u l t u m c e l ld i f f e r e n f i a f i o n 6 四川大学硕士学位论文 上- 工一 刖吾 1 研究背景 间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 是来源于胚胎发育 早期中胚层和外胚层，具有多向分化潜能的成体干细胞“。，间充质干细 胞已经在体外成功的诱导成成骨细胞，脂肪细胞，心肌样细胞，神经细 胞等“1 。问充质干细胞来源广泛，一般间充质干细胞来源于骨髓，脂肪 组织以及脐带血。由于问充质于细胞具有跨胚层的多向分化潜能和具有 来源广泛，容易获得及较低的免疫源性特性，所以，间充质干细胞成 为细胞移植治疗的理想细胞及基因治疗的理想载体细胞。 在利用动物模型的实验的过程中，间充质干细胞移植进行能加快骨 缺损的修复”。，能改善心肌缺损导致的心脏功能紊乱，能促进神经损 伤的修复等“”，但在所有的试验中，都没有检测到在损伤原位，有移植 的问充质干细胞分化成的相关分化细胞的存在或移植的问充质干细胞的 长期存在。实验提示我们，间充质干细胞改善机体损伤可能不是由于其 直接分化成为体细胞，而是通过别的途径。 神经系统的损伤是比较难自我修复。在过去的研究中，也发现了在 中枢神经系统，存在一群能自我增殖并具有多向分化潜能的神经干细胞， 通过神经干细胞的移植实验，表明神经干细胞的移植能改善如脊髓损伤 l i o j 脑卒中等神经损伤疾病的症状“。实验还证实神经干细胞与间充质 干细胞共移植，比只移植神经干细胞更能促进神经损伤的修复“。 2 选题依据 骨髓间充质干细胞是最早发现的间充质干细胞，骨髓间充质干细胞 易培养，具有多向分化潜能，被广泛的运用于机体损伤修复实验。骨髓 问充质干细胞分化形成的成骨细胞对维持造血干细胞的自我更新具有重 要的作用n 3 3 。神经干细胞与间充质干细胞共移植的试验结果使我们提出 7 四川大学硕士学位论文 假设，间充质细胞改善神经损伤是由于作用于神经干细胞的结果。 神经系统存在干细胞“，但是神经损伤的修复较别的组织修复更加 的困难，实验提示间充质干细胞的移植也能加快神经损伤的修复，因此 我们选择神经干细胞作为实验对象，利用体外实验来研究骨髓间充质干 细胞是否对神经干细胞有作用。 神经干细胞的体外培养较别的干细胞容易，在神经干细胞的培养中， 神经干细胞能在不需要饲养层细胞的条件下，形成细胞球，即神经球“， 神经球结构的存在，更利于体外实验观察间充质干细胞对神经球细胞的 细胞迁移及分化的影响。 3 实验目的和意义 实验将培养人骨髓间充质干细胞和小鼠神经干细胞，通过绿色荧光 蛋白( e g f p ) 标记培养的入骨髓间充质干细胞，再与小鼠神经干细胞共 培养，通过观察间充质千细胞对神经干细胞在增殖与分化培养条件下的 影响，来确定间充质干细胞对神经干细胞是否有直接的影响，以及探讨 影响可能存在的分子机制。 实验涉及两种干细胞的培养，由于现在对间充质干细胞和神经干细 胞没有准确的表面标记物的鉴定，所以干细胞的鉴定准备采用鉴定干细 胞的自我更新和多向分化潜能及神经干细胞的相对特异标记n e s t i n 进 行鉴定。实验首先通过两种干细胞的共培养来确认骨髓问充质干细胞是 否对神经干细胞有影响，然后通过条件培养基方式确认影响是否是通过 细胞分泌的可溶性因子进行的，最后通过实验结果对其相应的分子机制 作简单的探讨。 实验拟通过对神经干细胞与骨髓间充质干细胞相互影响的研究，来 探寻间充质干细胞移植改善神经损伤的机理，对今后神经干细胞的运用 以及问充质干细胞的进一步认识提供实验依据。 8 四川大学硕士学位论文 实验设计流程图： 参考文献 1 p i t 把 n g e ri f k a ya m , b kc bc tu 1 m u l t i l i n e a g ep o t e n t i a lo fa d u l th u m a n m c s e n c h y m u ls t e mc e l l s s c i e n c e1 9 9 9 ：2 8 4 ：1 4 3 1 4 7 2 w o o d b u r yd s c h w a r ze j , p r o c k o pd j , b l a c ki b a d u l tr a ta n dh u m a nb o n em a w s l l o m a lc e l l sd i f f e r e n t i a t ei n t on e u m m jn e u r o ir e s 2 0 0 0 ；6 l ：3 6 禾3 7 0 3 y u e h u a j ，b a l k x i s h n a n ，j a h a g i r d a r ，咖p l u r i p o t e n c yo f m e s e n c h y m u ls t e mc e l l s d e r i v e df r o ma d u l tm a l t o w n a t u r e ，2 0 0 2 ，4 1 8 ：4 1 4 9 9 四川大学硕士学位论文 4 d e a n s1 7 j ，m u s e l e ya b m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ：b i o l o g ya n dp o t e n t i a lc l i n i c a l u s 鹤e x p h e m a t o l ，2 0 0 0 ，2 “8 ) ：8 7 5 8 8 4 5 k i dd wc h u ny j ，k i mt ge t cc o t r a n s p l a n t a t i o no ft h i r d - p a r t ym e s e n c h y m a l s t r o r n a lc e l l sc a r ta l l e v i a t es i n g l e - d o n o rp r e d o m i n a n c ea n di n c r e a s ee n g r a f t m e n t f r o md o u b l ec o r dt r a n s p l a n t a t i o nb l o o d ，2 0 0 4 ，1 0 3 ( 5 ) ：1 9 4 1 - 1 9 4 8 6 k r u g l y a k o v p v , s o k o l o v a i b ，z i n 1 【o v a n n ，v i i d e s k , p o l y n t s e v d q r e l a t e d a r t i c l e s , e f f e c to fm e s e n c h y m a ls t e mc e l l so n 嘲e c t i o no fx e n o g e n i cb o n et r a n s p l a n t b u l l e x p b i o lm e d 2 0 0 6o c l 4 1 4 2 ( 4 ) ：5 3 4 - 7 7 n i c o l a sc h r l s t o f o r o ua n dj o h nd g e a t h a r ts t e mc e l i sm i d1 1 1 e i rp o t e n t i a li n c e l l b a s e dc a r d i a ct h e r a p i e sp r o g r e s si nc a x d i o v a s c u l a rd i s e a s e s , v o l u m e4 9 ， i s s u e6 ，m a y - j a n e2 0 0 7 ，p a g e s3 9 6 - 4 1 3 8 3 b o s s o l a s c ope ta l ( 2 0 0 5 ) n e u r o - g l i a ld i f f e r e n t i a t i o no f l m m a nb o n em a r r o ws t e m c e l l si nv i t r o e x pn e u r o l1 9 3 ：3 1 2 - 3 2 5 9 w i s l e t - g e n d e b i e nse ta l ( 2 0 0 5 ) p l a s t i c i t yo f c u l t u r a d m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ：s w i t c h f r o mn e s t i n - p o s i t i v et o e x c i t a b l en e u r o n - l i k ep h e n o t y p e s t e mc e l l s2 3 ：3 9 2 - 4 0 2 1 0 d e a gy be ta l ( 2 0 0 6 ) i m p l a n t a t i o no fb mm e s o n c h y m a ls t e mc e l l si n t oi n j u r o d s p i n a lc o r de l i c i t sd en o v on e u r o g e n e s l sa n df u n c t i o n a lr e c o v e r y ：e v i d e n c ef r o ma s t u d yi nr h e s u sm o n k e y s c y t o t h a , a p y8 ：2 1 0 - 2 1 4 1 1 t h o n m a , o h o n m o u , s i i h o s h i i n t r a v e n o u si n f u s i o no fi m m o r t a l i z e dh u m a n m e s e n c h y m a ls t e mc e l l sp r o t e c t sa g a i n s ti n j u r yi na c e r e b r a li s c h e m i am o d e li na d u l t r a t e x p e r i m e n t a ln e u r o l o g y ，v o l u m e1 9 9 ，i s s u ei ，m a y2 0 0 6 ，p a g e s5 6 - 6 6 1 2 l iy c ia l ( 2 0 0 5 ) g l i o s l sa n db r a i nr e m o d e l i n ga r e ru e a t m e n to f s t r o k ei nr a t sw i t h m a r r o ws t r o m a lc e l l s g 1 i a4 9 ：4 0 7 - _ 4 1 7 1 3 a n d r e ab a c i g a l u p o ，m e s e n c h y m a ls t e mc e l l sa n dh a e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l t r a n s p l a n t a t i o nb e s tp r a n c e r e s e a r c hc l i n i c a lh a e m a t o l o g y , v o l u m e1 7 ，i s s u e 3 ，s e p t e m b e r2 0 0 4 ，p a g e s3 8 7 - 3 9 9 1 4 l o i s c ，a l v a r e z - b u y l l a a 1 9 9 3 p r o l i f e r a t i n gs u b v e n t r i c u l a r z o n e c e l l s i n t h ea d u hm a m m a l i a nf o r e b r a l ng a l ld i f f e r e n t i a t ei n t on e u r o l 砖a n dg l i & p r o cn a t l a c a ds c iu s a9 0 ：2 0 7 4 - 2 0 7 7 1 5 r e y n o l d sb a ，r i e t z er l ( 2 0 0 5 ) n e u r a ls t e mc e l l sa n dn c u r o s p h c r e s - - - - c c - e v a l u a t i n g t h er e l a t i o n s h i p n a tm e t h o d s2 ：3 3 3 - 3 3 6 l o 四川大学硕士学位论文 实验部分 第一部分人骨髓问充质干细胞的培养与鉴定 成人骨髓中除了含有造血干细胞外，还含有一种能自我更新增殖， 并具有多向分化潜能的成体干细胞，骨髓间充质干细胞( m e s e n c h y m a l s t e mc e l l s ，m s c s ) 。在体外实验中，m s c s 能诱导分化，形成成骨细胞、 脂肪细胞、心肌细胞，神经细胞等。由于间充质干细胞没有特定的准确 的表面标记分子，所以，采用多向诱导分化来证明其干细胞特性。在下 一步实验中，需要砘s c s 与神经干细胞共同培养，所以选用带有增强型绿 色荧光蛋白( e g f p ) 的腺病毒感染m s c s ，使其带上绿色荧光标记。 1 实验材料 1 1 骨髓标本来源 骨髓取自健康的自愿者，由四川大学华西医院采集，共采集2 例自 愿者骨髓标本。 1 2 细胞株及腺病毒来源 ( 1 ) a d 2 9 3 细胞( 第3 8 代，四川大学病理研究室提供) ( 2 ) 带增强型绿色荧光蛋白的腺病毒空载体( 四川大学免疫研究 室陈乙兰提供) 相关信息见附件1 1 3 主要实验试莉与实验仪器 1 3 1 主要实验试剂 低糖d m e m 培养基( i n v i t r o g e n ) ； 胎牛血清( i n v i t r o g e n ) ； 四川大学硕士学位论文 胰蛋白酶( i n v i t r o g e n ) ； c d 2 9 一f i t c 、c d 3 4 一f i t c 、c d 4 4 一f i t c 、c d 4 5 一f i t c 、c d l 0 5 一 f i t c ( b d ) ；f i t c 标记的同型对照免疫球蛋白( b d ) ； e x g e n 5 0 0 ( m b if e r m e n t a s ) ； 地塞米松( s i g m a ) ； 抗坏血酸( s i g m a ) ； b 一甘油磷酸钠( s i g m a ) ； 3 - i s o b u t y l l - m e t h y l x a n t h i n e ( s i g m a ) ； 重组人胰岛素( s i g m a ) ； 5 一a z a ( s i g m a ) ； 人淋巴细胞分离液( 天津) ； 人肌钙蛋白t 抗体( 博士德) ； 骨钙素抗体( 博士德) ； 茜素红( s i g m a ) ； 油红0 ( s i g m a ) , i 3 2 主要实验仪器 二氧化碳细胞培养箱( t h e r m o ) ； 生物安全柜( t h e r m o ) ； ， 台式离心机( t h e r m o ) ； 倒置荧光相差显微镜( o l y m p u s ) ； 显微拍照系统( o l y m p u s ) ； 流式细胞仪( 叻) ； 2 实验方法 2 1 人骨髓间充质干细胞的原代培养 本实验共培养了2 例健康自愿者的骨髓间充质干细胞 ( i ) 骨髓标本的采集：在华西医院利用骨穿刺，采集健康自愿者骨髓 四川大学硕士学位论文 5 m l ，放入事先准备好含肝素的5 m l 低糖d m e m 无血清培养基，4 无菌条件下送至实验室，立即开始实验。 ( 2 ) 单核细胞的分离；取两支l o m l 的离心管，分别装入5 m l 人淋巴细 胞分离液，然后，按照1 ：1 的比例，小心的把骨髓液加到淋巴分 离液的上层，4 0 0 9 ，3 0 r a i n 离心；离心后，小心吸取溶液界面处 雾状层与新的离心管，用p b s 离心洗涤两次后，用2 m l 含1 0 胎 牛血清的低糖d m e m 重悬细胞，进行细胞计数。 ( 3 ) 细胞接种与培养：分离出的单核细胞按照1x1 0 8 2 5 c m 2 密度接种 于一次性培养瓶中，加入含1 0 胎牛血清的低糖d m e m 培养基 l o m l ，置于3 7 ，5 c 0 2 ，相对湿度 9 5 的细胞培养箱中培养。 培养至3 4 d ，有细胞开始贴壁，对细胞进行半量换液，到第7 d 时，对细胞进行全换液；到1 5 1 8 d ，细胞克隆逐渐增大，原代 细胞约长满瓶底的8 0 时，进行传代培养。 2 2 人骨髓间充质干细胞的传代培养与冻存 细胞长至约铺满瓶底的8 0 时，对细胞进行传代培养 ( 1 ) 吸去细胞的培养基，然后用p b s 洗涤细胞两次。 ( 2 ) 加入含0 2 5 胰酶与0 0 2 e d t a 的p b s ，消化细胞，在显微镜下观 察整个消化过程，待细胞脱壁后，用含血清的培养基终止消化。 ( 3 ) 用吸管吹打细胞成细胞悬液，转入离心管中，离心后，用1 0 胎 牛血清的培养基重悬细胞，然后计数。 ( 4 ) 传代培养按照2 x1 0 个细胞2 5 c m 2 接种后，置于3 7 c ，5 c 0 ， 相对湿度 9 5 的细胞培养箱中培养。 ( 5 ) 细胞冻存：调整细胞悬液浓度为2 1 0 6 个m e ，配制冻存液：含 2 0 d m s o ，4 0 胎牛血清的低糖d m e m 培养基，然后细胞悬液与冻 存液按照1 ：1 混和后，装入冻存管，梯度降温后，放入液氮中保 存。 2 3 人骨髓间充质干细胞的表面标记的流式细胞仪检测 按照抗体的说明书，取待检测的细胞，制成细胞悬液，然后加入抗 体孵育后，用流式细胞仪进行检测。 四川大学硕士学位论文 2 4 人骨髓间充质干细胞的诱导分化及鉴定 所有诱导分化的细胞均为第三代细胞，按照2 1 0 4 c m 2 密度接种子 培养瓶或放置了盖玻片的六孔培养板。等细胞长到7 0 8 0 融合时， 开始加入诱导剂。 2 4 1 人骨髓间充质干细胞的成骨诱导： 加入成骨诱导液：低糖d m e d + l o 8 m o l l 地塞米松+ 5 0l lg m 1 抗坏 血酸+ l o m o l lb 一甘油磷酸钠+ 1 0 胎牛血清，每2 3 d 换液。人骨 髓间充质于细胞诱导向成骨分化的检测： a 碱性磷酸酶：取诱导7 d 的细胞，先用9 5 酒精固定2 0 r a i n 后， 采用钴一钙法染色； b 骨钙素的表达检测：取诱导1 5 d 的细胞，4 多聚甲醛固定3 0 r a i n 后，作免疫荧光罗丹明标记染色； c 钙节结检测：取诱导2 1 d 细胞，用茜素红染色。 2 4 2 人骨髓间充质干细胞的成脂诱导： 加入成脂诱导液：高糖d 眦m + 1 0 i i m l 重组人胰岛素+ 0 5 删 3 - i s o b u t y l - l - m e t h y l x a n t h i n e + 1 0 m o l 几地塞米松+ 1 0 0 珀m i n d o m e t h a c i n + 1 0 胎牛血清，每3 d 换液。人骨髓间充质干细胞诱导向 成脂分化的检测：细胞用油红0 染色后，普通显微镜下观察有无脂滴形 成。 2 4 3 人骨髓间充质干细胞的成心肌诱导： 加入心肌诱导液：高糖d m e m + 1 0 | l 1 l5 一a z a + 1 0 胎牛血清， 2 4 h 后，用p b s 洗涤两次，换掉含5 一a z a 的培养基，每3 d 换液，第2 8 d ， 消化细胞后，作肌钙蛋白t 的免疫印迹检测与流式细胞术检测。肌钙蛋 白阳性对来自小鼠心肌细胞。 2 4 4w e s t e r n - b l o t t i n g ( 1 ) 样品制备 细胞收集后，用冰冷p b s 洗涤，然后用6 x 上样缓冲液溶液细胞 1 4 四川大学硕士学位论文 冰浴超声i m i n ，剪切d n a 以减低样品粘性； 4 1 50 0 0r m i n 离心3 0m i n ，取上清于另一e p 管中； 煮沸样品5m i n 。 ( 2 ) 电泳分离 1 0 分离胶的配制( 5m 1 ) ： 3 0 丙烯酰胺 3 o m l 水 i 9 3 0 丙烯酰胺溶液 i 7 1 5 m o l l t r i s ( p h 8 8 ) 1 3 1 0 s d s0 0 5 1 0 过硫酸氨0 0 5 5 积层胶的配置( 3 m 1 ) ： 3 0 丙烯酰胺( 2 9 ：1 ) 1 5 m o lt r i s c 1 ( p n 8 8 ) 0 3 8 m i 0 5 m l 1 0 s d s3 0 p l 1 0 9 6 过硫酸铵 3 0 i i l 双蒸水 2 i m l t e m e d 3 | 1 1 蛋白样品上样量为1 5 i tg ，在积层胶中电压恒定8 0 v ，待样品进入 分离胶后电压调到1 2 0 v ，直至溴芬兰到达凝胶底部时停止电泳。 ( 3 ) 转膜 将胶浸于转移缓冲液中平衡1 0 m i n ； 依据胶的大小剪取膜和滤纸6 片，放入转移缓冲液中平衡l o m i n 。 p v d f 膜需用纯甲醇浸泡饱和3 5 秒钟； 装配转移三明治：海绵斗3 层滤纸斗胶一膜寸3 层滤纸_ 海绵， 每 层放好后，用试管赶去气泡。胶放于负极面( 黑色面) ； 四川大学硕士学位论文 将转移槽置于冰浴中，放入三明治( 黑色面对黑色面) ，加转移 缓冲液，插上电极，i o o v ，l h ( 电流约为0 3 a h 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。 ( 4 ) 免疫杂交与显色 用2 5m lt b s 洗膜5 m i n ，室温，摇动；置膜于2 5m l 封闭缓冲 液中1 h 。室温，摇动； 1 5 m lt b s t 洗3 次( 5 m i n 次) ；加入l ：1 0 0 0 稀释的一抗，4 。c 孵育过夜，缓慢摇动； 1 5m lt b s t 洗3 次( 5m i n 次) ；加入1 ：3 0 0 0 稀释的辣根过 氧化酶( h r p ) 标记的二抗，室温孵育1 h ，缓慢摇动； 1 5m lt b s t 洗3 次( 5m i n 次) ；1 5m lt b s 洗1 次； 用化学发光试剂盒显色，显色后的p v d f 膜扫描保存。 2 5 带有增强型绿色荧光蛋白腺病毒空载体的扩增与感染细胞 腺病毒具有较高的细胞感染率与较小的细胞毒性，实验选用带有增 强型绿色荧光蛋白腺病毒空载体感染标记人骨髓间充质干细胞。 ( 1 ) 腺病毒的扩增；用腺病毒感染a d 2 9 3 细胞，培养感染病毒的a d 2 9 3 细胞，收集细胞后，反复冻融细胞4 次，离心后，收集病毒上清， 分装冻存病毒。测定病毒滴度。 ( 2 ) 感染人骨髓间充质干细胞：接种的h m s c s 长到铺满瓶底的5 0 时， 按照病毒数：细胞数= 1 0 ：l ，感染细胞，6 h 后除去含病毒培养基， 培养2 4 h 后，再次感染，重复感染两次。 ( 3 ) 感染率的计算：第二次感染细胞后，培养2 4 h ，消化后的细胞在 普通光学显微镜与荧光显微镜下进行细胞计数，计算出绿色荧光 细胞的百分率即为感染率。 1 6 四川大学硕士学位论文 3 实验结果 3 1 人骨髓间充质干细胞的原代培养 骨髓分离的单核细胞经过2 4 h 的培养，有部分细胞开始出芽并开始 贴壁，7 2 h 后，贴壁的细胞开始增多，细胞呈多边形或梭形( 图1 - - 1 ) 。 培养到第7 d 开始形成细胞克隆( 图1 2 ) ，到1 4 d 时，细胞克隆逐渐增 大，细胞形态多以成纤维样细胞为主( 图1 - - 3 ) ，到1 5 1 8 d 时，细胞 克隆之间开始连在一起，细胞排列呈现多中心的漩涡状( 图1 4 ) 。经 过两次传代培养，细胞形态呈均一的长梭形，当细胞铺满瓶底时，细胞 排列呈漩涡状( 图2 ) 。细胞能保持此特性到1 0 代以上。细胞在培养到 第二代时，部分冻存备用。 1 1 ( 2 0 0 )1 2 ( 1 0 0 ) 1 3 ( 1 0 0 x )l 一4 ( 1 0 0 x ) 图1 人间充质干细胞的原代培养 ( 1 - 1 ) ：接种后列，细胞贴壁后呈多边形或梭形；