（细胞生物学专业论文）转人端粒酶基因骨髓间充质干细胞的构建及其细胞特征分析.pdf

浙江大学博士学位论文图表目录图表目录图1p g r n l 4 5 质粒结构和酶切点。5 6图2 内切酶e c o ri 和b a m hi 酶切质粒p g r n l 4 5 的电泳图。5 6图3 表达h t e r t 逆转录病毒重组载体的构建流程图。5 7图4 表达h t e r t 的逆转录病毒重组载体p l x s n h t e r t 的酶切鉴定结果。5 8图5 骨髓间充质干细胞的分离6 0图6 病毒液处理前后的各代骨髓间充质干细胞。6 0图7h t e r t - h m s c s 的细胞生长曲线6 1图8 正常h m s c s 和h t e r t - h m s c s 的端粒酶活性的检测结果6 2图9r t - p c r 检测h t e r t - h m s c s 的端粒酶基因的电泳结果。6 3图1 0h t e r t - h m s c s 的端粒酶基冈的n o r t h e r n b l o t i n g 检测结果。6 3图nb t e r t - h m s c s 的端粒酶基因的w e s t e r nb l o t t i n g 检测结果。“图1 2h t e r t - h m s c s 表面抗原表达的流式细胞术分析6 5图1 3 染色体核型分析6 6图1 4 转人端粒酶基因骨髓间充质干细胞向脂肪细胞，软骨细胞，成骨细胞方向诱导6 8图1 5p l x s n e g f p 载体的构建流程图。7 0图1 6 表达h t e r t 的逆转录病毒重组载体p l x s n - e g f p 的酶切鉴定结果7 1图1 7p l x s n h t e r t - e g f p 的构建流程图。7 1图1 8p l x s n h t e r t - e g f p 重组载体的酶切鉴定结果。7 2图1 9 骨髓间充质干细胞端粒酶定位。一7 3图2 0 免疫缺陷小鼠致瘤实验结果和软琼脂培养克隆形成试验结果7 4图2 1 第1 2 代h m s c s 细胞样品的双向凝胶电泳图7 6图2 2 第9 5 代h t e r t - h m s c s 细胞样品的双向凝胶电泳图一7 7图2 3 第2 7 5 代h t e r t - h m s c s 细胞样品的双向凝胶电泳图7 7图2 4r e t i c u l o c a l b i n1 的质谱图7 9图2 5 差异蛋白分类一7 9图2 6r t - p c r 和w e s t e mb l o t 检测差异表达蛋白8 0表1 标准牛血清白蛋白的稀释3 5表2 蛋白质含量的测定4 0表3 各株转染细胞包装病毒的滴定结果一5 8表42 0 种差异表达的蛋白一8 1表5 鉴定出的1 0 0 种蛋白8 21 0 7浙江大学博士学位论文中文摘要中文摘要端粒酶是一种由r n a 和蛋白质两种组份构成的核糖核蛋白复合体，其中r n a组份是端粒酶复制时用的模板，蛋白质组分主要是端粒酶催化亚单位，又叫做端粒酶逆转录酶( h t e r t ) ，它的功能是利用r n a 模板复制端粒的重复片段，延长端粒。端粒的长度和细胞分裂时端粒损失的速度决定了不表达端粒酶细胞的衰老和寿命，而在表达端粒酶的细胞中端粒酶能补充端粒长度，使细胞的生命延长甚至永生。骨髓间充质干细胞( h m s c s ) 在细胞移植，基因治疗，组织工程方面有重要作用，但是骨髓间充质干细胞体外增殖能力弱，传代能力差。延长骨髓间充质干细胞的生命周期能弥补骨髓问充质干细胞来源的不足，具有重要的实际意义。因此，本研究制备了表达h t e r t 基因的重组逆转录病毒，在分离培养骨髓间充质干细胞的基础上，将h t e r t 基因导入骨髓间充质干细胞中，并传代2 9 0 代以上。在传代过程中，对转导h t e r t 基因的细胞进行了功能和特性的分析。目的：通过重组逆转录病毒技术体外转导h t e r t 基因，建立过表达端粒酶的h m s c s ，经传代培养观察过表达端粒酶的h m s c s 分裂和增殖能力以及细胞生命周期变化。阐明使用h t e r t 作为目的基因能否延长h m s c s 的生命周期，并研究过表达端粒酶h m s c s 的表面抗原，细胞核型特征与致瘤性，向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞方向分化的潜力以及细胞蛋白组学特征。为将来构建适用于临床的、有较长生命周期和有一定分化能力的骨髓间充质干细胞打下理论基础。方法和结果：使用重组病毒技术构建表达h t e r t 的重组逆转录病毒，用该病毒感染骨髓间充质干细胞，并使用t r a p p c r 方法证实我们重建了细胞的端粒酶活性。我们将转导了h t e r t 的细胞接种于免疫缺陷小鼠皮下，未见肿瘤形成。转导细胞的软琼脂细胞克隆形成实验阴性，表明转导h t e r t 的骨髓间充质干细胞未出现恶性转化，没有成瘤作用。另外，转导了h t e r t 的骨髓间充质干细胞在相应诱导液的作用下，能够向成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞方向分化，证实了细胞的多向分化潜能。采用双向凝胶电泳加基质辅助的激光解吸离子化飞行时间质谱方法( 2 d e m a l d i t o f - m s ) 分析转导h t e r t 与未转导h t e r t 的h m s c s 的蛋白组学2浙江大学博士学位论文中文摘要差异，我们鉴定了1 0 0 种蛋白点，发现有2 0 种蛋白质有差异表达。结论：使用表达h t e r t 的重组逆转录病毒感染的骨髓间充质干细胞能够再建细胞的端粒酶活性，克服细胞的复制衰老，延伸了细胞生命周期。免疫缺陷小鼠皮下接种实验和细胞克隆形成实验表明转导h t e r t 的骨髓间充质干细胞没有成瘤作用。在相应诱导液的作用下，转导h t e r t 的骨髓问充质干细胞能够向成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞方向分化。差异蛋白组学分析表明，在过表达端粒酶h m s c s 中有1 1 种蛋白表达明显升高，有9 种蛋白表达明显下降。本文研究结果提示h t e r t 具有抗复制衰老、延伸细胞生命周期的生物学作用，转导了h t e r t 的骨髓间充质干细胞具有向多种细胞分化的潜能，在组织工程，细胞工程，和基因工程方面有很大的应用前景。我们的结果为研究h t e r t 基因延长细胞生命周期的分子机制提供了重要的线索。关键词：端粒酶；端粒酶逆转录酶；细胞生命周期；重组逆转录病毒；细胞分化；致瘤性；蛋白组学；差异表达。3浙江大学博士学位论文abstracla b s t r a c tt e l o m e r a s ei sar i b o n u c l e o p r o t e i nc o n s i s t i n go fr n aa n dp r o t e i n s t h er n ac o m p o n e n t sa r et e m p l a t e so ft e l o m e r er e p l i c a t i o n t h ep r o t e i nc o m p o n e n t sc o n s i s to ft e l o m e r a s ec a t a l y s i ss u b u n i t sa n do t h e ra s s o c i a t e dp r o t e i n s t h et e l o m e r a s ec a t a l y s i ss u b u n i ti sa l s on a m e dt e l o m e r a s er e v e r s et r a n s c r i p t a s e ( t e r 0t h a tp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nt h er e p l i c a t i o no ft e l o m e r er e p e a ts e q u e n c e sa n dt h ee x t e n s i o no ft e l o m e r e s i nt e l o m e r a s e n e g a t i v ec e l l s ，t h ec e l l u l a rs e n e s c e n c ea n dt h el i f e s p a nd e p e n do nt h el o s sr a t eo ft e l o m e r e sd u r i n ge a c hc e l ld i v i s i o na n do nt h ep r i m a r yl e n g t ho ft e l o m e r e i nt e l o m e r a s e - p o s i t i v ec e l l s ，t h et e l o m e r a s ec a ne x t e n dt h et e l o m e r el e n g t h ，p r o l o n gt h el i f e - s p a no fc e l l sa n de v e nc a u s et h ei m m o r t a l i z a t i o no fc e l l s t h eh u m a nm s c sp l a yi m p o r t a n tr o l e si nc e l lt r a n s p l a n t a t i o n ，g e n et h e r a p ya n dt i s s u ee n g i n e e r i n g t h ep r o l i f e r a t i o nc a p a c i t yo fh m s c si nv i t r oi sl i m i t t e d t h e r e f o r e ，i ti si m p o r t a n tt op r o l o n gt h el i f e - s p a no fh u m a nm s c st om a k eu pt h es h o r t a g eo fc e hs o u r c e i nt h ep r e s e n ts t u d y ,w ec o n s t r u c t e dar e t r o v i r u se x p r e s s i n gh t e r tg e n e ，e s t a b l i s h e dal i n eo fh m s c st r a n s d u c e dw i t he x o g e n o u sh t e r t ( h t e r t - h m s c s ) a n di n v e s t i g a t e di t ss u s t a i n i n gc e l l u l a rp r o p e r t i e si nal o n g - t e r mc u l t u r ef o ro v e r2 9 0p o p u l a t i o nd o u b l i n g s ( p d s ) o b j e c t ：al i n eo fh m s c so v e r e x p r e s s i n gh t e r ti sc o n s t r u c t e db yt r a n s d u c t i n gh t e r tg e n e si n t oh m s c sw i t har e c o m b i n e dr e t r o v i r u s t h ec e l lp r o l i f e r a t i o na n dt h el i f e s p a no f t h et r a n d u c e dc e l l sa r eo b s e r v e dd u r i n gc u l t u r ea n dp a s s a g e a ni nv i t r oa s s a yo fc e l lg r o w t hi ns o f ta g a ra n da ni nv i v oa s s a yo ft u m o r i g e n i c i t yi nn o d s c i dm i c ea r eu s e dt ot e s tt h et u m o r i g e n i c i t yo fh t e r t - h m s c s t h eo b j e c t i v eo ft h ep r e s e n ts t u d yi st oi l l u m i n a t ew h e t h e rt h eh t e r tg e n ec a np r o l o n gt h el i f e s p a no fh u m a nm s c s ，t oi n v e s t i g a t et h es u r f a c ea n t i g e n s ，k a r y o t y p i cc h a r a c t e r i s t i c s ，t u m o r i g e n i c i t y , t oi n v e s t i g a t et h em u l t i p o t e n t i a l so fd i f f e r e n t i a t i o ni n t oa d i p o c y t e s ，c h o n d r o c y t e sa n do s t e o c y t e s ，a n dt oi l l u m i n a t et h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i n sb e t w e e nt h ep r i m a r yh m s c sa n dt h eh t e r t - h m s c s w eh o p et h ep r e s e n ts t u d yc a nb eu s e f u lt oc o n s t r u c tc l i n i c a l l ya p p l i e dc e l ll i n e so fh m s c sw i t hap r o l o n g e dl i f e - s p a na n dm u l t i p o t e n t i a l so fd i f f e r e n t i a t i o ni n t om e s e n c h y m a ll i n e a g e si nf u t u r e m e t h o da n dr e s u l t s ：h m s c sw e r ei n f e c t e db yt h er e c o m b i n a n tr e t r o v i r u se x p r e s s i n g4浙江大学博士学位论文a b s t r a c th t e r t t r a p - p c ra s s a yp r o v e dt h a tt h ea c t i v i t yo ft e l o m e r a s ei nt h eh m s c sh a db e e nr e c o n s t i t u t e d w ea p p l i e da ni nv i t r oa s s a yo fc e l lg r o w t hi ns o f ta g a ra n da l li nv i v oa s s a yo ft u m o r i g e n i c i t yi nn o d s c i dt oc o n f i r mt h et r a n s f o r m i n ga c t i v i t yo fh t e r t - h m s c sc e l l s t h es i g no ft r a n s f o r m a t i o nw a sn o td e t e c t e di nh t e r t - h m s c s ，w h i c hs h o w e dt h a th t e r t - h m s c sh a v en ot u m o r i g e n i c i t yp o t e n t i a l a f t e re x p o s u r et oa d i p o g e n i c ，c h o n d r o g e n i ca n do s t e o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o nm e d i a ，h t e r t - h m s c sc o u l dd i f f e r e n t i a t ei n t oa d i p o c y t e s ，c h o n d r o c y t e sa n do s t e o c y t e sr e s p e c t i v e l y , w h i c hs h o w e dt h a th t e r t - h m s c sh a v et h em u l t i p o t e n t i a l so fd i f f e r e n t i o ni n t oa d i p o c y t e s ，c h o n d r o c y t e sa n do s t e o c y t e s b yt w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i sa n dp e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t i n g ( p m f ) u s i n gm a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m e - o f - f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y ( m a l d i - t o f o m s ) ，w ei d e n t i f i e d1 0 0p r o t e i n si n c l u d i n g2 0d i f f e r e n t l ye x p r e s s e dp r o t e i n si nh t e r t - h m s c s c o n c l u s i o n ：t h et e l o m e r a s ea c t i v i t yo fh m s c sw a sr e c o n s t i t u t e db yr e c o m b i n a n tr e t r o v i r u se x p r e s s i n gh t e r t t h el i f e s p a no fh m s c sw a se x t e n d e da n dt h er e p l i c a t i v es e n e s c e n c ew a so v e r c o m e t h ei nv i t r oa s s a yo fc e l lg r o w t hi n s o f ta g a ra n di nv i v oa s s a yo ft u m o r i g e n i c i t yi nn o d s c i dc o n f i r m e dn ot u m o r i g e n i c i t yp o t e n t i a lo fh t e r t s h m s c s h t e r t s h m s c sh a v et h em u l t i p o t e n t i a l so fd i f f e r e n t i a t i o ni n t oa d i p o c y t e s ，c h o n d r o c y t e sa n do s t e o c y t e sa f t e re x p o s u r et oa d i p o g e n i c ，c h o n d r o g e n i ca n do s t e o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o nm e d i ar e s p e c t i v e l y t h ep r e s e n ts t u d ys h o w st h a th t e r th a st h ec a p a c i t yo fo v e r c o m i n gr e p l i c a t i v es e n e s c e n c ea n dp r o l o n g i n gt h el i f e - s p a no fh m s c s t h e r ew e r e1 1p r o t e i n su p - r e g u l a t e da n d9p r o t e i n sd o w n r e g u l a t e di nh t e r t s h m s ci nc o m p a r i s o nw i t hp r i m a r yh m s c s h t e r t s - h m s c sh a v ea ni n t e r e s t i n gp e r s p e c t i v ei nt i s s u ee n g i n e e r i n g ，c e l le n g i n e e r i n ga n dg e n ee n g i n e e r i n g k e y w o r d s t e l o m e r e ；t e l o m e r a s e ；l i f e s p a no fc e l l s ；r e c o m b i n a n tr e t r o v i r u s ；c e l ld i f f e r e n t i o n ；t u m o r i g e n i c i t y ；p r o t e o m i c s ；d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s i o n5浙江大学博士学位论文i 上j l 一月i j 吾骨髓间充质干细胞( m s c s ) 来源于中胚层，具有自我更新和多向分化能力。骨髓间充质干细胞能够分化为多种类型的终端细胞，包括骨( b r u d e r 等，1 9 9 7 和1 9 9 8 ) 、软骨( k a d i y a l a 等，1 9 9 7 ) 、神经元( w o o d b u r y 等，2 0 0 0 ) 、造血支持基质细胞( d e n n i s 等，1 9 9 9 ) 、肌腱( y o u n g 等，1 9 9 8 ；a w a d 等，1 9 9 9 ) 、肌肉( f e r r a r i等，1 9 9 8 ；g a l m i c h e 等，1 9 9 3 ) 和脂肪( p r o c k o p 等，1 9 9 7 ；d e n n i s 等，1 9 9 9 ) 。由于骨髓间充质干细胞的这种广泛的体内及体外分化能力在再生医学、组织工程和一基因治疗领域具有重要的潜在应用，分离纯化和体外扩增这些干细胞就显得相当有用。另外，m s c s 具有取材方便，不存在免疫排斥反应，而且易于进行细胞扩增，易于临床应用的特点，是一种重要的组织工程种子细胞。现在已经有报道将m s c s诱导分化为成骨细胞、软骨细胞，并在临床上用于修复骨组织、软骨组织的缺损。此外，由于m s c s 具有独特的细胞增殖分裂模式，使外源基因易于导入和表达，而使其成为潜在的基因治疗靶细胞。但是，体外培养的骨髓间充质干细胞为有限增殖，一般传代到第1 0 2 5 代左右就会出现老化甚至死亡。因此，如何防止细胞老化以及能够从分离的少量骨髓问充质干细胞经体外培养获得大量的种子细胞是组织工程需要解决的重要问题。端粒酶由端粒酶r n a ( h t r ) 、端粒酶相关蛋白( t p l ) 及端粒酶催化亚单位( h t e r t ) 三个亚基组成，是真核生物体内具有逆转录酶活性的核糖核酶，对端粒酶活性表达起着决定性的作用。体细胞中由于没有h t e r t 的活化，端粒酶不表达，随着有丝分裂次数的增加，细胞端粒长度逐渐缩短。加大端粒酶表达可以延缓端粒丢失速度，从而延缓细胞衰老。d n a 复制时，生物体内催化d n a 复制的d n a 聚合酶只能催化5 3 方向的d n a 链延伸，通过复制泡和复制叉形成前导链的连续性复制和滞后链不连续性复制。在线形染色体d n a 的复制中，r n a 引物占据了滞后链末端的一段d n a 序列，每次复制的子代d n a 都比其亲本d n a 少一段末端d n a 序列，这就是d n a 的末端复制问题。这就意味着细胞每分裂一次都要耗损一段染色体末端d n a 序列，即端粒。端粒是染色体稳定的重要结构，在细胞分裂过6浙江大学博士学位论文翮舌程中端粒的耗损是激活细胞衰老和凋亡的重要因素。b l a c k b u r n 等在1 9 7 8 年发现四膜虫的端粒是重复串联的5 - g g g g t r - 3 d n a 简单序列。后来g e i r d e r ( 1 9 8 5 ) 等发现端粒酶可用这种简单序列给端粒d n a “加尾 。之后，在h e l a 细胞中也发现了人端粒酶活性。这些发现意味着端粒的长度是可以改变的，端粒的“加尾”可能与肿瘤的永生化特性有关，为端粒和永生化的关系提供了直接的证据。本实验在将h t e r t 转导到骨髓间充质干细胞的基础上，将转导了h t e r t 基因的细胞在相应的诱导培养液作用下依次诱导成脂肪细胞，软骨细胞，成骨细胞，并观察其细胞学变化，另外还研究了转导了h t e r t 的骨髓问充质干细胞的致瘤性和蛋白组学差异表达。研究结果表明，转导了h t e r t 的骨髓问充质干细胞仍是具有单一特征的、均质的细胞群。其在体外以单层生长，外形类似成纤维细胞，呈长梭形，迅速地克隆性扩增，呈旋涡状盘旋排布，即使传了很多代后仍具有h m s c s的相似特征。但是在细胞内部，转导了h t e r t 基因的骨髓间充质干细胞和原代骨髓间充质干细胞的蛋白表达有明显的不同，表明过表达h t e r t 基因增长了细胞生命周期并在分子水平上调节细胞其它基因的表达。但其机理机制仍然不清楚，还需进一步研究。7浙江大学博士学位论文文献综述第一部分文献综述第一章骨髓间充质干细胞研究进展1 9 6 8 年，f r i e n d e n s t e i n 等首先证实在骨髓中存在一种纺锤形的成纤维细胞集落形成单位( c o l o n y f o r m i n g u n i t sf i b r o b l a s t s ，c f u f ) ，这些细胞具有高度的自我更新和分化能力( f r i e n d e n s t e i n 等，1 9 6 8 ) 。1 9 9 1 年，c a p l a n 把这些能在体外扩增并可多向分化的细胞群命名为骨髓间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s )( c a p l a n ，1 9 9 1 ) 。目前普遍认为m s c s 是来源于中胚层的具有多向分化能力的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，人脐血中亦可分离得到这类细胞。m s c s 能够在体外或者体内分化为多种类型的组织，特别是中胚层来源组织的细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞等等。因此m s c s 是组织工程中非常重要的种子细胞，具有广泛的应用潜力。另外有学者认为m s c s 是一种非常合适的基因传送载体，具有应用于基因治疗领域的诱人前景。而且，m s c s 是研究细胞自我更新机制、肿瘤细胞永生性、细胞信号调控等重大生物学问题的良好生物材料( k o l f ，2 0 0 7 ) 。然而，m s c s 在体外扩增代数有限，而且目前缺乏分离m s c s 的有效技术，相关领域的研究进展缓慢( c o l t e r ，2 0 0 0 ) 。相信随着m s c s 分离技术的成熟和增加m s c s 体外扩增代数的技术的实现，这种重要的干细胞将更广泛地应用于生物学、医学领域。1 骨髓间充质干细胞表面标志通过流式细胞仪检测技术，m s c s 表面抗原的鉴定取得了很大的进步。m s c s具有特征性的表面标志，它不表达血细胞及内皮细胞的抗原。它的特点是：不表达c d 3 4 ( 造血干祖细胞及内皮细胞呈阳性) 、c d 4 5 ( 白细胞呈阳性) 、h l a d r ( 抗原呈递细胞及成纤维细胞呈阳性) 和c d l l 7 ，而只表达c d 2 9 、c d 4 4 、c d l 0 5 、c d l 6 6 等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志，尤其是c d l 0 5 和c d l 6 6 已被一些学者作为m s c 的特征性标志( 郭子宽等，2 0 0 0 ；p r o c k o p 等，1 9 9 7 ；m a j u m d a r8浙江大学博士学位论文文献综述等，1 9 9 8 ) 。c d 4 4 是透明质酸和骨桥蛋白等几种配体的受体，透明质酸和骨桥蛋白分别在骨髓和骨细胞外基质的建构中发挥核心作用。另外，m s c s 还表达大量的粘附分子、生长因子和细胞因子受体、整合素和其它的特殊表面标志。而且，m s c s除了具有与上皮细胞、内皮细胞和肌肉细胞相同的表面标志外( m i n g u e l l 等，2 0 0 1 ) ，还表达广泛的细胞表面抗原( s i m m o n s 和t o r o k - s t o r b ，1 9 9 1 ；v o g e l 等，2 0 0 3 ；j i a n g等，2 0 0 2 ) 。通过特异抗表面标志的单克隆抗体( 如s t r o 1 、s h 2 、s h 3 和s h 4 )来体外分离m s c s 已经取得了很大的成绩( g r o n t h o s 等，1 9 9 4 ；h a y n e s w o r t h 等，】9 9 2 ) 。一2 骨髓间充质干细胞多向分化潜能m s c s 的一个重要特征是具有多向分化潜能。f d e d e n s t e i n 首先证实了m s c s具有分化为骨、软骨、纤维组织的能力。1 9 9 9 年p i t t e n g e r 等从人的髂骨骨髓样本中分离得到了m s c s ，在体外不同分化条件的诱导下，可以形成成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞，并且克隆化得到的细胞具有类似的分化特性，充分证明骨髓基质中m s c s 是多潜能干细胞( p i t t e n g e r 等，1 9 9 9 ) 。h a l l e u x 等( h a l l e u x 等，2 0 0 1 ) 从成人骨髓中分离的间充质细胞稀释后以低密度接种培养出来的由单个细胞生长而成的克隆，能在体外连续扩增培养2 0 多代，并且可以分化为成骨细胞，软骨细胞，成脂肪细胞，证实了骨髓中分离出来的间充质细胞中含有具有干细胞特性，即高度自我更新能力和多向分化潜能的单个细胞。骨髓间充质干细胞向其它细胞分化依赖于体外培养条件。地塞米松，维生素c 等化学物质，b m p 、t g f - b 等细胞因子可促进m s c s 向成骨细胞方向分化，促进成骨标志产物a l p 、b g p 、骨桥蛋白等的高效表达( m a d e ，2 0 0 6 ) 。地塞米松作用于m s c s 后，骨髓间充质干细胞a l p 活性增强，骨钙素( b g p ) 、骨桥蛋白的合成明显增加。地塞米松能够促进m s c s 的成骨分化，先是以促进基质合成为主，后是以促进矿化为主。b m p 的靶细胞是血管周围具有分化能力的间充质细胞，它是特异性的骨生长因子，它能够启动m s c s 的成骨过程，促进m s c s 分化为成骨细胞，诱导成骨细胞成骨表型的表达。9浙江大学博士学位论文文献综述在体外的研究发现m s c s 向软骨细胞分化受众多因素的影响。o w e n 等将体外培养的m s c s 接种至扩散盒中，然后移植到动物体内发现在扩散盒中央可形成软骨，而周围可形成骨组织，他认为这可能是由于中央区氧分压较低所致( o w e n 等，1 9 8 7 ) 。n o b l e ( n o b l e 等，1 9 9 5 ) 等在体外单层培养m s c s 过程中加入硫酸葡聚糖，发现m s c s 可形成聚集，免疫组化证实在细胞聚集中央区域能够检测到i i 型胶原，提示聚集的m s c s 已分化为软骨细胞。j o h n s t o n e 等( j o h n s t o n e 等，1 9 9 8 ) 建立了一种m s c s 聚集培养方法。先将单层培养扩增的m s c s 经低速离心后形成微团，然后在一些化学成份特定的培养基中进行培养。研究发现，含1 0 - t m 地塞米松的无血清培养液可诱导部分m s c s 向软骨细胞分化，而含1 0 n g m l 转化生长因子1 31 ，( t g f - 1 31 ) 的无血清培养液可诱导全部m s c s 向软骨细胞分化，且地塞米松和t g f - 1 31 的联合作用要优于两者的单独作用。b a r r y 等( b a r r y 等，2 0 0 1 ) 进一步研究发现t g f 1 32 和t g f 1 33 诱导m s c s 向软骨细胞分化的能力强于t g f l 31 ，并根据研究结果，可将聚集培养的m s c s 向软骨细胞分化的过程分成三步：第一步为诱导分化前6 d ，标志为纤维调节素及软骨低聚基质蛋白( c a r t i l a g eo l i g o m e r i cm a t r i xp r o t e i n ，c o m p ) 的表达上调；第二步为分化的7 d 左右，标志为l i 型胶原和软骨粘连蛋白的表达，硫酸软骨素逐渐增多；第三步为接下来的1 4 d 里，糖胺多糖逐渐累积，最终形成成熟的软骨细胞。此外，一些研究还表明成纤维细胞生长因子2( f g f - 2 ) ( m a s t r o g f a c o m o 等，2 0 0 1 ) 、骨形态发生蛋白( b m p 2 ，b m p 9 ，b m p 6 )( m a j u m d a r 等，2 0 0 1 ；s e k i y a 等，2 0 0 1 ) ，胰岛素样生长因予1 ( i g f - 1 ) ( l i ，2 0 0 7 ；s e k i y a 等，2 0 0 2 ) 均有诱导m s c s 向软骨细胞分化的作用。m s c s 定向分化成特殊的成熟细胞是一个严格而又短暂的过程。涉及到许多转录因子、细胞因子、生长因子和细胞外基质的相互作用。近2 0 年来关于m s c s的多潜能性的报道很多，这类体外研究试验均是针对不同分化方向采用了各种不同的诱导剂，分别使m s c s 向不同的终末细胞分化，例如骨( b r u d e r 等，1 9 9 7 和1 9 9 8 ) 、软骨( k a d i y a l a 等，1 9 9 7 ) 、肌肉( f e r r a r i 等，1 9 9 8 ；g a l m i c h e 等，1 9 9 3 ) 、肌腱( y o u n g等，1 9 9 8 ；a w a d 等，1 9 9 9 ) 、脂肪( p r o c k o p 等，1 9 9 7 ；d e n n i s 等，1 9 9 9 ) 、造血支持基质细胞( d e n n i s 等，1 9 9 9 ) 和神经元( w o o d b u r y 等，2 0 0 0 ) 等等。很多先进技术如d n a 芯片技术已经被应用于骨分化、脂肪分化和软骨分化过程的研究1 0浙江大学博士学位论文文献综述( d o i 等，2 0 0 4 ) 。但是m s c s 的分化机理至今仍然不能清楚地阐明。具体的分化机理还有待进一步的研究。3 骨髓间充质干细胞在细胞和基因治疗方面的应用由于m s c s 的多向分化潜能以及广泛的自我更新能力，m s c s 在细胞和基因治疗领域具有巨大的前景( b e m a r d o ，2 0 0 6 ；c a p l a n ，2 0 0 1 ；d e a n s ，2 0 0 0 ) 。动物移植研究表明，体外扩增的m s c s 能分化为定居点的组织，修复由于损伤或疾病引起的组织功能缺失( w o l f ，2 0 0 7 ) 。m s c s 不仅能再生问质组织，如椎间软骨( c r e v e n s t e n 等，2 0 0 2 ) 、骨( c h a m b e r l a i n 等，2 0 0 4 ) 、心肌细胞( g r i n n e m o 等，2 0 0 4 ) 和膝关节人工软骨( b a r r y ，2 0 0 3 ；d j o u a d ，2 0 0 6 ) ，而且能分化成来自其它胚层的组织，如神经元( s u g a y a 等，2 0 0 3 ) 和上皮细胞( o r t i z 等，2 0 0 3 ) 等。证明m s c s 在细胞治疗领域的组织修复和再生工程中有重要的作用。为了发展m s c s 在组织再生治疗方面的用处，人们利用了几种方法将外源d n a 导入m s c s 中。病毒转染，特别是逆转录病毒介导的基因转移，能产生高效低变异的稳定细胞克隆。这使得病毒转染技术能够广泛应用于基因治疗领域。如金丹等( 金丹等，2 0 0 2 ) 使用含编码b m p 的基因片段( h b m p 7 ) 的重组逆转录病毒液感染兔骨髓m s c s ，结果显示，经h b m p 7 基因转染的骨髓m s c s 与与空载体转染及未转染的骨髓m s c s 在细胞增殖、细胞周期表现方面差异无显著性，经转染的骨髓m s c s 合成胶原显著高于对照组。提示经逆转录病毒转染的细胞合成胶原的能力显著增强。尽管m s c s 具有巨大的应用潜力，但是由于分离或扩增的m s c s 数量上的限制，实际应用有限( b i a n c h i ，2 0 0 3 ) 。在骨髓移植和大的骨缺失修复方面，从m s c s组织中分离的m s c s 太少而不能应用。不像胚胎干细胞，m s c s 缺少端粒酶活性( z i m m e r m a n n 等，2 0 0 3 ) 。在体外培养3 4 5 0 个群体倍增后，细胞即失去多向分化潜能。因此研究既能有效保持m s c s 多向分化能力又能有效地扩增m s c s 的策略就显得很重要。已有研究表明将人端粒酶逆转录酶基因( h t e r t ) 转入m s c s 中能有效扩增m s c s ，并且保持了m s c s 的成骨、成软骨、成脂肪、成神经和基质分化能浙江大学博士学位论文文献综述力( s i m o n s e n 等，2 0 0 2 ；s h i 等，2 0 0 2 ) 。而且，有些h t e r t 转染的细胞具有正常的核型，不会导致肿瘤形成。因此，转染有h t e r t 基因的m s c s 可以在组织再生和修复中成为一种有用的细胞。4 问题和展望由于m s c s 具有取材方便、体外易分离扩增、在适宜条件下可多向分化等特点，现己成为组织工程中一种常用的种子细胞。另外由于它的干细胞特性及体外多次传代培养后仍能保持其多向分化等特点，又成为良好的基因载体之一。虽然近年来对m s c s 的研究已取得很大进展，但仍有许多问题尚待解决。首先，m s c s 的分离和扩增方法需进一步完善( t u b y ，2 0 0 7 ；s c h r e p f e r ，2 0 0 7 ) ，其次，m s c s 实验仅限于自体移植方面，在异体移植免疫反应问题上有待进一步探索( m i n a m i d e ，2 0 0 7 ) ，再次，m s c s 的定向分化机制、条件还不是很清楚，其机制、机理有待进一步研究( s c h i l l i n g ，2 0 0 7 ) ，第四，m s c s 基因转染技术还面临基因选择、基因表达调控、基因转染安全性等一系列问题，第五，如何促进m s c s 同载体材料相容生长有待进一步解决。总之，大量的研究证据已经表明m s c s 存在于人的各种组织和器官中。这些细胞具有广泛的多向分化能力。相信随着上述问题的解决，m s c s 在细胞工程，组织工程，基因治疗中会有更广泛的应用前景。第二章细胞的永生化研究进展细胞永生化是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力的过程。4 6 年前，h a y f l i c k 等( 1 9 6 1 ) 首次发现在体外培养的人正常细胞，经一段时间的分裂，就会进入一种生长抑制状态，即衰老期( m 1 期) ，大多数真核生物细胞( 生殖细胞除外) 都具有这种特性。经转化了的细胞可越过衰老期而进入另一增殖抑制状态，即危机期( m 2 期) 。危机期的细胞开始出现退化，并逐渐死亡。只有少数细胞在一定因素的影响下，端粒酶被激活，以自身r n a 为模板合成端粒d n a 来补充或延长端粒，恢复染色体的稳定性，从而使细胞越过危机期，发生了永生化。1 2浙江大学博士学位论文文献综述细胞的永生化技术1 病毒转染1 ) s v 4 0 病毒近年来，人们成功获得多种s v 4 0 转化的永生细胞株，应用的方法包括：野生型s v 4 0 病毒共培养感染靶细胞、磷酸钙法、电穿孔以及逆转录病毒载体导人s v 4 0大t 抗原基因等方法( c o t s i k i 等2 0 0 4 ) 。y o w n s e n d 等在h b m m 细胞中导人s v 4 0大t 抗原基因，3 个月后部分克隆度过了危机期，并获得了2 个永生细胞系h b m m i 1 和h b m m i 2 ( y o w n s e n d 等，1 9 9 3 ) ；k o b a y a s h i 等( 2 0 0 1 ) 在s v 4 0大t 抗原基因两侧加了一对l o x p 重组靶位点，转染人的肝细胞，结果获得了一个可逆的永生细胞克隆