（细胞生物学专业论文）日本七鳃鳗唾液腺分泌蛋白的组分分析与鉴定.pdf

i “ 一 - 毒 t i c 、 - ： 学位论文独创性声明 i i i i ii ii ii iii ii i iii tllf y 18 9 0 7 8 2 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特 别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其 他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示 谢意。 学位论文作者签名： 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：指导教师签名： 签名日期： l 乒， 1-11；， 专 0 l i i l 宰 辽宁师范大学硕士学位论文 日本七鳃鳗唾液腺分泌蛋白的组分分析与鉴定 摘要 在海洋生物中，七鳃鳗( 1 a m p e t r aj a p o n i c a ) 是迄今所知道的最原始的无颌类脊椎动 物，不仅是研究脊椎动物起源与进化的关键物种，同时也是研究脊椎动物发育与分化的 最佳模式动物之一。此外，日本七鳃鳗唾液腺分泌的多种活性物质赋予其极为特殊的寄 生生活习性。以成功构建的日本七鳃鳗唾液腺e d n a 文库为基础开展的前期研究中，已 证实日本七鳃鳗唾液腺的分泌物质中存在抗凝、抗炎、抗肿瘤以及抗氧化等多种活性分 子。然而，对于分泌物中含有的其他蛋白成分及其机制尚不明确。本研究对日本七鳃鳗 的唾液腺分泌蛋白的组分进行分析与鉴定，旨在发现和研究与其特殊的寄生生活方式相 适宜的特有功能蛋白质。利用生物信息学和分子生物学等手段从蛋白和基因两种水平对 日本七鳃鳗唾液腺分泌蛋白的组分进行鉴定分析，获得了分泌物中低含量蛋白的组成信 息，并选择新活性氧调节基因、血清白蛋白和细胞死亡调节因子样蛋白进行克隆、进化、 表达和活性分析。这有利于揭示日本七鳃鳗唾液腺分泌的功能基因在同系家族中的起源 与进化，并为日本七鳃鳗特殊的寄生生活习性提供更多的理论基础。 本研究利用s d s p a g e 电泳技术进行日本七鳃鳗唾液腺分泌低含量蛋白的分离， 以基质辅助激光解析电离化飞行时i 闭( m a l d i t o f m s ) 质谱测序手段进行低含量蛋白 的质谱测序，将结果在m a s c o t 数据库进行串联质谱检索( m s m si o ns e a r c h ) ，从而鉴定 日本七鳃鳗唾液腺分泌低含量蛋白的蛋白组成。选择的六条胶带经质谱测序分别获得了 3 1 2 、1 2 9 、1 3 7 、2 8 3 、2 9 9 和2 4 8 个蛋白质肽段，其中重要的匹配记录分别为2 0 、9 、7 、 9 、2 0 和1 0 项；与唾液腺e d n a 文库比较后发现匹配上的和未匹配上的肽段总数目皆 为1 9 个；最后将未匹配的蛋白重新查询，最终获得了细胞骨架蛋白、代谢酶类、细胞 周期相关蛋白、细胞增殖、分化和凋亡相关蛋白和脂质代谢相关蛋白等共计2 1 种有意 义蛋白。 利用生物信息学手段解析日本七鳃鳗血清白蛋白及类白蛋白基因家族的分子进化 与系统发育，获得类白蛋白基因家族成员演化图以及日本七鳃鳗血清白蛋白、鲑鱼血清 白蛋白以及斑马鱼维生素d 结合蛋白结构域水平上三者之间的进化关系，证实了日本 七鳃鳗血清白蛋白在进化上独特而原始的地位。 利用基因工程手段，克隆得到的日本七鳃鳗新活性氧调节功能基因l j r o m o l 开放 阅读框长2 4 3b p ，编码8 0 个氨基酸，分子量大约8 9 k d m 具有信号肽，且可作为跨膜 蛋白定位于线粒体膜上；一级结构、二级结构预测以及三维立体结构模拟结果均表明了 l j r o m o l 基因与其他物种的高度同源性；进化水平的分析则验证了l j r o m o l 的原始进 化地位；以s e m i p c r 技术检测l j r o m o i 在日本七鳃鳗各组织中的表达情况，发现 l j r o m o l 在日本七鳃鳗各组织中广泛表达，其中红细胞中相对表达量最高，且模拟病 i h。一r_l 日本七鳃鳗唾液腺分泌蛋白的组分分析与鉴定 原菌刺激后各组织中l j r o m o l 表达量明显上调，证明l j r o m o l 参与红细胞的氧化还 原信号通路；原核表达没有获得t j r o m o l 的重组蛋白，揭示其序列中可能含有稀有密 码子；进一步进行真核转染，发现l j r o m o l 基因的亚细胞定位于线粒体上，初步证实 了l j r o m o l 参与机体线粒体内的有氧呼吸过程。 利用生物信息学手段研究日本七鳃鳗细胞死亡因子g r i m i n 基因序列的基本性质， 证实其为具有疏水性的单层跨膜蛋白，不含信号肽和糖基磷脂酰肌醇锚定位点，具有氧 化还原酶活性，在细胞内可作为转录子参与能量代谢；二级结构和高级结构都显示 l i - g r i m i n 具有细胞凋亡因子g r i m l 9 基因家族的标志性特征，并且在进化上高度保守； 实时荧光定量p c r 法检测到l j g r i m i n 广泛分布于日本七鳃鳗各组织之中，且在一i i , 脏和 红细胞中表达量最高。同时，病原菌刺激后在心脏中表达量明显上调，提示l j g r i m i n 在日本七鳃鳗的生活史中起关键作用，并参与病原菌引发的的免疫防御反应。 日本七鳃鳗唾液腺分泌蛋白的组分分析与鉴定，从蛋白和基因两个水平上完善了日 本七鳃鳗唾液腺分泌蛋白的组成信息，有助于我们深入了解日本七鳃鳗特殊的生活习性 及其特殊的进化地位，并为深入研究日本七鳃鳗唾液腺分泌的功能基因和蛋白质组学提 供了理论基础。 关键词：日本七鳃鳗；唾液腺；功能组分；血清白蛋白；活性氧调节基因；细胞死亡调 节因子 j 1 l - 专 i - 一 j - p l a ya ni m p o r t a n tr o l e i np a r a s i t i cf e e d i n gd u et oi t sa c t i v ec o m p o n e n t i nt h ep r e s e n ts t u d y ， w eh a v ef o u n dav a r i e t yo fa c t i v em o l e c u l e s 劬ml a m p r e ys a l i v a r yg l a n ds e c r e t i o nb y a n a l y z i n gt h ee x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ( e s t s ) o ft h es a l i v a r yg l a n de d n al i b r a r y t h e ya r e a n t i c o a g u l a n t , a n t i - t u m o ra n da n t i o x i d a n ta n do t h e ra c t i v i t ym o l e c u l e s h o w e v e r ，o t h e r c o m p o n e n t sa n dm e c h a n i s mc o n t a i n i n gi ns e c r e t i o n sa r en o tc l e a r i nt h i ss t u d y ，w er e p o r tt h e a n a l y s i sa n di d e n t i f i c a t i o no fp r o t e i nc o m p o n e n t so fl a m p r e ys a l i v a r yg l a n d ，d e s i g nt of i n d a n dr e s e a r c ht h es p e c i a lf u n c t i o n a lp r o t e i n sw h i c ha p p r o p r i a t et ot h e i rp a r a s i t i cw a yo fl i f e h e r e ，u s i n gt h eb i o i n f o r m a t i c sa n dm o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d s ，w ei d e n t i f i e dt h ep r o t e i n c o m p o n e n t so fl a m p r e ys a l i v a r yg l a n ds e c r e t i o no nt h et w ol e v e l so fp r o t e i na n dg e n e ， o b t a i n e dt h ei n f o r m a t i o n so fl o w - c o n t e n tp r o t e i nc o m p o s i t i o n si nl a m p r e ys a l i v a r yg l a n d s e c r e t i o n w es e l e c t e dt h r e eg e n e s , i n c l u d i n gr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sm o d u l a t o rl ，a l b u m i n a n dc e l ld e a t hr e g u l a t o rt om a k ec l o n e s ，r e c o m b i n a n te x p r e s sa n da c t i v i t ya n a l y s i s o u r r e s e a r c h e sm a yc o n t r i b u t et ou n d e r s t a n dt h eo r i g i na n de v o l u t i o no ft h e s eg e n e sb e t w e e n i n v e r t e b r a t e sa n dv e r t e b r a t e s ，a n dp r o v i d em o r et h e o r e t i c a lb a s i sf o ru n d e r s t a n d i n gt h es p e c i a l p a r a s i t i cl i v i n gh a b i t so f t h el a m p r e y i n t h i sp a p e r ，s d s p a g ee l e c t r o p h o r e s i si st ob eu s e dt os e p a r a t et h el o w - c o n t e n t p r o t e i n si nl a m p r e ys a l i v a r yg l a n ds e c r e t i o n ，m a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o n t i m e o ff l i g h tm a s s ( m a l d i - t o f - m s ) s p e c t r o m e t r ys e q u e n c i n gi sf o rp r o t e i ns e q u e n c i n g t h e n p u tt h er e s u l t si nt h em a s c o td a t a b a s et od ot h et a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ( m s m si o n s e a r c h ) s e a r c h i n g ，t oi d e n t i f yl o we x p r e s s i o nl e v e l sp r o t e i n so fl a m p r e ys a l i v a r ys e c r e t i o n a m a s sl i s to fp e p t i d e sw a so b t a i n e df o rt h es i xt a r g e td i g e s tp r o t e i n s ，t h en u m b e r0 f p e p t i d ea r e 31 2 ，1 2 9 ，1 3 7 ，2 8 3 ，2 9 9a n d2 4 8r e s p e c t i v e l y ，a n dt h ei m p o r t a n tm a t c hr e c o r d e sa r e2 0 ，9 ，7 ，9 ， 2 0a n d10 c o m p a r e dw i t ht h el a m p r e ys a l i v a r yg l a n de d n al i b r a r y ，t h et o t a ln u m b e ro f p e p t i d e so nt h en o m a t c h e sa n dt h em a t c h e sa r ea l l 19 f i n a l l y ，t h en o m a t c hp r o t e i n sa r e r e s e a r c hi nt h en c b id a t a b a s e ，o b t a i n e d21k i n d so ff u n c t i o n a lp r o t e i n s ，t h e ya r ec y t o s k e l e t o n p r o t e i n s ，m e t a b o l i ce n z y m e s ，c e l lc y c l e r e l a t e dp r o t e i n s ，c e l lp r o l i f e r a t i o n , d i f f e r e n t i a t i o na n d a p o p t o s i s - r e l a t e dp r o t e i n sa n dl i p i dm e t a b o l i s mr e l a t e dp r o t e i n s f o rt h ep l a s m aa l b u m i ni n t h i sr e s e a r c h ，a l la n a l y s i sw a sd o n eo nt h ee v o l u t i o n a l r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ep l a s m aa l b u m i no fl a m p r e ya n d t h eo t h e rm e m b e r so ft h ea l b u m i n o i d g e n ef a m i l yw i t hb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d s ，a n dt h ep h y l o g e n e t i ct r e eo ft h ea l b u m i n o i dg e n e m t r a n s m e m b r a n ep r o t e i nl o c a l i z e di nt h em i t o c h o n d r i a lm e m b r a n e t h e r ei sas i g n a lp e p t i d ei n l j - r o m o ls e q u e n c e t h ep r e d i c t i o n so fp r i m a r ya n ds e c o n d a r ys t r u c t u r e ，a sw e l la s t h e s i m u l a t i o no ft h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r ei n d i c a t et h a tt h el j r o m olg e n eh a sh i g h l y h o m o l o g o u sw i t ho t h e rs p e c i e s t h es e q u e n c ec o m p a r i s o na n dp h y l o g e n e t i ct r e ev e r i f i e dt h e o r i g i n a l s t a t u so fl j r o m oli nt h ee v o l u t i o n t oc h a r a c t e r i z et h ee x p r e s s i o np r o f i l eo f l j r o m o lg e n ei nv a r i o u st i s s u e s ，w ep e r f o r m e ds e m i - p c ra s s a yw i t hg a p d h a sa ni n t e r n a l c o n t r 0 1 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl j r o m olg e n ew a su b i q u i t o u s l ye x p r e s s e di nav a r i e t yo f l a m p r e yt i s s u e s o b v i o u s l y ，t h el e v e lo fl j r o m o lg e n ee x p r e s s i o nr e m a i n e da tah i g hl e v e l a t t e rl p s s t i m u l a t e d ，p r o v i n gt h a tl j - r o m olc a na c ta sav e r ye f f e c t i v er o l e i nr e d o x s i g n a l i n gp a t h w a yo fr e db l o o dc e l l s t h e nt h el j r o m o lg e n ew a sc l o n e di n t op e t 3 2 aa n d o t h e rv e c t o r s ，b u td i dn o tg e tt h er e c o m b i n a n tp r o t e i n ，w h i c hr e v e a l e dt h a tl j r o m o l s e q u e n c em a yc o n t a i nr a r ec o d o n s t r a n s f e c t i o no fe u k a r y o t i cc e l l sf o u n dt h a tl j r o m o l g e n ew a sl o c a l i z e di nm i t o c h o n d r i a , i n i t i a l l yc o n f i r m e dl j r o m o lp a r t i c i p a t ei nt h ep r o c e s s o f a e r o b i cr e s p i r a t i o no f m i t o c h o n d r i a f o rt h eg r i m i ng e n e ，t h eb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d sw a su s e dt of i n dt h eb a s i cp r o p e r t i e so f l a m p r e yc e l l d e a t hr e g u l a t o r t h er e s u l t sc o n f i r mt h a ti ti sah y d r o p h o b i cs i n g l el a y e r t r a n s m e m b r a n ep r o t e i n ，h a v i n gn os i g n a lp e p t i d ea n dg l y c o s y lp h o s p h a t i d y l i n o s i t o la n c h o r s i t eb u to x i d a t i o nr e d u c t a s ea c t i v i t y ，a n dc a nb eu s e da st r a n s c r i p t sf o re n e r g ym e t a b o l i s m ； 1 h es e c o n d a r ys t r u c t u r ea n da d v a n c e ds t r u c t u r e ss h o wl j g r i m i nh a v et h es a m ef e a t u r e sw i t h t h ea p o p t o t i cf a c t o rg r i mg e n ef a m i l y ，a n dt h eh i g hc o n s e r v a t i o n i ni nt h ee v o l u t i o n r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c ra s s a yd e m o n s t r a t et h a tl j - g r i m i ng e n ew a su b i q u i t o u s l ye x p r e s s e di na v a r i e t yo ft i s s u e s ，a n dh a v et h es t r o n g e s te x p r e s s i o ni nh e a r ta n dr e db l o o dc e l l s m e a n w h i l e ， t h e r ei sah i g hl e v e la r e rl p s s t i m u l a t e d ，i n d i c a t i n gt h a tl j - g r i m i np l a y sak e yr o l ei nt h e l a m p r e yl i f eh i s t o r y ，a n dp a r t i c i p a t ei nt h ep a t h o g e n - i n d u c e di m m u n er e s p o n s e i nc o n c l u s i o n ，w er e p o r t e das e r i e so fa n a l y s i sa n di d e n t i f i c a t i o no ft h ep r o t e i n c o m p o n e n t sf r o ml a m p r e ys a l i v a r yg l a n ds e c r e t i o n t h e s e r e s u l t ss u p p l e m e n t e dt h e c o m p o s i t i o ni n f o r m a t i o no fl a m p r e ys a l i v a r yg l a n ds e c r e t i o np r o t e i n sf r o mt w ol e v e l so f p r o t e i na n dg e n e t a k e nt o g e t h e r ，o u rr e s e a r c h e sm a yc o n t r i b u t et ou n d e r s t a n dt h es p e c i a l l i v i n gh a b i t so fl a m p r e y sa sw e l la st h ee v o l u t i o no ft h e i rs p e c i a ls t a t u s ，a n dp r o v i d e d f a v o r a b l ea s s i s t a n c ef o rt h ef u r t h e rs t u d yo fl a m p r e ys a l i v a r yg l a n ds e c r e t i o nb o t ho ng e n e s a n dp r o t e o m i c s ： ￥ 一 f ， 击 i 一 - ， c 、 v 1 j ， 、一 i i 1 1 。l 1 1 。2 3 。3 。3 。3 1 1 2 4 多功能活性因子3 1 1 2 5 氧化还原相关活性因子4 1 1 3 有毒动物4 1 1 3 1 毒蛇4 1 1 3 2 蜘蛛。5 1 1 4 吸血蝙蝠6 1 2 动物唾液腺功能组分在药用开发中的研究现状与展望7 1 2 1 防治心脑血管疾病的新药7 1 2 2 抗肿瘤药和镇痛药7 1 2 3 新型降压药和糖尿病药8 1 2 4 基因工程产品8 1 3 本研究的目的和意义9 1 3 1e j 的9 1 3 2 意j ；己9 1 4 参考文献l l 第2 章日本七鳃鳗唾液腺分泌低含量蛋白的组分鉴定1 4 2 1 研究背景及意义1 4 2 2 1 研究背景1 4 2 1 2 生物质谱技术及其检索软件15 2 1 3 研究意义15 2 2 材料1 6 2 3 方法1 6 2 3 1s d s p a g e 溶液配制1 6 2 3 2s d s p a g e 电泳胶的配置1 7 2 3 3 蛋白质的切胶回收1 7 2 3 4 蛋白质的酶解1 8 2 3 5 质谱测序及数据库检索18 2 3 6 质谱测序结果分析1 9 v i l 一 辽宁师范大学硕士学位论文 2 4 结果：。 2 4 1 唾液腺分泌物的电泳结果1 9 2 4 2 数据库查询结果( m a s c o ts e a r c hr e s u l t s ) 1 9 2 4 3 多肽段与唾液腺e d n a 文库的比较结果2 6 2 4 4 未知肽段数据库重新搜索结果( n c b ib l a s tr e s u l t s ) 2 7 2 5 讨论2 9 2 5 1m a l d i - t o f m s 结果数据库查询分析2 9 2 5 2m a s c o t 数据库查询结果与唾液腺e d n a 文库比较结果分析2 9 2 5 3 低含量蛋白成分功能分类3 0 2 6 卅、结31 2 7 参考文献3 2 第3 章日本七鳃鳗血清白蛋白及类白蛋白基因家族分子进化与系统发育3 4 3 1 研究背景及意义3 4 3 2 材料3 4 3 3 方法3 5 3 3 1 同源序列比对。3 5 3 3 2 结构域预测3 5 3 3 3 系统发育树的构建3 5 3 4 结果与讨论3 5 3 4 1 同源序列比对结果分析3 5 3 4 2 类白蛋白家族成员的进化分析3 6 3 4 3 功能结构域预测分析及系统进化3 9 3 5d 、结4 2 3 6 参考文献4 3 第4 章日本七鳃鳗唾液腺分泌新活性氧调节功能基因r o m o l 的分子克隆、表达及功能初探4 4 4 1 新活性氧调节基因r o m o l 的研究背景及意义4 4 4 1 1 新功能基因与活性氧。4 4 4 1 2 新基因r o m o l 的由来4 5 4 1 3 新基因r o m o l 基因的功能及作用机制4 5 4 1 3 1 诱导细胞内线粒体r o s 的产生4 6 4 i 3 2 参与癌症细胞和正常细胞增殖的过程4 6 4 1 3 3 参与复制性衰老4 7 4 1 3 4 参与调控细胞的凋亡4 8 4 1 4 新基因与耐药性的临床应用4 9 4 1 5 新基因的研究意义5 0 4 2 日本七鳃鳗r o m o l 基因的分子克隆5 l 4 2 1 蒯f 料5 1 4 2 2 方法5 2 4 2 2 1 引物设计5 2 4 2 2 2 提取总r n a 5 2 4 2 2 3 逆转录聚合酶链式反应( r t - p c r ) 5 3 4 2 2 4 目的片段与载体相连及鉴定5 4 鉴定 ! i ! i ! ；5 ! ；6 ：；6 ! i 7 ! i 7 ! ；7 ! ；8 。：；s 4 3 3 1 蛋白质序列的基本性质分析5 8 4 3 3 2 结构域分析6 6 4 3 3 3 空间结构预测6 7 4 3 3 4 分子进化与系统发育分析7 0 4 3 4 讨论：7 3 4 4 日本七鳃鳗r o m o l 基因真核融合表达系统的构建、真核转染及活性初探7 3 4 4 1 材料7 3 4 4 2 方法7 4 4 4 2 1 酶切位点的选择7 4 4 4 2 2 设计引物7 4 4 4 2 3p c r 扩增7 4 4 4 2 4 目的片段和载体的酶切及回收一7 5 4 4 2 5 目的片段与载体相连。7 5 4 4 2 6 转1 q ：7 6 4 4 2 7 重组表达菌菌落p c r 及双酶切鉴定7 6 4 4 2 8 真核转染7 7 4 4 2 9 线粒体染色及亚细胞定位7 8 4 4 31 2 鞋7 8 4 4 4 讨论8 l 4 5 日本七鳃鳗r o m 0 1 基因原核表达载体的构建及诱导表达8 2 4 5 1 材料8 2 4 5 2 方法8 2 4 5 2 1 酶切位点的选择及引物设计8 2 4 5 2 3p c r 扩增。8 3 4 5 2 4 目的片段和载体的酶切及回收8 3 4 5 2 5 目的片段与载体连接并转化至宿主菌8 4 4 5 2 6 重组表达菌菌落p c r 及双酶切鉴定8 4 4 5 2 7 阳性重组子的诱导表达及s d s 鉴定8 5 4 5 3 结果8 5 4 5 4 讨论8 7 4 6 日本七鳃鳗r o m o l 基因的组织表达8 9 4 6 1 材料8 9 4 6 2 方法8 9 4 6 2 1 引物设计8 9 v i i i 辽宁师范大学硕士学位论文 4 6 2 2 分离七鳃鳗外周血红细胞和白细胞9 0 4 6 2 3 总r n a 提取9 0 4 6 2 4r n a 质量检测9 0 4 6 2 5s e m i p c r 反应条件9 l 4 6 3 结果9 2 4 6 3 1 各组织样品总r n a 9 2 4 6 3 2 各组织样品模板e d n a 9 2 4 6 3 3s e m i p c r 结果9 2 4 6 4 讨论9 4 4 7 小结9 5 4 8 参考文献9 6 第5 章日本七鳃鳗唾液腺g r i m i n 基因的序列分析、分子进化及组织表达9 8 5 1 研究背景及意义9 8 5 2 日本七鳃鳗g r i m i n 氨基酸序列生物信息学分析9 9 5 2 1 材料与方法9 9 5 2 3 结果9 9 5 2 3 1 蛋白质序列的基本性质分析9 9 5 2 3 2 结构域分析1 0 5 5 2 3 3 空间结构预测1 0 6 5 2 3 4 分