（细胞生物学专业论文）小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的分离及分化潜能的研究.pdf

s t u d yo n t h ei s o l a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n p o t e n t i a io fm o u s ee sf r o m p a r l t h e n o g e n e t i ce mb r y o s x i a o h u i z e n g s p e c i a l t y ： c e l lb i o l o g y c o l l e g e ：c o l l e g eo fl i f e s c i e n c e s u p e r v is o r p r o f e s s o rx u e f e n gl i s u b m i t t e dd a t e ： m a y3 0 ，2 0 0 8 摘要 小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的分离 及分化潜能的研究 专业：细胞生物学申请人：曾晓辉导师：李雪峰研究员 摘要 胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l ，e s ) 是由早期胚胎内细胞团 ( i n n e r c e l lm a s s ，i c m ) 、畸胎瘤细胞( t e r a t o c a r c i n o m ac e l l s ，e c ) 或原始 生殖细胞( p r i m a r yg e r mc e l l ，p g c ) 经体外分离、抑制分化培养获得的全 能性干细胞。孤雌生殖胚胎e s 细胞( p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o n i cs t e m ， p e s ) 是继正常受精胚胎干细胞之后近年研究较为热门的另一类干细 胞。 本论文通过免疫法制备兔抗鼠抗血清，用免疫外科法分离小鼠胚 胎孤雌激活发育到囊胚时期的内细胞团，将分离的内细胞团在体外进 行抑制分化培养、扩增，得到能稳定扩增的小鼠孤雌生殖胚胎干细胞 系；并初步研究了它们在体内、体外的分化潜能。结果如下： 1 通过常规免疫法制备了兔抗鼠抗血清，并通过红细胞溶解法进 行效价测定，抗血清稀释到l 16 ，补体血清稀释到1 l6 能高效地分离 出小鼠胚胎内细胞团。 2 为了提供孤雌生殖胚胎e s 细胞较好的培养环境，用丝裂霉素c 处理小鼠胎儿成纤维细胞，制备饲养层细胞。本研究用不同浓度的丝 裂霉素c ( 1 0 p g m l 、15 p g m l 、2 0 p g m l 、2 5 p g m 1 ) 处理小鼠胎儿成纤维 细胞3h ，流式细胞检测结果表明这些处理都能不同程度地抑制细胞 分裂，尤其以1o p g m l 处理3h 效果较好，既能显著地抑制细胞分裂， 细胞凋亡率又较低。 3 本实验对不同发育阶段孤雌胚胎进行了内细胞团的分离与培 养比较，结果表明用扩张囊胚分离i c m 与建立胚胎二f 细胞的效率均比 摘要 早期囊胚和孵化胚要高，因此选择扩张囊胚来分离内细胞团，并以此 建立小鼠孤雌生殖胚胎干细胞系。 4 本研究建系的小鼠孤雌生殖胚胎干细胞至少可传至2 5 代。选 取了第2 代和第15 代的p e s ，都能表达很强的碱性磷酸酶。 5 在小鼠p e s 细胞传代lo l5 代中多次检测核型，发现细胞系 的核型稳定，呈4 0 x x 。 6 将传至第l8 代的小鼠p e s 细胞消化后，接种至昆明鼠睾丸的 被膜下，4 周后，小鼠的睾丸异常增大。接种后第5 周，睾丸被膜下 形成肿瘤，将肿瘤进行常规石蜡切片，h e 染色，结果显示分离培养 的p e s 在体内可分化为外胚层、中胚层和内胚层的组织细胞。免疫组 化显示：神经细胞特异性烯醇化酶n s e 、肌肉特异性肌动蛋白仅a c t i n 均呈阳性，表明了分离培养的p e s 在体内可至少分化为来自外胚层和 中胚层的组织细胞。 7 将传至第2 0 2 4 代的小鼠p e s 细胞，经体外定向诱导分化， 可定向分化为节律性收缩的心肌细胞及神经细胞。免疫组化检测显示 节律性收缩的心肌细胞表达肌肉特异性肌动蛋白o c a c t i n ，而神经细胞 表达神经细胞特异性烯醇化酶n s e 。 关键词：小鼠孤雌生殖胚胎干细胞分化潜能 a b s t r a c t s t u d yo nt h eis o l a tlo na n ddlf f e r e n tla tio np o t e n tia l o fm o u s ee sf o r mp a r t h e n o g e n e t ice m b r y o s m a j o r ：c e l lb i o l o g y n a m e ：x i a o h u iz e n g s u p e r v i s o r ：x u e f e n gl i a b s t r a c t e m b r y o n i cs t e mc e l l ( e s ) i st h et o t i p o t e n tc e l lw h i c hc a nb ec l o n e d f r o mt h ei n n e rc e l lm a s s ( i c m ) o fe a r l ye m b r y o s ，t e r a t o c a r c i n o m ac e l l s ( e c ) o rp r i m o r d i a lg e r ms t e mc e l l s ( p g c ) p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o n i c s t e mc e l l ( p e s ) i sa n o t h e rk i n do fs t e mc e l lw h i c hw a sd e r i v e df r o m p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o s a n dp a i e da t t e n t i o nb ym a n ys c i e n t i s t si nr e c e n t y e a r s i nt h i s p a p e r ，t h e r a b b i ta n t i - m o u s ea n t i s e r u mw a s p r e p a r e d a c c o r d i n gt oi m m u n o r e a c t i o n ，a n dt h ei c mo fm o u s ep a r t h e n o g e n e t i c b l a s t o c y s t sw e r ei s o l a t e db yt h ei m m u n o s u r g i c a lm e t h o d t h em o u s ep e s w e r ee s t a b l i s h e da n dt h e d i f f e r e n t i a t i o n p o t e n t i a l o f p e s w a s i n v e s t i g a t e di nv i v oa n di nv i t r o t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w ： 1 t h er a b b i ta n t i m o u s ea n t i s e r u mw a sp r e p a r e da c c o r d i n g t o i m m u n o r e a c t i o na n dt h ee f f i c i e n c yo ft h ea n t i s e r u mw a sd e t e r m i n e db y t h eh a e m o l y s i sm e t h o d t h ei c mo fm o u s ep a r t h e n o g e n e t i cb l a s t o c y s t s c a nb es e p a r a t e de f f i c i e n t l yw h e nt h ea n t i s e r u ma n dc o m p l e m e n tw e r e d i l u t e dt o1 16 2 i no r d e rt op r o v i d eaf a v o r a b l ee n v i r o n m e n tf o rp e sg r o w t h ，m o u s e e m b r y of i b r o b l a s t s ( m e f ) w e r eu s e da st h ef e e d e rc e l l sa n dt r e a t e dw i t h m i t o m y c i n c f o r3h o u r s t h er e s u l t so ff l o wc y t o m e t r ys h o w e dt h a t d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fm i t o m y c i n c ( 1o p g m l ，15 i r t g m l ，2 0 p g m l i i i a b s t r a c t a n d2 5 p g m 1 ) c a nr e s t r a i nt h ec e l ld i v i s i o no fm e f e s p e c i a l l y ，1 0 p g m l 。 m i t o m y c i n - cr e s t r a i n e d c e l ld i v i s i o ne v i d e n t l ya n dr e s u l t e di nl o w a p o p t o s i s 3 t h ed i f f e r e n td e v e l o p m e n tp h a s e so fp a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o sw e r e c o m p a r e df o rt h ee f f i c i e n c i e so ft h ei c m i s o l a t i o na n dc u l t i v a t i o n t h e r e s u l ts h o w e dt h a te x p a n d i n gb l a s t o c y s t sw e r em o r ee f f i c i e n ti ni c m i s o l a t i o na n d p e s e s t a b l i s h m e n t e a r l yb l a s t o c y s t s a n dh a t c h e d b l a s t o c y s t s 4 t h em o u s ep e sc o u l dc u l t u r ei nv i t r oa tl e a s tt o2 5p a s s a g e sa n d s h o w e dv e r ys t r o n ga c t i v i t yo fa l k a l i n ep h o s p h a t ee n z y m e 5 t h e k a r y o t y p eo ft h e m o u s ep e sf o r m10t o15p a s s a g e sw a s e x a m i n e da n ds h o w e da s4 0 x x 6 t h em o u s ep e sa tt h e18 t hp a s s a g ew e r et r y p s i n e da n di n o c u l a t e d i n t ot h et e s t i c l ee n v e l o p eo fk u n m i n gm o u s e a f t e rf o u rw e e k s ，t h et e s t i s e n l a r g e da b n o r m a l l ya n d w e r et r e a t e dw i t hp a r a f f i ns e c t i o na n dh e s t a i n i n g t h er e s u l t s s h o w e dt h a tp e sd i f f e r e n t i a t e di n t oe c t o d e r m ， m e s o d e r ma n de n d o d e r m d e r i v e dc e l l si nm o u s et e s t i s i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys h o w e dt h a t m o u s et e s t i sh a dn e u r o ns p e c i f i c e n o l a s e ( n s e 、a n dm u s c l es p e c i f i c 仅一a c t i np o s i t i v ec e l l sw h i c hp r o b a b l y d e r i v e df o r mp e s 7 t h em o u s ep e sf o r m2 0t o2 4p a s s a g e sw e r ed i r e c t i o n a l l yi n d u c e dt o d i f f e r e n t i a t ei nv i t r o t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e yc a nb ed i f f e r e n ti a t e d i n t om y o c a r d i a lc e l l sw i t ht h er h y t h mo fc o n t r a c t i o na n dn e r v ec e l l s i m m u n o c y t o c h e m i s t r y s h o w e dt h a t m y o c a r d i a l c e l l sw e r ea a c t i n p o s i t i v e c e l l sa n dn e r v ec e l l sw e r en s ep o s i t i v ec e l l s t h e s e d a t a i n d i c a t e dt h a tm o u s ep e sa tl e a s tc a nb ed i r e c t i o n a l l yi n d u c e di n t o e c t o d e r ma n dm e s o d e r m d e r i v e dc e l l s k e yw o r d s ：m o u s e p a r t h e n o g e n e t i c e sd i f f e r e n t i a t i o np o t e n t i a l i v 目录 目录 摘要i a b s t r a c t iii 目录v 第1 章引言1 第2 章文献综述3 2 1 干细胞研究的起源3 2 2 胚胎干细胞的研究起源与进展4 2 3 胚胎干细胞6 2 3 1 胚胎干细胞的定义6 2 3 2 胚胎干细胞的分离方法7 2 3 3 胚胎干细胞生物学特性9 2 4 胚胎干细胞的体外诱导分化12 2 4 1 向造血细胞的定向分化12 2 4 2 向神经细胞的定向分化13 2 4 3 向肌细胞定向分化16 2 4 4 向血管和内皮细胞的定向分化1 8 2 4 5 向生殖细胞的分化18 2 4 6 向其他细胞和组织定向分化2 0 2 5 胚胎干细胞的应用f j i f 景21 2 5 1 探讨胚胎发育的调控机制21 2 5 2 利用胚胎干细胞研究基因功能2 1 2 5 3 制备转基因动物和人类疾病模型2 l 2 5 4 胚胎干细胞应用于心肌修复2 2 2 5 5 作为细胞替代治疗和基因治疗的载体2 3 2 5 6 药物筛选平台的建立，药理研究与新药开发2 3 2 6 胚胎干细胞研究中的主要问题2 3 2 7 结束语2 5 v 目录 第3 章实验研究2 6 3 1 实验材料j ：2 6 3 2 实验方法2 7 3 2 1 兔抗鼠抗血清( a n tis e r u m ) 制备2 7 3 2 2 饲养层细胞的处理2 8 3 2 3 卵母细胞的孤雌激活2 9 3 2 4 小鼠p e s 细胞的建系3 0 3 2 5 小鼠p e s 细胞的核型鉴定3 1 3 2 6 小鼠p e s 细胞的体外分化实验3 1 3 2 7 小鼠p e s 细胞的体内分化实验3 2 3 2 8 统计分析3 3 第4 章结果3 4 4 1 抗血清的效价3 4 4 2 不同浓度丝裂霉素c 对小鼠胎儿成纤维细胞的影响3 5 4 3 卵母细胞的孤雌激活与内细胞团的分离及培养3 7 4 4 不同发育阶段孤雌胚胎对内细胞团的分离效率的影响3 9 4 5 胎牛血清及血清替代品对p e s 细胞生长的影响3 9 4 6 小鼠p e s 细胞的a k p 染色及核型鉴定4 0 4 7 小鼠p e s 细胞的体外分化4 1 4 8 小鼠p e s 细胞的体内分化4 2 第5 章讨论4 5 5 1 兔抗鼠血清的制备4 5 5 2 孤雌生殖胚胎干细胞系建立的影响因素4 5 5 3 孤雌生殖胚胎干细胞的体外增殖4 9 5 4 孤雌生殖胚胎干细胞的体外分化5 0 5 5 孤雌生殖胚胎干细胞的体内分化5 5 第6 章结论5 7 参考文献5 8 致谢7 l v i 第1 章引言 第1 章引言 孤雌生殖是指在没有精子参与的情况下，卵细胞能发育为个胚 胎的过程。即无雄性配子的任何作用，由雌性配子产生的胚胎，不论 其是否发育成个体，均称为孤雌生殖( p r i m a k o f fe ta 1 2 0 0 6 ) 。自然 界孤雌生殖是一种繁殖现象，在爬行类动物、鱼类动物、鸟类动物也 存在着一定的孤雌生殖现象。两栖类动物的卵子能够为实验激活、卵 裂，并且有少数可以发育成个体( j u r ye ta 1 19 9 7 ) 。我国生物学家朱 洗等由蛙子宫取出蛙卵，使其卵膜粘有蛙血后用细针刺激，结果其中 lo 2 0 与受精卵一样可以进行正常卵裂，并获得了两只单性繁殖蛙 ( v i d a e u se ta 1 1 9 9 7 ) 。 哺乳类动物卵母细胞在体外激活后其孤雌激活胚可以发育到囊胚 期，在鼠和非人灵长类如猴子中已建立了孤雌胚胎干细胞系，具有与 胚胎干细胞相似的多潜能性。人类卵母细胞可在体外激活后成功获得 孤雌激活胚，并在体外培养可发育至囊胚。 n e w m a n s m i t h 等研究发现来自鼠孤雌胚的i c m 在增殖和分化方 面存在着缺陷，源自孤雌胚的i c m 不能保持未分化的干细胞状态，且 几乎分化为独有的体壁内胚层细胞( n e w m a n s m i t h ，w e r b 19 9 5 ) 。 l i n 等运用孕马血清和人绒毛促性腺激素对鼠进行超排，获得m i i 卵 母细胞，经孤雌激活和体外培养，从而建立了3 个纯合的孤雌胚胎干 细胞系( l 5 ，l 10 和l c 5 7 ) ( l i ne ta 1 2 0 0 3 ) 。 此外，国内有刘红林，陈林君等人先后也获得了孤雌生殖胚胎干 细胞集落。上述研究，虽然获得了孤雌生殖胚胎干细胞，但都没有做 过体内、体外分化的研究，孤雌生殖胚胎干细胞有哪些特性还是未知 的，对其进行研究是否价值也是未知的。 2 0 0 5 年，s d n c h e z p e r n a u t e 等建立了的人的孤雌生殖胚胎干细胞 系，并在体外定向诱导出能表达多巴胺的神经细胞，植入体内在很长 的时间内存活( s d n c h e z p e r n a u t ee ta 1 2 0 0 5 ) 。2 0 0 7 年，l e n g e r k e 等 研究了孤雌生殖胚胎e s 细胞的分化潜能，形成了畸胎瘤，石蜡切片 结果显示能在体内分化为含三个胚层的细胞和组织( l e n g e r k ee t a 1 华南师范大学硕士学位论文 2 0 0 7 ) 。2 0 0 7 年，姜华等获得了孤雌生殖胚胎e s 细胞系3 株，其中 一株注入裸鼠体内能分化成三个胚层来源的组织细胞，另外2 株参与 形成了嵌合体，并且找出了胚胎的孤雌激活跟一些基因的甲基化有关， 为研究基因印记的分子机制提供了体外研究模型( h u aj i a n g ，b o w e n s u n 2 0 0 7 ) 。 e s 细胞的分离与培养是基因打靶的基本技术之一，同时e s 细胞 在人类疾病的细胞或组织替代治疗中发挥着极大的作用。但正常受精 胚胎来源的e s 细胞，涉及到众多伦理方面的问题，许多国家政府限 制了此方面的研究。因此从孤雌激活胚胎分离孤雌生殖胚胎干细胞， 若这类干细胞具有正常干细胞的发育潜能，将减少因利用人类早期胚 胎建立胚胎干细胞所产生的道德和伦理上的争议，对人类治疗性克隆 开辟一条新途径。 本研究在前人研究的基础上，通过免疫外科法分离孤雌生殖胚胎 的胚胎干细胞，建立并完善小鼠孤雌生殖胚胎干细胞分离与克隆的技 术体系；并对分离的孤雌生殖胚胎干细胞的分化潜能进行了体内、体 外初步研究，对体内和体外分化的细胞进行免疫组织化学和免疫细胞 化学鉴定，以期探明孤雌生殖胚胎e s 细胞是否具有与正常受精e s 细 胞同样的发育潜能。 第2 章文献综述 第2 章文献综述 2 1 干细胞研究的起源 生命科学是2 0 世纪末和本世纪初自然科学中发展最为迅猛的学 科。干细胞的研究与应用成为其中最令人瞩目的领域之一，“干细胞 研究的新发现”在美国科学( s c i e n c e ) 杂志公布的l9 9 9 年的十大科 学成果中名列榜首，并于2 0 0 0 年再度入选世界十大科学成果。2 0 0 7 年，瑞典卡罗林斯医学院lo 月8 日宣布诺贝尔生理学或医学奖分别授 予两名美国科学家马里奥卡佩奇和奥利弗史密西斯、英国科学家马 丁一埃文斯。这三位科学家是因为“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物 d n a 重组方面的一系列突破性发现”而获得这一殊荣的，这些发现为 “基因靶向 技术的发展奠定了基础。在“基因靶向 技术的帮助下， 利用胚胎干细胞，改造老鼠体内的特定基因，可以使实验鼠体内的一 些“不活跃”基因失去作用，从而发现这些基因的实际功能。科学家 希望借此发现人类一些疑难杂症在分子水平上的发病原因，并最终找 到治疗途径。 “干细胞 一词最早出现于19 世纪的生物学文献中，像许多其他 的生物学名词一样被引用至今，并随着研究的深入被赋予新的内涵。 18 9 6 年，e b w i l s o n 在一篇论述细胞生物学的文献中第一次使用这个 名词，专门用来描述存在于寄生虫( 如蠕虫、线虫、蛔虫等) 生殖系的 祖细胞。当时人们认为干细胞只是能够产生子代细胞的一种较原始的 细胞。随着科学的发展和实验工具的改进，人们对于干细胞的认识也 逐渐深入。19 61 年t i l l 和m c c u l l o c h 将骨髓细胞悬液通过静脉注入受 致死剂量x 射线照射的小鼠体内，注入的细胞在脾中形成集落( 脾结 节) 。细胞学研究表明，脾集落就是来源于单个细胞的细胞克隆，并且 是一个包含红细胞和粒细胞的混合体，此外还含有一些细胞，当其被 转移受到其他照射的小鼠体内时，也可形成集落。据此，他们认为这 种来自于集落的细胞，同时具有多向分化潜能和自我更新的能力，就 具有了造血干细胞的特点。 华南师范大学硕士学位论文 2 2 胚胎干细胞的研究起源与进展 胚胎干细胞的研究可追溯到上世纪5 0 年代，由于畸胎瘤干细胞 ( e c 细胞1 的发现，而开始了e s 细胞的研究。l9 58 年，s t e v e n s 最早 发现了畸胎瘤，他把小鼠早期胚胎移植到12 9 品系小鼠的精巢和肾脏 的被膜下，得到了畸胎瘤( t e r a t o c a r c i n o m a ，e c ) ( s t e v e n s 19 5 8 ) 。 后来其他人发现这种细胞具有多能性，它可分化为多种细胞类型。l9 7 4 年，b r i s t e r 把e c 细胞注射到小鼠囊胚腔后，发现e c 细胞参与宿主 胚胎的发育而得到嵌合体，这表明e c 细胞确实是一种干细胞( b r i n s t e r 19 7 4 ) 。此后e c 细胞成为研究小鼠胚胎发育的良好模型，但是它具 有某些恶性肿瘤的特性，其染色体多有异常。 19 81 年，e v a n s 和k a u f m a n 利用延迟着床的小鼠早期胚胎在s t o 饲养层上培养，分离出小鼠e s 细胞，并以他们的名字命名分离出的 小鼠e s 细胞为e k 细胞( e v a n s ，k a u f m a n 19 8 1 ) 。同年，m a r t i n 用 p s a 1e c 细胞的条件培养基培养小鼠i c m ，分离到小鼠e s 细胞 ( m a r t i n 19 81 ) 。19 8 7 年，s u d a 等将小鼠e s 细胞传2 5 0 代以上没有 出现分化的迹象，它们仍具有正常的二倍体核型；在生殖系嵌合体中 能产生正常的配子；作为核供体能重组克隆胚胎，表明小鼠e s 细胞 具无限增殖能力( s u d ae ta 1 19 8 7 ) 。19 9 8 年，d o e t s c h m a m 等建立了 仓鼠的e s 系( d o e t s c h m a m 19 9 8 ) ；s u k o y a n 等建立了水貂的类e s 细胞系( s u k o y a n 19 9 2 ) ；g r a v e s 等建立了兔的类e s 细胞系( g r a v e s ， m o r e a d i t he ta 1 19 9 2 ) ；t s u c h i y a 等建立了绵羊的类e s 细胞系 ( t s u c h i y a 1 9 9 4 ) 。1 9 9 6 年，n o b e n 等以小鼠胎儿成纤维细胞( m o u s e e m b r y o n i cf i b r o b l a s t m e f ) 为饲养层添加白血病抑制因子( l e u k e a m i a i n h i b i t o r yf a c t o r l i f ) ，首次建立b a l b c 品系小鼠e s 细胞系( n o b e n e ta 1 19 9 6 ) 。l9 9 7 年，b r o o k 等进一步完善了小鼠e s 细胞的分离方 法，从许多品系小鼠( 包括近交系和突变系) 都可获得e s 细胞( b r o o k ， g a r d n e r 1 9 9 7 ) 。1 9 9 8 年，t h o m s o n 等报道，用他们在恒河猴胚胎干 细胞分离法类似的方法，从体外受精人胚胎发育至囊胚期的内层细胞 团中分离、克隆出人的e s 细胞系( t h o m s o ne ta 1 19 9 8 ) 。l9 9 9 年， 第2 章文献综述 d i n k e l 等用分离的b a l b c 小鼠e s 细胞获得转基因小鼠( d i n k e le ta 1 1 9 9 9 ) 。2 0 0 3 年，m u m m e r y 等报道：人e s 细胞可分化成心肌细胞而 没有自发发育成心脏( m u m m e r ye ta 1 2 0 0 3 ) 。19 8 3 年d e f e l i c i 等用 e d t a p e r c o l l 法分离到小鼠原始生殖细胞( p r i m o r d i a lg e r mc e l l ， p g c ) ( d ef e l i c i ，m c l a r e n 19 8 3 ) ；19 9 2 年，m a t s u i 等用小鼠p g c 建立了干细胞系并得到嵌合体( m a t s u ie ta 1 1 9 9 2 ) ；s t e w a r t 等利用 p g c 建立了干细胞系，并且得到了生殖系嵌合小鼠( s t e w a r te ta 1 19 9 4 ) 。此后，在牛( r o b e r t s ，b a r t h 19 9 4 ) 、大鼠( m i t a n ie ta 1 19 9 4 ) 和猪( p i e d r a h i t ae ta 1 19 9 8 ) 等动物上建立了来自p g c 的干细胞系。 19 9 8 年，s h a m b l o t t 等报道，从受精后5 9 周人胎儿含有原始生殖细 胞的生殖嵴和肠系膜中，分离、克隆出多潜能的干细胞系，其特征类 似于小鼠的e c 细胞和e s 细胞，并可分化为包括所有3 个胚层的组织。 为区别于e s 细胞，将之命名为原始生殖嵴细胞f p g c s ) ( s h a m b l o t te t a 1 1 9 9 8 ；g e a r h a r t 1 9 9 8 ) 。 孤雌生殖( p a r t h e n o g e n e s i s ) 是一种生物学现象，孤雌胚的发育可以 只有单性动物参与。随着对体细胞核移植及单性生殖的深入研究，人 们在卵母细胞激活方面取得了较大进展。19 7 0 年，g r a h a m 首次获得 了小鼠的孤雌激活囊胚( g r a h a m 19 7 0 ) ；19 9 5 年，e r i n 等研究发现， 来自母体染色体的小鼠胚胎在体内难以正常发育，从正常胚胎中分离 的e s 细胞可以分化成各种各样的细胞类型，但孤雌激活的e s 细胞仅 能分化成内胚层样腔体细胞，并难以维持未分化状态( e r i ne ta 1 1 9 9 5 ) 。2 0 0 1 年，f e n g 等运用7 的乙醇处理卵母细胞获得孤雌激活 胚胎，将孤雌胚转移至具灭活的成纤维细胞饲养层的培养液中，获得 了滋养层巨细胞和i c m ，通过分离i c m 和进一步培养于含饲养细胞层 和l i f 中，建立了胚胎干细胞系( f e n g ，h a l l 2 0 0 1 ) 。2 0 0 3 年，k e n t 等【2 6 】从猴子的孤雌激活囊胚中成功地分离出了胚胎干细胞，并且分 离出的e s 细胞端粒酶及碱性磷酸酶( a k p ) 活性检测为阳性，表达 o c t 4 、s s e a 一4 、t r a1 6 0 和t r a1 8l 等干细胞特异性蛋白( k e n te t a 1 2 0 0 3 ) 。2 0 0 4 年，k o n o 等对孤雌激活的小鼠囊胚的进行了基因修 饰后再移植，成功地诞生出世界首例孤雌激活小鼠，从而证实孤雌生 殖胚胎能够发育成个体。孤雌激活小鼠的诞生，改变了发育生物学内 华南师范大学硕士学位论文 容，打破了人们认为孤雌哺乳动物不能存活的传统观念，不仅具有重 大的理论意义，而且还具有重要的科学价值及广阔的应用前景( k o n o e ta 1 2 0 0 4 ) 。2 0 0 7 年，k i m 等成功分离了孤雌生殖胚胎e s 细胞，证 明在体内具有多分化潜能，并获得了一只嵌合体小鼠( k i me ta 1 2 0 0 7 ) 。 在国内，19 9 8 年，刘红林等建立了小鼠孤雌胚胎干细胞集落( 刘 红林，等19 9 8 ) 。19 9 9 年，刘红林等【3o 】建立了孤雌生殖胚胎e s 细 胞系( 刘红林，等19 9 9 ) ；2 0 0 6 年，陈林君等比较了去透明带孤雌 桑椹胚和留透明带孤雌囊胚在饲养层上囊胚的扩张率、贴壁生长率， 结果表明去透明带孤雌桑椹胚的扩张率、贴壁率显著地高于留透明带 孤雌囊胚( 陈林君，等2 0 0 6 ) 。2 0 0 7 年，姜华等获得了孤雌生殖胚 胎e s 细胞系3 株，其中一株注入裸鼠体内能分化成三个胚层来源的 组织细胞，另外2 株参与形成了嵌合体，并且找出了胚胎的孤雌激活 跟一些基因的甲基化有关，为研究基因印记的分子机制提供了体外研 究模型( h u aj i a n g ，b o w e ns u n 2 0 0 7 ) 。 2 3 胚胎干细胞 2 3 1 胚胎干细胞的定义 干细胞( s t e mc e l l ，s c ) 的“干，译自英文“s t e m ，意为“茎 干 、“干 和“起源”。简单来讲，干细胞是一类具有无限的或者 永生的自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的 子代细胞。干细胞群的功能即为控制和维持细胞的再生。一般来讲， 在于细胞和其终末分化的子代细胞之间存在着被称为“定向祖细胞” 的中问祖细胞群，它们具有有限的扩增能力和限制性分化潜能( s l a c k 2 0 0 0 ) 。这些细胞群的功能是增加干细胞每次分裂后产生的分化细胞 的数量。干细胞具有自我更新的能力，但是干细胞的分裂实际上是相 对不对称的( v a n d e rk o o y ，w e i s s 2 0 0 0 ) 。 胚胎干细胞通常是指源自囊胚内细胞团( i n n e rc e l lm a s s ，i c m ) 的 胚胎于细胞，高水平地表达端粒酶。但通常人们将从畸胎癌- _ | 分离、 筛选剑的畸胎瘤细胞( t e r a t o c a r c i n o m ac e l l s ，e c ) 和从早期胎儿原始生 第2 章文献综述 殖细胞( p r i m a r yg e r mc e l l ，p g c ) 中分离出来的e g 细胞也归为胚胎干细 胞。畸胎癌是由哺乳动物和人类生殖细胞癌变产生的，它由无序排列 的多种组织组成，其中含有一些未分化的e c 细胞这些未分化的细胞 具有分化形成各种组织细胞的潜能。但是e c 细胞常常表现出某些恶 性肿瘤的特性，其染色体核型异常，分裂潜能有限。原始生殖细胞来 源于卵黄囊壁的内胚层细胞，它经原始消化道系膜迁入生殖嵴内，从 这些原始生殖细胞中分离到的e g 细胞也具有多能性，但其体外增值 能力、分化能力均比e s 细胞要弱。 2 3 2 胚胎干细胞的分离方法 ( 1 ) 来源于早期胚胎的内细胞团( e v a n s 19 8l ；m a r t i n 19 81 ) 。早 期胚胎发育到囊胚期后，通过囊胚延迟着床法或免疫外科法分离囊胚 内细胞团，在含有饲养层和白血病抑制因子( l i f ) 的培养条件下培养， 可得到胚胎干细胞。 ( 2 ) 从原始生殖嵴分离培养( m a t s u ie ta 1 1 9 9 2 ；s t e w a r te ta 1 1 9 9 4 ： r o b e r t s 19 9 4 ) 。取胎儿，用p b s 液清洗后，在体视显微镜下，剖腹， 取生殖嵴后l 3 部及其周围组织，并充分剪碎，加入o 2 5 胰蛋白酶 一0 0 2 e d t a 消化1o l5 m i n ，加入等量培养液中止消化。离心后用 胚胎干细胞培养液制成悬浮液，接种于饲养层细胞上。p g c 原代培养 物在饲养层上分裂、扩增，2 4 d 类e g 细胞集落出现，待其周围开 始出现细胞分化时立即传代。 ( 3 ) 利用体细胞核移植的方法( w a k a y a m ae ta 1 2 0 0 l ：c h e ne t a 1 2 0 0 3 ) 。供体细胞的细胞核移植进入去除细胞核的卵母细胞中，再使 重组的胚胎发育至囊胚，然后从囊胚分离胚胎干细胞。该技术一般是 将患者体细胞核移入去核的卵母细胞浆，经过电激活和化学激活体使 体细胞核重排，形成囊胚，然后培养和分离与患者的基因和主要组织 相容性抗原完全一致的胚胎干细胞。但目前的人体细胞核移植的效率 非常低，仅在1 左右，制约核移植效率的因素包括：供核细胞类 型的选择，不同类型的体细胞对重构胚胎的发育潜能有不同的影响， 卵丘颗粒细胞、耳缘细胞、表皮细胞都可作为供体细胞。重构胚胎 的激活：为了使供核在卵胞浆内发生核重构，恢复到多能状念，需要 华南师范人学硕士学位论文 对重构卵子进行化学激活与电激活，以激发卵子内钙振荡。但目前没 有一种有效的激活方式能够模拟精子对卵母细胞的激活效应，这也是 制约人体细胞核移植技术发展的瓶颈。激活后胚胎的发育：重构胚 胎激活后，容易发生细胞分裂的阻滞，使得体细胞核移植技术发展更 为缓慢。 ( 4 ) 利用细胞融合方法。胚胎干细胞具有对成体细胞核进行再程序 化的能力。将胚胎干细胞与人成纤维细胞融合，每种细胞系都做一个 抗药性标记，然后加入聚乙二醇促使它们进行细胞融合，最后通过双 重药物筛选的方法对培养物进行目标杂合细胞的分离。这些杂合细胞 是四倍体的，但具有显型特征，而且还具有胚胎干细胞的两个独特个 性：无限生长性和多能性。运用基因组水平的基因表达分析方法发现， 体细胞全基因组转录活性、等位基因特异性表达、d n a 甲基化水平， 表明体细胞基因组重排到了胚胎时期状态。c o w a n 等利用细胞融合的 方法将人的成纤维细胞与胚胎干细胞融合，在体外培养时，维持了胚 胎干细胞的形态，特异表达了人胚胎干细胞的表面标志，并且在体内、 体外都能向胚胎的三个胚层分化( c o w a ne ta 1 2 0 0 5 ) 。 ( 5 ) 3 0 用单个卵裂球制备胚胎干细胞。分离发育到8 细胞时期的一 个卵裂球，让其与g f p 标记的胚胎干细胞紧密挨着培养2 4 4 8 小时， 然后将其置于饲养层细胞上抑制分化培养，通过这种胚胎干细胞诱导 卵裂球的方法，也能获得胚胎干细胞( k l i m a n s k a y ae ta 1 2 0 0 6 ；c h u n g e ta 1 2 0 0 6 ) 。 ( 6 ) 来源于孤雌生殖胚胎。将未受精的卵母细胞通过激活形成二倍 体的胚胎，发育到囊胚胎阶段，然后再将分离内细胞团在体外分化抑 制培养，也可以获得胚胎干细胞( f a n g e r a u 2 0 0 5 ；l e n g e r k ee t a 1 2 0 0 7 ) 。 ( 7 ) 通过特定基因重组使成体细胞形成胚胎干细胞。o c t 3 4 、s o x 2 、 c m y c 和k l f 4 可以使来自胚胎小鼠或者成年小鼠的不同的纤维原细胞 保留胚胎干细胞一常的多能性。被诱导的多能性干细胞具有胚胎干细 胞的经典的物理性质、生长方式和遗传学特征( t a k a h a s h i ，y a m a n a k a 2 0 0 6 ：t a k a h a s h ie ta 1 2 0 0 7 ) 。 8 第2 章文献综述 2 3 3 胚胎干细胞生物学特性 2 3 3 1 胚胎干细胞的形态学特征 各种哺乳动物的e s 细胞都具有与早期胚胎相似的形态结构特征： 细胞体积小、核大、核质比高、有一个或多个突出的核仁，染色质较 分散，多为常染色质；细胞内除游离的核糖体外，其它的细胞器较少。 细胞呈多层集落生长，紧密堆积，形似鸟巢。人e g 细胞集落与小鼠 e s 细胞集落更接近呈紧密牢固结合、多层密集立体生长的无明显细胞 界限的集落，而人e s 细胞集落呈相对松散、扁平状集落，集落内细 胞界限隐约可见( p e r ae ta 1 2 0 0 0 ) 。 2 3 3 2 胚胎干细胞的核型 e s 细胞具有正常稳定的二倍体核型，作为生物发育机制和移植分 化细胞的研究模型。e s 细胞无论是在长期传代过程中，还是在冷冻与 解冻复苏过程中，都能正常增殖并且核型正常。 2 3 3 3 胚胎干细胞的细胞周期特征 e s 细胞通常增殖较为迅速，如小鼠的e s 细胞一般每12 小时分裂 增殖一次，而人的e s 细胞生长相对缓慢些，通常每3 6 小时分裂一次。 胚胎干细胞的细胞周期与已分化的体细胞的细胞周期有所不同，在细 胞周期的整个过程中，细胞大多数时问处于s 期，进行d n a 的合成， g 1 、g 2 期很短，它没有gl 检验点，不需要外部信号来启动d n a 的复 制。 2 3 3 4 胚胎干细胞的标志物 ( 1 ) o c t 4 ：也称为o c t 一3 或者o c t 3 4