（细胞生物学专业论文）核仁磷酸蛋白b23在调控微管动力学的功能.pdf

摘要 摘要 核仁磷酸蛋白( b 2 3 ) 是一种多功能的磷酸蛋白，它主要定位于细胞核内， 并且快速的穿梭于细胞核和细胞质之间。目前对于b 2 3 的研究主要集中在细胞 核内它对细胞周期和增值调控，关于b 2 3 在胞质内对微管的调控研究还知之甚 少。 微管是由微管蛋白的异二聚体构成的管状空间网架结构，它是维持细胞结 构和细胞行使各种生理功能的基础结构。细胞对微管的效调控极其精细和复杂 生物学过程，微管动力学主要分为两种状态：一种是增长，另一种是解聚，这 两种状态的互换是快速并且随机的。微管由长聚合态解聚成短的解聚态的过程 叫做c a t a s t r o p h e ；由解聚态聚合成长聚合态的过程叫做r e s c u e 。这两种过程 ( 增长解聚) 受到各种因子的调控，促进细胞解聚的因子叫做解聚因子，行使相 反作用的因子是聚合因子。 本文主要研究核仁磷酸蛋白( b 2 3 ) 调控微管的动力学过程。我们发现作为 一种微管稳定因子，b 2 3 可以调控微管的动力学过程，并且通过抑制其下游解 聚因子的从而保护微管解聚。 通过解聚态聚合态微管分离实验，我们发现b 2 3 的敲除使细胞内的聚合态 微管量下降，并且这种解聚不受微管聚合药物紫杉醇的恢复。我们发现，通过 同时敲除b 2 3 下游微管解聚因子e 9 5 可以恢复由b 2 3 敲除引起的微管解聚，这 就说明b 2 3 调控微管是依赖于e 9 5 的解聚功能的。我们通过体内免疫共沉淀发 现b 2 3 可以和e 9 5 结合，并且这种结合是直接的蛋白质相互作用。我们进一步 通过体外偶联一酶活实验证明b 2 3 可以直接通过抑制e 9 5 的水解酶活抑制微管解 聚。 通过以上实验结果，我们证明了b 2 3 也是一个重要的微管调控因子，并且 这种对微管的调控依赖于下游微管解聚因子e 9 5 。 关键词：微管动力学，核仁磷酸蛋白( b 2 3 ) ，a t p a s e 酶活，微管解聚因子 a b s t r a c t a b s t r a c t n p m ( a l s ok n o w na sb 2 3 ) i sam u l t i f u n c t i o n a lp h o s p h o p r o t e i nt h a ts h u t t l e s r a p i d l yb e t w e e nt h en u c l e u sa n dt h ec y t o p l a s m b 2 3p r o v o k e sc e l lp r o l i f e r a t i o na n d t r a n s f o r m a t i o n ，d e s p i t ei t sw e l l s t u d i e df u n c t i o n si n s i d et h en u c l e u s ，t h ef u n c t i o n a l r o l eo fb 2 3i nt h ec y t o p l a s mr e m a i n se l u s i v e m i c r o t u b u l e sw a sm a d eu po ft u b u l i n h e t e r o d i m e r s ，i t i st h es t r u c t u r a l f o u n d a t i o nf o ra l lk i n d so fc e l l u l a re v e n t s t h er e g u l a t o r ym e c h a n i s m su n d e r l y i n g m i c r o t u b u l ed y n a m i c sw e r ei n t r i c a t ea n dp r o f i c i e n t m i c r o t u b u l ed y n a m i c se x i s t si n t w os t a t e s ，e i t h e rs h r i n k i n go rg r o w i n g t h ep r o c e s so fg r o w i n gf r o ms h o r tm t si n t o l o n g e rm t s i so f t e nr e f e r r e da sr e s c u e ，a n dl o s i n gl e n g t hi sc a l l e dc a t a s t r o p h e t h e s e t w os t a t e sw e r er e g u l a t e db yv a r i o u sc e l l u l a rf a c t o r s ，a n dt h o s ef a c t o r sw e r e c a t e g o r i z e di n t ot w oc l a s s e sb a s e do nt h e i rf u n c t i o n ，e i t h e rc a t a s t r o p h ef a c t o r so r r e s c u ef a c t o r s t h i sw o r kw a sm a i n l yf o c u s e do nt h em t sp r o t e c t i v er o l e so fn p m w e c a t e g o r i z en p m a sam t sr e s c u ef a c t o ra n dn p m r e g u l a t em t sm a i n l yb yi n h i b i t i n g i t sd o w n s t r e a me f f e c t o r s ，s u c ha sc a t a s t r o p h ek i n e s i n s t h r o u g hs o l u b l e s t a b l ef r a c t i o n a la s s a y s ，w ed i s c o v e r e dk n o c k i n gd o w no fn p m l e a d st os i g n i f i c a n tm t sc a t a s t r o p h ei nm a m m a l i a nc e l l s ；t h i sk i n do fc a t a s t r o p h ec a n n o tb er e s c u e db ym t - p o l y m e r i z i n gd r u gt a x 0 1 w eh a v ea l s of o u n dt h a tb y k n o c k i n gd o w ne 9 5a tt h es a i n et i m ec o u l dr e c o v e rt h em t sc a t a s t r o p h ec a u s e db y e l i m i n a t i n gn p m ；t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ee f f e c to fn p m o nm i c r o t u b u l e i sd e p e n d e n to ne 9 5 b yc o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n , w ef o u n dn p mi n t e r a c tw i t he 9 5 i nv i v o ，a n dt h r o u g ht h i si n t e r a c t i o n ，n p mi n h i b i t e se 9 5 sa b i l i t yt oh y d r o l y z ea t p , t h u sp r o t e c t i n gm t sf r o mc a t a s t r o p h e c o l l e c t i v e l y , w ed e m o n s t r a t e dt h a tb 2 3i si n d e e da ni m p o r t a n tm tr e g u l a t o r y f a c t o ra n di t sm t - p r o t e c t i v ee f f e c ti sm a i n l yd e p e n d e n to ni n h i b i t i n gc a t a s t r o p h e e 9 5 k e yw o r d s ：m i c r o t u b u l ed y n a m i c s ，n u c l e o p h o s m i n e b 2 3 ，a t p a s e ，m i c r o t u b u l e d e p o l y m e r i z i n gf a c t o r i i 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或 撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作 了明确的说明。 作者签名： 签字日期：k ! ! 磊西】! 立 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学 拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构 送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入中 国学位论文全文数据库等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 岫公开 口保密( 年) 作者签名：二害专址 导师签名：圣望：垫一一 签字日期： k 山通触签字日期：乎“辅j 习 第1 章绪论 1 1 引言 第1 章绪论 细胞骨架( c y t o s k e l e t o n ) 是指真核细胞中的蛋白纤维网络结构，作为生物 体基本单位的细胞，其多种多样的生理功能，如细胞形态的改变和维持，细胞内 物质运输，内吞外排，细胞分裂的无不伴随着各种形式的运动。不仅这些形式的 运动需要细胞骨架系统的参与，而且细胞骨架还对各种细胞器乃至某些大分子 ( 酶和受体) 进行空间组织安排的统一基质，是能量转换的主要场所。它通过自 己的活跃变化及功能参与细胞外信号向核的( 基因) 对整个细胞活动的调节。 细胞骨架分为三种类型的蛋白质纤维，即微丝( m i c r o f i l a m e n t ，m f ) ，微管 ( m i c r o t u b u l e ，m t ) 及中间纤维( i n t e r m e d i a t ef i l a m e n t ，i f ) 。它们分别由不同蛋 白质以不同方式组装成不同直径的纤维。由于本人的研究只涉及微管和微丝，中 间纤维在此不做介绍。 1 2 细胞骨架系统概述 1 2 1 微丝( m i c r o f i l a m e n t ，) 微丝是专门指由肌动蛋白( a c t i n ) 组成的纤维状蛋白结构，直径约为7 n m 的 纤维。肌动蛋白所有的真核细胞都含有的一种蛋白，一个细胞内微丝的总长可达 微管的3 0 倍。微丝表现出独特的结构状态与其他一些微丝相关结合蛋白能与肌 动蛋白相互作用是相关的，这些蛋白使微丝能够执行及其多样的功能，包括收缩 和非收缩功能。 构成微丝的基本成分是肌动蛋白。其分子量在4 3 k d 左右。微丝蛋白具有三 种异构体，即仪，p 和y 肌动蛋白。高等的脊椎动物都含有这三种异构体。由肌动 蛋白单体的亚单位组成的螺旋状纤维既是微丝，每个肌动蛋白分子都具有极性且 每3 7 n m 拧成一圈，所以当它们头尾相连接装配成纤维后，整个微丝也是具有极 性的。每个肌动蛋白分子是接近球形的g a c t i n 构成，肌动蛋白都是从同一个祖 先基因进化来蛋白质可以说是一种进化上及其保守的蛋白。然而从另一个方面 说，在同一个细胞中不同的肌动蛋白是由一组基因编码的，并且在它们的一级氨 基酸序列上可能有微小的不同。比如在肌肉细胞和非肌肉细胞中的肌动蛋白是不 同基因的产物，他们会在不同细胞过程中即使行使类似的功能，但是由于参与不 第1 章绪论 同细胞过程可能表现出功能上的差别。 “1 嘿器尸“9o r “o ( g a b u l a “r a 。c ) “ p m l y m e d z e da c t l nm i c r o f i l ar n t 122 微丝相关蛋白 f i g u r e1 肌动蛋白及微丝 微丝相关蛋白决定着微丝行使的功能，其中主要有以下几大家族：肌球蛋白 ( m y o s i n ) 是占肌肉总蛋白量的一半的一种马达蛋白，相对分子质量为4 5 0 x 1 0 3 ， 含有4 条多肽链，包括2 条重链和2 条轻链。两股重链盘绕成双股d 螺旋，长约 4 0 h m ，直径2 r i m 。因为可用蛋白水解酶将肌球蛋白分子切断，我们用胰蛋白酶处 理产生的轻酶解肌球蛋白( i i g mm e r o m y o s i n ，l m m ) 和重酶解肌球蛋白( h e a v y m e m m y o s i n ，h m m ) 柬确定其分子结构。肌球蛋白大约有十七种家族成员在肌 肉中主要成员是肌球蛋白i 和肌球蛋白l i 。其中在肌肉中为肌球蛋白i i ( m y o s i n i i ) ，主要功能是参与肌丝收缩。肌球蛋白i i 可以受到多钟调控研究发现在肌 球蛋白i i 头部和尾部有许多可以被磷酸化的位点，每个头部均有肌动蛋白及a t p 酶结合部位，具有a t p 酶活性，可利用水解a t p 的能量朝肌动蛋白纤维丝的正端 移动。肌球蛋白尾部朝向中央，而头部朝向两端聚合成双极纤维，头部具有水解 酶活，可以水解a t p 在微丝上行走。为了可以发挥其收缩功能，肌球蛋白1 i 的三 级结构存在两种结构状态，一种是伸展状态能形成双极纤维：另一种是弯曲状态 为了能收缩微丝。弯曲状态的轻链可以在c a 2 + 依赖的肌球蛋白轻链激酶作用下 呈现伸展状态，并且促进多个肌球蛋白分子平行交错排列，形成应力。 原肌球蛋白( t r o p o m y o s i n ，t m ) 也是一种微丝相关蛋白，占收缩蛋白的1 0 ，是由2 条平行的多肤链形成的a 一螺旋结构，长约4 0 n m ，双螺旋链彼此首尾 相接，连成更长的链，它定位于肌动蛋白纤维( m i e r o f l l a m e n t ，m f ) 的螺旋沟内。每 暑善 留帅洲 q 镊 第1 章绪论 条肌动蛋白双螺旋链均有一条原肌球蛋白积螺旋链与之缠绕结合，二者相伴而 行，且每一个原肌球蛋白分子的长度相当于7 个肌动蛋白分子并排的长度。原肌 球蛋白与肌动蛋白纤维结合后是为了调节肌球蛋白头部和肌动蛋白的结合，从而 保证肌丝收缩的循环可以重复延续。 组成微丝相关蛋白最后一个大家族的就是肌钙蛋白( t r o p o n i n ，t n ) 。肌钙蛋 白是一种特大球蛋白，由肌钙蛋白c 、肌钙蛋白i 和肌钙蛋白t3 个亚基组成的 蛋白复台物。肌钙蛋白t 为原肌球蛋白结合亚基( t r l - t ) 对原肌球蛋白具有高 度亲和力。肌钙蛋白c 又称为c a 2 + 结台亚基( t n - c ) ，能同时和4 个c a 2 + 特异性 结合，引起肌钙蛋白三级蛋白构象发生变化。还有肌钙蛋白i ( t ni n h i b i t o r ) 就是抑制亚基( t n i ) ，可以同肌动蛋白( a c t i n ) 和肌钙蛋白t 相结合，但不结合 c a 2 + 。肌钙蛋白i 可以抑制肌球蛋白头部的a t p 酶活性，并抑制肌动蛋白和肌球 蛋白头部接触，可以抑制肌丝的收缩和放松。在静l e 的肌肉中，肌钙蛋白i 和肌 钙蛋白t 形成的复合物把原肌球蛋白从正常的结合凹槽中拉出进入肌动蛋白纤 维的位置干扰了肌动蛋白纤维同肌球蛋白头部的结合。当c a 2 + 水平升高时， 原叽球蛋白结合肌钙蛋白结合4 个c a 2 + 引起t n i 释放到肌动蛋白上，使原肌球 蛋白分子滑回正常的位置，这样肌球蛋白头部可以在肌动蛋白纤维上正常运动。 每7 个球形肌动蛋白分子的长度中平均就有1 个肌钙蛋白分子和1 个原肌球蛋白 分子。 f i g u r e 2 肌球蛋白家族 釜蚤 蚤 “口口口自口o口口 一一一一一 第1 章绪论 1 2 3 微管( m i c r o t u b u l e ，m t ) 微管是存在于所有的真核细胞中的具有动力学微管蛋白聚合物，它是长的较 为坚硬而中空的蛋白管道，各种细胞亚组分可以沿着微管可以在细胞内按预定轨 道移动，并伴随着细胞结构和功能的变化。它可以迅速地在胞内某一处去组装然 后在另一处组装。它们在特殊的结构处成核，这种结构称之为微观蛋白组织中心。 微管在细胞内呈网状或束状分布，于是就形成了一个轨道系统。引导胞内运输以 及胞内膜性细胞器的定位。微管还能与微管相关蛋白共同装配成纤毛、鞭毛、基 体、中心体、纺锤体等结构，参与细胞形态的变化和维持、细胞迁移和运动以及 细胞分裂等重要生命活动。 微管可装配成单管( s i n g l e t ) 、二联管( d o u b l e t ) 和三联管( t r i p l e t ) 。 单管是由a - t u b u l i n 和p - t u b u l i n 的异二聚体头尾相互连接后形成的单管。单 管由1 3 根原纤维围成，是细胞质中主要的存在形式，分散或成束分布，其正端 是快速增长的一端，是由p 亚基构成的，负端增长较慢是由仅亚基构成的。微管 不稳定，易受低温、c a 2 + 等许多因素的影响而发生解聚。二联管由a 、b 两根单 管组成，a 管由1 3 根原纤维围成，b 管由1 0 根原纤维组成，与a 管共用3 根原 纤维，二联管主要分布于细胞表面的纤毛和鞭毛中。三联管由a 、b 、c 三根单管 组成，a 管由1 3 根原纤维围成，b 管和c 管均由1 0 根原纤维组成，与a 管和b 管一共共用6 根原纤维，三联管主要分布于中心粒以及原生生物的鞭毛和纤毛的 基体中是重要的运动结构。二联管和三联管是比较稳定的微管结构。 有些微管特异性药物在微管结构与功能研究中起重要作用，这些药物主要 有：秋水仙素( e o l c h i n e ) 、紫衫醇( t a x 0 1 ) 、长春花碱( v i n b l a s t i n e ) 和 n o c o d a z o l e 等。紫衫醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，能和微管 紧密结合防止微管蛋白亚基的解聚，加速微管蛋白的聚合作用。秋水仙素，已酰 甲基秋水仙碱和n o c o d a z o l e 能结合微管蛋白，阻断微管蛋白的聚合反应，使它 无法聚合成微管，引起微管的解聚作用。长春花碱和长春花新碱( v i n c r i s t i n e ) 同样能结合微管蛋白异二聚体亚单位，抑制它们的聚合作用。 微管主要由微管蛋白t u b u l i n 构成，真核细胞胞质中都有微管蛋白存在。微 管蛋白主要成分为q 一微管蛋白和b 一微管蛋白，约占微管总蛋白质含量( 和微管 相关蛋白) 的8 0 - 9 5 。q 一微管蛋白与b 一微管蛋白在化学性质上极为相似。 二者的分子量均为5 0 k d a 氨基酸数分别为4 5 0 个和4 4 5 个。氨基酸序列分析表明， 二者有4 2 的顺序相同，而且各种生物的微管蛋白几乎完全相同，这说明q 微 管蛋白和b 微管蛋白的基因来源于同一个祖先，并在进化过程中极为保守。 4 第1 章绪论 一 l ! 影簟乏7 、妻j j i f i g u r e 3 真核细胞微管 在细胞质中基本上投有单独游离的a 一微管蛋白或b 一微管蛋白，二者靠非共 价健结合以异二聚体的形式存在，o 一微管蛋白在下，b 一微管蛋白在上。异二聚 体是构成微管的基本亚单位，若干异二聚体亚单位首尾相接，就形成了原纤维。 由于a 一微管蛋白暴瑶在一头，b 一微管蛋白暴露在另一头，并且两种微管都具有 极性，所以连接形成的原纤维也具有极性。微管是由1 3 根大小上均匀一致的原 纤维靠非共价键排列而成，在整体上也具有极性。每一微管蛋白异二聚体上含有 二个g t p 的结合位点，微管蛋白与g t p 结合而被激活，引起分子构象变化，从而 聚合成微管， y 一微管蛋白也存在于所有的真核细胞中。虽然它不是构成微管的主要成分， 只占微管蛋白总含量的不足1 ，但却是徽管执行功能所必不可少的组分。y 微管蛋白分子量和其它两种徽管蛋白差不多，都是约为5 0 k d 大小，由4 5 5 个左 右的氨基酸构成。运用y 一微管蛋白特异性抗体标记荧光染色显示，v 一微管蛋白 定位于微管组织中心，对微管的形成、微管的数量和位置、微管极性的确定及细 胞分裂及染色体分离起重要作用。编码卜微管蛋白的基因如发生突变，可引起 细胞质微管在数量、长度上的减少和由微管组成的有丝分裂器的缺失，而且可以 强烈地抑制核分裂从而影响细胞分裂。 第l 章绪论 n - t u b u l i n 口t u b u l i n g t pt a x o t e n e f i g u r e4 微管蛋白 l2 4 微管相关蛋白 在细胞内，微管除含有。微管蛋白，b 一微管蛋白和y 一微管蛋白外，还含 有一些同微管相结合的辅助蛋白，这些蛋白质总是与微管共同参与微管的装配， 称为微管结合蛋自( m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e dp r o t e i n ，, y a p ) 。但是它们不是构 成微管壁的基本构件。微管结合蛋白有两个区域组成：一个是碱性的微管结合区 域，该结构域与微管结合，可明显加速微管的成核作用；另一个是酸性的突出区 域，以横桥的方式与其他骨架纤维相连接。微管相关蛋白的突出区域的长度决定 微管在成束时的问距大小。 微管结合蛋白在细胞中起稳定微管结构、促进微管聚合和调节微管装配的作 用。微管结合蛋白的磷酸化在控制微管蛋白的活性和细胞中的定位中起基本作 用。另外，微管结合蛋白在细胞中的分布区域不尽相同，它们执行的特殊功能也 不一样，这在神经细胞n e u r o f lc e l i s 尤为突出。 在高等生物中目前发现有几种微管结合蛋白，包括叭p l 、m a p 2 和m a p 4 三种。 此外，还有一类与微管结合的蛋白质称为t a u 蛋白。各种微管均由。一微管蛋白 b 微管蛋白异二聚体组成，所以微管的结构和功能的差异主要取决于微管结合 蛋白种类的不同。 t a u 蛋自有5 种不同的亚型，由同一基因编码，是一类低分于量( 5 5 k d a 第1 章绪论 6 2 k d a ) 的辅助蛋白，也称装饰因子，存在于神经细胞轴突中。t a u 的n 一末端和 c 一末端能形成1 8 r i m 的短臂，像发卡样结合在相邻的微管上以稳定微管。其功 能是增加微管装配的起始点和促进起始装配速度，进而促进二聚体聚合成多聚 体。另外t a u 蛋白也有控制微管延长的作用。t a u 蛋白可被钙调素激酶i i ( c a m k i i ) 、蛋白激酶a ( p k a ) 磷酸化，t a u 蛋白被蛋白激酶磷酸化后，可以减 弱它与微管蛋白的结合从而使微管聚合减弱。 微管相关蛋白( m a p ) 是_ 类高分子量( 2 0 0 k d a 3 0 0 k d a ) 的蛋白质，常见 于神经轴突和树突中。m a p l 常在微管间形成横桥，它可以控制微管的延长，但 不能使微管成束。m a p l 有三种不同的亚型：姒p 1 a 、m a p l b 和m a p l c 。m a p l c 是一 种胞质动力蛋白( d y n e i n ) ，是马达蛋白家族成员，它是由9 1 2 个亚基组成的 蛋白质复合体，具有a t p 酶活性，与轴突中逆向的物质运输有关。 微管相关蛋白2 ( m a p 2 ) 是一类高分子量( 2 0 0 k d a 3 0 0 k d a ) 的蛋白质， 虽然分子量巨大，但是是热稳定的，它存在于神经细胞的胞体和树突中。m a p 2 能在微管间以及微管与中间丝之间形成横桥。与m a p 不同，m a p 2 能使微管成束。 m a p 2 分子呈“l 形，以它的短臂结合到微管表面，短臂为微管促进装配区域 ( a s s e m b l yp r o m o t i n gd o m a i n ) ；长臂则以垂直方向从微管表面伸出，在电镜下 可显示出其表面的短纤丝。m a p 2 分子上有一些磷酸化部位，当c a m p 依赖性蛋白 质激酶( c a m p - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ) 以其调节亚基同m a p 2 长臂结合时， 可使m a p 2 磷酸化，磷酸化的m a p 2 可抑制微管装配。m a p 2 有三种不同的亚型： m a p 2 a 、m a p 2 b 和m a p 2 c 。m a p 2 a 分子量为2 7 0 k d a ，在神经元发育过程中不断增加 表达；m a p 2 b 的分子量也为2 7 0 k d a ，在神经元发育过程中的表达保持恒定；m a p 2 c 的分子量为7 0 k d a ，存在于不成熟的神经元树突中。 m a p 4 广泛存在于各种细胞( 包括神经原细胞和非神经原细胞) 中，分子量 为2 0 0 k d a 左右，在进化上具有保守性，具有高度的热稳定性。 与m a p s 不同的是，+ t i p s 微管结合蛋白专一的定位于微管的正端，它在微管 形成的控制、微管与细胞膜或动粒的连接及微管的踏车运动( t r e a dm i l l i n g ) 中起作用。它们参与各种细胞学过程如膜泡运输或者染色体分离，家族的一些成 员也参与细胞的结构变形。+ t i p s 有两个亚系：c l i p - 1 7 0 家族和e b l 家族。有实 验证明，c l i p - 1 7 0 结合到游离的微管蛋白异二聚体或寡聚体，然后通过共聚合 作用，一起结合到微管的正端。在动物细胞中，c l i p - 1 7 0 家族的调节因子也已 经发现，被称为c l i p 相关蛋白( c l i p - a s s o c i a t e dp r o t e i n s ) ，或称之为c l a s p s 。 c l a s p s 可以和整体微管结合，过量的表达会抑制其增长。它通过磷酸化来调节 与微管之间的联系。c l i p 相当于一种微管保护蛋白，可以帮助缩减的微管转变 为增长的微管。他也可以促进微管成核和微管捕获。有一些正端结合蛋白如e b l 7 第1 章绪论 结合在微管的末端可以通过调控其他家族的+ t i p s 来控制微管的定位。e b i 家族 含有三个成员，e b i ，e b 2 在各种细胞中都广泛存在，而e b 3 只在神经细胞中表 达。e b i 选择性的和松散的微管原纤维结合，帮助生长的微管末端特异性地靶向 生长。e b 3 和微管的正端结合，调控微管在神经细胞中形成长链的过程，也同时 调控p 1 4 0 c a p 的分布。p 1 4 0 c a p 进而通过控制微丝动力学来控制细胞的形态。 s t a t h m i n 是一种小分子的蛋白质，它们包括 s t a t h m i n 圣，s c g i o ( s t a t h m i n 2 ) ，s c l i p ( s t a t h m i n 3 ) ，r b 3 ( s t a t h m i n 4 ) 和它们的剪 切体r b 3 r b 3 ，它们都可以根据其磷酸化状态稳定或去稳定微管蛋白。它们都 具有一段保守的微管结合区域，并可以通过这些区域控制游离的微管进而控制微 管的组装和动力学过程。虽然大量的在细胞质中存在，在机体发育过程中， s t a t h m i n 在细胞中的定位和定量都会有改变。一分子s t a t h m i n 蛋白可以结合两 个微管蛋白异二聚体以阻止异二聚体添加到微管的末端。细胞中高活性水平的 s t a t h m i n ，会降低微管延长的速率。s t a t h m i n 的磷酸化会抑制s t a t h m i n 结合到 微管蛋白上，导致s t a t h m i n 磷酸化的信号能加速微管的延长和动力学上的不稳 定。s t a t h m i n 是重要的微管解聚分子，可以通过细胞f i l a p o d i a 和l a m e l l a p o d i a 的形成来调控细胞迁移和肿瘤转化。在果蝇中敲除s t a t h m i n 导致神经管组织的 畸形，但是只是在发育的后期才有这样的病变。s c g i o 是重要的神经细胞轴突增 长的控制因子，如果将其突变为不可磷酸化的突变体，或者直接抑制其表达，会 导致神经细胞轴突增长变慢。而s c l i p 专一性的调控神经细胞轴突的分支而不影 响其增长的习性。 总之，s t a t h m i n s 是一类可以调控细胞诸多发育层面的磷酸蛋白，它们可以 通过调控总体或者局部的微管蛋白的聚合来控制微管的动力学。 1 3 微管动力学概述 微管蛋白在细胞中以二聚体或多聚体的形式存在。根据细胞生理的需要，微 管蛋白表现聚合或解聚，形成微管的组装或去组装，从而改变微管的结构与分布。 若组装与去组装保持平衡状态，则微管维持稳定的结构。在正常生理状态下，微 管的装配总是先由一定区域开始的，该区域即称为微管组织中心( m i c r o t u b u l e o r g a n i z i n gc e n t e r ，m t o c s ) ，它包括：中心体( 动物细胞中主要的微管组织中 心，主要由y 一微管蛋白组成) 、动粒( 染色体与纺锤丝相连的部位) 、纺锤体的 极体( 真菌) 、基体( 原生动物鞭毛、纤毛) 、皮层微管射线和成膜体( 植物细胞) 等。微管组织中心决定细胞微管的极性，微管的正端指向微管组织中心，负端背 向微管组织中心。 8 量! 芏堑堡 一一 f ie n r r e5 微管鳃织中心 微管在体内的装配和去装配在时间上和空问上是高度有序的。问期细胞中， 微管与微管蛋白亚单位库处于相对平衡状态；在有丝分裂期中，微管装配和去装 配动态受细胞周期的调控而发生明显改变，胞质微管去装配，游离的微管蛋白亚 单包装配成为纷锤体；分裂束期，芨生逆向变化，纺锤体解体，微管蛋白重新装 配成胞质微管。体内微管蛋白的合成是可以自我调节的，多余的微管蛋白单体结 合于合成徽管蛋白的核糖体上，通过信号调节降解微管蛋白m r n a ，保持细胞内 部微管蛋白库的平街。 离体实验表明，微管蛋白的体外组装分为成核( n u c l e a t i o n ) 和延长 ( e l o n g a t i o n ) 两个反应，其中成核反应是微管组装的限速步骤。成核反应结束耐， 形成很短的微管，异二聚体首尾相接形成原纤维，原纤维再经过侧面增加扩展成 为片层，当片层达到1 3 根原纤维时即合拢成一段微管。然后新的异二聚体再不 断增加到微管的两端使之不断延长。 原纤维中异= 聚体亚单位重复排列具有极性使细胞内所有由微管构成的结 构也具有极性。在一定条件下，微管两个端点的装配速度不同，表现出明显的极 第1 章绪论 性。微管的端发生g t p - 微管蛋白的添加，使微管不断延长，称为正端，而在 另一端具有g d p - 微管蛋白发生解聚而使微管缩短，则为负端，微管的这种装配 方式称为踏车运动。 b a r b e de n d p o i n t e de n d g d p f i g u r e6 踏车运动，是微管组装后处于动态平衡的一种现象。即微管的总长度不变，但 结合上的二聚体从( + ) 端不断向( 一) 端推移，最后到达负端。 我们已经在上一节中提到了一系列的调控微管动力学的相关蛋白质，它们可 以通过直接或者间接的方式和微管蛋白作用，并且这些作用都是高度有序的。一 些因子可以补缺其它因子在功能上的缺失，现在面对的困难就是怎样理解诸多的 因子是怎样保持微管在各个不同时期能形成所需要的各种形态? 世界范围内的 研究正在一步一步的解释这个问题，一些分子和基因学实验室揭示了多个可以调 控微管动力学信号途径。这些信号途径在细胞发育的不同时期连续有序的控制微 管形态和功能的改变。 p 1 3 一激酶就是一个重要的信号控制途径。它可以激活a k t 和p k c 导致其下游 g s k 3 b 和m a r k 2 的抑制。这两种激酶的抑制就会进一步导致t a u ，m a p l b 和a p c 蛋白的去磷酸化，从而导致微管的稳定。c r m p 一2 的去磷酸化也能够促进微管的 聚合。p 1 3 k 可以受到各种细胞外因子的控制进而相应到下游因子，i g f - 1 就是一 种可以刺激细胞分极的细胞外因子，它就是通过激活p 1 3 k 通路的。 与p 1 3 k 通路类似，l k b l 和s a d 激酶同样也被发现具有重要的调控微管的功 1 0 第l 章绪论 能。缺少s a d 的小鼠会导致脑神经发育萎缩，类似的过量表达l k b l 可以促进微 管增长，降低l k b i 会抑制微管增长。l k b l 受到p k a 的磷酸化调控后进一步磷酸 化下游微管调控蛋白，如t a u 蛋白。增长因子b d n f 就是这一类激活p k a 的控制 因子之一。 d o c k 7 是r a c 的激活因子，它在未分化的神经细胞内可以影响r a c 一依赖的 s t a t h m i n 磷酸化，这对于神经细胞分化是至关重要的。有趣的是，r a c 也可以激 活p 1 3 k ，暗示这些调控可能存在互补的调控路径。 1 4 核仁磷酸蛋白b 2 3 研究现状 核仁磷酸蛋白b 2 3 ，或者称作n p m 。是在高等真核细胞核仁中大量存在的核 质穿梭磷酸蛋白。根据b 2 3 响应分裂刺激的上调以及在恶性增殖肿瘤中大量表 达，b 2 3 被认为是参与细胞分化，转化和增值过程中的重要蛋白。新的研究发现， b 2 3 参与更加复杂的生物学过程，它不仅抑制，也可以促进增值。人们对b 2 3 大 量兴趣集中在他的肿瘤源性，因为在急性白血病( a m l ) 病人白细胞中，b 2 3 是突 变胞质定位。虽然已经有大量证据证明n p m 参与肿瘤形成，但是其具体的机制 才被刚刚了解。 n p m 是核仁内大量存在并且高度保守的3 7 k d a 磷酸蛋白，它可以快速的穿梭 于核质之中。这种快速穿梭的能力与n p m 参与肿瘤转化具有重要关系，因为在细 胞质中定位的n p m c + 被证实与白血病相关。人们发现n p m 在核一质穿梭的过程中 参与前一核糖体颗粒的运输和核糖体合成。在紫外和低氧浓度的刺激下，n p m 可 以通过调控细胞染色倍数，d n a - 修复过程以及染色体聚合和解聚来保证细胞的基 因组稳定。 n p m 的能够具有这些功能依赖于它特定的分子的结构。n p m 拥有不同功能结 构域，其中最主要的结构就是它同时具有蛋白质和核酸伴侣结构域。事实上，n p m 属于核辅助n u c l e o p l a s m i n 蛋白家族，具有相同的n 一端保守区。体外的实验也同 时证明了n p m 能够在拥挤的细胞环境中防止蛋白聚集，同时也具有组蛋白伴侣的 功能，核小体组装等伴侣蛋白功能。 通过这些分子结构域，n p m 可以与各种分子包括：核仁分子 ( n u c l e o l i n ，f i b r i l l a r i n 和s n o r n p s ) ：有丝分裂相关因子( n u m a ，n e k 2 a ) ： 肿瘤响应分子( a r f 和p 5 3 ) 以及转录因子( i r f i ，y y i 和n f k b ) 在特定的细胞结 构区域结合。n p m 可以和d n a 以及r n a 结合，帮助r r n a 剪切成熟。同时，在响 应抑凋亡信号时，第二信使p i p 。也可以和n p m 结合。 第1 章绪论 n p m n l sn l s n u l s 【，j 【，【。，。_ _ 寡居化组虽白结台区 植酸站台区 分了伴偶区 棱酸剪蜘酶区 f ig u r e7k 刚的结构域 n f 】m 如此广泛生理功能使之同时具有原癌基因和抑癌基因的功能。临床证据 直接证明n p m 参与人类肿瘤致病过程，并且l 司时作为直肠，了宫，前列腺和食道 癌的标记分子。在某些情况下，n p m 的表达水平与肿瘤的发展相关。例如，过 量表达的n p m l 基因与膀胱癌的复发和恶化相关。此外蛋白质维分析发现n p m 作为一个雌激素调节蛋白质与雌激素一非依赖性乳腺癌相关。这表明，n p m 表达 状态与具体的病理生理相关。n p m 表达可咀导致细胞生长和增加扩散。n p m 表 达相关主要的生物效应是和肿瘤相关的细胞生长和增殖，抑制分化和凋亡。 虽然n p m 影响细胞增殖有各种机制，有证据表明，n p m个主要角色在支 持细胞的生长是基于其参与棱糖体合成。鲜明的结构特征( f i g ur e 7 ) ，核仁定位， 核质穿梭能力以及结合核酸及运输成熟前的核糖体颗粒的能力，都牵涉n p m 的 处理, f u 或组装的核糖体的能力。 n p m 过量的表达可以导致细胞增殖和生长的加快，和抑制细胞分化和凋亡。 这些都是癌症转变得表现。在受到自丝增值刺激后n p m 紧随表达，与静体的细 胞相比，癌性和快速增值细胞的n p m 表达量相对提高。其中主要原因与n p m l 基因与许多癌性转录因子的靶点有关。相反的，n p m f 凋则与细胞脱离分裂周 期和进入凋亡程序相关。有证据表明，n p m l 信使r n a 的f 调会减慢细胞蒯期 和进入有丝分裂的时间，而n p m 的上调则会降低细胞对凋亡刺擞如视黄酸的响 应。细胞的增殖量更足受n p m 基因敲除导致的n p m 核质穿梭能力抑制而降低， 虽然 j 许多机制可以解释n p m 如何调控细胞增殖其主要调控机制还是与其控 制核糖体合成相关。 第1 章绪论 。民。 瓣鬣国一嘧 jjijj = ! = 嚣器= 2 ：= =h 呷陆2 ：= 掣 f i g u r e8n p m 对中心体的调控 n p m 是重要的d n a 修复困子，n p m - - 细胞的组蛋白g a m a h 2 a x 是高度磷 酸化的，作为d n a 修复激酶a t m a t r 下游的靶点，g a m a h 2 a x 受其磷酸化调 控。同时，也有研究表明，在受到d n a 损伤后n p m 和染色质结合参与损伤修 复。 在细胞分裂时期，真核细胞的代谢和细胞结构经历非常深远的变化，这过程 受蛋白激酶的连环调控。细胞周期过程中n p m 受激酶磷酸化调控，包括c d k l l 和p 3 4 c d c 2 。在有丝分裂过程中核仁经历解聚和再聚合，很多核仁蛋白，其中也 包括n p m 从核仁穿梭致胞质。n p m 从核仁的染色体周边穿梭至细胞质的核仁 衍生聚集点( n u c l e o l u s - d e r i v e df o c in d f ) 并定位于纺锤体极点上，和n u m a 共定位。这种与有丝分裂相关的共定位受有丝分裂辙酶调控。 在细胞进入有丝分裂前，间期的染色体复制正好一次以形成两组染色质并分 裂至两极。在真核细胞中，染色体的复制受c d k 2 和c y c l i n e 调控，n e k 2 控制 其成熟。n p m 是c d k 2 一c y c l i n e 的底物，受其在染色体起始复制过程中的调控。 n p m 特异的和非复制的中心体结合，在受c d k 2 和c y c l i n e 在1 9 9 位的磷酸化 和从中心体上解聚，从而行使染色体分离。 1 5c a t a s t r o p h ek i n e s i n s 家族研究现状 最新的发现表示k i n e s i n s 家族可以直接调控微管动力学，这一发现为微管动 力学研究意义上提供了新的见解。最新的研究发现在防垂体中出现的差错可以被 k i n e s i n s 修复。对于这种修复机制，目前的研究主要集中在两个家族的k i n e s i n s ， 一个是k i nj 家族的马达蛋白，这类家族第一次是在人类细胞中发现的，但是它 的更多功能是在爪蟾中被发现的。与常规的机动蛋白不同的是k i nl 家族的马达 蛋白水解a t p 不是为了移动，而是为了解聚纺锤体微管。抑制或者过表达k i ni 第1 章绪论 家族的马达蛋白都会导致微管状态畸形。另一家族的调控微管动力学的k i n e s i n 家族蛋白就是k i p 3 家族蛋白，这一家族第次在芽殖酵母中发现。这一家族蛋 白的突变会导致在有丝分裂时出现非常长的微管蛋向，这种表型说明其去稳定蛋 白的功能。 关于这些k i n e s i n 的解聚微管的能力是怎样被控制的还知之甚少，但是通过 分析微管相关蛋白人们发现i c l 5 蛋白可以通过结合k i n l 来控制微管的聚合。同 时也有证据证明a u r o r a 激酶也可以调控k i n l ，需要这样的直接调控对于以后的 研究具有重要意义。 在非洲爪蟾中研究的m c a k x k c m l 是第一次证明k i n e s i n 蛋白除了可以水 解a t p 移动功能之外还具有解聚微管的功能。m c a k k c m l 是k i n e s i n - 1 3 家 族的成员或传统上的k i n l 家族，免疫清除x k c m l 会增加微管的稳定性和抑制 纺锤体正常的形成。x k c m l 是一种强烈的微管解聚园子，m c a k ，人类中的 x