（细胞生物学专业论文）超表达taver2的拟南芥导致开花延迟的分子机理.pdf

首都师范大学硕士学位论文 首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 伤烬 首都师范大学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利 目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据 库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规 定。学位论文作者签名：二戛否鹰 学位论文作者签名： 尉一， 2 首都师范大学硕士学位论文 摘要 死陋勉是以冬小麦为材料分离到的春化相关基因，t a v e 】地蛋白为一种新的植物凝集 素。免疫学定位显示春化处理可诱导t a r 2 在细胞核中集中分布，脱春化处理后蛋白定 位于细胞质中。目前已知，t a v e r 2 通过翻译后水平的修饰参与了小麦春化信号途径。p e r 2 反义转基因小麦在春化后开花时间延迟，表明盈p 豫2 在小麦发育过程中可能对植物开花有 重要的影响。 本论文从已经克隆到的而陋r 2 基因构建超表达载体转化c 2 4 型拟南芥肋脚超 表达拟南芥中，开花时莲座叶数目增加，叶子形态也发生一些改变，且开花时莲座叶数目 与勋珊的表达量成一定的正相关关系，表明转基因植物晚花表型确实是由于外源 勋凇的表达造成。r t - p c r 实验分析表明：与野生型相比，转基因拟南芥兄c 的表达 量上升，e n 7 表达量下降，但同时兄c 的上游调节因子n 伍、捌，p r 7 2 ，没有发 生相应变化，我们总体猜测这可能由于豫p e r 2 参与f i c 的翻译后的组蛋白的修饰而调节 了儿c 的表达。核蛋白w 鼯t 咖分析实验表明，与野生型相比，转基因植物1 1 3 k 4 m 和h 3 k 9 m 的修饰都出现一定程度的下降，说明t a v e r 2 能够对转基因植物体内的组蛋白修改产生影 响，参与了蛋白翻译后水平的修饰。同时c h m 实验结果发现，f i c 的c d o m a i 】1 ( 第一个外 显子与第一个内含子结合的区域) 的染色质组蛋白修饰的水平也发生明显变化。表明 勋脚的导入导致了组蛋白修饰的改变( f i c 组蛋白) 从而造成了f i c 表达量的变化， 出现了晚花表型。 由于而珊是春化相关基因，我们对转基因植物进行了春化处理，结果表明转基因 植物在春化后表现出早花表型。赆p c r 分析也表明可能由于春化后而您r 2 对f 1 c 翻译 后的组蛋白修饰发生改变从而调节了兕c 的表达。同时w e s t 锄结果显示，与春化前及其 野生型相比，春化后转基因植物的组蛋白m k 4 总体修饰水平没有发生显著变化，都呈下 降的趋势；但是组蛋白m k 9 m 总体修饰水平却上升了。由于组蛋白h 3 k 9 m 能够抑制目的 基因的表达，表明组蛋白h 3 k 9 m 的修饰与外源基因豫聊有比较直接的联系。 关键词：勋凇，拟南芥，开花，组蛋白修饰，甲基化 3 首都师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h e 死删i sav e m 黝i 啪l a t i v eg c n ew 雒s c d n 耐o u t 的m 血ew 】蛾珉t i i t i 饥m 4 巴跏啪l钾 m g d o n g1 ) t i a v e r 2 j sa0 v e lj 砌| u n h 衄岫删鼬i s t o r y 1 0 c “z a 廿e x p e r i m 钮i sd e m s 仃a t c dn l a tv e m a l i 2 斌i c o u l di n d u c c 删d e 缸t a r g e t0 f 豫陋r 2 p 0 s t t r 跹s a i p t i a l p o s t t 珊晦l a t i o n a lf c g u l a t i o f 砌凇m a yp l a yv c r yj m p 0 呦n t1 0 l c si n p l a n t 撕e l o p m c n t a t i s i n h i b i t i o no f 忍陋r 2i nt r a | 1 s g c n i cw h e a ts 咖删t h t 蚰t 哪t i t i i mw e r ed c l a y e dc o m p 对e d 谢恤n - 1 【r a n s f o 】衄c dw h e 峨锄路e s t i n gt h a t 托聊p l a y s 龇 i n l p o n a m1 0 l ci nv 豇珊d i z a _ 6 0 ns i 粤i a l i n g 龃dd e v e l o p i n e n ti nw i n t a fw h c 龇 o w 瓿廊如t sf o u n dt h a to v * e 删i 伽o f 忍删i n d u c 鹪t h cp h e t y p eo f l a t c n o w e r i nm c 彳m 6 沈呻( c 砷，m c 删t e c t 哪o f l e a f w 蠲a l c h 柚g c d i n 也e 缸缸s g c n i c 彳阳6 i d 哪话m e 死您r 2 仕黜c d p t l w dw 弱v c r yc l o s e l y 玎e l 棚w i n lm et i m 吨o f n o w e 血gi nt h e 仃a n s g c 玎i cp l 觚协砌妇t e dt h a tl h ep h e n o t y p eo f 协m s g c n i cp l 蛆t sw 鹤 i n d u c c db yt l 圯懿p 螂s i o f 砌哦r t p c r 旺p c r i m c ms h o w c d 也a tt h c 既阳燃i l 吖c l so f 刀西殿凇w e c q u a l w h n e 尼c w 勰血饿举e da n d u 吖w 嬲d e 锹娜c d 咖p 缸c d 诵t h t h c l e v e l s i n w n d t ) ，p c p l a n t s w c s t c m b l o t 锄a l y s i ss h o w c d t h t 血e h i s t o m 砌c a t i 蚰o f m k 4 m 觚dm k 9 mw e d e c 勰c d 伽p a r c d 耐t h 圮l 钾c ki nw i l dt y p ep 1 卸t s w en 既tc x 粗血c d h i s t o l 扯m o d i 丘c a t i 0 f 彤k 4 m 锄dm k 严a t 儿cb yc h r o m a t i ni 邛皿咖o p 崩五p i t a t i ( c 翔p ) ， c c 幔p a r e d 州t hw i l d - t y p ep l a n t s ，仃a n s g e n j cp l a m ss h o w e dam a r k e dr c d u c t i i nh 3 k 4 m 粕da i n c r c 船e dl e v e lo fh 3 k 9 mi nr c g i o 硒c ( t h er c g i j n t e g r c t st h e 丘娼tj n t r 0 血锄dt h e 丘r s tc x o n ) n i i sr u l id 锄0 m t m t e dt h a tt a r 2c a na 饿碰t h em o d i f i c 撕0 no fh i s t 0 ，s 0i n d u c i n g 岫 c h 柚g co f t r a n s c 】邱t l c v e l0 f f 【c 锄d n p h e t y p e l a t e - n o w c r o f 仃a 衄g e n i c p l a n t b e 伽死陋r 2i sav e 加a l i z a t i - r c l a t i v eg c n e ，it h g h tt h a tv e m a l i z 撕啪si m p o n a n t t ot h e 咖s g e n j cp l a n t o 叫e x p 洳e n ts h o w e dt h a tt h ep h 即o t y p co f 仃卸s g e n i cp l 缸tw 猫 e a r l y n o w e ra f t e rv 叩1 a l i 髓6 0 n ，尼愀a n dw 船t 哪p c r i m e n ts h o w e dn l a tm o d i 丘c a t i o n0 f h i s t 呲髂p c c i a l l yh 3 k 9 mp l a y s 龃i m p o r t 柚tr o l ei n 也c 托g i l l a t i o no fp l a n td c v c l o p m mo f 吮n s g 砌cp l a m 加v e r n a l i z a t i o n k e yw o m s ：m e ：冠2 ，彳，四撕盔缈函，n a w e r i n 舀h i s t o n em o d i 丘c a t i o n m c t h y l a t i 4 首都师范大学硕士学位论文 中英文缩略词 英文缩写英文名称中文名称 k a n k a n 锄y c i n卡那霉素 b pb a p a i r 碱基对 b s ab 叭，i l 忙姗ma l b u m i n 牛血清白蛋白 c d n a c o m p l 锄印t a 】r yd n a 互补d n a d e p c d i e m y lp ) 7 a i r b 0 t e 焦碳酸二乙酯 哪 d i t h i r y m i t o l二硫苏糖醇 e 眦 鼬y l 印酣i a m i d et e 舡a a d ca c i d 乙二胺四乙酸 g ao i b b e r e u ca c i d 赤霉素 脚c r r 钾c 啪舡a n 蝴i p t p c r 反转录聚合酶链式反应 皿t g i p r o p 叭b - d 枷喇a 唧y 瑚。鲡血 异丙基硫代b d 埠乳糖苷 l 出k 豇曲岫c 千碱基对 m s m u 随s h j g s k o o g m s 培养基 0 d o p 妇ld s i t y 光密度 o r f o p c n 佗a d 缸g 劬i n e 开放阅读框 r i f r 让a m i 湎利福平 r p p c r r e v 蹦沿t r a n s c r i p d p c r 反转录聚合酶链式反应 s d s s o d i 哪d o d e c y l 锄胁t e 十二烷基磺酸钠 t l 妇 i _ r i s 彻y d m 妒m 劬y 1 ) - a m i n om e 也a 肿 三羟甲基氨基甲烷 m u n 舡雒s h t c dr e g m非翻译区 5 首都师范大学硕士学位论文 第一章文献综述：植物开花的组蛋白甲基化调控分子机理 1 引言 植物开花是指从营养生长到生殖发育的过渡的生理过程，是花芽分化的前奏，包含了 细胞分裂和分化的调控，这一过程涉及不同发育方式的转换，各种不同花器官的发生和发 育，以及在外界环境条件的作用下内部信号的产生、传递和相互作用( i 加g ，1 9 5 2 ) 。成花的 决定过程是决定花的发生以及开花结实完成其个体生活历史的决定步骤，也是植物发育分 子生物学研究最活跃、研究时间最长的问题( 雍伟东等，1 9 9 9 ) 。它的启动和全部进程需 要在特定的环境条件下才能开始和进行，如冬小麦及众多的二年生植物需要经过一个越冬 过程，而另一些植物需要一段时间的长日照( 如菠菜、油菜等) 或短日照( 如菊花、水稻、 大豆等) 。由于人们的引种驯化，这些作物的一些品种逐步适应在较长的日照下开花。由 于各种不同的植物大多具有成花的决定过程，需要经过特定的环境条件的诱导才能开花或 者加速其开花，经分析这些综合条件中的主要作用因子是每天的日照长度( 光周期， p h 0 幻p e ：面d i 锄) 以及低温( 春化作用，v 锄a l i 髓t i 伽) 。植物经这些特定条件的诱导才能开 花，故成花的决定过程通常称之为开花诱导过程。 温度是影响植物开花的一个重要的环境因素。大多数冬性一年生或二年生植物在其种 子萌动期或营养生长初期必须经过一定时期的低温处理( 通常为4 ，2 - 8 周) 才能开花。这一 低温处理一定时期而促进植物开花的作用称为春化作用( 雍伟东等，1 9 9 9 ) 。春化作用具有 以下几个特征。( 1 ) 春化作用是一个缓慢的量变积累的过程，低温处理的时间越短，对开花的 促进作用越弱，而随着低温处理的时间延长，植物的开花时间越短，直到一个饱和状态。 ( 2 ) 春化作用并不改变植物的基因，不具有遗传性。春化作用的效果只可通过有丝分裂在当 代植株中保持稳定，而不能通过有性生殖传递给后代。( 3 ) 春化作用的感受位点在植物的茎 尖和根尖，只有有分裂活性的细胞才能对春化作用做出反应。( 4 ) 春化作用并不直接导致开 花，而只是在很大的程度上加速了开花的进程( 雍伟东等，1 9 9 9 ；w e u e 潞i e l 【1 9 “； i 朋g ，1 9 5 2 ) 。 在遗传学与分子生物学上，开花诱导过程包含了一系列信号转导和基因调控网络的协 同作用( 王听等，2 0 0 5 ；葛磊等，2 0 0 1 ) 。开花决定基因踊，a 田等决定开花的启动过程。 遗传学实验表明这一过程受光周期途径、春化作用途径、g a 途径和自主途径等多种途径 的调控。它们通过一个m a d s 盒类的转录因子o z o 助哝， 昭工d c 砸c ( 咒c ) 。进而 调控口吖，a 雕等基因控制开花过程( m i c h a e l s 锄d a m 勰劬，1 9 9 9 ；s h e l d c ta 1 ，1 9 9 9 ) 。其 窘 首都师范大学硕士学位论文 中兄c 是基因调控网络的枢纽。它的表达受到遗传、表观遗传以及环境因子的多重影响。 儿c 的上游调节因子包括只趴如m 仇r ，) ，陋r 纠，z 4 刀d 2 冗 7 2 j ，用僵，0 9 嬲翻巧 f c d ) ，d 陋r 咫d d u 觥d 倒缎l j 等( a u s i ne ta 1 ，2 0 0 4 ，g e n d a l le ta 1 ，2 0 0 1 ，a 缸k cc t a 1 ，1 9 9 4 ；p i l m lc ta 1 ，1 9 9 5 ；i i cc ta 1 ，2 0 0 4 b ) 且这些因子是通过不同途径来调节尼c 的表 达。d l 她的低甲基化也能够抑制f i c 的表达( j e 蛆c ta 1 ，2 0 0 回。 隗基因是从春化处理的小麦胚芽中获得，它的表达主要出现在幼叶中，春化处理 能够促进其转录( y o n gc ta l ，2 0 0 3 ) 。陋慰基因编码3 0 0 个氨基酸，存在一个植物疾病抗 性反应蛋白结构域与一个茉莉酸诱导凝集素，v e r 2 蛋白序列中也明显存在核定位信号与 多种磷酸化位点。蛋白的磷酸化参与信号的传递，、吲r 2 定位于细胞核内，很可能是调控 基因的转录或者翻译后水平的修饰( 邢立静博士后出站报告，2 0 0 3 ) 组蛋白甲基化是植物发育过程的重要调节方式，其参与开花调控研究近年来有了重要 进展，近几年关于此对植物开花的调节的研究也越来越多。近年来的研究已经初步揭示了 控制咒c 表达的分子机制。遗传学与分子生物学研究表明f r i - 依赖途径、自主途径与春化 途径调控植物的开花过程都是通过影响f 【c 染色体结构来实现的。组蛋白h 3 中的赖氨酸。 包括k 4 - 即组蛋白h 3 中的第4 位的赖氨酸、k 9 、k 2 7 、k 3 6 、和k 7 9 以及组蛋白h 4 中的 赖氨酸k 2 0 都能够被甲基化( s i m sc ta 1 ，2 0 0 3 ) 。其中，1 1 3 k 4 、h b k 3 6 、1 1 3 k 7 9 的双甲 基化能够促进咒c 的表达；而m k 9 与m k 2 7 的双甲基化能够抑制尼c 的表达( z h c t a 1 ，2 0 0 5 ；c e ta 1 ，2 0 0 2 ；b 眦i s t 盯c ta 1 ，2 0 0 1 ；h ec ta 1 ，2 0 0 4 a ) 。在c 2 4 型拟南芥中，f i c 染色体组蛋白h 3 k 4 的三甲基化程度升高；自主途径的抑制因子f l d 与f v e 能够调控h c 染色体的去乙酰化的程度；春化作用对f i c 染色体的组蛋白h 3 k 9 与h 3 k 2 7 的甲基化程 度有促进作用。兄c 组蛋白的甲基化有两个功能：一是使兄c 的组蛋白结构发生变化。使 得r n a 聚合酶i i 更易于靠近见c 二是作为信号可以被开花抑制因子e u 可、e l f 8 、v 砰1 4 组成的p a f l 复合物所识别。p a f l 复合物与e f s 结合，一起识别组蛋白甲基化信号，引导 r n a 聚合酶结合于皿c 5 端序列上，从而起始咒c 的转录。p m l 也可以识别组蛋白甲 基化并与之结合，稳定染色质的构象，维持屁c 的高活性。同时既c 各个区段在不同的条 件下处理下其染色质组蛋白甲基化的程度也不一样( b 弱b 唧c ta 1 2 0 0 4 ) 。 2 植物开花调控的遗传途径 近年来人们应用分子遗传学的方法，通过对模式植物拟南芥的研究发现，发现开花转 变过程是由环境因子及植物内在因素等多因子和多途径控制的。拟南芥遗传学研究表明植 9 首都师范大学硕士学位论文 物开花的主要遗传途径包括光周期途径、春化作用途径、g a 途径和自主途径等( b 0 s se ta 1 ， 2 0 0 4 ) 。这些途径调节尼c 来控制尼ka 川等开花决定基因，实现对开花过程的控制。他 们之间具有严格的调控关系和相互作用，最终激活花原基内的同源异型基因表达，促使花 器官形成。m 7 是目前已知的一个最早花同源基因，即开花的的早期起作用，并且直接激 活另一基因a w 的表达( w 电n 盯c ta 1 ，1 9 9 9 ；触e i m e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 自 甲基化 营养生长i 胤a p l生殖生长 _ _ _ _ _ o 图1 ：调节植物开花的的基因与遗传途径( j n ，2 0 0 回 f i g u 陀1 ：( ；锄璐锄d g e n e 吐c p a n 附a y s 如l v e d 缸n 地m g i 】l a t i o fp l 卸t n 渊嘲_ i n g ( k i n ，2 5 ) 2 1 光周期途径 光周期对开花的调节是依赖于关键基因控制。光周期途径中已经鉴定出多个控制基因。 其中c d m s 尉船亿钞) 是最重要的基因之一。拟南芥c d 突变体在长日照条件出现晚花的表 型，短日照条件下和野生型的没有差别，表明这类基因介导由光周期引起的开花早晚。所 以归为光周期途径。编码一个锌指类蛋白，表达量的多少与转基因植物开花的早晚程 度成比例关系，表明它可能在光依赖的调节开花中起核心作用，且它的表达受到光周期的 调控( 0 n 伽c h ic ta 1 ，2 0 0 0 ) 。与c d 突变体一样，与弦突变体在长日照条件下开花也推迟，但在 短日照条件下开花不受影响( k 0 0 m n e c f c ta 1 ，1 9 9 1 ；脚加e c fc ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 2 2 春化作用途径 春化作用是冬性和二年生植物开花的重要调控方式。春化基因( 豫) 也是在小麦中 定义的，在拟南芥和小麦中分别克隆了删和珊基因，并且两个物种都以完全相同的 命名，但是它们化学本质是完全不同的( y 趾e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。参与春化途径调节的基因还有 陋r 2 ，蹦，等等( c h o n ge ta 1 ，1 9 9 4 ；y o n gc ta 1 ，2 0 0 3 ；s 彻ga n da m 勰i n o ，2 0 0 4 a ) 。植物中 1 0 首都师范大学硕士学位论文 d n a 甲基化参与对发育过程的调节最早的报道是在春化作用的实验中得到验证的( j 咖e t a 1 ，2 0 0 5 ) 在春化途径中，舢、舢，啊发挥着重要的作用，它们可能是通过影响染 色质的结构来实现春化作用促进植物的生殖生长。删编码一个m y b 相关的d n a 结合蛋 白e ta 1 ，2 0 0 回，另外，删还有2 个p e s t 区域，为转录激活域，并且参与蛋白酶降解 蛋白的生化过程( s c h u b c l 盯c ta 1 ，2 4 ) ，、，】r n l 定位到细胞核内，参与染色质结构的改变 c ta 1 ，2 0 0 回；聊编码一种与组蛋白甲基化转移酶同源的多聚o m n b 蛋白( b 曲ee ta 1 ， 2 0 0 1 ) ；阳a 日编码一个含有p h d 结构域的蛋白，p 皿类型蛋白质与染色质空问结构的变化有 关，推测其可能是染色质修饰复合体的一个元件( s u n g 觚da m 鹬i ，2 0 0 4 b ) 。小麦v 】r n l 和 t n 2 以及、倒r 2 是控制小麦春化作用介导的重要基因。其作用机制可能和拟南芥中不同 ( a m a 豳oc ta 1 ，2 0 0 5 ；y o n ge ta 1 ，2 0 0 3 ；胡巍，2 0 0 4 ；赵仲华，2 0 0 6 ) 。近年来，从拟南芥 已经分离到了大量由于影响染色质修饰而调节开花的基因，如用酊，尼w ，z 兕2 ，正：l 刀 等等r a m e y e ta 1 ，1 9 9 刀。 2 3 卧途径 赤霉素( g ag i b b e r i m n ) 途径是控制开花过程的重要途径，g a 也是传统上认为控制开 花过程的开花素重要组分之一( y u c ta 1 ，2 0 0 6 ) 。在短日照条件下，拟南芥由营养生长向生殖 生长转变受到花的分生组织特征基因越盯的正向调节，而g a 能够促进髓y 的表达 l 矗z q u c zc ta 1 ，2 0 0 0 ) 。另外，花粉囊的形成与花粉小孢子的发生也依赖于g a 调节的部分 d e i i a 蛋白的表达，g a 是通过解除d e i j a 蛋白对植物开花的抑制作用从而促进植物开花 的( f ue ta 1 ，2 0 0 2 ；m c g i n l l i se ta 1 ，2 0 0 3 ；s a s a k ie ta 1 ，2 0 0 4 ) 。已有研究表明，m i c 砌姨也可能 参与了g a 促进花的发育过程。推测肌识j 锣是g a 信号相关因子g 蝴刀活性维持稳定的调 节因子，从而参与g t m 瞪依赖的信号传导途径( a c h a r dc ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 2 4 自主控制途径 促进植物的开花不仅仅需要外在条件的作用，也需要内在因子的参与。拟南芥晚花突 变体触哳玛磁办l 倒被认为是由于自主( a u c 0 咖。峭) 途径的破坏而造成植物的晚花现象，且 它们不受光周期的调控假m n e c f c ta 1 ，1 9 9 1 ；l c ta 1 ，1 9 9 4 ；a l 柚dy 如吕1 9 9 8 ) 。f i 巴4 编码一个r n a 结合蛋白，含有一个w w 蛋白相互作用的结构域，跟果蝇( 功删如) 的 繇j 与e 翻堪因有一定的同源性( m 池i 曲t e tc ta 1 ，1 9 9 7 ) 。上d 编码一个含有核定位信号的 蛋白，跟哺乳动物的转录结构域同源，也与植物的d n a 结合结构域有比较高的同源性( k e 首都师范大学硕士学位论文 c ta 1 ，1 9 9 4 ) 。n ，编码一个含有w d 重复的结构域，且c - 端含有两个p p 结构域( m a c k 血g h tc t a 1 ，2 0 0 2 ；q l l 船a d ac ta 1 ，2 0 0 3 ；s i m p s e ta 1 ，2 0 0 3 ) p p i j p 在酵母中的同源蛋白p f s 2 p 是 m q a - 3 端的加工剪切过程的重要蛋白( 0 h c k e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。，明也编码一个m 蛆结合蛋白， 它可能是通过丌俘发生作用。屁d 编码一个与人的组蛋白去乙酰化酶复合体同源的蛋白，表 明它可能是通过对染色体的修饰来发挥功能但a l 【i m ic ta 1 ，2 0 0 3 ；h ee ta 1 ，2 0 0 4 a ) 。 2 5 陬i 依赖的途径 以上四个途径是通过解除或者减缓忍c 的抑制作用而促进开花的，而f ：r 堤促进忍c 的 表达的，同时脚依赖的途径是c z 4 型拟南芥所特有的，腿影响拟南芥开花时间的关键 基因，c 2 4 型拟南芥中，兄c 的表达不受自主信号和光周期途径的调控。脚能够促进兕c 的 表达从而延迟开花，删码一个含有两个螺旋环螺旋结构域的蛋白，表明其可通过与其 他蛋白或者核酸相互作用来实现功能的( j o h a n s e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。在植物发育过程中，脚的 表达量都非常的低且不受春化作用的影响；与兕c 不同的是，豫，影响开花没有数量效应， 多拷贝的或者超表达豫嘟不能明显影响开花的过程现在也在拟南芥中克隆到了能够促 进兕c 表达的用u 同源基因豫u ( m i c h a c ks de ta 1 。2 0 0 4 ) 。 在这些途径中，参与自主信号途径的突变体通过抑制咒c 的表达来促进开花；在晓4 型拟南芥中，自主信号途径的作用能够被f 砒依赖的途径所取代；但春化作用能抑制f i u 依赖的途径发生作用。 2 6f l c 在植物开花中的关键作用 尼c 编码一个m a d s b o x 蛋白，在序列上保守性不强，是开花的负调控因子，很多控制 开花的基因功能都是通过调节f i c 来实现的。它主要在植物的根与茎的顶端部分表达 ( m i c h l s 缸da m 髂i l mc ta 1 ，2 0 0 0 ) ，它对开花的抑制程度与其表达量成正比关系( m i c h a c l s 趾da m 嬲i ，1 9 9 9 a ；s h e l d “a 1 ，1 9 9 9 ) 。n 可能通过阻遏开花信号途径的因子从而来抑 制植物的繁殖生长。在拟南芥中，也已经克隆到了一些与既c 同源的基因，如此t 巧，脚f ， 此4 砣，兕k 偶a t c l i 脏c ta 1 ，2 0 0 1 ，2 0 0 3 ；t o d de ta 1 ，2 0 0 4 ) 等，它们在植物开花过程中也起着 负调控的作用。尼c 及其同源基因抑制一组开花促进因子的表达，如刀，s d a ( n n s s e ta 1 ， 1 9 9 8 ；k 础i l s k yc ta 1 ，1 9 9 9 ；k o b a y 够h ie ta 1 ，1 9 9 9 ；b l a z q u e za n dw c i g e l ，2 0 0 0 ；l c ta 1 ， 2 0 0 0 ；s 锄a c he ta 1 ，2 0 0 0 ) ，它们的表达又能够促进一些分生组织特征基因l 翻n 与爿p z 的 表达。凡c 是开花调控过程一个起决定因素的调控因子，它受g a 、光周期、春化与自主途 首都师范大学硕士学位论文 径的负调控，受删- 依赖途径的正调控。遗传与分子生物学研究表明，f r i 与自主及春化途 径可能是通过影响f i r 的染色体结构来调控砚c 的表达的。 3 植物春化过程中的特征分析与分子机制 低温对植物的影响首先表现出一种逆境，而植物为了适应这种逆境，细胞内部进行了 相应的代谢调节；增加磷脂层的不饱和度而改变膜的流动性，加强蛋白质和糖类代谢，产 生抗冻蛋白等与抗低温相关的代谢产物，改变胞质渗透压，降低冰点温度等。在研究植物 对春化作用的感应部位和效应部位发现：当对植物茎尖和叶片分别分别进行低温处理，只 要茎尖进行一定的低温处理就可以促进植物开花，而单独叶片进行低温处理植物开花没有 受到促进，说明春化作用的部位在植物的茎端分生组织( c l l n i sc ta 1 ，1 9 3 0 ) 。春化作用是一 个缓慢的量变积累的过程，低温处理的时间越短，对开花的促进作用越弱，而随着低温处理 的时间延长，植物的开花时间越短，直到一个饱和状态，这似乎植物在春化作用的过程中 呈现一个量变的积累，而且发生反应的时间与发生效应的时间间隔较大，这一点也不同于 光周期反应。经过春化作用开花的植物，传粉受精的产生的后代依然需要春化作用来促进 开花，春化作用的状态不能够遗传给后代，会随着减数分裂或其他有性生殖过程而消失 ( b c m i c r1 9 8 8 ；e v a 璐1 9 印；b a p p 西如1 9 7 3 ) 。春化作用促进植物开花的效应会应高温等发 生脱春化现象，使植物返回到未春化的状态。植物在感受春化作用的过程中，需要细胞有 旺盛的代谢活性，谭克辉( 谭克辉等，1 9 8 3 ；1 9 9 2 ；1 9 9 8 ) 利用一系列的代谢抑制剂， 在研究冬小麦的春化作用中发现春化过程的代谢方式具有严格的顺序性和多步骤性。 近年来随着分予遗传学的迅速发展，人们利用模式植物拟南芥和冬小麦等已经分离鉴 定了许多与春化作用相关的突变体，克隆了相应的基因并对这些基因进行了功能分析，使 我们对于春化作用的机理有了分子水平的认识( f i 舳e g 姐c ta 1 ，1 9 9 8 ；c a n d i c cc ta l 2 0 0 0 ) 黜与舢是春化过程中两个重要的基因，但是它们的表达不受春化作用的调控。在春 化过程中，野生型拟南芥与突变体册j 和v 埘2 的尼c 的表达量都受到抑制( g e n d a l lc ta l 。 2 0 0 1 ；h ye ta 1 ，2 0 0 回，但不同的是，当植株重新回到正常生长环境中，突变体盼砚c 表达 量有迅速升高，显示未春化的状态，从而表现为开花延迟，而野生型的兄c 表达量变化却 不大。这表明阳硼和珊的功能是在春化作用后维持对兄c 表达的持续抑制。拟南芥y 打d 突变体分析发现，蹦，是在春化作用中扮演受体的作用，玩3 具有感受低温的特性，只有经 过长时间的冷处理之后，蹦，才能够被诱导表达，且只有瞅，被诱导后，儿c 的表达量才会 受到抑制，其所表达的部位也主要在根、茎的项端分生组织( s u n ga n da m 鸽i ，2 0 0 4 b ) 。 1 3 首都师范大学硕士学位论文 春化作用涉及多个基因并与多条途径均有联系。在拟南芥中大多数基因最终都作用于 关键基因兕c 从而实现开花促进作用。其春化作用的信号转导途径可以概括为：首先，由 珊啊感受低温处理的时间而表达并激活对开花关键基因凡c 转录的抑制；同时，职耐咒c 转录的促进作用受到抑制；进而眈c 的抑制状态被粼和黜所识别，在随后的生长 发育过程中二者共同作用维持了稳定的兕c 表达抑制状态。冬小麦中则可能是低温信号首 先被绝勉或一些未知的因子所获得，进而使得冬小麦开花抑制因子p r 2 表达受到抑制， 导致开花下游抑制因子的关闭以及删等开花促进因子的开启( a m 镐i l m ，2 0 0 5 ) ( 图2 ) 最 近人们通过对春化相关基因的克隆与功能分析，发现春化基因对于忍c 表达的调节是通过 对兄，c 染色质组蛋白的修饰，进而改变了兕，c 染色质的空间结构来实现的。春化作用导致 蹦，表达，进而使基因尼c 染色质组蛋白1 1 3 1 【9 和1 1 3 k 1 4 去乙酰化，因而儿c 染色质构型 发生了改变，这种染色质构型的改变使得组蛋白1 1 3 特异位点甲基化成为可能。在豫m 和 靴以及其他一些相关基因的共同作用下，使砚c 染色质h 3 k 9 、h 3 k 2 7 甲基化从而形 成稳定的异染色质，实现了对兄c 的抑制，从而加速了开花的进程。但在冬小麦中春化作用 促进其开花的过程是否也涉及其关键基因染色体空间结构的改变还需要进一步的证实。 il v 删，w ，1 2 硼咐忙， 上上 上 i s o c ，t f r 。l c 2 l 上 ii v b 学妇h r 州嘲f n 口咱时哪忡。f 轴_ 嘲籼g 图2 ： 拟南芥( a ) 和冬小麦0 ) 春化作用途径各基因间相互作用岫劬，2 0 0 回 脚2 ：釉a l i z 砸叩p a 由张y s 埠印l a 血gn 删枷n gt i m e 妯4 阳她i 叼凼( a ) 姐dw h c 融( b ) 娜h l o ， 2 0 0 5 、 4t a v e r 2 与植物开花 中国科学院植物研究所种康实验室早在1 9 9 4 年开始通过建立差异筛选富集低温诱导 1 4 首都师范大学硕士学位论文 冬小麦c d n a 文库及差异显示技术，得到了一系列春化相关的c d n 屯克隆了基因删、 陋砌7 、阳t c 锣和阳t c 钳。通过反义砒q a 等技术对这些基因的研究表明。它们均受春化作 用诱导而表达，在未春化和脱春化材料中不表达。p 躲2 调节春化诱导的开花过程m n g c ta l ，2 0 0 3 ) 陋r 2 基因组序列含有3 个内含子，4 个外显子，c d 量i a 全长1 1 9 5 b p ，编码3 0 0 个氨基。其 蛋白结构有两种结构域存在，在5 a a 1 5 3 a a 之间，是一个植物疾病抗性反应蛋白结构域： 另一个在1 7 0 a a 3 0 0 眦间，是一类茉莉酸诱导凝集素，这一类结构域也常存在于植物的 防御反应体系中。陋r 2 基因一方面受春化的诱导，另一方面舢弘和茉莉酸也能诱导腑 基因的表达。在勉蛋白上存在多种磷酸化位点，蛋白的磷酸化参与信号的传导，、吲眩 定位于细胞核中，很可能是调控基因的转录或者翻译后修饰( 邢立静博士论文，2 0 0 3 ) 。 m 峨原位杂交实验证明，觋的表达主要在经春化作用处理的幼叶中。构建反义砌叮a 导入植株可使开花明显延迟。上述结果显示，p e r 2 在春化作用信号传递中起重要作用通 过对陋r 2 启动子的研究表明，内源陋勉表达与春化过程中染色质结构的改变没有直接关 系，而可能是受春化作用处理所诱导产生的其他转录因子调控。p e r 2 的表达分别可受到 春化作用和茉莉酸的诱导，且二者诱导该基因表达的模式相近，因而推测茉莉酸可能参与 细胞对春化信号的反应过程m n g e ta l ，2 0 0 b ) 。 同时通过转化反义陋砌7 观察到，反义植物开花显著被抑制。m 1 7 蛋白含有h 蝣 构域，与丝氨酸蛋白酶有较高的相似性，丝氨酸蛋白酶一般在其他蛋白翻译后的修饰过程 起作用，调控蛋白半衰期、亚细胞转动或活性，提示陋础7 编码的蛋白可能具有丝氨酸蛋白 酶活性，进行一系列的蛋白活性调控作用( 徐文忠等，2 0 0 5 ) 。 瞬时表达分析表明m 2 蛋白具有核定位特征，其序列中存在一个类核定位信号 ( n 】l s ：2 1 9 - r t k g p r e k _ 2 3 1 ) 。春化处理可以诱导v e r 2 的表达以及核定位；脱春 化处理则导致v e r 2 的核定位特征消失，蛋白仅定位于细胞质中。即v e r 2 在春化应答过 程中具有核质定位特征。陋勉的表达可以被a b a 和j a 所诱导。、幔2 通过与t a s p y 的 相互作用响应春化信号转导途经。弧2 在春化信号途经中可能具有0 g l c k 修饰与 0 一p h o s p h o r ) ，l a t i o n 修饰质之间的动态转变，即“阴一阳”关系。其氨基酸序列中的“阴一 阳”位点位于第3 3 位的s 盯以及第2 0 9 位的1 1 1 r 残基。t a s p y 可能对v e r 2 进行翻译后水 平的o g l c n a c 修饰，对二者的细胞定位产生影响，进而调控下游的信号转导事件。对r 2 与t a s p y 的作用模式、生化特性、陋r 2 与开花基因之间的关系及其他v e l 匕相互作用蛋 白的研究，有助于阐明v e r 2 在春化应答过程中的作用机理( 邢立静博士后出站报告， 首都师范大学硕士学位论文 5 植物组蛋白的甲基化修饰 在真核细胞中，基因组聊峨是由组蛋白( h 1 ，i 毪气1 1 2 b ，m 趾d1 1 4 ) 包裹折叠形成染 色体而存在与细胞核中( l n g c re ta 1 ，1 9 9 r 7 ) 。细胞以这样的形式包裹它们的d n a5 i 而使调 节蛋白在细胞周期中能够很好地激活或者抑止目的基因的表达，且能够在d n a 修复损伤、 重组调节与d n a 复制中发挥重要作用。染色体结构的改变对d n a 与转录因子的结合具有重 要的影响，从而造成基因的表达的差异。染色体结构的变化也能够影响基因的时空表达， 组蛋白的乙酰化、甲基化、糖基化、磷酸化和泛素化的修饰能够影响它所包裹的基因的转 录活性( s 舡a h l 觚d a u i s ，2 0 0 3 ) ，例如春化过程需要f i c 的组蛋白的甲基化修饰( b a s l o w c ta i ， 2 0 0 4 ) 。组蛋白，特别是他们的末端，能够受到多种形式的修饰，包括乙酰化、甲基化、磷 酸化与泛素化等。这些修饰可以认为是染色体结构的“组蛋白密码它们能够决定染色体 所包围的基因的转录活性( s t r a h lc ta 1 ，2 0 0 1 ) 。大多数的组蛋白甲基化修饰发生在赖氨酸 残基( k ) 上，k 能够被单甲基化、双甲基化与三甲基化修饰，特定位点甲基化程度的不同 其功能也不相同。一般来讲，低等真核生物的特异位点的组蛋白的单甲基化、双甲基化与 三甲基化都被一种酶所调控；在高等生物中，一种甲基转移酶只能够调控特异位点的组蛋 白一种程度的甲基化( p a t r i c k c ta l2 0 0 6 ) 。h b k 4 、田k 3 6 和h 3 k 7 9 位点的甲基化能够 促进目的基因的转录活性，而h 3 k 9 、h 3 一k 2 7 和h 4 k 2 0 位点的甲基化作用反之。h 3 k 4 、 h 3 k 9 、h 3 k 2 7 和h 3 k 3 6 与h 4 k 2 啦点的甲基化是被一种含有s e t 结构域组蛋白赖氨酸甲 基转移酶( m ( m t s ) 所催化形成，s e t l 是一种甲基转移酶能够催化组蛋白h 3 k 4 位点的三 甲基化( r 0 9 i l c ve ta 1 ，2 0 0 1 ；s 蛆i o s r 0 s ac ta 1 ，2 0 0 回；1 1 3 - k 7 9 位点的甲基化是被不含s e t 结 构域的m 【m b 所催化形成( s i m se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。酵母的s e t 结构域大约含有1 3 0 个氨基酸，其晶 体结构显示其形成一个结状结构从而组成一个具有催化活性的酶。现在数据库中可以查询 到拟南芥、水稻与玉米都含有s e t 结构域的蛋白。拟南芥中的d d m l 在维持磁甲基化也具 重要作用，在野生型拟南芥的异染色质中，转座子与不表达基因跟组蛋白h 3 酗的甲基化有 很大关系，而表达基因偏好于h 3 k 4 的甲基化；而在胁l j 突变体中，这种情况刚好相反 ( g e n d r e lc ta 1 ，2 0 0 2 ) 。已知机制显示，组蛋白h 3 k 9 位点的甲基化引发h p l 蛋白结合与染色 体上，导致异染色体的形成与基因表达的沉默锄i s t c r c ta 1 ，2 0 0 1 ) 。也有证据显示组蛋白 的甲基化跟d n a 的甲基化有一定的关系( j e 趾c ta 1 ，2 0 0 5 ；b u me ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 染色体免疫共沉淀( c h 口) 是研究生物体内特定位点组蛋白修饰程度的有效方法。在染 1 6 首都师范大学硕士学位论文 色质甲基化修饰中，它是包含染色体片段的共沉淀和p c r j ，增与组蛋白结合的d n a 的体内 实验，它能够发现尼c 染色质组蛋白哪些区域的甲基化修饰与其表达直接相关。在植物中 吼口实验开始是用来在拟南芥中定位锚定组蛋白的亚细胞核分布( a s c e n z ia n dg 缸t t ， 1 9 9 9 ) ；c 五l l a 在植物中用此方法研究了凡饱基因的染色体结构，具体来讲，是通过检测组蛋 白m 和h 4 的乙酰化来实现的( 既岫c ta l 。2 0 0 1 ) 5 1 春化作用与组蛋白甲基化 拟南芥在春化作用下，n 3 蛋白与其他相关蛋白构成具有组蛋白去乙酰化酶活性的复 合物饵d a c ，印w 屺能特异地使得尼c 染色质m k 9 、h 3 - k 1 4 发生去乙酰化。组蛋白 h 3 一k 1 4 的去乙酰化导致了彪c 染色质空间结构的改变，使得e f s 无法靠近砚c 染色质，因 而不能形成啦k 4 三甲基化，p a f l 复合物找不到h 3 k 4 三甲基化信号而不能激活尼c 的表 达，从而实现了对觑d 障录的抑制。恢复到正常生长条件后，归不再表达，f i 的抑制作 用被解除( s u n g 缸da m 勰i n 0 2 0 0 4 a ) 。但是春化作用对f i 艨达抑制的维持还需要黜和 靴的共同作用。春化作用后，拟南芥野生型托c 染色质组蛋白h 3 k 9 和h 3 k 2 7 的双甲基 化水平升高，但是在突变体唧2 和啪j 确没有