（细胞生物学专业论文）新型探针原位延伸基因芯片的构建研究.pdf

目录 幽i ijjijf j f i i i r l f fr l l j j i j i r lrrll l f f l f l l l y 1 7 6 1 11 1 9 f l a i l 4 i i i i i12iiii19ll i i l l 一、摘要 中文论著摘要“1 英文论著摘要4 二、英文缩略语8 三、论文 前f 言9 刚舌 材料与方法1 0 实验结果1 3 讨论2 3 结论“2 5 四、本研究创新性的自我评价2 6 五、参考文献2 7 六、附录 综j 苤2 8 致 射4 1 个人简介4 2 新型探针原位延伸基因芯片的构建研究 翮罱 基因芯片技术自上世纪末诞生以来，取得迅速发展，并已广泛应用到了基因 表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断 和预测、遗传病相关基因分析、药物筛选、基因测序、基因调控网络分析等多个 领域。尽管所有的d n a 微阵列都是基丁核酸链的杂交，但就这种设计间的不同却 也产生了较大结果差异。目前的基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、 样品制备、杂交反应和结果分析，而绝大多数的基因芯片仅杂交反应又出现两个 甚至多个步骤，因此常规芯片复杂性较高，使得基因芯片的可操作性差、特异性 不高。本实验室利用h b v 基因分型实验开发出一种新型的探针原位延伸基因芯片 以提高检测的可操作性、准确性、特异性及高效性。 随着h b v 基因分型方法的不断发展，目前主要有四种分型方法：1 全基因 序列测定2 s 基因序列测定3 p c r - r f l p 分析法4 单克隆抗体e l i s a 基因型 分型法，其中测序方法是鉴定基因型的金标准。但不论是利用全基因序列，还是 利用s 基因序列分型，均不可避免面临大量序列测定的实际困难，其它传统方法 也因操作复杂并且不适合变异的h b v 检测而具有一定的局限性，而近年发展起来 的基因芯片则可对h b v 分型进行高通量、平行化、自动化检测。该技术将事先设 计好的大量h b v 探针同时固定于支持物上，通过单一的杂交试验就可以完全分 型，并能对大量基因同时进行检测。但是，传统的基因芯片方法存在其特异性不 高，操作复杂，对于单个基因的改变检测能力差等弱点，在临床应用上也存在一 定的限制。 本研究构建了一种新型的基因分型方法。其原理在于当p c r 引物的3 端碱基 与模板碱基出现错配时，p c r 反应将不会进行，根据这一原理，将基因型特异的 探针固定到芯片上，并且在芯片上进行p c r 反应，下游引物带有荧光信号，然后 检测芯片上的荧光信号来达到分型的目的。利用此种方法杂交反应一步完成降低 了常规芯片的操作复杂性，提高了检测的特异性，并可以对单个基因的突变进行 检测，为进行s n p 分析打下基础。 由于h b v 基因型与该病的地域分布、临床疾病谱、治疗方案及预后判断都有 一定相关性，所以开发简便、有效的基因分型方法有很大的实用价值。目前国内 对基因芯片的报道诸多，但尚没有成熟的h b v 芯片应用到临床，并且我国的基因 型研究开展较少，现有的报道其结果也并不完全一致，所以本研究将基因芯片技 术与p c r 技术结合，利用h b v 全基因型分型实验构建一种新型基因芯片。 实验方法 一、实验材料 含h b v 血清样本( 由沈阳市第六人民医院肝病研究室提供) h b v 特异基因片段( a h 亚型) ( 由本实验室筛选合成) 原位延伸基因芯片盒( 本实验室自行设计) 特异性粘合剂( 7 0 3 硅胶粘合剂) 感受态j m l 0 9 菌，p m d 1 8 t 质粒，r t a q 酶 限制性内切酶e c o r i 、n c o i ，v e n t r - - ( e x o 一) d n a 聚合酶 质粒提取试剂盒、p c r 产物切胶回收试剂盒 p c r 扩增仪( b i o m e t r ap e r s o n a lp c rs y s t e m ，g e r m a n y ) 生物芯片点样仪( m i c r og r i n di i6 0 0 ，b i o r o b t i c sl t d ，e n g l a n d ) 荧光图像扫描仪( g e n et a c t ml si v ，g e n o m i cs o l u t i o n si n c u s a ) 空气变温p c r 扩增仪( 实验室自制) 二、实验方法 l 、在n c b i 数据库中收集a h 八种基因型h b v 的全基因组序列。利用生物 信息学软件进行分析比对，筛选出分型位点。 2 、根据选择的位点设计探针及引物，并且分析其特异性。 3 、由含h b v 血清中提取病毒d n a 样本，测序，并通过生物信息学确定其 亚型。 4 、制备基因芯片：处理片基，按预先设计好的微阵列点阵使用生物芯片点样 仪将探针点到芯片上，水化，烘烤固定并且与基因芯片盒组装备用。 2 1 、利用血清中提取的d n a 样本与相应探针在液相及原位延伸芯片盒中反应 寻找最佳反应条件。 2 、s o e i n g 法制备包含分型碱基位点的a h 亚型特异核酸片段作为扩增模板 优化反应程序，并对芯片结果进行分析。 3 、把芯片结果与测序结果做对照分析芯片探针的特异性、准确性并多次试验 验证其重复性。 馇里 宝口木 1 、筛选并设计出了与其他细菌、病毒等无同源性的高度优化的分型相关引物 及探针。 。 2 、通过血清d n a 与探针的液相反应验证了探针的捕获能力及准确性。 3 、优化了部分亚型与探针特异结合的反应条件。 4 、h b v 基因的芯片分型结果与测序结果一致，证实了芯片的可靠性。 5 、简化了常规基因芯片的操作步骤，实现了单碱基差异的检测。 6 、多次实验结果一致证实了芯片良好的重复性。 结论匀j匕 1 、新型探针原位延伸基因芯片通过初步验证具有良好的可行性和可操作性。 2 、设计专门用于该基因芯片的空气变温p c r 扩增仪及原位延伸基因芯片盒， 能够简化常规基因芯片的操作繁琐性。 3 、s o e i n g 法构造的特异性h b v 基因片段能够代替h b v 病毒各亚型充当模 板用于基因分型实验。 4 、因芯片能够实现单碱基差异的检测。 关键词 基因芯片原位延伸h b v基因分型 3 英文论著摘要 r e s e a r c ho fc o n s t r u c t i n gt h en e wd n ac h i p s ： n u c l e o t i d ep r o b e se x t e n di ns i t u i n t r o d u c t i o n g e n ec h i pt e c h n o l o g ya c h i e v e dr a p i dd e v e l o p m e n ts i n c et h et u r no fl a s tc e n t u r y f r o mi t sb e g i n n i n ga n dh a sb e e nw i d e l ya p p l i e dt og e n ee x p r e s s i o na n a l y s i s ，t h en e w g e n ed i s c o v e r y , g e n em u t a t i o na n dp o l y m o r p h i s ma n a l y s i s a n dg e n o m i cl i b r a r y m a p p i n g ，d i s e a s ed i a g n o s i sa n dp r o g n o s i s ，d r u gs c r e e n i n g ，g e n es e q u e n c i n ga n d o t h e r f i e l d s ，s i n c ei t si n c e p t i o ni n19 9 5 e v e nt h o u g ha l l o ft h ed n am i c r o a r r a y sa r e h y b r i d i z a t i o n b a s e dn u c l e i ca c i dc h a i n ，b u ta st h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h i sd e s i g nh a s a l s op r o d u c e dal a r g ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h er e s u l t s t h ec u r r e n tg e n ec h i pt e c h n o l o g y m a i n l yc o n s i s t so ff o u rm a i ns t e p s ：c h i pp r e p a r a t i o n ，s a m p l ep r e p a r a t i o n ，h y b r i d i z a t i o n r e a c t i o na n dt h er e s u l t so fa n a l y s i s ，t h ev a s tm a j o r i t yo fg e n ec h i ph y b r i d i z a t i o no n l y a p p e a r e ds t e p st w oo rm o r e ，s ot h eh i g h e rt h ec o m p l e x i t yo fc o n v e n t i o n a lc h i p s ， m a k i n gg e n ec h i p so p e r a b i l i t yp o o rs p e c i f i c i t yi s n o t1 1 i 出w eu s e dh b vg e n o t y p i n g e x p e r i m e n t st od e v e l o pa n e we x t e n s i o no ft h ep r o b ei ns i t ud e t e c t i o no fg e n ec h i p st o e n h a n c et h eo p e r a b i l i t y , a c c u r a c y , s p e c i f i c i t ya n de f f i c i e n c y h b v g e n o t y p i n gm e t h o dw i t ht h ec o n t i n u o u sd e v e l o p m e n ta n d n o wt h e r ea r ef o u r m a i ns u b - t y p e s ：1 w h o l e - g e n o m es e q u e n c i n g2 sg e n es e q u e n c i n g3 p c r - r f l p a n a l y s i s4 m o n o c l o n a ia n t i b o d ye l i s ag e n o t y p i n gm e t h o d ，i n w h i c hs e q u e n c i n gi st h e g o l ds t a n d a r dm e t h o df o ri d e n t i f i c a t i o no fg e n o t y p e b u tr e g a r d l e s so f t h eu s eo fw h o l e g e n o m es e q u e n c e s ，o rt h eu s eo fsg e n es e q u e n c et y p i n g ，a r ei n e v i t a b l yf a c e dw i t ha l a r g en u m b e ro fp r a c t i c a ld i f f i c u l t i e si ns e q u e n c i n g ，a n do t h e rt r a d i t i o n a lm e t h o d sd u e t oc o m p l i c a t e dt oo p e r a t e ，a n da r en o ts u i t a b l ef o rd e t e c t i o no fh b v v a r i a n tw h i c hh a s c e r t a i nl i m i t a t i o n s ，b u ti nr e c e n ty e a r st h eg e n ec h i pc a nb ed e v e l o p e df o rh b v g e n o t y p i n gh i g h - t h r o u g h p u t ，p a r a l l e la n da u t o m a t e dt e s t i n g t h et e c h n o l o g yw i l lb ea 4 1 l a r g en u m b e ro fh b vp r e - d e s i g n e dp r o b ef i x e do nt h es u p p o r tm a t e r i a la tt h es a m e t i m e ，t h r o u g has i n g l eh y b r i d i z a t i o ne x p e r i m e n tc a l lb ec o m p l e t e l ys u b t y p e ，a n dc a n d e t e c tal a r g en u m b e ro fg e n e sa tt h es a m et i m e h o w e v e r , t h e r ei st h et r a d i t i o n a l m e t h o do fg e n ec h i pa n di t ss p e c i f i c i t yi sn o th i g h ，c o m p l i c a t e do p e r a t i o n ，f o ras i n g l e g e n e t i ca l t e r a t i o na n dp o o rd e t e c t i o nw e a k n e s s e s ，i nc l i n i c a la p p l i c a t i o n s ，t h e r ea r ea l s o c e r t a i nr e s t r i c t i o n s w ec o n s t r u c t e dan e w g e n o t y p i n gm e t h o d t h ep r i n c i p l ei st h a tw h e np c r p r i m e r s 3 e n dm i s m a t c h ，p c rr e a c t i o nw i l ln o tb ec a r r i e do u t ，a c c o r d i n gt ot h i sp r i n c i p l e ，t h e g e n o t y p e s p e c i f i cp r o b e sf i x e dt o t h ec h i pa n dt h ec h i po nt h ep c rr e a c t i o nw i t h p r i m e r sp 2f l u o r e s c e n c es i g n a l ，a n dt h e nd e t e c t i n gt h ef l u o r e s c e n c es i g n a lo n ac h i pt o a c h i e v et h ep u r p o s eo fc l a s s i f i c a t i o n h y b r i d i z a t i o nu s i n gt h i sm e t h o do n es t e pt o c o m p l e t et h eo p e r a t i o nt or e d u c et h ec o m p l e x i t yo fc o n v e n t i o n a lc h i p s i n c r e a s et h e s p e c i f i c i t yo fd e t e c t i o n , a n ds i n g l eg e n em u t a t i o n sc a nb ed e t e c t e d ，i no r d e r t ol a yt h e f o u n d a t i o nf o rs n p a n a l y s i s a st h eh b vg e n o t y p ea n dt h eg e o g r a p h i c a ld i s t r i b u t i o no ft h ed i s e a s e ，c l i n i c a l d i s e a s es p e c t r u m ，t r e a t m e n to p t i o n sa n dp r o g n o s i sh a v es o m er e l e v a n c e ，s od e v e l o p s i m p l ea n de f f e c t i v eg e n o t y p i n gm e t h o dh a sg r e a tp r a c t i c a l v a l u e c u r r e n t l ym a n y r e p o r t so fg e n ec h i p s ，b u tn o ty e tm a t u r eh b vc h i pa p p l i e d t ot h ec l i n i c a la n dg e n o t y p e s t u d i e s ，f e w e ro fo u rc o u n t r y , t h ee x i s t i n gr e p o r t i n g i t sr e s u l t sa r en o tc o m p l e t e l y i d e n t i c a l ，s ot h es t u d yo fg e n e - c h i pt e c h n o l o g ya n dp c rt e c h n o l o g yc o m b i n e d t ob u i l d an e wt y p eo f h e p a t i t i sbg e n o t y p i n g m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 、m a t e r i a l s h b v c o n t a i n i n gs e r u ms a m p l e s ( f r o mt h es i x t hp e o p l e sh o s p i t a lo fs h e n y a n g l i v e rd i s e a s er e s e a r c ha v a i l a b l e ) h b v s p e c i f i cg e n ef r a g m e n t ( a - hs u b t y p e ) ( s y n t h e s i z e db y t h el a b o r a t o r y s c r e e n i n g ) i ns i t ue x t e n s i o no fg e n ec h i pb o x e s ( d e s i g n e di no u rl a b o r a t o r y ) s p e c i f i ca d h e s i v e 5 j m10 9 ，p m d - 18 t , r t a q ，e c o r l 、n c o i ，v e n t r - - ( e x o 一) d n ap o l y m e r a s e e z 10s p i nc o l u m np l a s m i dm i n i - p r e p sk i t , e zs p i nc o l u m nd n ag e l e x t r a c t i o nk i t ( s h a n g h a ib i o t e c h n o l o g y ) b i o m e t r ap e r s o n a lp c r s y s t e m ，g e r m a n y b i o c h i ps a m p l es p o t t e r m i c r og r i n di i6 0 0 ，b i o r o b t i c sl t d ，e n g l a n d f l u o r e s c e n c ei m a g es c a n n e r ( g e n et a c t ml si v g e n o m i cs o l u t i o n si n c u s a ) a i r - h e t e r o t h e r mp c ra m p l i f ys y s t e m ( s e l f - m a d eb yo u rl a b o r a t o r y ) 2 、m e t h o d s 1 t oc o l l e c tt h ee i g h tg e n o t y p e sa - ho ft h ew h o l eg e n o m es e q u e n c eo fh b vi n t h en c b id a t a b a s e t h eb i o i n f o r m a t i c ss o f t w a r ef o ra n a l y s i s ，s e l e c t e ds u b - t y p e l o c h s 2 d e p e n d i n go nt h ec h o s e ns i t ed e s i g np r o b e sa n dp r i m e r s ，a n da n a l y s i so ft h e i r s p e c i f i c i t y 3 b ye x t r a c t i n gs e r u mc o n t a i n i n gh b vv i 谢d n as a m p l e s ，s e q u e n c i n g ，a n d b i o i n f o r m a t i c st od e t e r m i n et h e i rs u b t y p e s 4 p r e p a r a t i o no fd n am i c r o a r r a y ：d e w i n g 诵t hf i l m - b a s e d ，a c c o r d i n gt o a p r e - d e s i g n e dm a t r i xu s i n gt h eb i o - c h i pm i c r o a r r a ys p o t t i n gi n s t r u m e n tw i l l p r o b ep o i n tt ot h ec h i p ，h y d r a t i o n ，b a k i n gf i x e da n d 谢t hg e n ec h i pb o x a s s e m b l yb a c k 5 t h eu s eo fd n ae x t r a c t e df r o m s e r u ms a m p l e sw i t ht h ec o r r e s p o n d i n gp r o b ei n t h el i q u i dp h a s ea n di n - s i t ur e a c t i o no fa ne x t e n s i o no fc h i pb o xt of i n dt h eb e s t r e a c t i o nc o n d i t i o n s 6 s o e i n gp r e p a r e dw i t hs u b - t y p eb a s el o c u sa hs u b t y p e - s p e c i f i cn u c l e i ca c i d f r a g m e n ta st h et e m p l a t eo p t i m i z e dr e a c t i o na m p l i f i c a t i o np r o c e d u r e ，a n d m i c r o a r r a ya n a l y s i so f 7 t h em i c r o a r r a y a n a l y s i s a n d s e q u e n c i n g r e s u l t sa sc o n t r o l c h i pp r o b e s p e c i f i c i t y , m u l t i p l et r i a l st ov a l i d a t ei t sa c c u r a c ya n dr e p e a t a b i l i t y 6 r e s u l t s 1 s c r e e n i n ga n dd e s i g nw i t ho t h e rb a c t e r i a , v i r u s e sa n do t h e rn o n - h o m o l o g yo f t h eh i g h l yo p t i m i z e ds u b - t y p er e l a t e dt op r i m e r sa n dp r o b e s 2 b yl i q u i d p h a s es e r u md n a w i t ht h ep r o b er e a c t i o nt ov e r i f yt h ec a p a b i l i t ya n d 3 4 5 6 a c c u r a c yo f t h ec a p t u r ep r o b e o p t i m i z es o m ec o m b i n a t i o no fs u b t y p e - s p e c i f i cp r o b e r e a c t i o nc o n d i t i o n s h b v g e n o t y p i n gr e s u l t so fg e n e c h i pr e s u l t sa l e c o n s i s t e n tw i t ht h es e q u e n c i n g s i m p l i f yt h es t e p s o fc o n v e n t i o n a lg e n ec h i pt oa c h i e v eas i n g l e - b a s e d i f f e r e n c e si nd e t e c t i o n 一 s e v e r a le x p e r i m e n t a lr e s u l t sc o n f i r m e dt h ec h i pag o o dr e p e a t a b i l i t y j 1 o l 0 n c l u s l o n 1 t h en e wg e n ec h i pb yi ns i t ue x t e n s i o no fap r e l i m i n a r yv e r i f i c a t i o nh a sg o o d f e a s i b i l i t ya n do p e r a b i l i t y 2 w eh a v ed e s i g n e ds p e c i f i c a l l yf o rt h eg e n ec h i p ，t h ea i rt e m p e r a t u r ec h a n g ei n s i t up c ra m p l i f i c a t i o nd e v i c e sa n de x t e n s i o no fg e n ec h i p sb o x ，c a ng r e a t l y s i m p l i f yt h et e d i o u sr o u t i n eo f t h eo p e r a t i o no fg e n ec h i p s 3 s o e i n gm e t h o du s i n gs t r u c t u r e - s p e c i f i cg e n ef r a g m e n to fh b v c o u l dr e p l a c e t h ev a r i o u ss u b t y p e so fh b vv i r u st oa c ta st e m p l a t e sf o rg e n o t y p i n g e x p e r i m e n t s 4 t h eg e n ec h i pc a nd e t e c ts i n g l e b a s ed i f f e r e n c e s k e vw o r d g e n o t y p i n g d n a m i c r o a r r a y e x t e n s i o ni ns i t uh b v 7 英文缩略语 8 论文 新型探针原位延伸基因芯片的构建研究 前言 自1 9 9 5 年斯坦福大学研制出第一块以玻片为载体的基因芯片，基因芯片技术 便开始步入了广泛的研究和应用时期，并对生命科学研究产生了巨大的推动作用。 高通量、并行化检测的特点使其在基因分型，遗传变异，致病基因的定位和遗传 病的筛查等多方面都显示出了独特的优势。 d n a 芯片能够作为一种以杂交为基础的基因分型技术。高密度微阵列能以数 十万计的有序排列的寡核苷酸序列，附着于固体表面的。目的d n a 片段首先通过 p c r 扩增，将荧光标记的核苷酸序列上，然后杂交至阵列上。每一寡核苷酸序列 在高密度微阵列中充当等位特异探针。相比较不匹配的核酸序列，完全匹配的序 列能更有效地与其相应的探针结合，产生更强的荧光信号。杂交产生的信号量通 过高分辨率荧光扫描并通过计算机软件进行分析。碱基多态性或突变，插入和删 除等d n a 的改变便能够确定下来。 然而，由于设计差异等问题使得其可靠性、重复性和灵敏性等多方面受到一 定的限制和质疑，另外如何提高芯片特异性及简化样本制备流程、操作程序规范 化等问题也已成为当今国内外作为改进研究的热点，很多人都在尝试这种技术的 更新和进一步的探索，在最近的研究中有人描述了新的标准化方法，并有效降低 了这一技术的不稳定性。 乙型肝炎病毒( h b v ) 感染是全球性的公共卫生问题，其中尤以我国为重。某 些h b v 基因的多态性影响着疾病的进展，这使得对其进行准确的分型研究显得非 常重要，目前己报道多种对其进行分型研究的方法，其中d n a 芯片技术的应用也 得到高度的认可和应用。早在2 0 0 2 年前h b v 已被分成a 至h 八个基因型。因此， 可以说目前h b v 基因型的分型研究日臻成熟。在中国，h b v 的感染率，基因型 及基因分型技术等问题也取得了很大的进展。但同时由于区域的限制，中国的 h b v 基因型仅限于b 和c 两种，为保证本实验的完整性，全面性和可靠性，本实 9 验室利用s o e i n g 法对c 亚型进行了定点突变，构建了其它目前发现的全部基因 型特异片段( 已发表) 。 综上所述，为解决和改进目前芯片的上述问题，我们拟在试验技术路线、试 验设备仪器等多方面进行了创新，利用h b v 基因分型试验进行验证，尝试构建了 核酸探针原位延伸基因芯片。 材料与方法 一、实验材料 ( 一) 实验标本 含h b v 血清样本( 由沈阳市第六人民医院肝病研究室提供) h b v 特异基因片段( a h 亚型)( 由本实验室筛选合成) ( 二) 实验材料及主要仪器 主要试剂： r t a q 酶，p m d - 1 8 t 质粒，感受态j m l 0 9 菌购于t a k a r a 公司； v e n t r 一( e x o 一) d n a 聚合酶，限制性内切酶e c o ri ，n c o i 购于n e b 公司； p c r 引物，寡核苷酸探针和阳性标志点由上海生工公司合成； 琼脂糖凝胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒购于上海生工公司。 电泳缓冲液相关：t r i s ，s d s ，甲醇，e d t a ，硼酸，h c l ，t e 等。 芯片处理相关试剂：氨基硅烷，戊二醛，n a o h ，丙酮，碳酸盐缓冲液( 0 2 m ， p h = 9 0 ) 。 主要仪器： p c r 扩增仪( b i o m e t r ap e r s o n a lp c rs y s t e m ，g e r m a n y ) 稳压稳流电泳仪( b i o r a dm i n ii i ，u s a ) 生物芯片点样仪( m i c r og r i n di i6 0 0 ，b i o r o b t i c sl t d ，e n g l a n d ) 荧光图像扫描仪( o e n et a c t ml si v 。 c m o m i cs o l u t i o n si n c u s a ) 数显电热恒温干燥箱( 2 0 2 0 。上海阳光实验仪器有限公司) 空气变温p c r 扩增仪和原位延伸基因芯片盒( 本实验室自行研制) 二、实验方法 1 0 ( 一) h b v 基因组序列信息分析 宅e n c b i 核酸数据库中分别搜索h b va h8 种基因型的全基因组序列，总长度 约为3 2 0 0 b p ，用o m i g a 2 0 软件对每种基因型进行多序列比对，获取各基因型的简 并序列( c o n s e n s u ss e q u e n c e ) 。再将不同基因型的简并序列进行比对。筛选出在 h b v 的s 基因区第2 2 8 ，2 4 4 ，2 8 8 ，3 2 4 ，3 6 0 ，4 0 3 共6 个碱基位点，通过分析这6 个位点的碱基排列组成可以初步分辨出h b v 的8 个基因型。 ( 二) 引物及探针设计 用p r i m ep r e m i e r 5 0 软件对各基因型的保守序列区域设计一对通用的引物。探 针设计原则是以找到的突变位点为3 端设计长度约为3 0 b p 的探针，合成4 条序列 一致，仅3 末端碱基不同，分别为a ，t ，c ，g 的探针作为该突变位点的特异性 探针。然后用同样的方法设计出其它检测突变位点的探针。所有探针合成均需要 5 端氨基修饰。通用引物的下游引物5 端做c y 5 荧光修饰。 ( 三) 预实验验证设计的可行性 从h b v 病人血清中利用苯酚氯仿法抽提d n a ，进行序列测定，获得其亚型 为c 亚型。将设计的相应引物及探针与之分别在液相和芯片中进行杂交试验，然 后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和芯片结果扫描，结果证实设计的可操作性和准确性； 多次进行试验重复，实验结果基本保持一致，证实了实验设计的可重复性。预实 验为下一步利用全探针阵列进行分型实验打下了基础。 ( 四) s o e i n g 法构建a h 各亚型的特异基因片段 由于目前国内乙肝患者多数为b 亚型和c 亚型病毒感染，为获得其他各序列， 并且满足芯片基因分型验证需要，通过生物信息学分析，以c 亚型为模板利用 s o e i n g 法定点突变构建a h 各亚型特异基因片段，这些基因片段将6 个特异突变 位点包含在其中，为分型提供所有需要的全部模板。 ( 五) 构建特异片段的芯片检测 1 、先期的液相p c r 验证 为了保证芯片的可行性和准确性。在进行芯片检测之前，通过常规p c r 模拟 芯片盒中的反应，以验证芯片结果。将制备出的a h8 个基因型核酸片段做为模板。 将设计好的探针作为特异引物。加入p 5 5 ，p 4 4 2 进行不对称p c r 扩增。扩增酶选用 n e b 公司的v e n t r - - ( e x o 一) d n a 聚合酶。该酶不具有3 5 外切酶活性。反应条 件为9 5 预热5m i n ，9 5 变性4 0s ，6 0 退火4 0s ，7 2 延伸1 5 s ，2 5 个循环，7 2 延伸3 m i n 。 2 、芯片检测 ( 1 ) 片基处理 取2 0 x 2 0 盖玻片，在铬硫酸溶液中浸泡2 - 4 小时，蒸馏水洗净。1 nn a o h 浸 泡9 0 分钟，d d h 2 0 冲洗3 次，每次3 分钟。丙酮洗3 分钟，浸入手臂分子溶液 ( 1 0 氨基硅烷，9 5 丙酮) 修饰1 0 分钟。取出后丙酮洗3 次，每次3 分钟，吹 干。1 0 4 烘烤固定6 0 分钟。浸入5 戊二醛溶液( p b0 0 1 m ，p h = 8 ) 过夜，洗 净( 超声3 0 秒) ，吹干，备用。 ( 2 ) 芯片盒的组装 将根据各分型碱基位点设计的寡核苷酸探针用碳酸盐缓冲液溶解至1 0 0 p m ， 置于3 8 4 孑l 板中，根据孔板的不同可以加入5 1 0 微升探针样本，样本浓度可由先期 实验摸出，本实验用4 0 u m 即可。点样，用n h 2 修饰的p 4 4 2 + ( 引物p 4 4 2 的互补序 列) 序列配成同等浓度作为阳性对照点，使用生物芯片点样仪按预先设计好的矩 阵在经过处理的片基上点样，点样后室温水化1 2 d 时，8 0 烘烤固定，备用。杂 交反应前先进行超声3 0 秒去掉表面冗余的探针，避免反应后因水洗而信号减弱。 然后将芯片用硅胶固定到自制的原位延伸基因芯片盒上备用，固定时芯片表面有 探针的一面朝内。 ( 3 ) 芯片的延伸反应 在组装好的芯片中进行反应，p c r 反应体系为特异片段模板6 1 x l ，1 0 x b u f f e r 1 0 “l ，d n t p1 0 i t l ，v e n t r - - ( e x o 一) d n a 聚合酶1 肛i 引物分别为p 5 5 ( 1 l x m 0 1 ) 5 1 x l ， p 4 4 2 ( 1 0 p m 0 1 ) 5 p l ，d d h 2 06 3j _ t l 。将总体积为8 0 p l 的混合液注入封闭好的芯片中， 用密封夹将硅胶管密封。然后置于空气变温p c r 扩增仪进行扩增。p c r 反应条件 为9 5 预热5m i n ，9 5 变性4 0s ，6 0 退火4 0s ，7 2 延f * l s s ，2 5 个循环，7 2 延伸5 m i n 。反应结束后，用1x s s c + 0 1 s d s 室温冲洗多次，再用0 1x s s c 室温冲 洗，然后用d d h 2 0 冲净，吹干后使用激光共聚焦扫描仪检测。根据各型探针平均 1 2 信号强度及点阵排列组合确定h b v 分型结果。 馇蟹 毒日禾 一、h b v 各基因型部分简并序列比对及分型碱基位点的筛选 删 c o 肼v c o 苴t v c c o 矗啪c 0 哪v e c o h w r c l 0 h o v g c a n 删i k o 唧c a n h 暑v o c o e v c c a h o v d c o e v e c 喇 冀v ，c o h h t v a c 喇 置v i 虻0 3 3 0 ，oi o 图1 ，h b v 各基因型简并序列( c o n s e n s u ss e q u e n c e s ) 比对( 部分) t a b 1b a np o i n tf o ri m l o t y p i m l 2 2 82 i l绷眈3 6 04 0 3 6ggct igtc cg gct d6g gccc bg 白，ctc rgc