（细胞生物学专业论文）家蚕bmice912基因的克隆与功能研究.pdf

d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e r ，sd e g r e eo f so u t h w es tu n i v e r s i t y c l o n i n ga n d f u n c t i o no fb m l c e - 9 12g e n ei nsi l k w o r m ， b o m b y xm o r i m a j o r f i e l d c e l lb i o l o g y g e n e t i co fc e l l e t l c soe l l p r o f l u c h e n g s u p e r v i s o r p r o f p a nm i n h u i c a n d i d a t e d a n h o n gz h a o c h o n g q i n g ，c h i n a a p r i l ，2 0 11 独创性声明 学位论文题目：塞蚕墅垡鲤丝基圈鲍克隆生勉能珏究 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者：冱夸警红 签字日期：，年月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：差专q 乒加， 导师签名：学位论文作者签名：鳓，加导师签名： 签字日期：纱，年占月7 日签字日期：功r 年6 月7 日 目录 目录 摘要 a b s t r a c t 第一章文献综述 i i i 1 1 细胞凋亡简述l 1 1 1 细胞凋亡的研究概况1 1 1 2 细胞凋亡的研究进展5 l - 2c a s p a s e 基因家族的研究概述5 1 2 1c a s p a s e 基因家族的研究概况。5 1 2 2 家蚕c a s p a s e 基因家族的研究进展7 1 3 c e 基因的研究概述8 1 3 1j c e 基因的结构及功能8 1 3 2 家蚕j c e 基因的研究进展9 第二章引言 2 1 研究背景1 1 2 2 研究目的和意义。l l 2 3 主要内容和技术路线1 l 2 3 1 主要内容l l 2 3 2 技术路线。1 2 第三章材料与方法 1 3 3 1 主要材料和试剂1 3 3 1 1 主要材料1 3 3 1 2 培养基及血清。1 3 3 1 3 主要仪器1 3 3 1 4 主要药品1 4 3 1 5 主要试剂的配制1 4 3 2 实验方法1 8 3 2 1 家蚕i c e 基因各剪接体的克隆及信息分析方法1 8 3 2 2b m c b 9 1 2 基因的原核表达及酶活鉴定2 2 3 2 3 占m 肥b 9 1 2 基因蚕体水平的r n a i 方法2 6 3 2 4b m c b 9 1 2 细胞水平的过表达研究方法2 8 第四章结果与分析 3 l 4 1 家蚕i c e 基因的克隆及信息分析3 1 4 1 1 砌托b 9 j 2 基因的克隆3l 4 1 2 家蚕j c e 基因剪接体圮b 5 、j c b 2 ，b m l c e 的克隆。3 2 4 1 3 家蚕i c e 基因各剪接体的信息分析3 4 4 1 4 家蚕i c e 基因在基因组上的扩增3 7 西南大学硕士学位论文 4 2 励疗j 巴酷9 - 2 基因的原核表达及酶活鉴定3 8 4 2 1b m c b 9 1 2 基因的原核表达3 8 4 2 2b m i c e 9 1 2 蛋白的酶活鉴定3 9 4 3b m c b 9 1 2 基因的功能研究。4 l 4 3 1 家蚕i c e 基因各剪接体的时空表达4 1 4 3 2b m l c e - 9 1 2 基因在家蚕细胞系b m e s w u l 中的转染4 2 4 3 3b m c b 9 1 2 基因在家蚕品种大造中r n a i 的研究4 4 第五章小结 4 5 5 1 家蚕i c e 基因的不同剪接方式4 5 5 2b m l c e - 9 1 2 基因的序列特征。4 5 5 3b m l c e - 9 1 2 蛋白的c a s p a s e 酶活性分析4 5 5 4b m j c b 9 1 2 基因的功能4 5 第六章讨论 4 7 6 1 家蚕i c e 基因各剪接体间的关系4 7 6 2b m l c e - 9 1 2 基因的作用机制推测4 8 6 3b m l c e - 9 1 2 基因与细胞凋亡4 8 6 3 1b m l c e - 9 1 2 基因在细胞水平的过表达4 8 6 3 2 砌z 圮d 9 j 2 基因在蚕体水平的干涉4 9 参考文献 硕士在读期间发表的文章 致谢 5 l 5 9 6 1 摘要 家蚕b m l c e - 9 1 2 基因的克隆与功能研究 细胞生物学专业硕士研究生赵丹红 指导老师鲁成教授 潘敏慧教授链r 碍k 一恐碍k 仪 摘要 家蚕发育过程的独特性、品系的多样性、遗传变异的多态性，使其具备成为模式生物的 良好潜质，是进行细胞凋亡等研究的理想材料。细胞凋亡是家蚕完成变态发育的重要手段， 对凋亡的研究是解析家蚕变态发育机制的重要途径。c 雏p a s e 家族在细胞凋亡中起着重要的 作用，但是家蚕中c a s p a s e 基因的相关研究仍处于初级阶段。本实验以n c b i 中提交的b m 尼p 设计特异引物，获得了该基因的一个新的剪接体b m l c e - 9 1 2 ，并对该基因进行了信息分析和 功能研究。同时，对i c e 基因4 个剪接体间关系也进行了初步探讨。结果如下： 1 b m l c e - 9 1 2 基因的克隆与序列特征 本实验克隆了b m l c e - 9 1 2 基因，序列全长9 1 2b p ，包含完整的开放阅读框( o r f ) 9 1 2b p ， 共编码3 0 3 个氨基酸，预测分子量为3 5 1k d 。将克隆的b m l c e - 9 1 2 与家蚕基因组序列进行 比对，结果表明该基因具有8 个外显子和7 个内含子。编码蛋白具有c a s p a s e 家族成员特有 的酶活性中心位点q a c r g 序列和经典的大小亚基。家蚕i c e 基因的4 个剪接体很可能是由 两个同源基因通过两种剪接方式产生的。 2 b m l c e 9 1 2 蛋白具有c a s p a s e - 1 酶活性 我们采用了c 弱p 弱e l 、c a s p a s e - 3 、c a s p a s e - 9 活性检测试剂盒对原核表达产生的b m i c e 9 1 2 目的蛋白进行酶活检测，利用紫外分光光度计测定每一份样品，对得到的4 0 5n m 的a 值数 据分析，结果表明，目的蛋白的活性在加入了c a s p a s e - 1 作用底物后催化产生的p n a 量最高。 即通过原核表达产生的b m l c e 9 1 2 蛋白具有e a s p 嬲e 1 酶活性。 3 b m l c e - 9 1 2 有抑制细胞凋亡的功能且影响家蚕翅的发育 将滞后质粒l1 8 0 h r s l 0 0 0 a 4 - b m l c e 9 1 2 s v 4 0 以一定的浓度梯度转染b m e 细胞，u v b 处 理b r n e - s w u l 细胞，正常培养2 4 h ，t u n e l 染色后，经流式细胞仪检查凋亡情况，结果显 示：转染组的细胞凋亡率为3 1 6 ，远低于对照组3 5 7 4 的凋亡率。这些变化提示，在我们 西南大学硕士学位论文 所研究的u v b 诱导转染组b m e s w u l 细胞凋亡过程中，b m l c e - 9 1 2 基因起到了明显的抑制 细胞凋亡的功能。除此之外，利用r a n i 技术，通过蚕体注射s i r n a ( b m l c e - 9 1 2 ) ，我们发 现降低b m e - 9 1 2 基因的表达，影响了干涉组蛾子翅的发育，导致翅明显变小。 关键词：家蚕；细胞凋亡；b m l c e - 9 1 2 ：r a n i u s i l k w o r mn o to n l yh a st h ep o t e n t i a lt ob e c a m eag o o dm o d e lo r g a n i s m , b u ta l s oh a sb e e nt h e i d e a lm a s t i f ft os t u d ya p o p t o s i s ，i ti sd e p e n d e n to nt h e u n i q u e n e s so f t h es i l k w o r m , s t r a i nd i v e r s i t y , g e n e t i cv a r i a t i o no ft h ep o l y m o r p h i s m a p o p t o s i si san e c e s s a r yp r o c e s sf o rs i l k w o r mt oc o m p l e t e m e t a m o r p h o s i s a n a l y s i so fa p o p t o s i si ns i l k w o r mi sa ni m p o r t a n tw a yt ou n d e r s t a n dm e c h a n i s mo f m e t a m o r p h o s i s c a s p 豳ef a m i l yp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei na p o p t o s i s ，b u tt h er e s e a r c hi ss t i l li ni t s i n f a n c y i nt h i ss t u d y ，a c c o r d i n gt ot h eb m l c eg e n e ( g e r l b a n ka c c e s s i o nn u m b e r ：a y 8 8 5 2 2 8 ) ，t h e s p e c i a lp d m e r sw e r ed e s i g n e d ，an e wn o v e li s o f o r mo fi c en a m e db m i c e - 9 1 2i so b t a i n e df r o m s i l k w o r m ，a n a l y s i st h ef u n c t i o na n di n f o r m a t i o no ft h en e wn o v e li s o f o r m a tt h es a m et i m e ，w e a n a l y s i st h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ef o u rn o v e li s o f o r m s t h er e s u l t sa r e a sf o l l o w s ： 1g e n ec l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y s i so fb m l c e - 9 1 2g e n e t h eo p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) o ft h en e wn o v e li s o f o r mc o n t a i n91 2b a s ep a i r s ，e n c o d i n g3 0 3 a m i n oa c i d s s e q u e n c ea n a l y s i so fb m l c e - 9 1 2s h o w e dt h a ti tc o n t a i n s8e x o n sa n d7i n t r o n s p r o t e i no fb m l c e - 9 1 2g e n ec o n t a i n st h es p e c i f i ca c t i v es i t es e q u e n c e sq a c r ga n dc l a s s i cl a r g e a n ds m a l ls u b u n i t sw h i c hi su n i q u ei nc a s p a s ef a m i l ym e m b e r t h et w oh o m o l o g o u sg e n e sp r o d u c e f o u rn o v e li s o f o r m so f i c ei ns i l k w o r mb yt w os p l i c i n gw a y s 2b m l c e - 9 1 2p r o t e i nh a se n z y m ea c t i v i t yo fc a s p a s e - 1 t h ea c t i v i t yo fb m i c e - 9 1 2p r o t e i no fp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nw a ss t u d i e db yc a s p 舔e 1 ， c a s p a s e - 3 ，c a s p a s e 一9a c t i v i t ya s s a y k i t d e t e r m i n a t i o no f e a c h s a m p l eu s i n g u v s p e c t r o p h o t o m e t r i c ，a n a l y s i st h ea v a l u ed a t ai n4 0 5n n l ，t h er e s u l t sm a yi n d i c a t et h a tt h ea c t i v i t y o ft h et a r g e tp r o t e i nc l e a v et h ec o l o r i m e t r i cs u b s t r a t ea e - y y a d - p n au n d e rs a t u r a t e ds u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n si nc a s p a s e - 1 t h a ti sm e a n st h a tb m l c e 一9 1 2p r o t e i nh a s 明卿ea c t i v i t yo f c a s p a s e - 1 3b n d c e - 9 1 2c a l li n h i b i ta p o p t o s i si ns i l k w o r mc e l l sa n da f f e c tt h eg r o w t ho fw i n go f s i l k w o r m ，。 i i i 西南大学硕七学位论文 w eu s el a g g e dp l a s m i dl l8 0 h r sl0 0 0 a 4 励刀胁9 ，2 - s v 4 0t ot r a n s f e c t i o nb m ec e l li nc e r t a i n c o n c e n t r a t i o n , t h e nb m e - s w u1c e l l sd e a l l e dw i t hu v b ，a f t e r2 4h o u r s ，t h ef l o wc y t o m e t r ya s s a y e x a m i n a t i o ns h o wt h a tt h ea p o p t o s i sn u m b e ro f t a n s f e c t i o nc e l l si s3 1 6 ，b u tt h ec o n t r o li s3 5 7 4 t h e s ec h a n g e ss u g g e s tt h a tb m l c e - 9 1 2c a ni n h i b i ta p o p t o s i si ns i l k w o r mc e l l s i na d d i t i o nt o ， u s i n gr a n it e c h n o l o g y , b yi n j e c t i o no fs i r n a ( b m l c e - 9 1 2 ) i n t os i l k w o r mb o d y , w ef o u n dt h a tt h e r e d u c t i o no fb m l c e - 9 1 2g e n ee x p r e s s i o n , a f f e c t i n gt h eg r o w t ho fw i n go fs i l k w o r ma n dr e s u l t i n g s m a l l e rw i n g si nr n a is i l k w o r m k e y w o r d s ：b o m b y xm o r ia p o p t o s i s b m l c e - 9 1 2r a n i i v 衰老、冗余的细胞保障自身正常生存、发育的一种机制；是一个在外部环境刺激同内部基因 调控下，细胞自发有序的死亡过程【l 】。 细胞凋亡是一个复杂的过程，从凋亡的进程上可分为凋亡起始和凋亡执行两个阶段。前 者包括凋亡因素、因子的刺激诱导，凋亡信号传递及凋亡相关基因激活等过程；后者包括凋 亡相关因子对凋亡的调控、执行和机体对凋亡小体的吞噬清除等过程。整个细胞的凋亡体系 涉及到饥饿、病毒、紫外线、过氧化氢等因素的诱导，肿瘤坏死因子、糖皮质激素、放线菌 素d 等因子的刺激【2 】；存在线粒体凋亡途径、死亡受体途径、内质网凋亡途径等3 个凋亡主 要途径 3 1 ：包括c a s p a s e 家族、b c l - 2 家族、p 5 3 、c 哪y c 、i a p 等因子的复杂作用。 1 1 1 2 细胞凋亡的特征 细胞凋亡广泛存在于真核生物细胞中，是一种特殊的生命现象，有别于细胞自噬、细胞 坏死等细胞死亡现象。 细胞发生凋亡时形态上常表现为，细胞体积皱缩，与周围的细胞连接消失，彼此脱离； 细胞膜发生外翻，磷脂酰丝氨酸由膜内翻转到膜外，且有小泡形成：细胞核消失，核膜、核 仁破碎；在细胞膜结构完整的情况下，形成包含凋亡残渣的凋亡小体f 4 】，并被周围的吞噬细 胞所吞噬等现象。细胞凋亡时生理生化的主要变化有，线粒体功能丧失，通透性改变，膜电 位消失，释放细胞色素c ：染色体的d n a 在核小体间的连接部位被内源性核酸内切酶水解， 产生的d n a 片段长度均近似为2 0 0 b p 的整倍数，其电泳图像为 d n al a d d e r ，这是细胞凋 亡的显著特征p j ；以及c a s p a s e - 3 ，7 等具有凋亡作用的因子表达量上升，活性增强等特征。 虽然细胞凋亡与自噬都属于程序性细胞死亡，有学者将凋亡称为p c di ，将自噬称为 p c di i 州，均不产生炎症效应，但仍有区别，主要表现为以下几个方面。首先，凋亡与自噬 的分子机制是不同的，在凋亡存在3 种主要途径，自噬主要有形成c v t 和自噬体的“大自噬”、 “小自噬”及分子伴侣介导的3 种自噬途径1 7 】；其次，参与其中的作用因子虽有联系但差异很 大，凋亡主要依靠c a s p a s e 家族的成员来执行，自噬则需要a 馆家族来完成嘲；再次，在形 态上凋亡具有独特的“凋亡小体”及 d n a l a d d e r 现象，自噬则会产生特殊的自噬体和c v t 泡； 最后，两者降解的物质及效力不同，一般而言细胞中的蛋白质及细胞器主要通过自噬途径降 解，而细胞核可以通过凋亡相关蛋白降解，细胞自噬在一定情况下( 如：饥饿) 是可逆转的 例，而凋亡一旦执行就无法自由逆转。 两南大学硕士学位论文 与细胞坏死相比，细胞凋亡主要有以下几个差别。首先，细胞凋亡是机体自发的细胞死 亡过程，是一种正常的现象，而坏死是细胞在致伤因素作用下的一种被动的细胞死亡过程， 是一种异常现象。其次，发生凋亡的细胞，细胞膜完整，细胞器完好，细胞核发生有规律的 降解产生“d n al a d d e r 形成“凋亡小体”，凋亡残骸由附近细胞所吞噬，无内涵物渗出及炎症 效应；发生坏死的细胞各结构均有破损，细胞核染色体无序降解，并伴有炎症效应。最后， 发生凋亡的细胞经琼脂糖凝胶电泳、荧光染色、流式细胞仪等方法检测下可以得“d n a l a d d e r 、“凋亡小体”、a p 峰等凋亡特征结果，而细胞坏死则无以上特征，多为弥散状态呈 现f l o 】。 1 1 1 3 细胞凋亡的生物学意义 生物体通过凋亡机制无害的清除衰老、冗余、病变的细胞，避免炎症的产生，保障内环 境稳定及正常生理功能的行使。因此细胞凋亡在生物体维持正常机能的进行、保障正常发育 变化、参与免疫应答等过程中起到重要的意义【1 1 】。 通过凋亡机制清除衰老的细胞，维持生理机能正常进行。在消化、循环、免疫等系统中 的诸如消化道上皮、血液、淋巴、肝脏以及皮肤等代谢率较高的组织器官中，发生凋亡的频 率特别耐1 2 1 。机体通过凋亡机制完成对衰老细胞的清除，维持新生与衰老细胞间的动态平衡， 保障组织、器官中细胞数量及生物体内环境的稳定。 依靠凋亡作用消除冗余无用的细胞，保障生物正常发育。在个体发育，尤其是变态发育 及胚胎发生、发育的过程中，通过细胞凋亡辅助机体完成组织退化或重塑。细胞凋亡是保障 生物正常发育所必需的机制。如在线虫的发育中，共有1 3 1 个细胞因凋亡而消失【1 3 】；当d r i c e ， d r o n c 等基因被干涉后将使果蝇个体发育产生突变，产生的眼部刚毛、等不正常现象【1 4 】； 蝌蚪尾和雄蛙m u l l e r 管的消失等变态发育的进行都离不开凋亡作用；凋亡也是哺乳类胚胎变 化、个体发育过程中的核心机制之一，在人胚胎发育尾芽、鳃、指厂趾间组织等冗余结构的消 失过程中，凋亡起到主要作用【l 习；脊椎动物神经系统发育过程中，近5 0 的细胞通过凋亡方 式被清除【1 6 l 。细胞凋亡也可以清除成熟个体的不正常的无用细胞，如清除大脑中无用的神经 元，维护神经系统的有效连接；许多有丝分裂后期的神经细胞通过凋亡消除多余的神经元【l ”。 由凋亡形成的残骸被周边细胞吸收利用，也为生物自身节约了大量的资源。 激活凋亡功能消灭发生病变的细胞，参与机体免疫过程。凋亡对于维持免疫系统的正常 运作十分重要，如免疫系统中t 细胞及b 细胞的产生与功能的行驶都需要凋亡机制的参与【l 引。 凋亡本身也是细胞的一种自我保护机制，凋亡相关因子具有抗氧化【1 9 1 、癌症1 2 0 等作用，如 p 5 3 2 、c m y c l 2 2 】等因子。同时细胞凋亡也是生物体防御病毒的一种机制，感染病毒的细胞将 通过凋亡方式，破坏病毒的增值环境并激活相关免疫应答，保障整体安全。如a i f 诱导的凋 亡途径对h i v 病毒致病机理具有影响1 2 3 1 ，感染杆状病毒的昆虫细胞常发生凋亡【2 4 1 。而许多病 毒在进化过程中也获得抗凋亡能力，反证了细胞凋亡在机体抗病毒侵染中发挥积极作用1 2 5 1 。 1 1 1 4 细胞凋亡的过程及主要途径 2 伤途径也能够开启死亡受体、线粒体凋亡通路【3 l 】；饥饿处理可导致线粒体途径、内质网途径 及d n a 损伤等途径的细胞凋亡。 凋亡效应阶段是凋亡相关因子活化及凋亡过程的调节阶段，是促凋亡因子与抑凋亡因子 博弈的过程。此过程包括b c l - 2 、b c l - x i , 等抑凋亡因子与b a x 、b a d 等促凋亡因子间作用， p 5 3 因子、c m y c 等因子的调节，凋亡复合体的形成及c a s p a s e 家族各因子的活化等过程【3 2 】。 当c a s p a s e - 3 、7 等凋亡执行因子完成活化并级联放大后，细胞就进入了不可逆的凋亡执 行阶段。表现为d n a 降解，线粒体等细胞器功能丧失，细胞膜外翻，细胞皱缩，凋亡小体 形成等细胞凋亡特征。 死亡受体凋亡途径是细胞外源性凋亡途径的代表【3 引。其凋亡起始阶段为外源的死亡配体 与细胞表面的死亡受体相结合，激活下游因子诱导凋亡；效应阶段是相关凋亡调节因子的作 用调控如n f - k b 对p 5 3 、c - m y c 等调节因子的活化调节；效应阶段指活化的c a s p a s e 8 对下 游c a s p a s e 3 、6 、7 等执行因子的活化及凋亡的执行过程p 4 】。当机体发生病变时杀伤性t 细 胞及巨噬细胞等产生诸如f a s l 、t n f 、t r a i l 等胞外肿瘤坏死因子超家族的配体并与相应的 死亡受体有f a s 、t n f 、d r 4 等结合，并形成三聚化的死亡受体，活化位于细胞膜内侧的死 亡结构域( d e a t hd o m a i n ，d d ) ，具有水解功能的d d 募集并活化连接蛋白f a d d ，使f a d d 的死亡效应域( d e a t he f f e e t e rd o m a i n ，d e d ) 暴露出来，并与c a s p a s e 8 前体的d e d 结合，完 成对c a s p a s e - 8 前体的募集，至此由死亡受体、连接蛋白及c a s p a s e 。8 前体形成了为死亡诱导 信号复合物( d e a t h i n d u c i n gs i g n a l i n gc o m p l e x ，d i s c ) p 习。通过该复合体完成e a s p a s e 8 前体的 自身活化，并将其释放到细胞，完成下游c a s p a s e 3 、6 、7 等的活化使凋亡过程继续进行。不 同的死亡受体的信号传导途径各有特点，f a s 介导的途径是细胞中较简单且基本的途径，涉 及到的相关因子较少。与之相比t n f r ( 肿瘤坏死因子受体) 途径比较复杂，其是最大的死 亡受体家族，包括t n f r l 、t n f r 2 两种受体其中t n f r 2 缺少d d ，当t n f r l 活化后需t r a d d 的参与完成对f a d d 的募集及活化，在t n f r 2 通路中要先与r i p 结合，激活n f k b 进而募 集f a d d 活化c a s p a s e 8 完成凋亡；同时活化的n f k b 也作用于p 5 3 、c - m y c 等因子对凋亡 具有调节作用0 6 - 3 9 1 。t r a i l 的受体分为两类功能型受体如d r 4 、d r 5 ，诱捕型受体如d c r l 、 3 两南大学硕士学位论文 d c r 2 等，诱捕型受体与功能型受体结构相近但无凋亡作用，起到对功能型受体的竞争性抑 制作用 4 0 l 。死亡受体数量大、种类多、功能复杂使细胞凋亡途径更加丰富且灵活。 线粒体是细胞生存的“动力工厂”，同时也是细胞凋亡的“燃烧室”。线粒体在凋亡过程中 扮演着重要角色，主要通过线粒体外膜通透性、膜电位变化，c y t - e 及a i f 的释放完成凋亡 作用。 当线粒体受到凋亡因子刺激，如神经酰胺、b a x 、c a ，、氧化自由基( r o s ) 及p h 值上 升时，m p t p 将持续性开放，使平时不能自由进出的物质( 分子量大于1 5 k d ) 发生自由扩 散，造成膜电位下降【4 1 】；同时大量胞质成分涌入线粒体，导致线粒体肿胀外膜破裂释放c y t c 、 a i f 等物质1 4 2 1 。膜电位的下降造成呼吸链解偶联，a t p 合成终断，当a t p 与a d p 比值小于 5 时将发生凋亡【4 3 1 。c y t - c 的释放同样会造成呼吸链终断，使a t p a d p 值发生变化诱发细胞 凋亡，同时在c a s p a s e 依赖的细胞凋亡通路中发挥不可替代的作用【“】。 线粒体释放出的c y t c 是一种水溶性蛋白，原位于线粒体内外膜之间，当线粒体膜通道 改变，与内膜相连松弛的c y t - c 将释放到细胞质中。研究表明释放的c y t c 将激活依赖c a s p a s e 的细胞凋亡通路。细胞质中的c y t - c 将在d a t p 的作用下同a p a f - i 结合并活化使a p a f - 1 形成 7 具体，同时每个活化的a p a f - 1 将募集c a s p a s e 9 的前体，最终形成由7 个c y t - c 、a p a f - 1 及 募集c a s p a s e - 9 前体构成的“凋亡复合体”【4 5 】。凋亡复合体的特殊结构能使c a s p a s e 9 的活性增 强完成自身剪切，活化后的c a s p a s e - 9 将募集并激活c a s p a s e 3 、6 、7 等c a s p a s e 家族的执行 因子m 】。活化的c a s p a s e 家族的执行因子在激活下游通因子的同时，切割b c l - 2 、b c l x l 等凋 亡抑制因子，消除其对m p t p 开放的抑制作用，使更多的c y t c 、a i f 等促凋亡因子从线粒体 释放到细胞质中，形成一个促进型反馈性回路 4 7 】。最终通过促进型反馈性回路、级联放大 过程，使入细胞进入凋亡的执行阶段。此外线粒体c y t - c 的释放导致呼吸链中断，使呼吸链 电子超载发生外溢，制造0 2 。、h 2 0 2 等活性氧分子，破坏d n a 、蛋白质等细胞结构导致凋亡 发生【4 引。 在线粒体释放c y t c 的同时，将内部的a i f 也释放的细胞质中。a i f 是位于线粒体内外 膜之间的一种双功能黄素蛋白，研究表明a i f 不依赖c a s p a s e 家族，可以直接导致细胞凋亡 4 9 1 。a i f 在a t p 功能下，直接转入细胞核内，与e n - d og 等核酸内切酶共同作用，特异地切 割d n a 形成6 0 k b p 的片段，促使细胞凋亡冈。 当细胞生存中发挥重要作用的细胞器发生不可修复的损伤时，往往会导致细胞凋亡的发 生。在细胞中起着蛋白质生产、加工及胞内钙离子储存作用的内质网，在细胞凋亡中发挥重 要的作用【5 。折叠错误蛋白积累过多或内质网钙离子大量流失等不正常情况发生时，将会导 致内质网的应激效应( e r s ) ，e r s 的长期作用将诱导细胞凋亡的发生p 2 】。e r s 激活p e r k 、 a 1 r f 6 、i r e 1 等因子，在停止蛋白质生产降解错误折叠蛋白的同时，上调c h o p 、a s k l 的 表达并活化c a s p a s e 1 2 1 5 3 】。c a s p a s e 1 2 的活化是内质网凋亡通路中的标志性过程，死亡受体 及线粒体途径均不能导致c a s p a s e 1 2 的活化酬。e r s 通过依赖钙离子的c a l p a i n 活化及 4 第一章文献综述 c a s p a s e 一7 发生转位剪切位于内质网外膜的c 勰p 雒e 1 2 前体，同时使与前体c a s p 弱e 1 2 形成 复合体的t r a f 2 发生解离，使c a s p a s e 1 2 完成活化并释放到胞质中f 5 5 】。活化的c a s p a s e 1 2 切割前体c a s p 弱e 9 ，由活化的c a s p 继e 9 ，激活c a s p a s e 3 完成细胞凋亡过程【铜。 死亡受体、线粒体及内质网途径是细胞凋亡的主要通路，同时还存在着以p 1 3 k 为代表 的生存因子途径f 5 7 】，a t m 家族为代表d n a 损伤途径【5 3 1 ，a n o i k i s 介导的“失巢凋亡”印印1 及 端粒酶b 介导的细胞凋亡【6 1 1 等。在细胞凋亡进程中除c a s p a s e 家族外还有b c l - 2 、i a p 等家 族发挥着调节及抑制凋亡的作用。凋亡进程不是线性进行的，各凋亡途径复杂的交织在一起， 形成庞杂的细胞凋亡网络。 1 1 2 细胞凋亡的研究进展 在1 9 7 2 年k e 1 正式提出a p o p t o s i s 概念前，凋亡现象就已被观察及研究。1 8 5 8 年，v i r c h o w 发现一种发生在正常组织中不同于细胞坏死的细胞死亡现象；上世纪初，g - r a p e r 通过研究认为这种现象是机体维持稳态的一种方式；2 0 世纪中叶g l i i c k s m a n 等，首次在了脊 椎动物胚胎发育中观察到细胞死亡现象；l o e k s h i n 等将之称为程序性细胞死亡1 6 3 1 。随着科 学技术的发展，凋亡研究的进展迅猛。研究的范围从植物到动物噼l ，从线虫到人类【6 卯，从单 细胞酵母到多细胞生物嗍，所有的模式生物无所不包、无所遗漏；研究层次从组织发育到细 胞变化，从亚细胞结构到基因、蛋白水平直至各凋亡因子的分子结构【6 7 】；研究技术从形态观 察到分子生化检查，包含几乎所有的生物学研究手段与技术。研究方向从基础科学研究向应 用科学研究发展，基于凋亡研究理论己在医学领域产生众多新技术、新方法治疗目前的顽疾。 如类风湿性关节炎、系统型红斑狼疮等自身免疫疾病是由机体凋亡不足所致1 6 s l ：阿尔茨海默 症、h i v 病毒对t 细胞的杀伤作用都于细胞凋亡相关9 1 ；使用凋亡研究成果治疗癌症也是目 前研究的热点【7 0 l 。 1 2c a s p a s e 基因家族的研究概述 y u a n 等于1 9 9 3 年发现哺乳动物细胞的i c e 基i 因( i n t e r l e u k i n 1 1 3 c o n v e r t i n ge n z y m e ) 和秀丽 隐杆线虫的c e d - 3 基因存在功能和序列上的高度同源，与c e d - 3 基因一样i c e 高表达时可导 致啮齿动物成纤维细胞的凋亡。目前在哺乳动物细胞中已发现有1 4 种i c e c e d - 3 蛋白酶家 族成员【7 1 】，命名为半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶( c y s t e i n y la s p a r t a t es p e c i f i cp r o t e s a e ) ，简称 c a s p a s e 。 1 2 1c a s p a s e 基因家族的研究概况 1 2 1 1c m p 珊e 基因家族的结构和分类 c a s p a s e 家族具有相似的氨基酸序列、结构以及底物特异性。结构上c a s p a s e 均具备 o a c x g ( x 可为各种氨基酸残基) 五肽保守序列。通常以无活性的酶原形式储存在细胞内，当 5 西南大学硕十学位论文 受到凋亡信号刺激，将通过上游因子活化或自身蛋白水解获得活性。无活性的c a s p a s e 前体 通常由n 端结构域及大、小亚基三部分组成。当其受到调亡信号诱发时，前体c a s p a s e 将在 大亚基末端a s p - x 处发生水解，2 个大亚基和2 个小亚基，形成a 2 1 3 2 结构的异源四聚体【7 2 】， 每两个大小亚单位构成一个催化区负责对其底物位点激活。完成c a s p 嬲e 的活化【7 3 】。活化的 c a s p 舔e 通过级联放大效应激活下游凋亡因子，最终引起染色体d n a 的降解及细胞的解体完 成细胞凋亡。根据c a s p a s e 家族成员在细胞凋亡中功能的不同，可分为参与上游调节的启动 因子( i n i t i a t o r ) 和直接水解下游底物并完成凋亡的效应因子( e f f e c t o r ) 。 所有c a s p 嬲e 家族成员都由一个前域( p r o d o m i a n ) 和一个酶活性域组成。由于前域结构的 多相性，使不同前体c 笛p 弱en 端被切割肽段的长度存在差异，可分为长前域和短前域。有 学者认为前域的长短与c a s p a s e 家族成员功能的差别有关【7 4 1 。具有长前域的c 硒p 弱e 家族成 员主要起激发和调节凋亡的活化作用，即启动因子( i n i t i a t o r ) 。如c 雒p 勰e 8 、1 0 ，其长前域中 有两个d e d ( d e a t he f f e c t o rd o m a i n ) 通过与f a d d 的结合形成异源二聚体，促使c 鹬p 觞e 自身 活化开启凋亡的死亡受体通路；c 舔p 舔e 1 、2 、4 、5 、9 为另一类长前域c a s p 嬲e ，具有一个 c a i m ( c a s p 雏er e c r u i t m e n td o m a i n ) ，与含c a r d 的配体( a p a f - i ) 结合后完成配体介导的募 集和自身活化。具有短前域的c 雏p 雏e 家族成员主要进行蛋白质酶解作用，即效应因子 ( e f f e c t o r ) 。如被认为是依赖于上游c a s p a s e 激活具有水解活化下游因子作用的c a s p a s e 3 、6 、 7 等。 1 2 1 2c 嬲p 舾e 的特征 哺乳动物c a s d 嬲e 家族成员在氨基酸序列、二级结构和底物特异性上具有相似的特征 7 5 , 7 6 ：首先它们属于同一种半胱氨酸蛋白酶，具有以c y s 作为裂解底物的亲核基团；其次它 们的催化活性对底物天冬氨酸有特异性要求，不同的c a s p 雒e 能够特异地水解一类底物。，最 后c a s p a s e 家族成员以活性很低的酶原形式存在于细胞中，当受到凋亡信号刺激或上游因子 作用使n 端的部分序列发生水解去除；恢复活性，从而导致不可逆的细胞凋亡反应。 1 2 1 3c a s p a s e 的活化 c a s p a s e 至少可以通过3 种方式激活：自活化、转活化以及非c a s p a s e 蛋白酶活化。研究 表明c a s p a s e 酶原有很低的蛋白水解活性，这暗示其在某种条件下具有自活化的潜力如野生 型c a s p 豁e 过表达时可导致酶原的激活，表明酶原在高浓度时可促进自我活化。c a s s p a s e - 8 、 9 的前域中都含有死亡效应域d e d ，通过蛋白一蛋白相互作用，在f a d d 、a p a f - i 等因子的 帮助下，募集形成寡聚复合体。使局部酶原浓度升高导致酶原相互接近，促使酶原的自活化 7 7 1 。起始c a s p a s e 一旦被激活，便能完成对下游c 舔p 嬲e 酶原的转活化作用。例如，c a s p a s e 8 能激活几乎所有的已知c 雏p 雏e 酶原；而c c 印船p 9 能激活酶原c 珊p 珊p 3 和7 ，但不能激活 妒珊p 67