（细胞生物学专业论文）乙酰胆碱酯酶在细胞凋亡中的表达调控研究.pdf

中科院上海生命科学研究院 研究生学位论文声明 本人郑重声明： 1 ) 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容或属合作研究共同完成的工作外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 2 ) 所呈交的学位论文，实验结果均由相应的实验数据分析得出，实验数 据真实可靠。 该声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名 日期：沙州移年( 7 月砖日 研究生学位论文版权使用授权声明 本人完全了解并同意遵守中科院上海生命科学研究院有关保留、使用学位论 文的规定，即：生科院有权保留送交论文的复印件和电予文件，并提供论文的目 录检索及借阅、查阅；生科院可以公布论文的全部或部分内容，可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制 于段保存和汇编本学位论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名 导师签名 n 日期：堡丝上、 摘要 乙酰胆碱酯酶在细胞凋亡中的表达调控研究 朱慧( 分子细胞生物学) 导师张学军研究员 摘要 乙酰胆碱酯酶( a c e t y l c h o li n e s t e r a s e ，a c h e ，e c3 1 1 7 ) 是一种b 型的羧 酸酯酶，它在神经胆碱能突触部位和神经肌肉接头处迅速水解和灭活神经递质乙酰 胆碱。我们最近报道了在各种细胞类型的细胞系被诱导凋亡的过程中，a c h e 都会被 诱导表达。但a c h e 被诱导表达的分子机制并不清楚。在本项研究中，我们首次表 明了a c h e 在细胞凋亡中的表达受到细胞内钙离子的调控。在钙离子通道a 2 3 1 8 7 诱导的h e l a 细胞和m d a m b 一4 3 5 细胞凋亡中， a c h em r n a 水平和蛋白水平的增加 被一种细胞内钙离子拮抗剂b a p t a a m 明显抑制。a 2 3 1 8 7 能增加a c h em r n a 的稳 定性并增加a c h e 肩动子的活性，而这两种效应也都能被b a p t a a m 所拮抗。 t h a p s i g a r g i n ( t g ) 是另外一种能破坏细胞内钙离子平衡的诱导剂，在t g 诱导的 h e l a 细胞和m d a m b 4 3 5 细胞凋亡中，它同样能增加a c h e 的表达和a c h e 启动子 的活性，并且这两种增加的效应也都能被b a p t a a m 所抑制。我们还首次阐明了 a 2 3 1 8 7 和t g 对a c h e 启动子的转录激活作用是部分通过人a c h e 启动子上一1 2 7 0 至f j - i 2 4 8 序列中的一个顺式作用元件c c a a t 所介导的，而和这个顺式作用元件结合 的转录因子是c c a a t 结合因子( c b f n f y ) 。e m s a s 结果表明在a 2 3 1 8 7 作用后， c b f n f y 和c c a a t 顺式作用元件的结合活力明显下降。c c a a t 位点的定点突变以 及通过r n a i 技术下调内源c b f n f - y 三元复合体中c b f b n 卜y a 的表达都能明 显增加a c h e 启动子的活性。这些结果表明当转录因子复合物c b f n f y 结合在 c c a a t 顺式作用元件上时存在一种抑制效应，而在a 2 3 1 8 7 诱导的细胞凋亡中， a 2 3 1 8 7 对a c h e 启动子的激活是部分由于c b f n f y 从c c a a t 顺式作用元件上解 离，释放出了这种抑制效应，从而使a c h e 启动子活力上升。 乙酰胆碱酯酶在细胞凋亡中的表达调控研究 我们还进一步探讨了细胞凋亡中钙离子对a c h e 的表达进行调控的分子机制。 我们发现在a 2 3 1 8 7 诱导的h e l a 细胞和m d a m b 一4 3 5 细胞凋亡中，一种钙激活 的半胱氨酸蛋白酶，钙蛋白酶( c a l p a i n ) ，和种钙依赖的蛋白磷酸酶，钙调磷 酸酶( c a l c i n e u r i n ) ，都调控了a c h e 的表达。c a l p a i n 的抑制剂c a l p e p t i n 利 c a l c i n e u r | i n 的抑制剂f k 5 0 6 以及c y c l o s p o r i n ea ( c s a ) 都能抑制a c h em r n a 和蛋白的表达，并且抑制a c h e 启动子的活性。相反，过表达持续激活型的 c a l c i n e u r i n 能激活a c h e 启动子。另外我们还表明受c a l c i n e u r i n 调控的转录 因子家族n f a t ( n u c l e a rf a c t o ro fa c t i v a t e dtc e l l s ) 在钙离子载体诱导的细胞 凋亡中也调控了a c h e 启动子的活性。在a 2 3 1 8 7 诱导的细胞凋亡中过表达人 n f a t c 3 和人n f a t c 4 能明显增加a c h e 启动子的活性。过表达核型的n f a t c 4 能 直接激活a c h e 启动子，而过表达负显性失活的n f a t 抑制了a 2 3 1 8 7 对a c h e 启 动子的激活作用。这些结果首次表明了在a 2 3 1 8 7 诱导的细胞凋亡中钙依赖的 c a l c i n e u r i n 调控了a c h e 的表达，并且a c h e 启动子的活性也受到了 c a l i n e u r i n n f a t 信号通路的调控。 关键词：乙酰胆碱酯酶；细胞凋亡；钙离子；c c a a t 顺式作用元件；c c a a t 结合因 子c b f n f y ；钙蛋白酶( c a l p a i n ) ；钙调磷酸酶( c a l c i n e u r i n ) ；n f a t 2 摘要 r e g u l a t i o no fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s ee x p r e s s i o nd u r i n ga p o p t o s i s h u iz h u ( m o l e c u l a rc e l lb i o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f x u e j u nz h a n g a b s t r a c t a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( a c h e ) i sat y p ebc a r b o x y l e s t e r a s et h a tr a p i d l y h y d r o l y z e sa c e t y l c h o li n e ( a c h ) a tc h o l i n e r g i cs y n a p s e sa n dn e u r o m u s c u l a r j u n c t i o i l s w eh a v er e c e n t l yr e p o r t e dt h a ta c h ee x p r e s s i o nw a si n d u c e dd u r j n g a p o p t o s i si nv a r i o u sc e l1t y p e s h o w e v e r ，t h em e c h a n i s m st h a tr e g u l a t et h e e x p r e s s i o no fa c h ed u r i n ga p o p t o s i sh a v e n tb e e ne l u c i d a t e d i nt h e c u r r e n ts t u d yw ep r o v i d ee v i d e n c et os u g g e s tf o rt h ef i r s tt i m e t h a tt h e i n d u c t i o do fa c h e e x p r e s s i o nd u r i n ga p o p t o s i s i s r e g u l a t e db yt h e m o b i i i z a t i o no fi n t r a c e l l u l a rc a 2 + d u r i n ga p o p t o s i s ，t r e a t m e n to fh e l aa n d m d a “m b 4 3 5 sc e l l sw i t ht h ec a l c i u mi o n o p h o r ea 2 3 1 8 7r e s u l t e di nas i g n i f i c a n t i n c r e a s ei na c h em r n aa n dp r o t e i nl e v e l s c h e l a t i o no fi n t r a c e l l u l a rc a ”b y b a p t a a m ，a ni n t r a c e l l u l a rc a 2 + c h e l a t o r ，i n h i b i t e da c h ee x p r e s s i o n a 2 3 1 8 7 a l s oe n h a n c e dt h es t a b i l i t yo fa c h em r n aa n di n c r e a s e dt h ea c t i v i t yo fa c h e p r o m o t e r e f f e c t st h a tw e r eb l o c k e db yb a p t a a m p e r t u r b a t i o n so fc e l l u l a r c a ”h o m e o s t a s i sb yt h a p s i g a r g i n ( t g ) r e s u l t e di nt h ei n c r e a s eo fa c h e e x p r e s s i o na sw e i la sa c h ep r o m o t e ra c t i v i t yd u r i n gt gi n d u c e da p o p t o s i si n h e l aa n dm d a 淞一4 3 5 sc e l l s e f f e c t st h a tw e r ea l s oi n h i b i t e db yb a p t a a m w ea l s of i r s t l yd e m o n s t r a t e dt h a tt h et r 8 n s a c t i v a t i o no ft h eh u m a na c h e p r o m o t e rb ya 2 3 1 8 7a n dt gw a sp a r t i a l l ym e d i a t e db yac c a a t m o t i fw i t h i nt h e 一1 2 7 0t o 一1 2 4 8f r a g m e n to ft h eh u m a na c h ep r o m o t e r t h i sm o t i fw a sa b l et o b i n dt oc c a a tb i n d i n gf a c t o r ( c b f n f - y ) e 1 e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f t a s s a y s ( e m s a s ) d e m o n s t r a t e dt h a tt h eb i n d i n gi n t e r a c t i o no fc b f n f y at ot h e 3 乙酰胆碱酯酶在细胞凋亡中的表达调控研究 d i s t a lc c a a ts e q u e n c ed e c r e a s e da f t e ra 2 3 1 8 7t r e a t m e n t s i t e - d i r e c t e d m u t a t i o no ft h ec c a a td i s t a ls i t es i g n i f i c a n t l ye n h a n c e dt h ea c h ep r o m o t e r a c t i v i t ya sc o m p a r e dw i t ht h ew i i d t y p es e q u e n c e k n o c k d o w no fo n eo ft h e t h r e ec b f n f ￥s u b u n i t sc b f b n f y a b y r n ai n t e r f e r e n c e ( r n a i ，a l s o i n c r e a s e dt h ea c h ep r o m o t e ra c t i v i t y t h e s er e s u l t si n d i c a t eas u p p r e s s i r e e f f e c tw h e nc b f b n f yp r o t e i n sb i n dt ot h ed i s t a lc c a a tm o t i f ，a n ds u g g e s t t h a tt h em e c h a n i s m se ft h ea c t i v a t i o no fa c h ep r o m o t e rd u r i n ga 2 3 1 8 7 一i n d u c e d h e l ac e i l sa p o p t o s i sr e s u l tp a r t l yf r o mt h ed i s s o c i a t i o no fc b f n f yp r o t e i n s f r o mt h ed i s t a lc c a a ts e q u e n c ei nt h ea c h ep r o m o t e ra n dr e l e a s et h e s u p p r e s s i v ee f f e c t i nt h ef u r t h e rs t u d yo ft h em e c h a n i s mb yw h i c hc a 2 + r e g u l a r e sa c h e e x p r e s s i o nd u r i n ga p o p t o s i s ，w es h o wt h a ta c t i v a t e de a t p a i n ，ac y t o s o l i c c a l c i u m a c t i r a t e dc y s t e i n ep r o t e a s e ，a n dc a t c i n e u r i n ，ac a l c i u m d e p e n d e n t p r o t e i np h o s p h a t a s e ，r e g u l a t ea c h ee x p r e s s i o nf o l l o w i n ga 2 3 1 8 7t r e a t m e n t t h ec a l p a i ni n h i b it o r ，c a l p e p t i n ，a n dt h ec a l c i n e u r i ni n h i b i t o r s ，f k s 0 6a n d c y c l o s p o r i n ea ( c s a ) ，i n h i b i t e da c h ee x p r e s s i o na tb o t hm r n aa n dp r o t e i n 1 e v e l sa n ds u p p r e s s e dt h eh u m a na c h e p r o m o t e ra c t i v i t y i nc o n t r a s c ， o v e r e x p r e s s i o no fc o n s t i t u t i r e l ya c t i v ec a l c i n e u r i ns i g n i f i c a n t l ya c t i v a t e d t h ea c h ep r o m o t e r f u r t h e r m o r e ，w ei d e n t i f yar o l ef o rt h et r a n s e r i p t i o n f a c t o rn f a t ( n u c l e a rf a c t o ro fa c t i v a t e dtc e l l s ) ，ae a l c i n e u r i nt a r g e t ，i n r e g u l a t i o no ft h e a c h e p r o m o t e rd u r i n gi o n o p h o r e i n d u c e da p o p t o s i s 0 v e r e x p r e s s i o no fh u m a nn ；f a t c 3a n dn f a t c 4g r e a t l yi n c r e a s e dt h ea c h ep r o m o t e r a c t i v i t y i nh e l ae e l l sa n dm d a m b 一4 3 5 sc e l i xt r e a t e dw i t ha 2 3 1 8 7 o v e r e x p r e s s i o no fc o n s t i t u t i v en u c l e a rn f a t c 4a c t i v a t e dt h ea c h ep r o m o t e r i n d e p e n d e n to fa 2 3 1 8 7 ， w h e r e a so v e r e x p r e s s i o no fd o m i n a n t n e g a t i r en f a t b l o c k e da 2 3 1 8 7 一i n d u c e da c h ep r o m o t e ra c t i v a t i o n t h e s er e s u l t sf i r s t i y i n d i c a t et h a tc a l e i n e u r i ni si n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no fa c h ee x p r e s s i o n d u r i n ga p o p t o s i si n d u c e db ya 2 3 1 8 7 o u rd a t aa l s os u g g e s tt h a tn f a tm a yb e 4 摘要 at r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o ro fh u m a na c h eg e n e ，a n ds u g g e s tf o rt h ef i r s t t i m et h a tt h ec a l c i n e u r i n n f a tp a t h w a yi si n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no fa c h e g e n et r a n s c r i p t i o nd u r i n gc a 2 + i n d u c e da p o p t o s i s k e yw o r d s ：a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ；a p o p t o s i s ：c a ”：c c a a tm o t i f ；c c a a tb i n d i n g f a c t o r ( c b f n f y ) ：c a l p a i n ：c a l c i n e u r i n ：n f a t 己簸疆碱酝酶在缨藏穗亡孛熬袭这调麓镂究 楚酶溺： a c h e ：a c e t y l c h o li n e s e r a s e ，a e e t y l e h o t i n ea c e t y lh y d r o l a s e 8 a p a a 疆：i ，2 - b i s - ( 2 一a m i n o p h e n o x y j e t h a n e n ，n ，n ，7n ，一t e t r a a c e t i c a e i d a c e t o x y m e t h y le s t e r ： t h a p s i g a r g i n t u n e l ：t e r m i n a ld e o x y n u e l e o t i d et r a n s f e r a s e - m e d i a t e d d u t pn i c ke n dl a b e l i n g c b f n f y ：t h ec c a a t b i n d i n gf a c t o r e m s a s ： e l e c t r o p h o r e t i cm e b i l i t ys h i f ta s s a y s r n a i ：r n ai n t e r f e r e n c e 。 c s a ： c y c l o s p o r in ea n f a t ： n u c l e a rf a c t o ro fa c t i v a t e dtc e l l s c t ： c y c l et h r e s h o l d ，荧瓷信号遮戴添缓静静褥繇数 g a p d h ：g l y c e r a l d e h y d o3 一p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，甘油醚3 磷酸躐氢酶 p m s f ：p h e n y l m e t h y l s u i f o n y lf l u o r i d e 乙酰胆碱酯酶在a 2 318 7 和t h a p s i g a r g i n 诱导的细胞凋亡中的表达受到细胞内钙离子的调控 第一章：乙酰胆碱酯酶在a 2 3 18 7 和t h a p s ig a r gin 诱导的细胞凋亡 中的表达受到细胞内钙离子的调控 1 前言 乙酰胆碱( a c h ) 介导的神经传递是神经系统的一个重要功能，它的逐渐丧失将 导致认知和神经肌肉功能的逐渐退化，如阿尔茨海默病( a d ) 1 。乙酰胆碱酯酶 ( a c e t y l c h o i n e s t e r a s e ，a c h e ) 是一种b 型的羧酸酯酶，它能迅速水解和灭活乙 酰胆碱，从而调控胆碱能突触部位和神经肌肉接头处神经递质的浓度 2 ，这通常 被称其为经典功能。a c h e 还有其他一些非经典功能，例如在细胞粘连，细胞增殖和 神经生长等过程中，a c h e 都起到一定作用 3 7 。a c h e 蛋白在哺乳动物中只由 个基因编码而来，此基因有6 个外显子，通过m r n a 拼接形成三种成熟的a c h e m r n a ：a c h e s ( s y n a p t jci s o f o r m ) 型，a c h e e ( e r y t h r o c y t i ci s o f o r m ) 型和 a c h e r ( r e a d t h r o u g hi s o f o r m ) 型 8 。a c h e s 型包含e 2 一e 3 一e 4 e 6 ，a c h e e 型包 含e 2 e 3 一e 4 一e 5 ，a c h e r 型包含e 2 一e 3 一e 4 一1 4 一e 5 9 。c 端序列的不同决定了不 同亚基聚合成寡聚体的形式，进而决定亚细胞定位。其中突触型a c h e - s 主要位于 脑和肌肉里。a c h e s 可以形成一系列寡聚体的形式，包括同聚体( 单体，二聚体 和四聚体) ，异聚体( 包括四聚体一个胶原样分子c o l a g e n ，c o l q 结合或者四聚体 和一个脯氨酸富集的膜锚定分子p r o l i n e r i c hm e m b r a n ea n c h o r ，p r i m a 结合) 。 在a c h e e 中，离梭基末端的一个糖基键结合了一分子疏水的糖基磷酯酰肌醇( g pi ) ，从而将成熟的a c h e e 以二聚体的形式锚定在红细胞的外表面，所以称其为 红细胞型，又叫a c h e h ( h y d r o d h o b i c ) 1 0 。而对于a c h e r ，没有任何线索表明 它和其他分子结合，事实上，它确实是以可溶性的单体存在，通常在各种压力影响 下表达 1 1 。 关于a c h e 基因的表达调控的研究主要集中在肌肉系统 1 2 1 4 ，神经系统和 造血系统 9 ，令人注目的是在这三种系统中，通过增加a c h em r n a 稳定性而上调 a c h e 表达的转录后调控机制在a c h e 的表达调控中都起到了重要作用 1 2 ，1 5 1 7 。 a c h e 启动子部分包含了丰富的转录因子调控序列，如m y o d ，e - b o x ，s p l ，e g r l ，a p 一2 己酰胆碱酯酶在细胞凋亡中的表达调控研究 鞋及釉发育稆关的g a g am o t i f 等。第一内禽予1 1 中盏含了一个增强子窿猁。在电 鳐，大鼠，小鼠和人中a c h e 启动予中的转录调控序列对a c h e 转录的调控都有所报道 1 3 ，1 8 2 2 。 我们实验室最避的研究表鞠器释类墅的细脆在不同诱器荆诱导翁亡的过程中， a c h e 都会被诱导表达，包括那姆非神经来源，非肌肉来源以及非造血来源的细胞， 从而嚷示a c h e 可能蹙一静新的凋亡调控因子【2 3 。随后，p a r k 等大报道在鹅亡过 程串a c h e 在参与猫亡复台俸( a p o p t o s o m e ) 懿形成中起鹜关键静作焉 2 4 j 。然藤 有关a c h e 在凋亡中淡达的分子机制却鲜有报邋。 在肌肉母细胞分化成肌管的过程中，c a + 水平的增加上溺了a c h e 的转录水平 1 2 】。在原代培莠的鸡虢管缢绞中，a t p 通避a t p 受体刺激a c h e 的表达，丽这一 过程受到蛋白激酶c 和胞内c a “释放所调控 2 5 。有报道表明在p 1 9 小鼠畸胎瘤 细胞帮视网膜细胞申，淀耪榉鬣自a m y l o i d 毋- p r o t e i n ( a8 ) ，例如a 。和 a 。，上调a c h e 豹活性与缨臌露c d + 逡流瓤铺有关 2 6 ，2 7 。这些研究都表嚼 在肌肉系统和神经系统中c a ”依赖的信号通路在调控a c h e 的表达和活性方面都起 到一寇 篁用。 e 矿+ 是一种重要黪第二信使，缁耱内c 酽+ 倍号在谲控编耱蠲亡中也超捌鲞要作 用 2 8 3 0 。一些研究表明在凋亡发生的早期溅晚期，会出现细胞内c a ”浓度的增 加 3 1 ，3 2 。c a 2 + 从内质网( e r ) 释放和胞外c a 2 + 从被激活骢c a ”通道出流入胞内 都会s l 越细胞谣亡 3 3 ，3 4 3 。鸯人甚至谈舞c 酽+ 静超载是新肖类墅细胞襁亡的一个 最终麸同通路 3 5 。我们以前的研究发现a c h e 在各种类烈的细胞中，在秣种诱导 剂诱嚣的细胞凋亡中都被诱导表达 2 3 ，这波明a c h e 的诱导表达也是城亡细胞 懿一个稻当普遍的特征。由魏我们提出弦设：凋亡细胞中a c h e 酶表达帮e a ”的动员 有关。 在各种类型的触腿中，e 矿载髂a 2 3 1 8 7 熊增加c d + 浓发磐诱导细胞弼亡 3 6 ， 3 7 。缁胞腮质丽e a 气解p 酶泵的静靠剂t h a p s i g a r g i n ( t g ) 使内质丽( e r ) 围e a “ 外流，导致细胞内瞬间c a ”水平上调 3 8 ，而细胞内c a “水平的稳态失调将引起 歪常和憋性细胞的撼亡 3 9 。农我们嚣兹的磺究中，我们发现在a 2 3 1 8 7 和t g 诱导的h e l a 细胞帮黼潍一溜一4 3 5 s 缨胞凋亡串，a c h e 的表达瞪显增加，两这种效应 己酰胆碱酯酶在a 2 3 1 8 7 和t h a p s i g a r g i n 诱导的细胞凋亡中的嵌谜受到细胞内锊离子的调控 2 被稀c a ”的撼抗齐b a p t a a m 所都镪。雯终，a 2 3 1 8 7 秘t g 都能增加人a c h e 启 动予豹活性。这个2 2k b 的人a c h e 基因的启动子序列的功能在很多系统中已被 证明 2 1 ，2 2 ， 。 在太a c h e 癌动予被a 2 3 1 8 7 和t g 诱导激活的过裰中，位子 天2 2k ba c h e 启动子上一1 2 7 0 捌1 2 4 8 序列中的一个顺式作用元件c c a a t 起瓢了重 要作用。 另外，我们还首次发现c c a a t 结合因子c b f n f - y 在a 2 3 1 8 7 和t g 诱导的 绥腿爨亡中是a c h e 题一个潜在鹃转录调控黢予。 2 材料和方法 2 1 缁胞培养和娥理 h e l a 和m d a 细胞用r p m i1 6 4 0 ( g i b c o b r l ，g a i t h e r s b u r g ，m d ) 培养，添加 1 0 热灭活的小牛威清犯i b c o b r l ，6 a i t h e r s b u r g ，锄) ，i 0 0u n i t s 氇i 青霉素积 5 0 # g m l 链霉索。3 7 c 麟c 0 2 条件下正常生长。h e l a 缎胞雳a 2 3 1 8 7 ( 2p 淤 ( c a l b i o e h e m ，l aj o l l a ，c a ) 和t g ( 2 “m ) ( c a l b i o c h e m ，l a7 0 i l a ，c a ) 诱导 凋亡。m d a 细胞用a 2 3 1 8 7 ( 2h 朝t g ( o 5p 啦诱导礴亡。由于m d a 缁胞对t g 的敏戆程度远超邀h e l a 细臆，我们露了较低的 g 浓度。弼亡的检测用猁澎态观察 ( 细胞变圆，皱缩和漂浮) ，h o e c h s t 染色( 染色质凝集) ，t u n e l 染色( d n a 断裂) ， 和颧裂的e a s p a s e 一3 免疫鲴骢倪学染色。 2 2 免疫细胞化学染色和t u n e l 染色的双熏标记 细胞离心予藏玻片上，用l 辍13 鳃多浆甲醛在4 c 暖定4 0 分镪。超8 0 0 hl 努透液( 0 1 t r i t o nx - i 0 0 秘0 1 篱s o d i u mc i t r a t e 溶于p b s 中) 在3 7 穿透5 1 0 分钟，p b s 洗3 遍。用1 0 0 “l 封闭液( 3 b s a 溶于p b s 中) 室 温下瓣闼4 0 分镑。用1 0 0hl 一抗( 1 1 0 0 耩释予封闭液孛) 于3 7 孵育卜2 小辩，爝p b s 流3 次。用8 0 # l - - 抗( 1 1 0 0 稀释于封闭液中) 于3 7 c 孵育0 5 小时，用p b s 洗3 次。加5 0u1t u n e l 反威液在3 7 暗处反应6 0 分钟。p b s 洗后髑h o e c h s t3 3 2 5 8 染色波遮光染色l o 分钟。5 0 彗濑封片，荧光照微镜下观 察( n i k o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ，n i k o ni n c ) 。 乙酰胆碱酯酶在细胞凋亡中的表达调控研究 a c h e 单抗购自b db i o s c i e n c e s ( s a nj o s e ，c a ) 公司，检测哺乳动物细胞内 源6 8k d aa c h e 蛋白分子；识别剪切型c a s p a s e 一3 抗体购自c e l ls i g n a l i n g t e c h n o l o g y ( b e v e r l y ，m a ) ；r h o d a m i n e 偶联的抗鼠i g g 和f i t c 偶联的抗兔i g g 购自s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y ( s a n t ac r u z ，c a ) 。 2 3 钙成像实验 细胞以3 5 x 1 0 5 的密度接种在六孔板上培养过夜。次日对数生长期的细胞用 c a ”m g ”平衡缓冲液( n sb u f f e r ，1 2 4m mn a c i ，3m mk c l ，2 】mm g c l b1 3i 】l mn a h ：p o 。， 2 6m mn a h c o 2m mc a c l2 ，和1 0m md e x t r o s e ，p h 7 4 ) 洗两遍。加入钙荧光指 示剂f u r a 一2 a m ( 5um ) 处理细胞4 5 分钟，3 7 c 。细胞在n i k o nt e 2 0 0 0 e 荧光显 微镜( n i k o ni n c ) 下观察，并记录荧光强度。记录基线荧光强度后，加入a 2 3 1 8 7 或t g 后，记录下瞬间单个细胞f u r a 一2 a m 荧光强度的变化。单个细胞c a “的相对 浓度由矗。，啪。荧光强度的比值确定。在用b a p t a = a m ( 1 0 “m ) 抑制细胞内钙离 子浓度的实验中，b a p t a a m 和f u r a 一2 a m 一同加入处理细胞。 2 4 半定量r t - p c r 和实时定量r t p c r 细胞总r n a 的提取：吸去细胞培养液，p b s 清洗，加入lm l ( 1 0 7 细胞) r n a 快速抽提液t r i z o l ( i n v i t r o g e n ，c a r l s b a d ，c a ) ，反复吹吸几次后，室温放置5 分钟。转移至1 5m l 离心管中，与2 0 0p l 氯仿，剧烈摇晃混匀，室温放置2 分 钟。1 2 0 0 0r p m4 c 离心5 分钟，取上清，加入5 0 0u1 异丙醇，剧烈摇晃混匀， 室温沉淀1 0 分钟，1 2 0 0 0r p m 4 c 离心8 分钟，弃上清，7 0 乙醇洗沉淀，7 5 0 0 r p m4 离心5 分钟，干燥后将r n a 沉淀溶解于适量d d h 。0 ( d e p c 处理) 中，测 a 2 6 0 、a 2 8 0 以确定r n a 浓度与纯度。t r i z o l 处理之后的所有步骤所用的器具和溶 液都需确保无r n a s e 污染。 r n a 产物用m 州l v 逆转录酶( p r o m e g a ，m a d i s o n ，w i ) 3 7 c 逆转录1 小时，所 用引物为1 0 个碱基的随机引物( 生工生物工程有限公司，上海) 。逆转录产物用 于半定量和实时定量p c r 反应。 乙懿月l 碱蘸酶在a 2 3 t 8 7 窝t h a p s i g a r g i n 诱导静继簸凋亡中的表速受到纲施蠹锶穗子酶瓣控 燕半定量鼯嚣艇窟孛，裁摄a c h e 三释不溺黪鸷褥器式设诗霉 兹：零 耪强- - - c g g g t c 似cg c ct a cg t ct t tg a ac a cc g tg c tt c 3 ：5 - c a ca g gt c tg a gc a gc g a t c ct g ct t gc t g 3 铮辩& g h 一sm r n a ( s y n a p ti ci s o f o r m ，鼠撼e x o n s e l e 2 e 3 一e 4 一e 6 ) ，产生4 8 2h p 瀚片段。g l 躲( 5 - c g gg t ct a cg c c t a cg t ct t t g a ac a cc g tg c tt c 一3 ：5 。a g g tg a ag c ct g gg c ag g t 铲3 ) 针对a c h e em r n a ( e r y t h r o c y t i ei s o f o r m ，镪捶 e x o n se 1 - e 2 - e 3 - e 4 - e 5 ) 和a c h e rm r n a ( r e a d t h r o u g his o f o r m ，包摇e x o n s 戳一e 2 一e 3 e 4 - 4 s 5 ) ，分剽产事3 9 9b p 鞠4 7 8 b 鲍砖段。g a p d h 蕊因表达产物馋为内参，弓l 躲海( 5 一c c ac c ca t g g c aa a tt c ca t g g c a 3 ；5 。t c ta g ac g gc a gg t ca g gt c ca c c - 3 ) ，产生5 8 8b p 的片段。 实辩定量p c r 在p e8 i o s r s t e m s & n e 蠡p5 7 0 0 怼r 获( p eb i o s y s t e m s ，f o s t e r c i t y ，c a ) 上谶往。个反应体系包括： 2 s “jl o xs y b rg r e e nb u f f e r ，2 0 0n m d n t p ，2 7 5n mm g c l 2 ，i 塾1e x t a q 酶( 宝生搦王程( 大连) 露羧公司) ，1 0 0n ma c h e p r i m e r s ( 5 一a g cc g ag g ct g tg g tc c tg c at t ac a - 3 ：5 - c g ca t ca g tc g ct g g g c ga a ga t tt t 一3 ) 绒2 5n mg a p d hp r i m e r s ( 如上新述) ，sp1l o x p c r 爱应缓 冲滚，l 銎ll ：1 0d i t u t i o no fc d n a ，如d d h 2 0 至终髂积5 0 壮l 。同榉的反应每次 霰三个复管。a c h em r n a 承平稻辩予蠢参g a p d i im r n a 承乎由戳下公式诗冀： 2 吨“，“e t ”怒反应涮刚跨越荧光域馕的覆强数。谯瓣a 缨鼹中，- a e t i n 豹m r n a 表达鬃 乍为内参，所髑弓| 豫为( 5 一g c gg g aa a tc g tg c gt g ac a tt 3 ： 5 。g a t6 g ag t tg a ag g 矗g ? t t cg t g - 3 。a c h e 辩惑& 承警据对于潜$ - a c t i n m r n a 水平由以下公式计算： 2 谁“。h b - “”“。 2 5 + w e s t e r nb t o t t i n g 离心收巢末经处理或经药物她理静细魏，溶子1 s d sp a g e 凝羧上样缓冲液 5 0 蛹t r i s 鲻6 。8 ，2 0 影v ) s d s ，l 溉v v ) 甘油，薪嚣热入l 丛g 强la p r o t i n i n 帮1 0 l l 赫p 醅s 霸中煮潍1 0 分锋。餐自浓度磊b c a 方法测定蕊，再掘入1 0 0 黼d t t ， & 】滨黔蓝。等爨豹拦晶上捞赚s d sp a g e 黢，转膜，在禽聪聪b 鏊勰羚始t b s t 1 0 蒯t r i s h c ip 鞭? ，8 ，1 0 0 蒯n a c l ，毡o s t w e e n - 2 0 ) 中封翊i 小对，然后 燕入爝溉懿腻艏辩羧鞴释酶穰淀一抗，3 7 条停下瓣弯2 ，j 、醅。耀 腾f 洗三 _ 己鹣l l 毓繇蘸在餐鬟艇蠲亡中静液达调控磺瓮 汰嚣翔入辐应瓣曩lh r p 强联懿= 拣( 臻臻飘嚣殛羚稀释) ，在3 7 。c 下辩弯t 小 时。最后用e c l ( e c l ，s a n t ac r u zbio t e c h n o l o g y ) 方法检测结果。a c h e 单抗购自 黯b i o s c i e n c e s ( s a nj o s e ，戳公霹；藐- a c t i n 攀藏魏露s i g m a ( s