（细胞生物学专业论文）拟南芥鼠李糖合成酶基因rhm1的初步研究.pdf

拟南芥鼠李糖合成酶基因尺脚町的初步研究 摘要 摘要 l 鼠李糖是植物细胞壁果胶多聚糖的重要组成成分之一，也存在于不同的次 生代谢产物中，包括花色素苷、类黄酮和三萜。在模式植物拟南芥中，由鼠李糖 合成酶( r h 删o s es ) l l t i l 嬲e ，r 卸m ) 催化底物u d p a - d 一葡萄糖生成u d p - l 广鼠李糖。 拟南芥砒m 酶蛋白家族包含砒跏1 ，似2 和砒似3 三个成员。本文主要对拟 南芥中腰m - ! 基因启动子中的相关调控元件进行定位，并通过构建l 州础突变体， 过表达突变体对删基因的进行了比较系统的研究。主要结果如下： 1 ) 通过g u s 组织化学染色与r t - p c r 分析，结果表明，该基因除了在成熟的 种子的没有表达外，在其余各个组织部位均高度表达，包括花、花絮、叶、茎、 种荚和叶柄。 2 ) 通过比较缺失启动子与全长启动子转基因幼苗的g u s 染色情况发现在启 动子的7 5 2 b p 3 0 8 b p 区域可能存在与根表达相关的元件，在一3 0 8 b p 一1 4 0 b p 区域 可能存在与子叶表达相关的元件。 3 ) g u s 定性和定量实验以及r t - p c r 结果表明，r h m z 基因的表达受葡萄糖 和伤害诱导，并且推测参与葡萄糖调控途径的顺式作用元件位于基因上游启动子 区一9 3 1 b p 一7 5 2 b p 区域，伤害应答元件位于一7 5 2b p 一3 0 8 b p 区域。 4 ) 尺胧jr n 越突变体、过表达突变体中在表型、抵御菌体侵染等方面与野 生型无区别。 关键词：鼠李糖合成酶基因删j ) 启动子缺失顺式作用元件葡萄糖伤害 作一者：季秦梅 指导教师：沈颂东 拟南芥鼠李糖合成酶基因删的初步研究 英文摘要 p r i m a 巧s t l l d yo fu d p l r h a m n o s ebi o s y n m e s i sg e n e r h m i 试加曲i d o p s i st 蛔l i 硼c i a b s t r a c t l - r h a n ：l i l o s e ( r h a ) i sac o m p o n e n to f l ep l a n tc e n w 1 1 1p e c t i 印o l y s a c c h a r i d e s 订1 a 舢鲥a 孤n 孤i ( r g - i ) a n dr h 黜o g a l a 呶聃n a ni ia 5 沁一i i ) i nt h i sp a p e r ，w e s t u d i e dm e 如n c t i o no f 足咒九“w 池m o l e c u l a rb i o l o g ya l l dp h y s i o l o g i c a la p p r o a c h e s e x p r e s s i o ns t i l d i e s 、) l ，i t l l 彳依删zp r o m o t e 卜g u sm s i o ng e n es h o 、e dm a t 么坎删了 w 鹤e x p r e s s e d2 i l m o s tu b i q 毗o u s l y ，、 ，i t l lg 呐n g e re x p r e s s i o ni i lr 0 0 t s 孤dc o t ) ，1 e d o no f y o l l i l gs e e d l i n g sa n di n n o r e s c e n c e s t h eg u ss t a i n i n ga n dg u se n z y m a t i ca c t i v 时 勰s a ys h o w e d 也a t 也ee x p r e s s i o no f4 缓跚坦i si n d u c e da tt r 孤s 耐p t i o n a ll e v e lb y 9 1 u c o s e 肌dw o u n d i n g t 0i d e n t i 黟m er e 叫a t o 巧e l e m e n t si i l 么删p r o m o t e r ，w ec r e a t e das e r i e so f d e l e t i o n so f 彳删p r o m o t e r 舢g i n g 劬m - 9 31 b pt 0 + 4 2 7 b p t h e 如ul e n g t l lo fm e p r o m o t e r 锄di t sd e l e t i o nd e r i v a t i v e s 如s e dw i mg u sr 印o n e rg e n ew e r ei n t r o d u c e d i n t 0 丽l d - t y p e 心a b i d o p s i sb y 么d 6 口c 把，f “珑一m e d i a t e d 咖n s f o m l a t i o n ，r c s p e c t i v e l y 。 1 1 1 ec 町ss t a i l l i n ga n d ( m se n z m a t i ca c t i v i 锣嬲s a ys h o w e d 廿1 a tt ：h er e g i l l a t o d r e l e m e m si n v o l v e di nn l eg l u c o s ea n dw o l l l l d i n gr e s p o n s ea r el o c a t e di nn l er e g i o no f 一9 31 b p - 7 5 2 b p ，一7 5 2 3 0 8 b pr e s p e c t i v e l y n e0 v 眯i x i r e s s i o n 觚dm u t a t i o no f 彳厶r 翩幽i n 心a b i d o p s i sh a v en 0e 虢c t0 n p 1 1 c n o t y p e 。 k e yw o r d s ：r h a m n o s es y t l l n a s eg e n e 似删1 ) ，p r o m o t e rd e l e t i o n ，c i s - r e g u l a t o r y e l e m e n t s ，9 1 u c o s e ，、o u n d i n g l i w r i t t e nb yq i i l n l e ij i s u p e n 幢s e db ys o n g d o n gs h e n 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名：盘叁盎日 期： 挫茳：至：兰z 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名：盘垒登日期：曼竺墨：支： 导师签名：孓进日 期：理量：丛 拟南芥鼠李糖合成酶基因彤z m 的初步研究 第一章前言 第一章前言 1 鼠李糖的研究 1 1 鼠李糖的物理性质 鼠李糖( r h 猢o s ) 是一种甲基戊糖，属单糖类，其甜度为蔗糖的3 3 ，熔点为 9 3 9 5 。纯品鼠李糖为无色结晶性粉末，能溶于水和甲醇，微溶于乙醇，其 结晶呈两种形式，a 型和p 型。口型含有一分子结晶水，加热后失去结晶水，转 变为p 型( 分子量为1 6 4 1 6 ) ；p 型极易吸湿，在空气中吸潮转变为a 型。在通常的条 件下，仅l 鼠李糖水合物呈片状晶体，其分子量为1 8 2 1 1 ，分子结构如图1 1 。p - l 一 鼠李糖( 无水) 为针状晶体有吸湿性，熔点1 2 2 1 2 6 。除分子结构的差异外，与 其它l 型的糖相比，l 鼠李糖较为特别( 图1 1 ) 。 h - h 羽伪) c 洲鼽h 妒 图1 1 鼠李糖分子结构示意图 f i g 1 - 1s t m c t u r eo fr h a 【r 啪s 1 2 鼠李糖的来源 在自然界中，鼠李糖通常与其它物质分子相结合存在于动物、植物、多糖中【l 】， 其中芦丁、橡树皮、柑橘皮、柚子皮、阿拉伯胶、卡拉胶、凝结胶等中含有与鼠 李糖基相结合的物质，例如橡树皮中所含的栎皮酮，柑橘皮中所含的柚苷，枥属 树皮和芦丁中所含的维生素a ( 芸香苷) ( 2 羽。阿拉伯胶、卡拉胶、凝结胶等的多糖分 子中分别含个数不等的鼠李糖基，可通过水解这些物质而得到鼠李糖。 植物细胞壁是一种坚韧的结构，主要成分为多糖类物质。细胞壁与维持细胞 的一定形态、增强细胞的机械强度以及细胞间连接有关。双子叶植物细胞壁的主 要成份是纤维素木糖苷组成的网络结构，这种被胶质多糖包围的结构是细胞壁主 要的支架结构。胶质矩阵的主要成份有三种：糖主链的半乳糖醛酸聚糖 拟南芥鼠李糖合成酶基因删的初步研究第一章前言 o l o 脚g a l a c t u r o n 锄，h g a ) ，鼠李半乳糖醛酸聚糖i ( r h 觚m o g a l a c t u r o n 锄i ，r g - d 和鼠 李半乳糖醛酸聚糖( r h 锄n o g a l a c t u r o n 锄，r g 一田。h g a 是一种同源聚合物，由 1 ，4 a 一连接的半乳糖醛酸组成，它经常被部分的甲基化。r g i 是一种异源聚合物， 由重复的1 ，2 _ a l - 鼠李糖一l 4 - a - 半乳糖醛酸双糖组成，有很多侧链连接到鼠李糖 ( r 】1 a ) 残基上。r g 圈b 黾一个复杂又保守的异源聚糖，包括一个由四个不同单糖组成 的侧链修饰的h g a 骨架【s 州。 单糖是组成细胞壁的主要碳水化合物，鼠李糖是r gi 和r g 的主要组成成 分，通过鼠李糖基转移酶( r h a 凰) 将鼠李糖与各种分子连接起来。糖基转移酶在高 尔基体表面合成胶质，以核酸糖作为供体底物。许多糖基转移酶已经鉴定，但是 只有很少参与到胶质的生物合成。鼠李糖是r gi 和r g 的主要组成成分，通过鼠 李糖基转移酶( r h a t s ) 将鼠李糖与各种分子连接起来。 同时鼠李糖也广泛存在于细菌多糖中。革兰氏阴性菌可以合成d 1 d p p l l m a ， d t d p d l r h a 用来进一步合成脂多糖( l p s ) 【1 0 1 。肺炎链球菌( s 仃e p t o c o c c u s p n 肌n l o n i a e ) 也可以合成u d p - p l r h 撇o s e 。一些革兰氏阳性菌可以利用 g d p d r h a 和d t d p d l 广r h a ，而共生小球藻病毒( m ep a 捌n e c i l 珊b u r s a i i a c h l o r c n a v i m s ) 合成g d p - d r 蛔用于合成病毒外壳糖蛋白。 1 3 鼠李糖生产的研究现状 生产鼠李糖的传统方法是从天然植物中提取，如从橡树皮中提取栎皮酮，从 柑橘皮中提取柚苷或从枥属树皮中提取维生素a 【1 1 1 。这些物质分子中含有鼠李糖 基，可通过水解这些物质而得到鼠李糖。再通过萃取及其它化工单元过程操作获 得鼠李糖纯品。但这种生产方法存在较大缺点，如劳动强度大，在萃取过程中产 生大量潜在的有毒物质，在提取过程中需要用到有毒或腐蚀性化学试剂，并且原 材料的季节和地域性来源及运输等均给生产带来许多不便【1 2 】。由于鼠李糖的应用 前景越来越广，特别是在合成香料、合成强心药物领域，生产鼠李糖的研究倍受关注。 工业化生产鼠李糖的方法主要为发酵法。按中间产物的不同可将生产鼠李糖 的方法划分为两类，a 利用微生物或藻类生产含鼠李糖基的多糖，水解多糖得到 鼠李糖；b 利用微生物生产鼠李糖脂，水解鼠李糖脂得到鼠李糖。微生物或藻类 生产的含鼠李糖基的多糖，某些具有胶凝特性，故可作为乳化剂，还有的作为制 备单糖的原料【1 3 1 。一种海底绿藻细胞壁多糖含4 6 的鼠李糖，有些果聚糖也含有 鼠李糖，将这些多糖水解也可得到鼠李糖。由微生物产生的多糖多为胞外产物， 2 拟南芥鼠李糖合成酶基因删的初步研究 第一章前言 它们或是形成胶囊状附着于细胞周边，或以胶状形态分泌到培养液当中，也有两 种形式并存的现象。这种生产方法存在一些明显不足。一是多糖中鼠李糖含量往 往偏低，而且水解后含有其它单糖，使分离提取困难，增加生产成本；二是多糖 分泌到发酵液中时，时常混有杂蛋白，这些杂蛋白将使多糖的分离提纯更加困难； 三是多糖本身性质影响，如用微生物生产多糖时，发酵液粘度高，工艺条件难控 制，生物反应器的搅拌能耗较高，而且从发酵液中提取多糖也不易【1 4 1 。大规模生 产鼠李糖较有发展前景的方法为利用微生物生产鼠李糖脂，水解鼠李糖脂得到鼠 李糖。某些细菌在有油性基质的培养基当中培养，能够刺激细胞分泌鼠李糖脂， 以鼠李糖脂加强油的乳化作用，使油均匀地分布于水相当中，以促进微生物对油 性基质的利用【1 5 】。与用天然含鼠李糖基的资源生产鼠李糖的方法相比较，发酵法 生产鼠李糖脂有可能得到较高产量，利用生物技术的方法或常规的分离方法，从 发酵液中分离出鼠李糖脂、从水解液中分离鼠李糖与脂肪酸，比从发酵液中分离 多糖、从水解液中分离鼠李糖与其它单糖相对容易，而且生产过程中毒性及腐蚀 性较低，又不受地域、季节等因素影响，故极有发展前景1 1 6 j 。 1 4 鼠李糖的作用 除分子结构的差异外，与其它l 型的糖相比，l 一鼠李糖较为特别。剑桥大学 m u 时j a 等人的研究结果表明，在西如p ，渤蛔c d 疗中，由于l - 鼠李糖的诱导，菌 体产生生化及遗传特性独特的l 一岩藻糖一h + 同向转运活性。r e ni 沁s c h e r 等人研究结 果表明，l 鼠李糖是p 七 缸c 印s “肠绍合成f u r a n e o l 的碳源。在人体中，l 鼠李糖的 生理功能不同于乳果糖( l a c t u l o s e ) ，在服用升压药多巴胺( d o p 锄i n e ) 或d o p e x a m i n c 后，直肠的渗透性发生变化，直肠吸收的乳果糖与l - 鼠李糖的比例存在显著差异， 两种糖的生理功能不同，但其机理仍不清楚。 许多天然强心药物分子结构的末端都连接有一个l 鼠李糖基，在这类强心药 物的合成过程中，l 鼠李糖基是必不可少的基本原料。目前，用l 一鼠李糖为基本 原料之一，人工合成强心药物仍处于研究开发阶段，尚未投入市场。在与其它物 质反应生成风味物质方面，与核糖和葡萄糖相比较，l _ 鼠李糖较为特别。由l - 鼠 李糖形成风味物质的种达五种，核糖、葡萄糖各为两种。 目前，l 鼠李糖在工业生产主要应用于合成香料f u r a i l e o l 。f u r a l l e 0 1 在水果香 料领域占有十分重要的地位。它除了直接作为香料产品外，还是合成许多水果香 料的基本原料。鼠李糖在工业生产和科学研究中已得到广泛应用，例如，作为有 拟南芥鼠李糖合成酶基因黜眦j 的初步研究第一章前言 机物合成的中间体合成香料f u r 柚e o l ，合成强心药物等。也可直接用作为食品添加 剂添加于高档咖啡、饮料、肉类食品中。随着研究开发工作的不断深入，鼠李糖 的应用范围将不断扩大【1 6 j 。 2 鼠李糖合成酶的研究 细菌中d t d p d ，l - 鼠李糖的合成已经研究的比较清楚，合成起始于 d t d p - a d g l u c o s e ，在一系列的催化反应下完成，此过程需要三种酶： d t d p g l c 一4 ，6 一d e h y d r a t a s e ( n i l i b ) f 1 7 堋，d 1 d p - 4 k e t o 一6 d e o x y g l u c o s e 3 ，5 e p i m e r a s e ( 1 1 i l l c ) 【1 9 捌，d 1 d p 4 一k e t o r h 舢o s er e d u c t a s e ( m l l d ) 【1 6 1 。鼠李糖合成酶基因已经在 许多细菌中被鉴定和克隆2 1 捌。 在植物中，鼠李糖的生物合成已经在一些研究中有所报道，u d p - a - d 葡萄糖 是u d p 鼠李糖合成的起始原料。一种类似于细菌中加l b 的酶将u d p - a d g 1 c 转 化成切) p - 4 一k c t 0 6 一d e o x y g l c ，然后具有核酸糖异构酶和还原酶双重功能的蛋白 n r s 凰将d t d p - 4 k e t 0 6 d e o x y g l c 转化成d 1 d p p l - r h a 。除了u d p - a - d g l c ， 一些植物还可以利用d t d p - a d 一葡萄糖合成d t d p b l 鼠李糖【矧。 在细菌中，以r d p d 葡萄糖为底物合成d t d p 一【，鼠李糖的过程中需要三种酶： 黜n l b ，r l l c ，黜n l d ，相应地编码这三种酶的是三种不同的基因渊。而在植物中， r e i t e ra l l dv a l l z i n 推测在以u d p 。a d 一葡萄糖为底物生成u d p l 鼠李糖的过程中需 要三个高度相似的鼠李糖合成蛋白r h m l ，r 卸m 2 ，i 瑚m 3 催化合成，而这三种酶 是由一种被称为珊基因家族的基因编码。删蛋白n 端编码 d ) p - l g l u c o s e 一4 ，6 - 脱水酶( 黜n 1 b ) ，c 端编码3 ，5 印i 脒：m s 动4 一酮还原酶( n r s e r ) 从而催化n d p - a - d g 1 c 合成n d p p l 广r h a ( 图1 - 2 ) 剀。 a 承捌比基因的突变导致拟南芥种皮粘液中鼠李糖和半乳糖醛酸含量的减少， 进一步证实了l 瑚m 蛋白具有鼠李糖合成酶的功能瞵一。拟南芥中与细胞壁形成有 关的脚唧基因突变导致拟南芥根毛变短且有分枝，而删基因的突变可以使 z j 突变体根毛的表型恢复成野生型，施m f 突变体根细胞壁的鼠李糖含量与野生 型相比没有显著区别，表明r 日m z ，删和删这三个基因功能冗余2 7 ，2 8 j 。 目前，有关植物r 删z 基因启动子不同区段的顺式作用元件以及功能分析未见任 何报道。 4 拟南芥鼠李糖合成酶基因j t h j 哪的初步研究第一章前言 i 猢铷 9 05 9 6 6 c 0鳓 d t d p - l g l u s e 4 ，6 一d e h y d r a t 嬲e3 5 - e p i i n e r 嬲鲋- k e t or e d u c t a a r h 皿；)烈r s ，e r ) 图1 2 砒似l 蛋白功能结构域示意图 f i g 1 2f u n c t i o n a ld o 础l i n so fi 瑚m 1 3 糖信号感应和信号传导 糖是植物生长发育和基因表达的重要调节因子，它不仅是能量来源和结构物 质，而且在信号传导中具有类似激素的初级信使作用【2 9 】。糖信号感应和糖信号传 导在植物的整个生命周期中调控其生长和发育。在种子萌发和幼苗发育早期，糖 可抑制营养成分的转运、下胚轴伸长、子叶变绿和子叶伸展m3 1 1 。糖可调控植物 的开花周期，且对花形态建成等方面具有不同程度的影响，这依赖于糖的浓度、 植物的营养生长阶段和遗传背景【3 2 3 3 1 。此外，糖信号还可调控叶片的衰老及植株 的防御反应【州。 3 1 糖信号分子 以往认为，糖对代谢、生长、发育、胁迫和基因表达的调节是糖代谢的结果。 然而，用不能代谢或部分代谢的己糖或己糖和蔗糖类似物来研究糖对基因表达的 调控作用发现，特异的信号感应和传导不需要通过糖的分解代谢来实现【3 5 1 ，也就 是说，糖分子本身在植物的生长、发育、成熟和衰老等许多过程中具有调控作用【3 6 】。 从理论上讲，任何一种中性糖分子或糖酵解的中间代谢物都具有信号功能，然而 事实并非如此。蔗糖是植物体碳水化合物运输的主要形式，并且常被用来研究糖 对植物生长发育和基因表达的调控作用，但是在大多数情况下，蔗糖的这种作用 可完全被己糖( 例如果糖和葡萄糖) 所替代。例如，蔗糖对光合基因表达的抑制作用 可通过低浓度的己糖实现【3 7 】；在玉米原生质体中，葡萄糖和果糖比蔗糖作为信号 分子能更有效地抑制光合相关基因的表达。由此说明，许多情况下蔗糖并不是直 接的信号分子。故一些作者认为，葡萄糖和果糖可能是直接的信号分子，而蔗糖 拟南芥鼠李糖合成酶基因j 珊枷的初步研究第一章前言 在行使信号功能前已经转化成己糖阳。 3 2 糖相关调控元件 目前，对于参与植物糖信号传导途径的顺式调控元件和反式作用因子的研究 还不够详细，共确定了五个不同类型的顺式作用元件：s u r e ( s u g a r r e s p o n s i v e ) 【3 8 1 ， s p 8 【3 9 】，t g g a c g g 嗍，g - b o x 【4 1 】和b - b o x1 3 8 】。与植物糖信号传导相关的s p f l 和s t k 已经分离，s p f l 结合到s p 8 序列上，起到阻遏物的作用，s t k 结合到b b o x 上，起 到激活物的作用3 9 1 。s u r e ( s u g a rr e s p o n s i v e ) 是植物中糖信号传导的顺式元件。 s u r e 首先在番茄中被报道，它是p 织l 血启动子糖响应元件。转录因子 s u s m a 2 ( s u g a rs i g n a l i n gi nb a r l e y ) ，属于w r k y 蛋白家族，可以与s u l 也和w - b o x e l e m c n t s 结合，但是不能与扫d ( j 括。口，哕五已f ) 启动子s p 8e l e m e n t 结合【4 2 】。 g - b o x 基序是高度保守的d n a 序列，其核心序列为c a c g t g 。g b o x 首先被发 现存在于编码二磷酸核酮糖氧合羧化酶( r u b i s c o ) 小亚基的基因上游【4 1 1 ，其后，在 一些受环境因子调控的基因和糖诱导基因的启动子中也陆续发现了g - b o x 元件的 存在【4 封。玉米淀粉分支酶基因舾明启动子的糖调控相关区域中存在g b o x 【4 2 1 。水 稻糖调控基因以，妒启动子中存在g - b o x 参与糖应答途径。同时，在删基因 启动子9 3 1 b p - 7 5 2 b p 中还存在g c 七o x 。水稻口诅，掣3 基因启动子中的g - b o x 可以与 g c - b o x 和t a r c c a 元件协同作用介导糖应答反应【捌。 g - b o x 在环境诱导型基因中的作用模型是一个双组分系统：g _ b o x 以及另外一 个顺式作用元件如i - b o x 、h - b o x 等，两个元件在细胞接受外界信号时调节转录起始 的频率。这种机制可能是通过g - b o x 及其结合蛋白相互作用产生一个内部环境，使 另外的调节蛋白与启动子区域有效结合，允许细胞准确而有选择地起始转录。如 p c n a ( 增值细胞核抗原) 基因上游一2 0 2b p 一1 9 lb p 即为g - b o x 顺式元件，中心回 文对称序列a c g t 同核因子砒f 2 1 的b z m 结构域相结合，这也是g - b o x 元件的 共同特征【4 5 】。 4 删1 基因的研究现状及意义 在细菌中，砌馏，砌f c ，砌f d 三种鼠李糖合成酶基因分别编码三种酶：硒1 1 1 b ， 黜1 1 1 c ，黜i l l d ，以催化m p - d 一葡萄糖从而合成d t d p l 广鼠李糖。拟南芥中，以 u d p a - d 葡萄糖为底物合成u d p p l 鼠李糖或者d t d p p 一鼠李糖的过程中需要两 种酶：u d p 葡萄糖或d t d p 一葡萄糖4 ，6 一脱水酶和3 ，5 - 异构4 酮还原酶( n r s e r ) ( 图 1 3 ) 。拟南芥中的n r s e r 与p ，l 纪，f 和e 豇中的内n l d 在氨基酸序列上有4 0 的 6 拟南芥鼠李糖合成酶基因删的初步研究第一章前言 相似性【4 6 】。n r s e r 与拟南芥i m m l ，r h m 2 和r h m 3 蛋白的2 9 0 个氨基酸有着约8 0 的相似性。 1 i i t - 。- ： n r s ，e r ： n i ) p 肛l 球h a 图1 3 鼠李糖合成途径 f i g 1 - 3s y n t h e s i so fr h a i n n o s 通过氨基酸序列同源性分析，用t a i r ( a v a i l a b l e0 nt h ew o r l dw i d ew e b 嘲幅狮麟l b i d o p s i s o 呦网站上的b l 认s t 工具，分离到了三个预定的删基因， 它们被分别命名为删，僦( m 嗍) ，删。删l 和2 分别定位在第一 号染色体上，剐鼢刀则在第三号染色体上。i m m l ，r h m 2 ，r h m 3 是由6 6 4 6 6 9 个 氨基酸残基组成的约7 5 k d a 的蛋白质且在氨基酸水平上有8 3 乡：墨2 丝的相似性( 图 1 4 ) 。体外酶活分析表明，拟南芥心 m 1 酶蛋白能够将u d p d 葡萄糖转化为 u d p l 鼠李糖【2 9 1 。r h m 2 蛋白包含两个结构域：n 端与细菌中的d 1 d p 葡萄糖4 ，6 脱水酶( r m l b ) 相似，c 端与细菌中的还原酶相似( 黜1 1 l c ，r m l d ) 。拟南芥删 基因的突变导致拟南芥种皮粘液中鼠李糖和半乳糖醛酸含量的减少，进一步证实 了删蛋白具有鼠李糖合成酶的功能。僦基因的转录过程中需要上游转录 因子a p 2 ，t t g l 和g l 2 的参与。r t - p c r 结果表明在拟南芥中删，删和 删基因在根、茎、叶、花絮、种荚中均有表达【2 6 刀】。拟南芥中与细胞壁形成 有关的三兄w 基因突变导致拟南芥根毛变短且有分枝，而删基因的突变可以 使厶x 突变体根毛的表型恢复成野生型，砌m j 突变体根细胞壁的鼠李糖含量与野 生型相比没有显著区别，表明删，删和删这三个基因功能冗余。在 国内对于鼠李糖的研究仅限于对鼠李糖的提取纯化方面，而对关于鼠李糖的基因 的研究尚未开始。 7 c 印 ，事 拟南芥鼠李糖合成酶基因r h 训的初步研究 第一章前言 燕；兰莲舞豳圈豳嚣豳隧豳麓避嚣 ：矗= = ：i 一 窭；露藿强圈鞠圈豳圆圈豳豳蓬 一一一一。一一。二嚣一。 塞毫蘑霾墨圜露豳圈豳圈露圈滋 塞戮暖豳豳霭豳濑瞄孵氍蕊圈翥 塞翌匪豳震霹圈圈豳豳蕊隧；蔫颡 一c t t - o 置- a 篡嚣蔫臻雾嚣蠹霎墨圈圈豳嘲辫 黧j 圈阔豳霜匿墨嚣雾露蕊圈攒 罴蚤圈蕊圈圜豳豳舞豳豳磷蕊甄 悉爱豳圜鞠蕊惑罄圈黛盈震豳蚕 燕囊豳基 图1 - 4r h m 家族氨基酸水平相似性的比较 f i g 1 4s i m i l 撕t ) ro f i 己h mp r o t e 访f a m i l y 本实验中研究的r 删，基因，属于上面所述的鼠李糖合成酶家族基因。基因 定位在第一号染色体上，根据1 a 瓜网站( h 卸：v 州w ：觚a b i d o p s i s o r g i n d e x j s p ) 公布 的拟南芥序列，r 五m ，基因的全基因长为2 7 9 0 b p ，c d n a 2 4 6 3 b p ，砒 m 1 蛋白有 6 6 9 个氨基酸，预测的基因特征如表1 1 所示。 囤 拟南芥鼠李糖合成酶基因删，的初步研究 第一章前言 表1 1t a i r 网站预测的么f 灭翩幽基因的特征 t a b l e1 - 1 加l a l y s i so f 么氓删7o nt a i r o r f4 6 2 2 5 5 9 5 u 缸l - 2 1 3 5 u 仃4 5 3 。4 6 l c o d i n gr e g i o n 4 6 2 2 0 2 7 c o d i n gr e g i o n 2 1 1 6 2 5 5 9 e x o n 1 2 1 3 i n t i d n 2 1 4 4 5 2 e x 0 n 4 5 3 2 0 2 7 i n n o n2 0 2 8 - 2 1 1 5 e x o n2 1 1 6 2 7 9 0 3 曲2 5 6 0 2 7 9 0 本实验以拟南芥为材料，通过分子生物学方法以及植物生理学方法，研究植 物中删基因的表达模式以及基因启动子中重要顺式作用元件的。 5 实验设计 图1 5 实擞计图 f i g 1 5r o u t eo fe x p e r m l e n t 9 拟南芥鼠李糖合成酶基因删的初步研究第二章删基因启动子的研究 第二章r 胁么，基因启动子的研究 1 实验材料 1 1 实验样品 野生型拟南芥种子( c o l u i 】曲i a 诚l dt y p e ) 由本实验室提供。 1 2 菌种 大肠杆菌e c 0 1 id h 5 伍、t o p l 0 ，农杆菌l b a 4 4 0 4 ，由本实验室保存。 1 3 载体 g a t e w a y 载体p k g l 岍s 7 由本实验室保存，脚载体购自北京天为时代公司。 1 4 工具酶 各种限制性内切酶购自n e we n g l a n gb i o l a b 公司，a 公司。t a qp c r 聚合 酶来自东盛生物技术公司的，高保真聚合酶和d n a s ei 购自a 公司。 1 5 测序及引物合成 由北京奥科生物公司，上海博亚生物技术有限公司和上海生工生物技术有限 公司完成。 1 6 试剂盒 质粒提取用天为时代和s i g m a 公司质粒小量提取试剂盒；琼脂糖凝胶d n a 回 收用北京天为时代科技有限公司琼脂糖凝胶瑚呵a 回收试剂盒；r n a 提取用安徽 优晶生物工程有限公司试剂盒；逆转录试剂盒( t o y o b o ) ：r a c e 试剂盒购自 h l v i 仃o g e n 。 1 7 分子量标准 核酸分子量标准参照天为时代公司1 k b 和1 0 0 b pd n a l a d d e r 。 1 8 化学试剂 e ba g a r o s e 购自s i 鲫a 公司，强z o l 购自h l v i 仃o g e n 公司，其它化学药品均为 国产分析纯。 2 方法 2 1 拟南芥的栽培 2 1 1 温室栽培 种子避光4 春化2 3 天，种在吸足水分的蛭石与营养土按体积比1 ：2 的比 l o 拟南芥鼠李糖合成酶基因尺h 的初步研究 第二章删基因启动子的研究 例混合土中。在2 2 培养，1 6 小时光照，8 小时黑暗条件的温室中培养。 2 1 2 拟南芥种子播种在培养基上 1 ) 称取2 5 3 0 i n 1 5 m le p 管的种子，加入1 1 1 1 l 含o 0 5 吐温2 0 的7 5 乙 醇，在摇床上约3 0 0 r p m 振荡1 0 分钟。 2 ) 瞬时离心，用1 n d 移液器吸去上清。 3 ) 加入1l n l9 5 乙醇清洗一下，瞬时离心，移去乙醇( 重复一至二次) 。 4 ) 在超净台里，每个e p 管加入o 3i l d1 0 0 乙醇，用移液器把种子转移到灭 过菌的滤纸上，吹干。 5 ) 把种子均匀的撤在含有1 蔗糖的1 2m s 培养基上( 筛选阳性转基因苗时 加入相应的抗性) 。 6 ) 用封口膜封好平皿，4 培养4 8 7 2 小时。 7 ) 在2 2 ，1 6 小时光照8 小时黑暗的光照培养箱中培养。 2 2c t a b 法提取基因组d n a 1 ) 将5 0 0 u lc t a b 溶液加入1 5 l 也p 管中，6 5 水浴中预热。 2 ) 0 1 9 样品液氮中研磨成粉末，倒入1 5 l i l l 含有c t a b 深夜的e p 管中。 3 ) 6 5 0 保温4 0 - 6 1 0 m 地每1 0 分钟小心摇动离心管。 4 ) 待冷至室温2 5 后，加入2 0 0 山氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，冰上放置1 0 分钟。 5 ) 室温下1 4 ，o o o 叩m 离心1 0 m i n 。 6 ) 将上清液逐滴加入2 倍体积无水丙醇( 约8 0 0 山) ，1 1 0 体积3 m n a a c ( 约 4 0 “1 ) ，一2 0 放置l 小时。 7 ) 1 5 ，0 0 0 印m 离心1 0 l i l i n ，沉淀用7 0 乙醇洗涤2 次。 8 ) 将d n a 吹干，加入适量t e 一8 0 或无菌d d h 2 0 ，于6 5 水浴中1 5 1 1 1 i n 以溶 解d n a ，电泳检测。 2 3 拟南芥r n a 提取 1 ) 实验前准备工作： 配制d e p c 水：在超纯水中加入d e p c 使其浓度为o 1 ，剧烈振荡摇匀，通 风橱中静置过夜。1 2 1 灭菌6 0 分钟，趁热摇匀，室温下冷却。研钵、研棒、量 筒、烧杯、药匙高温干热灭菌1 8 0 ，8 小时。无r n 弱e 的枪头、离心管高温湿热 1 2 l 灭菌3 0 分钟。用d e p c 水配制擦拭液o 1 nn a o h ，1 n l me d l a 。事先将工 作台用擦拭液擦净，离心机预冷到4 ，在e p 管中加入1 0 0 0 “l1 也o l ，冰上预冷。 拟南芥鼠李糖合成酶基因心m ，的初步研究第二章删基因启动子的研究 2 ) 从新鲜植物取得目的组织样本。 3 ) 称1 0 m g 材料并将其放入研钵中，液氮冷冻研磨。 舢加入l m l i 屹裂解缓冲液i i 至匀浆溶解物中。 5 ) 室温下温育裂解5 分钟。 6 ) 往裂解物中加入2 0 0 “l 的氯仿，并涡旋混匀2 0 秒。 7 ) 室温下以1 2 ，0 0 0 9 离心1 0 分钟。这样将会形成小量的组织碎片沉淀，而且 在上清的顶部可以看见少量的漂浮物。 8 ) 转移上清至一个无i 矾硒e 的1 5 m l 微量离心管中。注意：转移时不要带入 沉淀物，而且移液枪头必须放在上清漂浮物之下。漂浮物通常可能会黏附在枪头 的外壁，注意不能将其带入离心管中。 9 ) 加入等体积的7 0 乙醇至裂解液中，并将其彻底涡旋混匀。 1 0 ) 仔细将7 0 0 m 上述样品( 可能包括一些沉淀) 加入装有2 m l 收集试管的 m u p u r n a 分离柱中。 1 1 ) 室温下1 0 ，0 0 0 9 离心1 分钟。弃去流出液，收集试管在下一步中可重复使用。 1 2 ) 重复步骤9 和1 0 的操作，将剩余样品加入分离柱中，离心并弃去流出液。 收集试管在下一步中可重复使用。 1 3 ) 加入4 0 0 li 斟a 洗涤缓冲液i 至分离柱中。如上法离心1 分钟。弃去流出 液，收集试管在下一步中可重复使用。如果不在膜上进行d n 嬲e 消化的话，可简 单的增加r n a 洗涤缓冲液i 至7 0 0 山，8 ，0 0 0 9 离心1 分钟以洗涤柱子，弃去流出 液及及收集试管。接着进行第1 6 步操作。 1 4 ) 选做步骤) ：准备d n a s ei 混和物：在一个1 5 m l 试管中，加入1 5 斗ld n 弱e i 到7 3 5 md n 2 u s ei 消化缓冲液。轻轻翻转试管以混匀之。不要剧烈震荡，因为d n 嬲e i 对物理变性特别敏感。 1 5 ) 将1 5 p ld n 髂ei 混和物直接加到m u p u 砒町a 分离柱硅膜中心。室温放置 1 5 分钟。 1 6 ) 加入3 5 0 mr n a 洗涤缓冲液i 到分离柱中。1 0 ，o o o g 离心1 分钟。弃去流 出液和收集试管。 1 7 ) 将分离柱装上一个新的收集试管。加入5 0 0 “lr n a 洗涤缓冲液i i ( 预先用 无水乙醇稀释) 至柱中。1 0 ，0 0 0 9 离心1 分钟。弃去流出液，收集试管下步可再次 使用。 1 2 拟南芥鼠李糖合成酶基因彤删的初步研究第二章删基因启动子的研究 1 8 ) 再加入5 0 0 p l 鼢悄洗涤缓冲液i i 至柱中，1 0 ，o o o x g 离心1 分钟。弃去流 出液及收集试管。 1 9 ) 将m u p ur n a 分离柱装上一个新的2 m l 收集试管。极速离心2 分钟以甩 干硅膜。 2 0 ) 洗脱r n a ：将m u - p u 砌叮a 分离柱放入一个1 5 m 1 无r n a s e 离心管中，直 接加入5 0 7 5 md e p c 水至柱中硅胶膜的中心。1 0 ，0 0 0 x g 离心1 分钟以洗脱出r n a 。 2 1 ) 如要得到更高的产量，可进行第二次洗脱。 要判定r n a 的浓度和纯度，可用分光光度计在2 6 0 嘲及2 8 0 眦下测其吸光 值得知。在2 6 0 咖下测得的1 0 d 相当于4 0 一“的r n a 。纯净的核酸其a 2 6 0 a 2 为2 0 ，比值在1 8 2 0 相当于核酸纯度为9 0 1 0 0 。砒呵a 样本储藏在7 0 。这 种条件下的鼢蛆可保存一年时间。 2 4 反转录 ( f i r s ts t r a n dc i n as y 玎m e s i sk i t _ ，凡i v e 以 r aa c e 洳，t o y o b 0 ) 试剂 用量 r n 邪e f r e eh 2 0 5 i u b u 毹r d n t pm i x t u r e i 斟邪e i n h i b i t o r ( 1o u m ) o l i g o ( d d2 0 1 研mr n a ( 5 0 0 p m ) ) r e v e rt r aa c e 8 p l 4 山 2p l 1 u l 1 u l 1 “l 2 m 1 山 i b t a lv o l u m e 2 0 p l 反应条件：4 2 2 0 分钟，9 9 5 分钟，4 5 分钟，瞬间离心。 2 5 转录水平鉴定 提取拟南芥r n a ，反转录成c d n a ，用基因特异引物检测突变体。其中设野 生型对照和不加模板的阴性对照。 内标基因引物：a c t i n 2 f ：5 a t g t c t c 仉c aa t 盯c c c g - 3 a c t i n 2 r ：5 c c a a c a g a g a g a a g a t g a c t - 3 基因特异引物：f ：5 g a g a c t a t c c g t g c c a a t g r a 3 r ：5 t aa t aa c t c g t c c a a c a c a g t c 3 1 3 拟南芥鼠李糖合成酶基因删的初步研究第二章脚基因启动子的研究 p c r 反应条件： 9 4 预变性5 分钟； 9 4 ，3 0 秒：5 5 ，3 0 秒；7 2 ，3 0 秒。3 5 个循环。 7 2 延伸5 分钟。 2 6 植物表达载体的构建 2 6 1 缺失启动子的获得 用p c r 的方法从拟南芥基因组中获得缺失启动子，所用引物： 表2 1 扩增片断名称、所用引物及扩增片断大小 仉出l e2 - 1f r a g m e m sa n dp r i m e r 名称5 端正向引物3 端反向引物片断大小 5 aa aa a g c a g g c t t c a c c g 5 a g a a a g c t g g g t 匏g c c a 噜a t p r h l n l 1 3 5 8 b p g c g a l t c t c t c t c t c 3 c a 觚c g c t g c3 5 a a a a a g c a g g c t t c c 勰g5 a g a 从g c t g g g t a a g c ca _ l l 乒 p d l 1 1 7 9 b p g c g t c l ：t t a g a t g t t3 c 凇c g c t g c 3 5 a a a a a g c a g g c t q ；t t a c t5 a g a a a g c t g g g t a a g c c a 喀a t p d 27 3 5b p t c a t a c t c c a t a3 c 撇c g c 蟾c3 5 a a a a a g c a g g c t t a c c t a 5 a g a a a g c 7 r g g g t a a g c c a 培a t p d 3 5 6 7 b p c c c g c t 熘越壤3 c 嬲a c g c 蟾c3 5 a a a a a g c a