（细胞生物学专业论文）糖类物质的hplc柱前衍生化新方法研究及其malditofms分析.pdf

糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i - t o f m s 分析 摘要 高效液相色谱( h p l c ) 已经成为糖类物质分析的重要工具，但由于糖类物 质没有紫外或荧光吸收，需对样品进行柱前衍生使它带上紫外或荧光基团，从 而可通过紫外或荧光检测器对其进行检测。由于已有的各种衍生试剂都有衍生 反应难控制或质谱检测灵敏度不高的等局限性，不能很好地满足当前糖生物学 分析的需要。因此，继续研究开发新的高灵敏衍生化试剂及方法有着重要意 义。本论文重点研究了一种新型糖类物质柱前衍生化方法，首次以3 氨基一9 一乙 基咔唑( 3 - a m i n o 9 e t h y l c a r b a z o l e ，a e c ) 作为衍生化试剂对糖类物质进行柱前 衍生化h p l c 分离和m a l d i t o f m s 分析。对反应条件和色谱条件进行了优 化，对方法进行了考察，并用该衍生化方法对不同生物样品进行了分析，取得 了很好的效果。本研究主要取得了以下的研究成果和结论： 1 首次将a e c 试剂用于标准单糖的柱前衍生化，利用h p l c 和m a l d i t o f m s 分析对反应结果进行检测和分析。对反应条件进行了优化，并考察了 方法的稳定性、灵敏度、检测限等。结果显示：衍生化方法反应条件温和 ( 7 0 。c 反应6 0m i n ) ，衍生物不用脱盐处理即可直接进行质谱分析，检测灵敏 度高，避免了微量样品的损失。该方法的灵敏度高，最低检测限达0 0 6n g m l 1 ；稳定性好，存储5 天的样品的相对标准偏差( r s d ) 3 ；准确度高，样品 的平均回收率大于9 8 。 2 对色谱条件进行优化，建立了理想的单糖分析模式，并将此方法成功应 用于三种螺旋藻多糖的单糖组成分析。 3 对色谱分离条件进行优化，建立了寡糖链分析的h p l c 分离和m a l d i t o f m s 分析方法。将该方法应用于壳寡糖生物样品的分析，首次实现了壳寡 糖混合物的柱前衍生h p l c 和m a l d i t o f m s 分析，较好的分析了壳寡糖混 合物的主要组成成分。 4 探讨该方法在糖醛酸分析中的应用价值，进一步拓宽方法的应用范围。 关键词：糖，柱前衍生，3 氨基9 乙基咔唑，高效液相色谱，基质辅助激光解 析电离质谱 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i - t o f m s 分析 a b s t r a c t h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) h a sb e c o m e a l le s s e n t i a l a n a l y t i c a lt o o lo fc a r b o h y d r a t e sa n a l y s i s ，d u et ot h el a c ko ff l u o r e s c e n to ru l t r a v i o l e t g r o u p ，c a r b o h y d r a t e sn e e d t ob ed e r i v a t i z e db e f o r eh p l ca n a l y s i s al o to f d e r i v a t i z a t i o nr e a g e n t sh a v e b e e nu s e dt os a c c h a r i d ea n a l y s i s ，h o w e v e r ，s o m eo ft h e s e d e r i v a t i z a t i o n ss u f f e r e df r o mt h ep r o b l e m si n c l u d i n gt e d i o u sr e a c t i o np r o c e d u r e so ra s i g n a ld e c r e a s i n gb yb i o l o g i c a lm a s ss p e c t r o m e t r yd e t e c t i o nt h a td i dn o tm e e tt h e d e m a n d so fm o d e mt r a c el e v e la n a l y s e sw i t hr e g a r dt os e n s i t i v i t ya n d o rs e l e c t i v i t y h e n c e ，i t ss i g n i f i c a n tf o ru st oe m p l o yah i g hs e n s i t i v ed e r i v a t i z a t i o nr e a g e n tf o r s a c c h a r i d ea n a l y s i si na c t u a lw o r k i no u rp a p e r ，w ee s t a b l i s h e dan e wp r e c o l u m n d e r i v a t i z a t i o nm e t h o df o rs a c c h a r i d e sa n a l y s i s ，e m p l o y i n g3 - a m i n o 一9 一e t h y l c a r b a z o l e a sad e r i v a t i z i n gr e a g e n t t h ed e r i v a t i v e sw e r es e p a r a t e db yr e v e r s e p h a s eh p l ca n d i d e n t i f i e db ym a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ( m a l d i ) t i m e o f - f l i g h t ( t o f ) m a s ss p e c t r o m e t r y w eo p t i m i z e dt h ed e r i v a t i z a t i o nr e a c t i o na sw e l la st h eh p l c c o n d i t i o n sa n dv a l i d a t e dt h ed e s c r i b e d m e t h o d m a n ys a m p l e si n c l u d i n g m o n o s a c c h a r i d e sa n do l i g o s a c c h a r i d e sw e r es u c c e s s f u l l ya n a l y z e db yt h ed e s c r i b e d m e t h o d f i n a l l y ，w eh a v eg o tt h e s er e s u l t sa n da c h i e v e m e n t sa sf e l l o w s ： 1 t h es t a n d a r dm o n o s a c c h a r i d e sw e r ew e l l d e t e c t e da n da n a l y z e db yh p l ca n d m a l d i t o f - m s ，p r e v i o u s l yd e r i v a t i z e dw i t ha e c w eh a v eo p t i m i z e dt h e d e r i v a t i z a t i o nr e a c t i o na n di n v e s t i g a t e dt h es t a b i l i t y ，s e n s i t i v i t ya n dd e t e c t i o n l i m i t so ft h em e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e a c t i o nc o n d i t i o nw a sm i l d ( 7 0 。c ，6 0m i n ) t h ed e r i v a t i v e sc o u l db ed i r e c t l yd e t e c t e db ym a l d i t o f - m s w i t h o u td e s a l t e dp r o c e d u r e ，a v o i d i n gl o s eo fs a m p l e d e t e c t i o nl i m i t sf o rt h e s a m p l e s ( d - g l u c o s e ，l x y l o s e ，d - m a n n o s e ，l - a r a b i n o s e ，a n dl r h a m n o s e ) r a n g e d f r o m0 0 6t o1 9 7n g m l ( s n = 3 ) s h o w e dt h a tt h em e t h o di sh i g hs e n s i t i v e t h e d e r i v a t i v e sw a ss t a b l ee n o u g hf o ra n a l y s i st h a ts t a b i l i t ya n a l y s i ss h o w e dr s d w a s 9 8 6 2 i na 1 1c a s e s 2 t h eh p l cc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e da n dam e t h o df o rm o n o s a c c h a r i d e sa n a l y s i s w a sd e v e l o p e d a sar e s u l t ，t h e s u g a rc o m p o s i t i o n so ft h r e eo l i g o s a c c h a r i d e s s p p a 一1 ，s p p b 1a n ds p p c 1o fs p i r u l i n ap l a t e n s i sw e r es u c c e s s f u l l ya n a l y z e d b yt h i sm e t h o d 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i t o f m s 分析 3 w eh a v eo p t i m i z e dt h eh p l cc o n d i t i o n sa n de s t a b l i s h e dam o d ef o rh p l ca n d m a l d i t o f - m sa n a l y s i so fo l i g o s a c c h a r i d e s c h i t o s a nw a sf i r s t l yp r e - c o l u m n d e r i v a t i z e dw i t ha e ca n da n a l y z e d b yh p l ca n dm a l d i t o f - m s t h e m a s s a g eo fm a i nc o m p o m e n tc o m p o s i t i o no fs a m p l ew a sr e c o r d e d 4 w ea r ea l s oa p p l y i n gt h i sd e r i v a t i z a t i o nm e t h o dt ou r o n i ca c i da n a l y s i si no r d e rt o e v a l u a t ea n de x p a n dt h eu s eo fm e t h o d k e y w o r d sc a r b o h y d r a t e s ，p r e - c o l u m nd e r i v a t i z a t i o n ，3 - a m i n o - 9 一e t h y l c a r b a z o l e ( a e c ) ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，m a t r i x - a s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o ni o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ( m a l d i - t o f - m s ) 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 ， 学位论文作者签名：盆堕 指导教师签名：皇丛生竺 学位论文作者签名：至鱼墨指导教师签名： 丝r 、，至 哥年月5e l 冲曰年6 月j 目 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也小包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：乏占最 8 年6 月日 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i - t o f - m s 分析 1 1 糖类的概念及分类 第一章文献综述 牛津大学的r a ym o n da d w e k 于1 9 8 8 年在当年的生化年评( a n n u a l r e v i e wo f b i o c h e m i s t r y ) 上，发表了题为“g l y c o b i o l o g y ”的综述，提出了糖生物 学( g l y c o b i o l o g y ) 这一名称，标志着一门新的分支学科的诞型卜2 1 。糖生物学 这门学科领域一经提出，便得到了科学界的广泛认同，并在西方发达国家受到 高度重视。近1 0 年来，随着分析技术的进步和分子生物学的发展，糖的研究也 取得的了巨大进展，糖生物学的研究正成为生命科学研究中又一新的前沿和热 点，吸引着众多科研学者的兴趣 3 】。 糖类( c a r b o h y d r a t e ) 从化学角度看，指的是多羟基醛、多羟基酮或其衍生 物，或水解时能产生这些化合物的物质。糖类物质是自然界存在的一大类具有 广谱化学结构的有机化合物，糖类物质不仅是动植物的能源( 贮能材料如糖 元) 和燃料，也是代谢过程的中间产物，在生物过程中起着非常重要的作用， 是除蛋白和核酸之外的又一类重要的生物大分子，它是四大类生物大分子之 一。糖生物学之所以落后于基因和蛋白质的研究，在于以前研究人员缺乏研究 糖类分子的有效工具，以及糖分子结构本身的复杂性。美国麻省理工学院糖原 生物学家萨西赛克哈兰说：“目前我们尚未破译其密码，我们仅处于揭示糖奥 秘的初始阶段 。 糖类物质根据 5 q 3 功能基团的不同，可分为醛糖( a l d o s e ) 、酮 ( k e t o s e ) 、糖醇( a l d i t o l 或s u g a ra l c o h 0 1 ) 和糖醛酸( u r o n i ca c i d ) 四大类；依 据糖的还原氧化特性，又可以分成还原性糖和非还原性糖，几乎所有的醛糖都 属于还原性糖，大多数酮糖以及1 ，6 脱水醛糖属于非还原性糖；根据糖残基数 目的多少，糖类物质又可分为单糖( m o n o s a c c h a r i d e ) 、寡糖 ( o l i g o s a c c h a r i d e ) 和多糖( p o l y s a c c h a r i d e ) 。单糖可以依照其碳原子数目的不 同分为：丙糖或三碳糖( t r i o s e ) 、丁糖或四碳糖( t e t r o s e ) 、戊糖或五碳糖 ( p e n t o s e ) 、己糖或六碳糖( h e x o s e ) 和庚糖或七碳糖( h e p t o s e ) ，常见的单 糖有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等。寡糖是由少数( 2 6 ) 个单糖缩合形 成的聚合物，低聚糖通常是指2 0 个以下的单糖缩合形成的聚合物，而多糖则由 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i t o f m s 分析 多个单糖分子缩合、失水而成的。寡糖、低聚糖、多糖只是指一定数量范围内 的单糖基的聚合物，其中并无十分严格的规定，都可用通式( c 6 h 1 0 0 5 ) n 表 示。寡糖和多糖还能进一步分为直链、支链和环状糖以及a 、异头物等【4 】。多 糖是自然界中分子结构复杂且庞大的糖类物质，它们在动物、植物和微生物中 起着重要的作用，植物的骨架纤维、动植物储藏养分的淀粉、糖原，昆虫与节 肢动物的甲壳质，植物的粘液、树胶等都是由多糖组成的。多糖按其组分分 类，有均一多糖和杂聚多糖。通常所说得多糖都是指由不同的单糖分子或单糖 衍生物与非糖物质组成的大分子杂聚多糖，如蛋白聚糖、粘多糖以及目前许多 人共提取的植物多糖等。 1 2 糖类的功能 糖类物质是细胞中非常重要的一类有机化合物，它的生物学功能主要有以 下几个方面 4 】： ( 1 ) 作为生物体的结构成分。植物的根、茎、叶含有大量的纤维素、半纤 维素和果胶物质等，这些物质构成植物细胞壁的主要成分。属于杂多糖的肤聚 糖是细菌细胞壁的结构多糖。昆虫和甲壳类的外骨骼也是一种糖类物质，称为 壳多糖。 ( 2 ) 作为机体的能源物质，为机体提供能量。植物的淀粉和动物的糖原都 是能量的储存形式。 ( 3 ) 物质代i 勇 的碳骨架，为蛋白质、核酸、脂类的合成提供碳骨架。 ( 4 ) 是细胞的主要组成成分，构成细胞骨架。纤维素、半纤维素、木质素 是植物细胞壁的主要成分，肽聚糖是细胞壁的主要成分。 ( 5 ) 作为信号分子，参与细胞间识别和生物分子间的识别。许多细胞膜表 面糖蛋白的寡糖链参与细胞间的识别。一些细胞的细胞膜表面含有糖分子或寡 糖链，构成细胞的天线，参与细胞通信。红细胞表面a b o 血型决定簇就含有岩 藻糖。 ( 6 ) 糖蛋白、蛋白多糖和糖脂都是细胞膜的重要组成部分，其结构中的糖 链作为生命活动过程中主要的生物信息携带者和传递者调节着细胞的生长、发 育、分化和代谢。近年来研究还表n t l 4 - 1 7 ，无论是在基本的生命过程中如受 精、受精卵细胞的分裂增殖、发生、发育和分化，还是在疾病的发生和发展中 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i t o f m s 分析 都有糖链的参与，糖链在生命和疾病过程中起特异性的识别和调控的作用，并 且糖类药物对预防、诊断和治疗各种疾病都显示出巨大的应用前景。 研究结果 3 4 。8 1 已确证，糖类物质在整个生命活动中都起着重要的作用，作 为信息分子在受精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统衡态的维持等方 面起着重要作用；炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增殖和转换、病 原体感染等生理和病理过程都有糖类的参与。2 1 世纪生命科学的研究焦点是对 多细胞生物的高层次生命现象的解释，因此，对生物体内细胞识别和调控过程 的信息分子一糖类的研究是必不可缺的。 1 3 糖类的分析方法 糖的分析在实际工作和科研中具有重要的意义。糖的种类相当多，结构也 特别复杂，因而，其分析方法也多种多样。传统的菲林法、二硝基水杨酸法等 化学分析方法以及光度法等，由于无法对体系中的各种糖进行预先分离，所以 得到的只是糖的总分析结果【1 8 】。 酶分析法或电化学法虽然检测灵敏度高，但受到特异性及样品中污染物干 扰的限制，所以这些方法近年来已较少使用 1 9 - 2 0 1 。传统的电泳法及8 0 年代后期 迅速发展起来的高效毛细管电泳法能进行糖的分离，但检测灵敏度较低，并且 重复性相对较差 2 l - 2 5 1 。 色谱法能够将多种糖逐一分离，准确地进行定性定量分析，因此在糖类物 质的分析中占有非常重要的地位。混合糖的分离鉴定及其组成的分析方法一般 采用 2 6 】纸色谱法、薄层色谱法以及柱色谱法。这些经典的层析法有着分辨率 低，分析时间长，定量测定困难，难以实现自动化控制等缺陷。另外糖混合物 在有机相中溶解能力较差也使得这些方法的应用受到了限制 6 】。 近几年来一种脉冲安培检测阴离子色谱法( a e p a d ) 用于单糖和寡糖的 测定，在十几分钟内可以分离2 0 多种糖，且灵敏度很高，检测限可达几十个 p l 水平，但由于安培检测的稳定性较差，人们仍在不断探求新的电极材料。 比较而言，气相色谱( g c ) 、高效液相色谱( h p l c ) 、毛细管电泳 ( c e ) 等高效分离分析技术在很大程度上避免了这些问题，自应用于糖类物质 分离分析以来，已使糖的相关研究得到长足的发展。随着这些方法的不断成熟 与完善，它们在糖类物质的分离分析中越来越显示出优势。 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i t o f m s 分析 1 3 1 气相色谱( g c ) 1 9 5 8 年，第一次有报道用气相色谱( g c ) 来研究糖类，并且描述了分离一 些单糖中完全甲基化的甲基糖。采用气相色谱法测定糖类，遇到的主要困难是 糖类本身没有足够的挥发性，必须将其转化为挥发性衍生物才能进行g c 测 定，g c 常用的衍生化包括甲基化、酞基化、三甲基硅醚化。单糖或简单寡糖可 直接制备成衍生物进行分析，但对分子量较大的多糖或寡糖，分析起来就困难 得多。需首先通过水解、s m i t h 降解、甲基化反应等方法将其降解为相应的结构 简单的单糖或简单寡糖，再通过对降解产物进行衍生来进行进一步的定性、定 量测定，来确定其结构【2 9 , 3 0 】。气质联用( g c m s ) 在复杂糖类物质的结构解析 方面具有独特优势。 气相色谱法( g c ) 测定糖类，具有选择性好、样品用量少、分辨率高、快 速准确、灵敏度高等优点，近年来在国内外得到了广泛应用。但是，无论如 何，被分析的样品必须先经过预处理，常包括要除掉蛋白质和盐类物质，再做 衍生化处理，这些操作一般都较为复杂。而气相色谱的检测法，如：火焰离子 化方法，常是具有破坏性的，用来制各样品很难。 1 3 2 高效液相色谱( h p l c ) 液相色谱法始于2 0 世纪初，开始阶段主要为经典液相色谱法，其固定相的 柱效较差，由于流动相在常压下输送，导致其存在分离效率低、分析速度慢以 及周期长等缺点。2 0 世纪7 0 年代，液相色谱在技术上采用了高压液相泵、高 效固定相和高灵敏度检测器，克服了经典液相色谱技术的缺点，具有分离效率 高、分析速度快以及检测极限低等优点，因此被称为高效液相色谱技术。快速 发展的高效液相色谱技术，己成为蛋白质组学研究中不可缺少的工具。 高效液相色谱被认为是迄今为止人类己掌握的对复杂混合物分离能力最强 的手段之一。它在生命科学的多肽、蛋白质、核酸和糖等 3 9 生物大分子的分 离、分析及制备纯化方面的应用，是目前最活跃的研究领域之一。无论在揭示 生命奥秘的生理、生化诸领域，还是在谋求人类生存和发展的食品、保健和农 业等方面，都具有广泛的应用前景 2 7 2 8 1 。 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i t o f - m s 分析 h p l c 用于糖的定性和定量分析具有快速、灵敏、样品处理简单等优点。 从大量的文献报道和综述【3 卜3 3 1 中可以看出，由于糖的特殊结构及它本身不含强 紫外和荧光吸收的官能团，到目前为止还没有建立一个统一的h p l c 方法来分 析所有的糖类物质。 1 3 2 1h p l c 的分类 高效液相色谱法依据溶质在两相分离过程的物理化学原理分类可分为以下 5 类： 1 3 2 1 1 吸附色谱 用固定吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在 吸附剂上吸附能力的差别来实现分离。 1 3 2 1 2 分配色谱 用载带在固定相基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依 据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和流体流 动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配色谱。当固定相极性 大于流动相极性时可称为正相分配色谱或简称正相色谱：如固定相极性小于流 动相极性时。可称为反相分配色谱或简称反相色谱。 1 3 2 1 3 离子色谱 用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定p h 值的缓冲溶液作流动 相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆 性离子交换能力的差别而实现分离。 1 3 2 1 4 体积排阻色谱 用化学惰性的多孔性凝胶作固定相。按固定相对样品中各组分分子体积用 化学惰性的多孔性凝胶作固定相。按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用 的差别来实现分离。以水溶液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶过滤色 谱；以有机溶剂作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法。 1 3 2 1 5 亲和色谱 在不同基体上，键合多种不同属性的配位体作固定相，用具有不同p h 值 的缓冲溶液作流动相，依据生物分子与基体上键连的配位体之间存在的特异性 亲和作用能力的差异，而实现对具有生物活性的生物分子的分离。 1 3 2 2h p l c 简介 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i - t o f m s 分析 高效液相色谱仪包括以下主要部件：贮液罐，在线脱气装置，高压输液 泵，进样装置，色谱柱，检测器，记录仪和数据处理装置。 报道上测定单糖所用的检测器有红外检测器，电化学检测器、示差折光检 测器、光散射检测器和紫外检测器。用h p l c 测糖，选择合适的检测器是很重 要的，用于h p l c 的检测器很多，根据样品中的糖的种类、含量和纯度来选择 合适的检测器。 1 3 2 3h p l c 的优点 h p l c 法以其高超的分离能力为特点，它的分离效率远远高于其他分离技 术如蒸馏、萃取等方法。与其他分离技术相比，h p l c 法的优点主要表现在如 下几方面： 1 分离效率高。由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色谱填充柱的柱 效可达5 、1 护3 1 护块m 理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱1 护块m 理论塔板数的柱效。 2 选择性高。由于液相色谱柱具有高效柱，并且流动相可以控制和改善分离 过程的选择性，因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合 物及其同分异构体，还可分析在性质上极为相似的旋光异构体，并已在高 疗效的合成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重要作用。 3 应用范围广。高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的，受热不稳定易 分解的，分子量大，不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产 物；合成的和天然的高分子化合物等。 4 样品用量少。h p l c 的进样量是按l 计，需要配置的样品溶液也只需要极 少量即可。 5 灵敏度高。随着液相色谱检测技术的成熟和完善，液相色谱检测灵敏度也 得到提高。线性范围宽，应用广泛。用于痕量分析的荧光检测器，最小检 出量可达n g 。 6 分离和测定一次完成，可以和多种分析仪器联用。 7 易于自动化。现在制备色谱和半制备色谱的应用越来越广泛，制备色谱是 制备色谱纯物质的色谱技术，即分离、收集一种或多种色谱纯组分，供进 一步定性鉴定、作为色谱标样或用于合成等。 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i - t o f m s 分析 h p l c 法除具有上述特点，它的应用范围也日益扩展。由于它使用非破坏 性检测器，样品被分析后，在大多数情况下，可除去流动相，实现对少量珍贵 样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。 1 3 2 4 衍生化与h p l c 分析 h p l c 分离中常用的一种检测器是紫外检测器，紫外检测器的突出优点是 检测灵敏度高、可靠性强。但对糖类物质而言，所含的被测组分多数不产生荧 光或紫外吸收，无法实现紫外检测。因此，需要开发高灵敏荧光衍生化试剂， 使之与被测组分进行衍生化，达到检测的目的。 衍生化方法可以使糖类样品转变为带有发光基团的物质，使检测信号增 强，提高监测灵敏度，某些种类的糖类物质经衍生反应后结构改变，极性随之 变化，使原本难以分离的成份可以用简单的、人们熟悉的分离模式分离开。常 用衍生化试剂有紫外和荧光两种，具有荧光基团的物质一般都能吸收紫外光， 所以通常的荧光衍生化试剂可以同时用紫外和荧光检测器进行检测。 1 3 2 4 1h p l c 的衍生模式 h p l c 中的衍生模式主要有两种：柱前衍生和柱后衍生。 柱前衍生是在分离前，预先将样品转化为衍生物，然后进行分离并检测。 柱后衍生则是分离后，在色谱系统中引入衍生试剂和辅助反应液与色谱流出组 分在系统中直接进行反应，尔后检测衍生产物。柱前或柱后衍生的主要差别在 于前者是根据衍生物的性质不同而进行色谱分离，后者是先对样品混合物分离 后再进行衍生及检测。 柱前衍生化是应用最为广泛的一种衍生技术，在色谱分离前，样品组分经 过特定的化学反应，使之转变为荧光衍生物分离测定，该方法的优点表现在以 下几方面： 1 通常不考虑衍生化反应的动力学，直到衍生反应完全； 2 为使衍生反应及衍生产率获得最佳效果，可以任意选定衍生化条件； 3 柱前衍生化反应的溶剂不必与分离时的流动相相配伍； 4 衍生化的副产物可进行预处理以降低或消除其干扰； 1 3 2 4 2 衍生化反应类型 近年来发展最为迅速的是柱前衍生化的h p l c ，使糖链带上紫外或荧光基 团，用紫外或荧光检测，它具有分离效率高、分析时间短、进样量少、检测限 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i t o f m s 分析 低、多模式等特点。柱前衍生的方法可以提高检测的灵敏度，同时又可以使糖 链带上疏水基团，降低糖链的极性，使糖链在反相色谱柱上得到保留便于糖链 的分离，在普通的色谱柱通常为反相c 1 8 ，c 8 柱就可以得到很好的分离效果。 根据衍生化原理的不同，衍生化的方法可以分为以下几种 4 1 1 。 1 3 2 4 2 1 还原胺化法 还原胺化法具有检测灵敏度高、衍生产物稳定、操作简单等优点，是在糖 链的还原端上引入发色基团的最通用的方法，被广泛应用于糖类物质的柱前衍 生化分析【4 1 4 2 1 。该方法的原理它的基本原理是糖在酸性条件下，还原端的羰基 与一级氨形成希夫碱，希夫碱在酸性条件下不稳定，后被还原剂还原为稳定的 二级胺。通常在弱酸条件下糖的环状结构被破坏，在还原剂的作用下与过量的 胺化合物反应，从而生成稳定的化合物。此反应的产物是二级胺，它具有较高 的稳定性及敏感性适合用于m s ，l c ，c e 及h p l c 的分析。 1 3 2 4 2 1 1 氨基吡啶类荧光衍生试剂 1 9 8 1 年，h a s e 等人第一次用2 氨基吡啶来进行糖类的衍生化及h p l c 分 析。2 氨基吡啶( 2 a p ) 用于糖类物质衍生的研究开始得比较早，至今仍被广 泛采用4 3 1 。目前研究者多将其用于糖蛋白中的- 连接寡糖的定量分析和结构分 析4 3 4 引。l e e 等删应用同样的2 一a p 衍生法证实了糖蛋白中的- 连接寡糖类型一 般可分为杯( 甘露糖) 型、x - ( 木糖) 型、f - ( l 海藻糖) 型以及z - ( 其它) 型。天然组织样品经肼解和酞基化作用能产生- 糖苷键型糖，f u j i m o t 等 4 5 】采 用2 - a p 衍生结合h p l c 的方法对这类- 糖营键型糖结构进行了分析，得到了 人体血浆或脑部组织中- 糖苷键型糖的二维结构图。 但是2 - a p 通常有以下缺点：( 1 ) 糖类物质结构的不同导致衍生反应方式 的不同，反应条件难以控制；( 2 ) 与糖结合时会导致去糖基化作用，干扰糖的 分析 4 9 】。 1 3 2 4 2 1 2 苯胺类荧光衍生试剂 氨基苯甲酸类衍生化试剂如氨基苯甲酸( 2 a a ) 无上述氨基吡啶类衍生化 试剂的缺点，无论糖类物质是否带有保护基团，都能与其反应生成具有紫外基 团和亲水性的衍生产物，使得糖类物质的分离分析更为简单，是一种无选择 性、有效而灵敏的衍生化试剂，尤其适用于r p h p l c 分离 5 0 1 。2 a a 同样可以 用于荧光检测【5 1 1 。m e y e r 等 5 2 1 使用带亲水基团的c 1 8 反相柱分离分析了1 0 种 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i t o f m s 分析 包括中性糖、氨基糖以及糖醛酸的混合物，并使用紫外和荧光同时对它们进行 检测。但是2 a a 固有的负电荷使得它更适用于电色谱分析，所以有关h p l c 的研究相对较少。 k i t a g a w a 等【5 3 1 分析了g a g s 中产生的上述糖类物质，但他们使用的是另一 种荧光衍生化试剂2 氨基吖啶酮( 2 - a m a c ) ，以磷酸二氢钠为流动相在氨基 柱上对未饱和的干磷脂类肝素一双糖进行了分离。2 - a m a c 作为一种灵敏的荧 光试剂可以用于单糖、中性多糖【5 4 1 及糖蛋白的研刭55 1 。2 - a m a c 荧光衍生化试 剂灵敏度高，用于多糖物质分析时速度比一般方法快，但其衍生过程比较繁 琐，反应难于控制，在糖类物质研究中的应用并不多见。 a b e e ( p a m i n o b e n z o i ce t h y le s t e r ) 5 6 - 5 7 衍生化试剂可以用于分析从糖缀合 物中释放的寡糖结构。快原子轰击法( f a b ) 可以确定a b e e 衍生化糖链的分 子量。随着糖链的分子量增大，衍生化反应的条件也更剧烈。为了避免在衍生 化过程中去唾液酸化，应减少乙酸的浓度，且在无水条件下反应。衍生化的唾 液酸乳糖的回收率为8 0 - - - 9 0 ，去唾液酸少于1 。我们 5 8 。5 9 1 用a b e e 标记了 水蛭( 1 e e c h ) 神经寡糖链和老年痴呆症患者脑组织中的糖链，用液相色谱和质 谱进行了结构分析，效果较好。a b e e 衍生化试剂的缺点在于用m a l d i 检测 时，其灵敏度增强不显著。此外，还有很多衍生化试剂被用于糖类的柱前衍生 化，如表1 所示，不再一一介绍。 1 3 2 4 2 1 3 酰肼类荧光衍生试剂 酰肼类化合物中的c o n h n h 2 基团能与还原性糖中的醛基反应生成具有荧 光的腙类化合物，因此这类化合物可作为糖类物质的柱前衍生荧光试剂 6 1 1 。文 献报道的这类衍生化试剂有n 一二甲氨基萘磺酰肼【6 2 1 ，4 - n ，n 二甲基氨基4 偶氮 苯磺酰肼【6 3 】等。但糖与这些试剂反应后通常会产生两个峰，使分离复杂化，所 以相关的研究进行得并不十分深入。近年来出现的一种与单糖有高反应活性的 新型酰肼类荧光衍生试剂芴甲氧基羰基肼( 9 - f l u o r e n y l m e t h y lh y d r a z i n e ， f m o c 肼) 克服了以往酰肼类试剂的缺点，成为新的研究热点。z h a n g 等脚“6 】 使用f m o c 肼分离了7 种还原性糖( 单糖和双糖) ，分别对比了相同流动相 ( 乙腈一醋酸) 下3 种不同填料的色谱柱( c 8 ，c 1 8 ，苯基柱) 的分离效果，证 明c 8 柱的分离效果最好。林启山等 6 5 】综合前人的经验，同时采用f m o c 肼及 f m o c c 1 对包括葡萄糖、半乳糖、木糖、氨基葡萄糖等1 0 种单糖进行衍生。 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i - t o f - m s 分析 其中f m o c 肼作用于中性糖，f m o c c 1 作用于氨基糖，两种衍生方法能使被 衍生糖带有相同的f m o c 荧光基团，用相同的色谱分离条件和荧光检测条件进 行分离分析，同时测定了胎球蛋白和转铁蛋白中寡糖链的单糖组成。 虽然f m o c 一肼衍生化产率高且衍生产物稳定，具有高灵敏度、低检测限的 优点，但由于它只能与还原性糖反应，因而限制了其使用范围。 1 3 2 4 2 2 与吡唑啉酮反应 除了还原氨化法之外，还有一类比较常用的衍生化方法，利用1 一苯基3 甲 基一5 一吡唑啉酮( p m p ) ，1 ( 对甲氧基) 苯3 甲基5 吡唑啉酮( p m p m p ) 和 醛糖在微碱性条件下进行缩合反应，生成p m p 和p m p m p 衍生物 6 7 1 。 这两种衍生化方法因为不损失唾液酸，所以对唾液化的寡聚糖特别有效。 由于p m p m p 的反应活性更高，因此它具有更高的灵敏度。但是，该衍生产物 的稳定性较差，易发生降解，一般在反应完成后数小时内要立即进行检测，并 且不能对酸性糖进行衍生。 1 3 2 4 2 3 金属配合物荧光衍生试剂 金属配合物作糖类物质的荧光衍生试剂使用较少。d a n i e l s o n 等【6 8 】发现二氯 氧化锆水解产生的z r ( o h ) + 能与酮糖( 果糖) 、己糖( 葡萄糖) 以及双糖( 蔗 糖) 等反应产生荧光物质( 具有烯二醇的结构) 。在检测软饮料中的果糖时， 为了降低抗坏血酸和咖啡因的影响，采用了稀释溶液的方法。他们还将这种衍 生方法用于果糖的流动注射分析( f i a ) ，流动相h c l 0 4 ( 含1 的二氯氧化 锆) 与样品溶液在聚苯乙烯二乙烯基苯柱中混合，将其检测结果与酶化法比 较，f i a 具有明显的优势。金属配合物衍生糖类物质专一性较强，无法用于多 种糖的分离分析。 由于已有的各种衍生试剂都有一定的局限性，不能很好地满足当前化学分 析的需要，因此，开发一种应用范围广、检测灵敏度高、操作简单、能提高质 谱检测灵敏度的方法有着重要意义。 表1h p l c 中几种常见的衍生化试剂 t a b l e1s o m ed e r i v a t i z a t i o nr e a g e n t su s e di nh p l c 衍生化试剂应用范围方法 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其v i a l d i - t o f - m s 分析 氨基吡啶中性糖柱前衍生 ( 2 一a m i n o p y r i d i n e ) 氨基糖紫外、荧光检测 氨基苯甲酸 中性糖 柱前衍生 ( 2 一a m i n o b e n z o i ca c i d )紫外、荧光检测 氨基苯甲酰胺 寡糖柱前衍生 ( 2 一a m i n o b e n z a m i d e )糖苷类、糖蛋白紫外、荧光检测 氨基吖啶酮 单糖柱前衍生 ( 2 一a m i n o a c r i d o n e ) 中性多糖荧光检测 芴甲氧基羰基氯 柱前衍生 ( 9 一f l u o r e n y l m e t h y l 氨基糖 c h l o r o f o r m a t e ) 紫外、荧光检测 芴甲氧基羰基肼 还原性糖 柱前衍生 ( 9 一f l u o r e n y l m e t h y lh y d r a z i n e )紫外、荧光检测 对氨基苯甲酸乙酯 所有类型糖 柱前衍生 ( p a m i n o b e n z o i ce t h y le s t e r )紫外检测 1 苯基一3 一甲基5 吡唑啉酮 柱前衍生 ( 1 一p e n y l 一3 一m e t h y l - 5 一 还原性糖 p y r a z o l o n e ) 紫外检测 对羟基苯甲酰肼 还原性糖柱前衍生 0 一h y d r o x y b e n z o i ca c i d 少数非还原性糖紫外检测 h y d r a z i d e ) 苯甲脒 还原性糖 柱后衍生 ( b e n z a m i d i n e ) 荧光检测 1 3 2 4 3 荧光试剂的选择 糖类物质由于没有荧光或者紫外吸收，需经衍生化( 柱前或柱后荧光标 记) 才能有效地进行荧光或紫外分析。检测方法的灵敏度及色谱分离的选择性 与衍生物的性质直接相关。因此，用于荧光衍生化反应的衍生化试剂应具备下 列基本条件： 1 在温和的条件下，衍生化反应能方便定量的完成。 2 衍生产物应具有较低极性，以利于有机溶剂萃取并进行分离与浓缩。 3 衍生试剂对某一官能团化合物的衍生反应具有较高的选择性。 糖类物质的h p l c 柱前衍生化新方法研究及其m a l d i t o f m s 分析 4 过量的衍生试剂易从反应产物中分离或对色谱分离影响较小。 5 衍生产物具有好的色谱分离稳定性。