（细胞生物学专业论文）人脐血间充质干细胞饲养层对造血干祖细胞扩增的支持及其向软骨细胞方向的诱导.pdf

浙江大学硕士学位论文 人脐血间充质干细胞饲养层对造血干祖细胞扩增的支 持及其向软骨细胞方向的诱导 中文摘要 脐血作为一种可替代的造血干细胞的来源，可重建骨髓造血及免疫，对重建 患者的短期造血功能和长期造血功能具有显著作用，另外，脐血来源广泛，采集 方便，所以近年来有关脐血移植的研究越来越广泛。然而，脐血的数量有限，因 此，脐血干祖细胞的高效体外扩增是一项具有很高临床应用价值的研究。 骨髓是成人造血干祖细胞的主要发源地，其中的间充质样细胞为造血干祖 细胞的增殖和分化提供了良好的微环境，这可能与其能合成和分泌多种造血正、 负调控因子( 细胞因子和粘附因子) 等有关。因此，目前许多实验室在体外扩增 培养造血干祖细胞时，应用骨髓基质细胞或间充质干细胞为饲养层，与造血干 祖细胞共培养，以此提高造血干祖细胞的扩增效率。本研究从脐血中培养出类 似于骨髓基质或间充质干细胞的脐血间充质干细胞，对这种细胞进行形态学观 察，利用流式细胞仪对其进行表面抗原的测定，并且以其为饲养层，结合外源生 长因子，建立共培养体系，体外扩增脐血造血干祖细胞，研究来自脐血的间充 质干细胞饲养层对脐血造血干祖细胞的支持作用。同时，体外诱导脐血间充质 干细胞向成软骨细胞方向分化，检测软骨细胞特有的i i 型胶原m r n a 表达，研究 脐血间充质干细胞的分化特性。 从脐血中分离、培养出贴壁细胞，培养2 周后开始形成纤维状细胞，3 0d 后 全部铺层。全部铺层后，部分贴壁细胞利用流式细胞仪鉴定c d l 4 阴性，c d l 3 、 c d l 6 6 、c d 2 9 阳性，初步推断被鉴定的从脐血中培养出的纤维状贴壁细胞具有 骨髓间充质干细胞的特性，并以此作饲养层以扩增培养脐血造血干祖细胞。脐 血问充质干细胞培养中的最适接神密度约为2 1 0 6 个细胞m l 。 以密度为1 0 7 7 9 m 1 的f i c o l l 分离液从人脐血中分离出单个核细胞( m n c ) ， 分离的单个核细胞一半用于单个核细胞扩增培养，一半用于分选c d 3 4 + 细胞。 c d 3 4 + 细胞分离采用吸附单克隆抗体磁珠分离系统( m a c s ，m i l t e n y i b i o t e c h ， 浙江大学硕士学位论文 i n c ) 。用以脐血贴壁细胞做饲养层加外源细胞因子所建立的共培养体系与仅用 外源细胞因子的培养体系相比较，其单个核细胞和c d 3 4 + 细胞扩增效率分别提高 了2 0 9 倍和2 9 4 倍，并且前者扩增出的细胞比后者具有更高的g e m f c f c 形成 潜能。根据脐血造血干祖细胞生长曲线，在培养后的1 4 天，达到扩增数的最高 峰，以后将逐渐下降。 用t g f b1 和维生素c 诱导体外脐血间充质干细胞两周后，甲苯胺蓝染色 显示诱导细胞的细胞浆内含有大量异染颗粒；用r t p c r 证明m s c s 表达成软骨细 胞特异的i i 型前胶原m r n a ，说明培养的细胞具有向软骨细胞分化的潜能，由此 进一步证实从脐血中培养出的贴壁细胞具有骨髓间充质干细胞的特性，故称脐血 间充质干细胞。 关键词脐血间充质干细胞，培养，扩增，诱导，t g f b1 ，软骨细胞 浙江大学硕士学位论文 h u c b d e r i v e d m e s e n c h y m a l s t e mc e l lf e e d e r l a y e r f o r s u p p o r t i n g e xv i v o e x p a n s i o n o fh s p c s a n di t sc h o n d r o g e n i ci n d u c t i o n h u m a nu m b i l i c a lc o r db l o o d ( h u c b ) ，a sar e p l a c e a b l es o u r c eo f h e m a t o p o i e t i c s t e m c e i l s ，c o u i d b eu s e dt or e c o n s m l c tb o n em a r r o w ( b m ) h e m a t o p o i e s i sa n d i m m u n i t y ，t h eh e m a t o p o i e t i cs t e 叫p r o g e n i t o rc e l l s ( h p s c s ) 硒mc o r db l o o d h a v e o b v i o u se 矗e c t so nr e c o n s t n l c t i o no f h e m a t 叩o i e t i c m c t i o no fs h o r tt i m ea n dl o n g t i m eo f t h ep a t i e n t sa f t e rc h e m o t h e r a p y h p s c sa l s oh a v e 廿l em u l t i p o t e n t i a l i 妙f o r d i f f e r e n t i a t i o n ：i na d d i t i o n ，h u m a n 啪b i l i c a 王c o r db l o o dh a sar i c hr e s o u r c ea n di s c o n v e n i e n tt o c o l l e c t t h e r e f o r e ，t h e r e i sm u c ha t t e n t i o n恤t h e s t u d y o f t 捌1 s p l a n t a t i o no fh u m a nu m b i l i c a l c o r db l o o di nt 1 1 er e c e n t y e a r s a 1 1 de xv i v o e x p a n s i o n o fh s p c si sh i 啦i yv a i u a b l ei nc l i n i ca p p l i c 撕o n b m d e r i v e dm e s e n c h y m a ls t e mc e l l sa r ec r a d l eo f h e m a t o p o i c t i cs t e m p r o g e n i t o r c e l l s t 1 1 ea d h e r e i nc e l lf e e d e rl a y e rc o n s i s t e do f b m - d e 矗v e dm e s e n c h y m a ls 坝nc e l l s p r o v i d et h em i c r o e n v i r o m e mf o rm a i n t e n a n c e ，p r o l i f 孤i o na n dd i f ! f b r e m i a t i o no f h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s t 虹si sp r o b a _ b l yd u e t om e s y l l 也e s i sa n d e x c r e t i o no fm a n y s o r t so fp o s i t i v ea n dn e g a t i v e r e g m a t o r yf 矗c t o r s o fh e m a t o p o i e s i s ( c y t o k i n ea n d a d h e s i o nm 0 1 e c u l e ) t h e r e f o r e ，m a n yl a b sn o w a d a y sa r eu s i n gb m _ d e m e ds t r o m a l c e i l so r m e s e n c h ”n a l s 把mc e l l st oe s t a b l i s ha d h e r e n tc e l l 触d e r l a y e r s a n d c o c u l t u r e d w i 血h e m a t o p o i e t i cs t e m 巾r o g e m t o r c e l l st oi n c r e a s em ee x p a n s i o n e m c i e n c yo fh e m a t o p o i e t i cs t e 州p r o g e n i t o rc e l l s n l e r ca r ep r i i n i t i v ec e l l si nh u c b s i m i l a rt os t r o m a lc e l l so rm e s e n c h y r n a ls t e mc e l l s 肺mb m 1 1 1 i ss 机d yi n d i c a t e dm a t a na d h e r e n ts t r o m a l l a y e r 的mh u c bc o u l db ee s t a b l i s h e dw i 血s p e c i 矗cl o n g - t e 咖 c u l t u r ec o n d i t i o n s w ec o n f i n i lm et y p eo fc e l l s b y 也em o r p h o l o g i c a l a 工l d i m m u n o p h e n o t y p i c a l c h a r a c t e r i s t i c so fh u c b - d e r i v e dm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s b e s i d e s ，h u c b d o r i v e dm e s e n c h y m a is 把mc e i j sw e r eu s e da sa d h e 嘲1 fc e j j 盎e d e r 4 浙江大学硕士学位论文 l a y e rt os u p p o r te xv i v oe x p a n s i o no fh s p c s w ee v a i u a t e dt h ea b i l i t yo fh u c b s t r o m a lc e l i st of 。m 1a 向n c t i o n a lf e e d e rl a y e ra n dt o s u p p o r th e m a t o p o i e s i so v e ra i o n g - p e r i o dc u l t u r e ， i na g r o p i n g f b ran e wa p p r o a c ho fe xv i v o e x p a n s i o n o f h u c b - d e 打v e d ( h s p c s ) t h e n ， h u c b - d e r j v e d m e s e n c h y m a l s t e mc e 儿sw e r e i n d u c e dt of b n n c h o n d r o c y t e ， a n dt h e e x p r e s s i o n o fa n i c u l a r c a n i l a g e m a t r i x - p r o c o l l a g e n i im r n aw a se x a m i n e dt ou r l d e r s t a l l dm e b i o i o g i c a l a n d d i f k r e n t i a t i o nc h a r a c t e r i s t i co fh u c b d e r i v e d m e s e n c h y m a ls t e m c e l l s h u c b d e r i v e dm e s e n c h y m a ls t e mc e l l sw e r ei s o l a t e d 孤dc u l t u r e d t w ow e e k s l a t e r ，n u m e r o u sf l b m b l a s t l i k ec e l l sc o u l db eo b s e r v e d s u b s e q u e m l y ，t h e yf o r m e d c o l o 士l i e s ，a n dt h e ne x p a n d e d b yt h ee n do f 廿l ef o u n h 、e e k ，ah o m o g e n e o u sl a y e ro f 舶r o b l a s t o i dc e l l so c c u p i e dt h ew h o l eb o t t l es 曲c e w h e nm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s 、v e f e c o n n u e n t ，s o m e o fp a r a l l e lc u l t u r e sw e r es a c r i f i c e df o r a n a l y s i s o ff l o w c y t o m e t r fo t h e r c u i t u r e sw e r eu s e da st l l ec e l l 南e d e r j a y e r st oc u l t u r eh u c b d e r i v e d h s p c s f l o wc ”o m e t r ya n a l y s i si r l d i c a t e dm a th u c b d e r i v e dm e s e n c h y m a ls t e m c e l l sw e r eu n i v e r s a l l yp o s i t i v ef o rc d l 3 ，c d l 6 6a n dc d 2 9 ，a 1 1 dn e g a t i v ef o rc d l 4 i tc a nb ei n f e r r e dt h a th u c b d e r i v e d 肋r o b l a s t i cm e s e n c h y m a ls t c mc e l l ss h o w c dt h e c h a r a c t e r i s t i c so fm s c sf r o mb o n em a r r o wi ti sp r o p e rf o rt h ec e l l sp l a t e da t 山e d e n s i t y o f 2 1 0 6 m l f o r p r o p a g a l i o n l o w d e n s i t ym n c s f r o mh u c bw e r ei s o l a t e db yf i c o l ld e n s i t yc e n t r i f u g a t i o n m n c sf r o mt h eg r a d i e n ti n t e r f a c ew e r ec o l l e c t e da n dw 鹋h e dm r e et i m e si ni m d m a n dt h e nh a l fo f t h em o n o n u c l e a rc e l l s ( m n c s ) w 酷r e s u s p e n d e di nc u i t u r em e d i u m c d 3 4 + c e l l sw e r ei s o l a t e df r o mt h eo 血c rh a l fo f 1 em n c sp r e p a m t i o n sl l s i n ga m a c s l a b o r a t o r ys e p a r a t i o ns y s t e m ( m i l t e n ) r ib i o t e c ，b e 唱i s c hg l a d b a c h ，g e h n a n y ) a c c o r d i n g t ot h em a n u f a c t u r e r si n s 旬m c t i o n s m n c si n 也ec u l t i l r e s y s 把m 、v i t l l m e s e n c h y m a ls t e mc e l lf c e d e rl a y e r h a da n c x p a n s i o n o f2 0 9 - f o l dh i 曲e rt 1 1 a n 也a ti n t b ec u n u r es y s t e mw j t b o u tm e s e n c h y m a ls t e mc e l lf e e d e rl a y e r ，c d 3 4 + c e l li n t l l e c u l t u r es y s t e mw i t 王lm e s e n c h y m a ls t e mc e l lf e e d e rl a y e rh a d a n e x p a n s i o n o f2 9 4 一f 0 1 d h i g h e rt h a n 血a ti nt h ec u l t u r es y s t e m 、i 也o u tm e s e n c h y m a ls t e mc e uf e e d e r1 a y e r e x p a n d e dc e l l si nn l ec u l t i 】s y s t e mw i 也m e s e n c l y m 8 ls t e mc e l lf e e d e rl a y e rh a d h i g h e rp o t e n t i a l so fg e m m c f c f 0 锄a 土i o n 也吼t l l o s ei nt h ec u l t u r es y s t e m 、v i m o u t 5 浙江大学硕士学位论文 人脐血间充质干细胞饲养层对造血干祖细胞扩增的支 持及其向软骨细胞方向的诱导 前言 有效造血是造血干祖细胞和为造血干祖细胞维持和扩增提供必要生长因 子的支持基质两者相互作用的结果。脐血含有丰富的造血干祖细脆，自从1 9 8 8 年法国的g 1 u c k m a n 利用脐带血成功地治疗了1 例f a n c o n i 贫血的患儿以来， 脐血造血干细胞的医疗价值已逐步为人们所认识。目前，全世界已有1 0 0 0 多例脐 血移植的病例，我国也有近2 0 例。与骨髓移植相比，脐血具有来源丰富、采集方 便的特点，尤其是脐血中成熟t 细胞含量很少，所以允许一定程度内的h l a 不匹 配，在移植中较少发生移植物抗宿主病( g v h d ) “1 ，作为移植来源具有很多优势， 为骨髓移植提供了造血于祖细胞新的来源。“。但一般单份脐血的体积在 4 0 一1 0 0 m l ，其数量通常只能满足体重不大于3 0 k g 的儿童的移植，而大儿童或成 人应用因数量不足而受到很大限制。因此，脐血造血干祖细胞的高效体外扩增 是一项具有很高临床应用价值的研究。 造血干细胞自我复制的同时，分化为特定的造血前体细胞，向各种血细胞分 化“3 ，通过用基质细胞饲养层并结合外源细胞因子的体外共培养体系，可模拟 体内的造血微环境，不仅达到了扩增造血于祖细胞数量的目的，而且可更为有 效地缓解其功能丧失。“。因此，近年来许多研究者建立了模拟体内造血微环境 的基质细胞层或间充质干细胞层，希望能够促进造血干祖细胞的体外扩增，同 时调节其分化速率。r o s l e r 等”3 应用猪脑微血管内皮细胞建立基质细胞层，同时 应用s c f 、f l t 3 一l 、i l 一6 、g m c s f 组合进行脐血c d 3 4 细胞扩增的研究。结果显 示，有基质细胞层的扩增效果明显优于对照组。应用此共培养体系扩增狒狒骨髓 的c d 3 4 + 细胞，第l o 天细胞总数、c d 3 4 + 细胞、c f u g m 和c a f c 分别扩增了1 4 2 2 倍、4 5 倍、3 4 倍和1 2 1 7 倍，并成功地进行了自体移植。也有研究显 示：，应用非接触的基质细胞体系，并结合f l t 3 一l ，t p 0 及s c f ，同样可以扩增 脐血c d 3 4 + 细胞。王金福等咖以入骨髓间充质干细胞做饲养层，加入r h s c f ， 浙江大学硕士学位论文 r h g c s f 和r h m g d f 后，采取阶段扩增方法培养来自脐带血的单个核细胞和c d 3 4 细胞，并用无骨髓间充质干细胞的非共培养体系做对照。扩增的结果表明，与非 共培养体系相比较，单个核细胞扩增效率提高了约228倍，cd34+细胞的扩增效 率提高了约179倍，在单个核细胞扩增中gmcfc和hppcfc的扩增效率分别提 高了约l ，7 l 倍和1 。3 8 倍，c d 3 4 + 细胞扩增中g m c f c 和h p p c f c 的扩增效率分别 提高了约1 4 6 倍和1 + 5 4 倍。 向分化潜能的组织干细胞，呈纤维样，表达sh 2 、sh 3 、s h 4 、as ma、ma b 1470、cd1 3 、cd2 9 、cd 4 9 e ，这与骨髓间充质干细胞完全一致，在体外 具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力“川。虽然在脐血中这种细胞比较少， 但引起排斥反应低，能够向非间充质类细胞分化“，可以借此 虽然对于脐血 贴壁细胞的一些生长机理和定向分化机制的研究尚处于初级阶段，但是通过从脐 血中得到该种细胞“0 1 使得从脐血中寻找人的间充质干细胞的替代来源成为可能， 脐血可能作为间充质干细胞的来源之一来供给实验的和临床的需要。 本实验从脐血中培养出类似于骨髓来源的间充质干细胞的贴壁细胞，对这种 细胞 x 浙江大学硕士学位论文 4 t d l 一4 0 b 水平离心沉淀器 j 低速水平离心机 6 高速冷冻离心机 7 s u b c e k kg t 电泳仪 8 y j 1 4 5 0 医用净化工作台 9 ，e p i c s x l 流式细胞仪 1 0 电热手提压力蒸汽消毒器 1 1 ，自动双重纯水蒸馏器 1 2 i c y c l e r 基因扩增仪 上海安亭科学仪器厂 上海安亭科学仪器厂 h e r a e u s 公司 美国b i o r a d 公司 苏州医疗器械七厂 c o u l t e r 公司 上海医用核子仪器厂 上海玻璃仪器一厂 美国b i o r a d 公司 4 实验试剂的配制： 1 i m d m 培养液： l o gi m d m 干粉，溶解于双蒸水中，定容前加3 4 2 9n a h c o 。调节p h 值，定容 至1 0 0 0 m l ，用o 2 2um 的微孔滤器过滤除菌，4 保存。 2 ，1 6 4 0 培养液： 1 0 4 9r p m i1 6 4 0 干粉，溶解于双蒸水中，定容前加2 o gn a h c o 。调节p h 值， 定容至1 0 0 0 m l ，用o 2 2um 的微孔滤器过滤除菌，4 保存。 3 p b s 溶液： k c lo 2 9 ，k h ：p 0 40 2 9 ，n a c l8 0 9 ，n a 2 h p 矾2 9 4 9 ，充分溶解后， 加双蒸水至1 0 0 0 m l 。高压蒸汽1 5 磅灭菌2 0 分钟。4 保存。 4 g l n 母液( 2 0 0 【i m ) ：称取2 9 2 2 9g l n 溶于1 0 0 m l 双蒸水中，溶解后用0 2 2um 的微孔滤器过滤除菌，分装，一2 0 保存。 5 消化液： n a c l 8 0 9 ， k c l 0 4 9 ，葡萄糖1 o g ， n a h c o ：，0 5 8 9 ， e d t a 0 2 9 ，胰蛋自酶0 5 9 溶于双蒸水中，定容至1 l ，用0 2 2um 的微孔滤器过滤除菌，分装小瓶，于4 保存。 6 1 6 4 0 完全培养基： 1 6 4 0 培养液：8 8 ；f b s ：1 0 ；双抗：1 ；g 1 n ：1 7 i m d m 完全培养基： 浙江大学硕士学位论文 i m 肼培养液：7 7 ：f b s ：2 0 ；2 巯基乙醇：】；氢化可的松丁二酸钠f 琥珀酸 钠1 ：1 ：g l n ：1 8 2 3 甲基纤维素： 4 6 94 0 0 0 m p as 甲基纤维素干粉，放入2 5 0 m l 血浆瓶中，加双蒸水1 0 0 m l 旋紧瓶盖，高压灭菌3 0 分钟，冷至3 7 ，加入双倍浓度i m d m 培养液1 0 0t l ，反 复摇晃震荡大约i 小时，混匀后4 保存。 9 d e m e 培养液： l o gd m e m 干粉，溶解于双蒸水中，定容前加3 7 9n a h c o 。调节p h 值，定容 至1 0 0 0 m 1 ，用o 2 2um 的微孔滤器过滤除菌，4 保存。 l o 软骨细胞诱导液： i m d m 完全培养液，1 0 0 u m 1 青霉素，1 0 0 9 m 1 链霉素，t g f b 。1 0 n g 吡，抗 坏血酸5 0ug m l 。 二、实验方法 1 脐血闻充质干细胞饲养层的建立及其形态学： 取脐血在室温下2 5 0 g 离心l o 分钟，离心后用裂解缓冲液裂解红细胞，2 5 0 g 离心l om i n ，弃上清。用i m d m 悬浮后2 5 0 g 离心7 蕊n 洗涤细胞，然后 以2 1 0 6 个细胞m l 的接种密度接种于含有2 0 f b s 、5 0 u m 的2 巯基乙醇、1 “m 氢化可的松丁二酸钠( 琥珀酸钠) 、 2m m o 忆谷氨酰氨的i m d m 完全培养 基中，置于3 7 、5 c 0 2 的培养箱内进行培养，每周半量换液1 次，去除非 贴壁细胞。培养1 4d 后开始形成纤维状贴壁细胞，3 0d 后全部铺层。全部铺层 后，部分培养瓶中的纤维状细胞用作免疫组化分析，其余用作饲养层以扩增培养 脐血造血干祖细胞。 2 脐血间充质干细胞的最适接种密度 依步骤2 分离得到的细胞，以如下密度( 1 0 6 个细胞m 1 ) ：o 6 、0 7 、0 8 、 o ，9 、1 o 、2 0 、3 o 、4 ，o 、5 0 、6 o 接种于2 4 孔板里，倒置显微镜下观察脐 血贴壁细胞的形态，以及贴壁情况，以寻找最适合细胞贴壁的接种密度，使用的 是同一批号的血清。 1 2 浙江大学硕士学位论文 3 ，不同类型的培养基对脐血间充质干细胞的贴壁、生长的影响 从同一脐血样品中分离到的脐血贴壁细胞，以2 x1 0 6 m l 接种于2 4 孔板中， 分别用d m e m l g ，d m e m h g ，om e m ，i m d m ，1 6 4 0 ，f 1 2 完全培养基进行培养，每种 培养基接种3 孔，倒置显微镜下观察脐血贴壁细胞的形态，以及贴壁、增殖情况。 五种培养基使用的是同一批号的血清。 4 脐血间充质干细胞的表面抗原鉴定 取一部分纤维状贴壁细胞，用磷酸盐缓冲液( p b s ) 洗涤3 次，并用胰蛋白 酶消化液消化成单细胞悬液。用结合有p e 或f i t c 的鼠抗人单克隆抗体( m a b s ) 标记，这些抗体包括抗c d l 6 6 一p e 、抗c d 2 9 一f i t c 、抗c d l 4 一f i t c 、抗c d l 3 一p e ( b e c k m a n c o u l t e r 公司) 。每种单克隆抗体标记的细胞数为1 1 0 6 ，标记前细 胞用p b s 洗涤，加入相应的抗体后置于室温下3 0m i n ，再进行流式细胞仪检测。 检测结果用软件v e r e s i o n 3 1 进行分析。 5 脐血造血干祖细胞的分离 脐血样品在采集后2 4h 内室温下2 0 0 0r m i n 1 离心l o m i n ，离心后的细胞 用裂解缓冲液裂解红细胞后，沉淀用p b s 重新混匀，缓慢加入到相对密度为 1 0 7 7 9 m 1 的f i c o l l 分离液上，4 5 0 g 离心3 5 m i n ，收集单个核细胞层，洗涤 后悬浮在培养基中，记数细胞后备用。 脐血中分离的单个核细胞一半用于单个核细胞扩增培养，半用于分选 c d 3 4 + 细胞。c d 3 4 + 细胞分离采用吸附单克隆抗体一磁珠分离系统( m a c s ，m i l t e n y i b i o t e c h ，i n c ) 。每1 o 1 0 8 个细胞悬浮于0 5 lm a c s 缓冲液中，加5 0pl 偶联于磁珠的鼠抗人c d 3 4 抗体和5 0ulf c r 封闭剂( b l o c k i n gr e a g e n t ) ，4 孵育3 0m i n ，洗涤1 遍后悬浮于o 5m l 的m a c s 缓冲液，然后加入固定于高 强度磁场中的m i n i m a c s 吸附柱中进行分离。 6 细胞因子i l 一3 和f l 对造血干祖细胞的扩增支持 将分离得到的细胞悬浮于1 6 4 0 培养液中，用移液管吹打均匀后，分为4 组：a 浙江大学硕士学位论文 为在不添加任何细胞因子的1 6 4 0 培养基中培养，作为空白对照，b 为添加1 0 0 n g m l 的i l 一3 ，c 为添加1 0 0 n g 讯l 的f l ，d 为添加l o o n g m l 的i l 一3 和l o o n g m l 的f l ，每 组复种3 孔，每孔含i m i 缅胞悬液，在3 7 ，含j c 虢的培养箱中培养；第7 、9 、 1 4 天对各组的细胞分别进行计数，将细胞扩增情况录入附表，并半量换液，即弃 去原培养系统中一半的培养液，再按原有比例补足培养基和细胞因子。 7 脐血间充质干细胞饲养层对造血干祖细胞的扩增支持体系 扩增培养液为i m d m 培养基，并添加2 0 f b s 、5 0 p m 的2 巯基乙醇、1 “m 氢化可的松丁二酸钠( 琥珀酸钠) 、2m m o l 几谷氨酰氨，以及相应的外源细胞因 子s c f ( 1 0 0 n m 1 ) ，t p o ( 1 n g ，m 1 ) ，g m c s f ( 2 5n m l ) 。扩增实验分为a 和b 两组：a 组为用扩增培养液进行体外扩增培养( 非共培养体系) ，b 组为上 述细胞饲养层加扩增培养液进行体外扩增培养( 共培养体系) 。单个核细胞和 c d 3 4 + 细胞分别以6 2 5 1 0 5 个细胞n 正和7 3 5 x 1 0 4 个细胞皿i 的接种密度种植 到上述培养体系中，每组实验重复3 次，置于3 7 、5 c 0 2 的培养箱内培养， 每周换液2 次，每次半量换液，并计数细胞。 8 造血干祖细胞的g e 捌一c f c 扩增检测 脐血贴壁细胞饲养层对造血干祖细胞的扩增前后均取出部分细胞，用含 2 3 甲基纤维素的i m d m 半固体培养体系在3 5c m 培养皿中进行培养，分析 g e m m c f c 的形成。培养体系中加有3 0 的f b s ，1 0 m o l 几的巯基乙醇、3 的谷 氨酰氨，细胞因子s c f ( 5 0n g m l ) 、g m c s f ( 1 0n g m l ) 、i l 一3 ( 1 0n g 札) 、 t p 0 ( 5 0n g m l ) 。单个核细胞的培养密度为1 1 0 个细胞m l 和1 1 0 8 个细胞m l ， c d 3 4 + 细胞的培养密度为1 1 0 4 个细胞m l 和l 1 0 5 个细胞l l 。每个实验重复3 次。细胞置于3 7 、5 e 侥的培养箱内培养1 4d 后，记数g e 删一c f c 集落总数。 9 成软骨细胞的诱导 选生长良好的脐血间充质干细胞，待细胞达到8 0 一9 0 融合后，加入成软骨细 胞的诱导液，每隔三天换液一次，倒景显微镜下观察，1 4 天后终止诱导。 1 4 浙江大学硕士学位论文 诱导后细胞的甲苯胺蓝染色 终止诱导后，用p b s ( p h = 7 2 ) 洗3 次，每次l m i n ，用预冷的丙酮固定细胞 l j m i n ，蒸馏水冲洗3 次，滴加1 0 9 l 的甲苯胺蓝染液至将细胞浸没，染色2 4 小时，加入体积分数9 j 酒精，洗去多余的染液，分色后，观察拍照。 诱导后细胞的i i 型前胶元m r n a 的表达 终止诱导后，取其中3 样本用胰蛋白酶消化液消化制成单细胞悬液，细胞总 数分别为2 0 1 0 7 、1 5 1 0 7 、1 o 1 0 7 ，另取3 样本未用诱导液诱导用常规培 养液培养的细胞为对照组，同上消化制成单细胞悬液，分别提取总r n a ，设计i i 型前胶元的引物序列，c o l ( i i ) 上游：57 一t t ca g ct a tg g ag a tg a ca a tc 一3 7 ，下游：5 一a g ag t cc t ag a gt g ac t ga g 一3 ，产物片断4 7 5 b p ，进行r t p c r 扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测i i 型前胶元m r n a 的表达。 r n a 提取步骤： 1 、按1 0 c m 2 的培养瓶底面积加入1 m 1t r i z o l 的比例加入t r i z o l 进行匀浆。 2 、4 1 2 0 0 0 r m p 离心l o m i n 。将上清转移到一洁净无r n a s e 的离心管中( r n a 存在于上清中) 。 3 、室温放置5 m i n 。每1 m l t r i z o l 加入o 2 m 1 氯仿，盖好试管，剧烈摇动 1 5 秒钟，室温温浴3 m i n ，4 1 2 0 0 0 r m p 离心1 5 m i n 。离心后混合物分成三层， 底部红色的酚一氯仿层，中间相和无色的上层水相，r n a 只存在于上层水相中。 4 、转移水相至一洁净的试管中，加o 5 m l 异丙酵沉淀r n a ，室温温浴1 0 m i n ， 4 1 2 0 0 0 r m p 离心1 0 m i n 。 5 、弃上清，用l m l7 5 的乙醇洗涤沉淀，4 1 2 0 0 0 r m p 离心5 m i n 。 6 、稍微干燥r n a 沉淀( 空气干燥5 1 0 m i n ) ，用适量的r n a s e f r e e 水溶解 r n a ，电泳检测r n a 的质量( r n a 不能彻底干燥，否则很难溶解) 。 逆转录的步骤( 按照逆转录酶试剂盒的说明书进行) c d n a 的合成反应体系 ( 1 ) 一个o 2 m l 的离心管中，混合引物，r n a 和d n t pm i x ，用d e p c 处理的水 浙江大学硕士学位论文 结果 1 脐血间充质干细胞的分离、培养及形态特征 应用红细胞裂解液裂解后将有一团白色的细胞附于试管底部( 细胞量的多少 依分离的脐血量而定) ，离心洗涤，以2 1 0 6 个细胞l 的接种密度接种于含有 2 0 f b s 的i m d m 完全培养基中，在倒置相差显微镜下4 d 观察发现，部分细胞贴 壁，贴壁的细胞大部分为圆形，椭圆形，有少数伸出突起的细胞，培养1 4 d 后， 可观测到一些纤维状细胞，随后它们形成克隆，并逐渐扩张。在3 0d 后，纤维 状细胞占据了整个培养瓶的表面( 见图1 ) ，细胞相互汇合可达到8 0 的生 长表面，此时的脐血间充质干细胞呈较均一的长梭形，形态类似于骨髓间充质干 细胞，但较骨髓间充质干细胞稍小，通过更换培养液，逐渐除去未贴壁的细胞。 图l 脐血闻充质干细胞的形态( 培养3 0d 1 0 0 ) 2 脐血间充质干细胞的最适接种密度 细胞以不同密度接种于2 4 孔板中，并于倒置显微镜下进行观察。结果发现， 以o 6 o 9 1 0 6 个细胞m 1 的密度接种后，细胞贴壁稀疏甚至不贴，间距大，生长 缓慢，随培养时间的延长，贴壁的细胞都从细胞瓶底脱落下来。以密度为2 o 1 8 浙江大学硕士学位论文 1 0 6 个细胞m l 接种时，细胞活性好，生长旺盛，形态为有规则的束状。密度在4 l o “m l 及其以上时，细胞生长拥挤，培养基消耗快，短时间内变黄，虽有大量 细胞贴壁，但细胞贴壁不牢固。在频繁的换液过程中，大部分贴霞嚣龄裂嚣辨疑 髓耐。毹抟职豫：鲤型蒙铝蜊基释鬻嚣蕊磊薛终s 4 毒 。弄辨芭弱 出 划黛 鬻篱黼鬏捌簧| j 嚣c t i o nb u f f e r 4ul 1 0 m m4d n t pm i x2 ul r i b o nu c l e a s ei n h i b i t o r 2 0h d e i on i z e dw a t e r ( n u c l e a s ef r e e )至1 9pl 与3 7 下温浴5 m i n ，添加2 0 0 u 的逆转录酶。将上述混合物短暂离心混匀后 立即放于4 2 反应6 0 m i n 合成c d n a 。 ( 5 ) 应完成后，立即放于7 0 1 0 m i n ，灭活逆转录酶。 ( 6 ) 合成的c d n a 第一链于2 0 保存备用。 c o l la g e ni ic d n a 的p c r 扫增 p c r 反应体系：( 总体积5 0u1 ) 反应成分 1 0 p c rb u f f e r 2 m md n t pm i x 引物l ( 1 0 m ) 引物2 ( 1 0 u m ) t a qd n a 多聚酶 模板d n a 浙江大学硕士学位论文 c d l 3c d 2 9 c d l 6 6 c d l 4 图2 流式细胞仅检测脐血问充质干细胞表面标记物的结果 5 脐血造血干祖细胞的分离： 应用f i c o l l 液( 1 0 7 7 9 m 1 ) 密度梯度离心( 4 5 0 9 3 0 m i n ) 从脐血中分离 单个核细胞，离心后可见有明显的4 层。从上到下依次为：血小板层，白膜层， f i c o l l 层，红细胞层。其中自膜层为单个核细胞层，分离出来后，离心洗涤， 悬浮于培养液中，用于单个核细胞扩增培养和c d 3 4 + 细胞分选。采用吸附单克隆 抗体一磁珠分离系统( m a c s ，m i l t e n y ib i o t e c h ，i n c ) 分离得c d 3 4 + 细胞后， 进行扩增培养。 6 细胞因子i l 一3 和f l 对造血干祖细胞的扩增支持 分别在第7 、9 和1 4 天对扩增的单个核细胞和c d 3 4 + 细胞进行取样，并计细 胞总数，其结果如图3 所示。 浙江大学硕士学位论文 1 0 _ b 8 粪 6 掣 d 器 土 蜒。 妊 么 0 0 d7 d9 d1 4 d ( a ) 单个核细胞培养的有核细胞的扩增 p 1 4 d ) 3 九2 5 o 更 2 耋1 5 羹 1 忙0 5 0 + a 组 + b 组 + c 组 一d 组 + a 组 + b 组 + c 组 + d 组 0 d7 d9 d1 4 d ( b ) c d 3 4 + 细胞培养的有核细胞的扩增 ( 0 1 4 d ) 图3 在细胞因子i l 一3 和f l 下造血干祖细胞的扩增动态 7 脐血间充质干细胞饲养层对造血干祖细胞的扩增支持 分别在第7 、9 和1 4 天对扩增的单个核细胞和c d 3 4 + 细胞进行取样，并计细胞 总数，其结果如图3 所示。 浙江大学硕士学位论文 色 一 蠹 暮 哥 燮 - 窿 3 5 0 3 0 0 乙2 5 0 姜2 0 0 星 羹1 5 0 1 0 0 5 0 o o 7 91 4 扩增时间d ( a ) 单个核细胞培养的有核细胞的扩增( 0 一1 4 d ) 扩增时间，d ( b ) c d 3 4 + 细胞培养的有核细胞的扩增 ( o 1 4 d ) 1 4 图4 两种培养体系下脐血造血干祖细胞的扩增动态 一一共培养体系，一一非共培养体系 在共培养体系中，有核细胞扩增的速度明显大于非共培养体系( p o 叭) ：单 个核细胞扩增培养中，共培养体系比非共培养体系提高了2 0 9 倍；c d 3 4 + 细胞扩 增培养中，共培养体系比非共培养体系提高了2 9 4 倍( 见表1 ) 。通过对比可以 看出，来自脐血的细胞饲养层对c d 3 4 + 细胞扩增的支持作用要大于对单个核细胞 如印印加0 l r ，l l 浙江大学硕士学位论文 扩增的支持作用( p o 0 1 ) 。 表l 单个核细胞和c d 3 4 细胞培养中有核细胞的扩增 8 造血干祖细胞g e 埘一c f c 的形态观察及扩增分析 扩增前后的细胞接种在含2 3 甲基纤维素的i m d m 半固体培养体系中进行培 养。培养第7 d ，在倒置相差显微镜下可观察到细胞混合集落；第1 4 一1 8 d 达到高 峰，呈致密或较分散的细胞团( 见图4 ) ，大小与b f u e 集落相似。大多数的集 落中心为有血红蛋白形成的细胞团，少数