（细胞生物学专业论文）cpap的自身二聚作用对中心体连接的调控.pdf

摘要 摘要 哺乳动物中心体，是主要的微管组织中心，包括一对定位在核附近的中心粒 和中心粒周围环绕的由大量蛋白聚集而成的周围物质( p c m ) 。中心体周期和细 胞周期相互配合以保证遗传物质的精确分配。从细胞分裂过程中产生的子细胞含 有两个紧密相连的中心粒，在有丝分裂后期或g l 早期，两中心粒间的紧密相连 消失，两中心粒间不再呈直角结构，取而代之的是在两中心粒近端形成松散的动 态蛋白质组成的连接，称为中心体连接。中心体连接形成是中心粒复制的前提， 并保持中心粒间的距离小于2 a m 。在g 2 m 期，中心体连接消散，发生中心体分 裂，两个中心体分离成为两个独立功能的个体形成两极纺锤体。扰乱中心体分裂 的时空动态性会导致细胞分离中基因组的不稳定性。事实上，在很多实体瘤中都 发现过中心体连接和分离的机能失常。在细胞周期中，中心体连接和分离的调控 机制还不太清楚。不过，一些参与中心体连接的蛋白如c - n a p l ，r o o t l e t i n ， i h n b p l ，d y n a m i n 2 ，c e p 6 8 和c e p 2 1 5 等已经被报道。 c p a p 也被称为c e n p j ，是中心体蛋白，包括5 个卷曲螺旋结构域和一个甘 氨酸重复结构域称为g b o x 。包含第二个卷曲螺旋结构域的3l1 - 4 2 2 氨基酸残 基是个微管去稳定结构域，可以与微管蛋白a 1 3 二聚体结合，4 2 3 6 0 7 氨基酸残 基包括第3 个卷曲螺旋结构域，是微管结合结构域。破坏0 【螺旋结构或电荷性质 都会显著影响c p a p 的微管去稳定能力。c p a p 的某些突变诱导神经发育紊乱疾 病“常染色体隐性小脑畸形( m c p h ) ”导致人类大脑生长的严重缩小。 在本研究中，我们发现用s i r n a 部分敲除c p a p 和过表达c p a p 的c 端都 会诱导中心体分裂的增加，说明c p a p 参与了中心体连接。使用免疫共沉淀和 p u l l d o w n 等实验发现，c c 5 结构域在c p a p 多聚化的形成中具有重要作用。这 里，我们报道了c p a p 在间期细胞中形成同源二聚，第5 个卷曲螺旋结构域参与 了这种二聚作用。而且，这种自身相互作用参与了中心体连接的维持并抑制了 g 2 m 期之前中心体的分裂。我们的生化研究显示，c p a p 在体内也形成自身的 二聚。另外，无论是单体还是二聚体的c p a p 对于细胞分裂的精确调控都是必需 的，说明c p a p 同源二聚的时间动态性在细胞周期中被严格调控。我们的结果显 示，c p a p 在有丝分裂期是被磷酸化的，而这种磷酸化解除了其分子间的相互作 用。总之，细胞周期调控的磷酸化作用精密调节了c p a p 分子间相互作用的动态 性和中心体的分裂，保证了细胞分离中基因组的稳定性。综上所述，有丝分裂期 c p a p 的自身相互作用被磷酸化作用负调控，这对于中心体连接和分裂在细胞周 期中的精确调控有重要作用。 v i 摘要 关键词：c p a p 自身相互作用中心体连接中心体分离 i a b s t r a c t a b s t r a c t m a m m a l i a nc e n t r o s o m e s ，t h em a j o rm i c r o t u b u l e o r g a n i z i n gc e n t e r s ( m t o c s ) ， c o n s i s to fap a i ro fc e n t r i o l e sn o r m a l l yl o c a l i z e da tt h ep e r i p h e r yo ft h en u c l e u sa n d s u r r o u n d e db yan u m b e ro fp r o t e i n sc o l l e c t i v e l yr e f e r r e dt oa sp e r i c e n t r i o l a rm a t e r i a l ( p c m ) t h ec o o r d i n a t i o no ft h ee e n t r o s o m ec y c l ea n dc e l lc y c l ee n s u r e sa na c c u r a t e d i s t r i b u t i o no fg e n e t i cm a t e r i a l d a u g h t e rc e l l sr e s u l t i n gf r o mc e l ld i v i s i o np o s s e s so n e c e n t r o s o m et h a ti n c l u d e st w ot i g h t l ya s s o c i a t e dc e n t r i o l e s d u r i n gl a t em i t o s i so re a r l y gip h a s e ，t h ec l o s el i n kb e t w e e nt h et w oc e n t r i ol e si sl o s ta n dal o o s el i n kb e t w e e nt h e p r o x i m a le n d so f t h et w oc e n t r i o l e sd e v e l o p s t h ec e n t r o s o m ec o h e s i o ni sap r e r e q u i s i t e o fc e n t r i o l ed u p l i c a t i o na n dk e e p st h ed i s t a n c eb e t w e e nt h et w oc e n t r i o l e sl e s st h a n2 l a m i ng 2 mp h a s e ，c e n t r o s o m ec o h e s i o nd i s s i p a t e sa n dc e n t r o s o m es p l i t t i n gh a p p e n e d a n dt w oc e n t r o s o m e ss e p a r a t ei n t ot w of u n c t i o n a lu n i t st of o r mt h eb i p o l a rs p i n d l e p e r t u r b a t i o no ft h es p a t i o t e m p o r a ld y n a m i c so fc e n t r o s o m es p l i t t i n gc a nl e a dt o g e n o m i ci n s t a b i l i t yd u r i n gc e l ld i v i s i o n m a l f u n c t i o n s i nc e n t r o s o m ec o h e s i o na n d s e p a r a t i o n ，i nf a c t ，h a v eb e e ns e e ni nm a n ys o l i dt u m o r s h o wt h ec o h e s i o na n d s e p a r a t i o no ft h ec e n t r o s o m ea r er e g u l a t e dt h r o u g h o u tt h ec e l lc y c l e i sn o ty e tw e l l u n d e r s t o o d h o w e v e r ，s e v e r a lp r o t e i n ss u c ha sc - n a pl ，r o o t l e t i n ，r a n b p1 ，d y n a m i n 2 ， c e p 6 8a n dc e p 2 15h a v eb e e nr e p o r t e dt ob ei n v o l v e dw i t hc e n t r o s o m ec o h e s i o n c p a p ( c e n t r o s o m a lp 4 1 a s s o c i a t e d p r o t e i n ) ，a l s o n a m e dc e n p j ，i sa c e n t r o s o m ep r o t e i nw h i c hc o n t a i n sf i v es h o r tc o i l e d c o i ls e g m e n t sa n dag l y c i n e r e p e a t e ds e g m e n tt e r m e dt h eg b o x r e s i d u e s3 11 - 4 2 2a ao fc p a p ( i n c l u d i n g c o i l e d - c o i l2 ) i sam t - d e s t a b i l i z i n gd o m a i n ，a n dr e s i d u e s4 2 3 6 0 7a ao fc p a p ( i n c l u d i n gc o i l e d c o i l3 ) i sam t - b i n d i n gd o m a i n m u t a t i o n st h a td i s r u p tt h ea h e l i c a l s t r u c t u r eo rt h ec h a r g ep r o p e r t ys i g n i f i c a n t l ya f f e c tt h em t - d e s t a b i l i z i n ga b i l i t yo f c p a p m u t a t i o no fc p a pi n d u c e san e u r o d e v e l o p m e n t a ldi s o r d e rn a m e dm c p h ( a u t o s o m a lr e c e s s i v ep r i m a r ym i c r o c e p h a l y ) t h a tc a u s e sag r e a tr e d u c t i o n i nb r a i n g r o w t hi nh u m a n i nt h i ss t u d y , w ef o u n dt h a tb o t hp a r t i a ld e p l e t i o no fc p a pb yc p a ps i r n aa n d o v e r e x p r e s s i o no ft h ec - t e r m i n a lo fc p a pi n d u c e da ni n c r e a s ei nc e n t r o s o m es p l i t t i n g ， i n d i c a t i n gt h a tc p a pf u n c t i o n so ne e n t r o s o m ec o h e s i o n m o r e o v e r , t h ec c 5d o m a i no f c p a pw a si d e n t i f i e da sb e i n ge s s e n t i a lf o rt h ef o r m a t i o no fp o l y m e r sb e t w e e nc p a pb y m e a n so fc o i m m u n o p r e c i p i t a t i o na n dp u l l d o w ne x p e r i m e n t s h e r ew er e p o r t e dt h a t v i i i a b s t r a c t 一_ l 一 c p a pf b n n sah o m o d i m e rd u r i n gi n t e r p h a s ea n dt h ef i f t hc o i l e d c o i ld o m a i no f c p a pi s r e q u i r e df 1 0 ri t sd i m e r i z a t i o n m o r e o v e r , t h i ss e l f - i n t e r a c t i o ni sr e q u i r e df o rm a i n t a i ni n g c e n t r o s o m ec o h e s i o na n dp r e v e n t i n gt h ec e n t r o s o m ef r o ms p i r t i n gb e f o r eg 2 mp h a s e o u rb i o c h e m i c a ls t u d i e ss h o wt h a tc p a pf o r m sh o m o d i m e r si nv n o i na d d i t i o n ，b o t h m o n o m e r i ca n dd i m e r i cc p a pa r er e q u i r e df o ra c c u r a t ec e l ld i v i s i o n ，s u g g e s t i n gt h a t t h et e m p o r a ld y n a m i c so fc p a ph o m o d i m e r i z a t i o ni st i g h t l yr e g u l a t e dd u r i n gt h ec e l l c y c l e s i g n i f i c a n t l y , o u rr e s u l t sp r o v i d ee v i d e n c et h a tc p a pi sp h o s p h o r y l a t e dd u r i n g m i t o s i sa n dt h i sp h o s p h o r y l a t i o nr e l e a s e si t si n t e r - m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n t a k e nt o g e t h e r , t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tc e l lc y c l er e g u l a t e dp h o s p h o r y l a t i o no r c h e s t r a t e st h ed y n a m i c s o fc p a pm o l e c u l a ri n t e r a c t i o na n dc e n t r o s o m es p l i t t i n gt oe n s u r eg e n o m i cs t a b i l i t yi n c e l ld i v i s i o n c o l l e c t i v e l y , t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tn e g a t i v er e g u l a t i o no fc p a p s e l f - i n t e r a c t i o nb ym i t o t i cp h o s p h o r y l a t i o ni sr e q u i r e df o ra c c u r a t ec e n t r o s o m ec o h e s i o n a n ds p l i t t i n gd u r i n gt h ec e l lc y c l e k e y w o r d s ：c p a p , s e l f - i n t e r a c t i o n ，c e n t r o s o m ec o h e s i o n ，c e n t r o s o m es p l i t t i n g i x 缩略词组 a p c c d e c d k c e n p c p a p d a p i l f i p m p s p b s p c m p l k p m s f s d s p a g e t b s w b , - t u r c 缩略词组 a n a p h a s e - p r o m o t i n gc o m p l e x c e l ld i v i s i o nc y c l e c y c l i n - d e p e n d e n tk i n a s e c e n t r o m e r e a s s o c i a t e dp r o t e i n c e n t r o s o m a lp 4 1r - a s s o c i a t e dp r o t e i n 4 ，6 - d i a m i d i n o - 2 一p h e n y l i n d o l e i m m u n o f l u o r e s c e n e e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n m o n o - p o l a rs p i n d l e p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p e r i c e n t r i o l a rm a t e r i a l p o l o - l i k ek i n a s e p h e n y l m e t h y l s u l p h o n yf l u o r i d e s d sp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s t r i sb u f f e r e ds a l i n e w e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i s , - t u b u l i nr i n gc o m p l e x v 目录 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除已特 别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一 同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名： 签字吼掣二 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文 的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 蛔公开口保密( 年) 作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： 第一章绪论 第一章绪论弟一旱殖比 1 1概述 细胞是有机体结构和功能的基本单位，是生命活动的基本单元。细胞包含 众多分子，这些分子共同作用维系着细胞的正常生长。就像地球具有黑夜与白昼 的交替一样，细胞也具有自己的周期。在真核生物中，细胞通过d n a 的复制，染 色体的分离和遗传信息分配，产生具有相同遗传信息的两个子代细胞。这一复杂 而有序的过程称为细胞周期。在快速复制的人类细胞中，一个细胞周期大约需要 2 0 2 4 小时，不过在不同物种和不同来源的细胞中，细胞周期及各个周期时相的时 间是不相同的。细胞周期分为间期和有丝分裂期( 图1 1 ) 。其中间期包括g 1 期， 细胞合成各种r n a 及蛋白质，约7 - 9 小时；s 期，d n a 合成和遗传物质复制约7 - 1 0 小时；以及g 2 期，合成一些有丝分裂必须蛋白，约2 - 4 小时。间期主要完成遗传 物质的拷贝，中心体复制等过程，为细胞分裂做准备。有丝分裂期包括前期 ( p r o p h a s e ) ，复制好的中心体开始迁移到两极准备进行纺锤体的组装；前中期 ( p r o m e t a p h a s e ) ，核膜破裂，纺锤体形成，微管开始对动点进行捕获；中期 ( m e t a p h a s e ) ，染色体排列双极定向建立；后期( a n a p h a s e ) ，染色体分离；末期 ( t e l o p h a s e ) 以及胞质分裂期( c y t o k i n e s i s ) ，核膜重新形成染色体去凝集，两 个新生的子细胞完全分开。有丝分裂过程总共只有1 - 2 小时，复制好的遗传物质 以及胞质和细胞器会平均的分配到两个子代细胞中，实现遗传物质的正确传递。 在一个细胞周期结束后，每个子代细胞都会分配到了一个中心体。中心体 是动物细胞中主要的微管组织中心( m t o c ) ，在中心体以及很多蛋白的共同作用下， 细胞的骨架结构不断发生动态变化，从而使细胞周期可以顺利进行。中心体同样 也具有自己的周期。中心体周期与细胞周期协同作用，保证了细胞事件在时间和 空间上的精密调控。 c p a p 蛋白定位在中心体上，具有进化保守性。在线虫中的同源物是s a s - 4 ， 果蝇中的同源物是d s a s - 4 ，虽然它们的序列保守性不强，但是他们在中心体复制 以及对中心体大小的控制上具有功能保守性。为了更深入理解中心体以及中心体 上的c p a p 蛋白，我们将在下面对它们进行更为详细的描述。 第一章绪论 1 2 中心体 中心体是细胞中主要的微管组织中心，是细胞的重要组成部分。c p a p 及其 同源物的主要功能都与中心体有关，所以在介绍c p a p 前先介绍一下中心粒。 早在1 9 世纪v o nb e n e d e n ( 1 8 7 6 ) 观察细胞有丝分裂过程时就发现了中心 粒( c e n t r i o l e s ) 。动物细胞和低等植物细胞中都有中心体，它通常位于细胞核一 侧的细胞质中。最初对中心体的研究主要集中在中心体的结构研究、去除中 心体后对细胞的影响、中心体对有丝分裂的作用和中心体周质蛋白伽玛微管 蛋白的发现及其与微管的作用等方面，最近对中心体的研究主要集中在中心 体的形成，中心体对纺锤体组装的影响以及一些重要蛋白在这些过程中的作 用上。 中心体调控细胞间期的细胞移动、粘附和极化以及细胞有丝分裂期纺锤 体极的建立和组装。 1 2 1 中心体的基本结构 中心体( c e n t r o s o m e ) - - 般位于细胞核旁，高尔基区中央( 图1 2a ) 。中心体 主要包括三个部分： 1 ) 中心粒部分( e e n t r i o l a rd o m a i n ) ：是中心体的核心部分，存在于大多数而不 是全部的动物细胞中。在分辨率为o 2 微米的光学显微镜下可以看到，每个中 心体主要含有两个中心粒( c e n t r i o l e s ) ，这两个中心粒互相垂直排列。在电子显 微镜下可以看到中心粒的超微结构，中心粒为成对的圆筒状小体，长度大约 0 3 0 5 微米，直径大约o 1 5 0 2 0 微米。每个中心粒含有2 7 条很短的微管。 在横切面上，可以看到9 组三联体微管形成环状结构，构成中心粒圆筒状的 壁( 图1 2b ) 。母中心粒具有次远端( s u b d i s t a la p p e n d a g e s ) 和远端附属物( d i s t a l a p p e n d a g e s ) ，它们可以结合胞质微管或将细胞膜与中心粒铆钉形成基体( b a s a l b o d y ) 。基体可以形成坚硬或可动的纤毛和鞭毛，它们在生理、发育和疾病中都 有重要作用。大部分可动刚毛具有9 连体二聚微管和一个中心对微管，而不可动 的初级刚毛没有中心对微管( 图1 2c ) 。在一些类型的癌症中，不正常的中心 体会引起基因组的不稳定。因为过量的或失调的中心体可以导致不正常的或不对 称的细胞分裂。 2 ) 中心粒周围部分( p e r i c e n t r i o l a rd o m a i n ) ：此部分含有一团高电子密度的 透明无定形的中心粒周围物质( p e r i c e n t r i o l a r m a t e r i a l ，p c m ) 。在大多数细胞中，中 心粒及其周围部分的平均直径约l u m ( 图1 2 ) 。p c m 部分的尺寸是细胞周期依 赖性的，在细胞分裂时期达到最大。在一些癌症细胞中存在着p c m 的增大，这 种现象与不正常的c e n t r i n 磷酸化水平以及微管成核能力的增强有关。p c m 主要 2 第一章绪论 由两部分组成，环状复合物( r i n gc o m p l e x e s ) 和网格状细丝( 1 a t t i c e 1 i k ef i l a m e n t s ) 。 两者之间的部分称为矩阵( i n t r a l a t t i c em a t r i x ) 。这些部分含有很多不同类型的蛋 白复合物，其结构还不是很清楚。周围物质p c m 的精确成分至今尚不清楚，微 管并不是直接从中心粒组装出来的，而是从中心粒周围物质中生长出来的，所以 这部分物质具有真正的微管组织中心作用。微管与环状复合物( r i n gc o m p l e x ) 相连，高尔基复合物与中心体外周部分相连( 图1 2a ) 。目前研究p c m 的主 要方法包括鉴定单个蛋白质，分析蛋白质复合物以及体外研究分离的中心体。 3 ) 中心体外周部分( o u t e rc e n t r o s o m a ld o m a i n ) ：中心体在p c m 边缘并没 有结束，而是通过从p c m 中延伸出去的微管和微丝与周围的细胞质和组织整合 形成中心体外周部分。这一部分至少有四个作用，首先它可以将中心体与其他细 胞器如细胞核、高尔基体等相连接；其次，它可以通过微管将蛋白质输出或输入 到中心体；然后，它可以调控中心体在细胞中的运动；最后，在细胞分裂时将中 心体整合到有丝分裂纺锤体中。 另外，有一些丝状连接物存在于两个成熟的中心粒体之间，直到g 2 m 期 中心体开始分裂( c e n t r o s o m es p l i t t i n g ) 和分离( c e n t r o s o m es e p e r a t i o n ) 时才消失， 称为中心体连接物( c e n t r o s o m ec o h e s i o n ) 。此部分的介绍详见1 2 5 。 第一章绪论 m n k ：d a u g h l e r c e l i i 、， 6 0 c y t e k i n e s l s 勺谚s i s t e r m ! 、 、 盈1 1 细胞周期示意图( l o d i s h ) 。 细胞周期可划分为四千主璺时相tg l 期 细胞合成各种g i l a 以及蛋白质) 、s 期( d m 的 台成与遗传物质的复制) 、g 2 期( 合成一些有丝分裂必需蛋白质，为进入有丝分裂做最后准 蔷) 、以及m 期( 包括一系列复杂的过程，最终完成染色体的分离) 。 篇= ：嚣i 幡 却同对闩 酐 第一帝绪论 t 呻c h 帅k ”1 蝴 4 ” m m k 1 日一 目12 中心体及中心粒的结构 中心体主要包括三十部分中心粒部分如e n t r i o l a rd o m i n ) 中心粒周嗣部分 ( p e r i c e n t r i o l 批 d o m a i n ) 和中心体外属部分( o u t e rc e n t r o s o m a ld o m a i n ) 。微管与环 状复音物( r | n gc o m o l e x ) 相连高尔基复合物与中心体外周部分相连( c ke ta 1 2 0 0 0 ) 。 b 中心粒结构中心粒长约05 岫直径约02 u m ，具有九个三聚悼微管。母中心粒具有扶远 端( s u b d i s t a la p p e n d “e s ) 和远端附属物( d i s t a la p p e n d a g e s ) ，它们可以结合胞质微管 或将细胞膜与巾心牲铆钉形成基体( b a s a lb o d y ) ( b o r n e n s 2 0 0 2 ) 。 c 基体组成基体可以形成坚硬或可动的纤毛和鞭毛，大部分可动刚毛具有9 连体二聚微管 和一个中心对微管。而不可动的韧级刚毛没有中心对镦管( b e t t e n c o u r t d i a sa n dg l o v e r ， 2 0 0 9 ) 。 第一章绪论 1 2 2 中心体上的一些重要蛋白 中心体的结构复杂预示着有大量的蛋白参与其中。以下按照中心体的组成部 分对一些重要蛋白进行简单总结( 表1 1 ) 。 在中心粒部分主要含有构成微管壁的蛋白a 、p 、丫t u b u l i n 蛋白、p l k 4 激 酶、n e k 2 激酶、c d k 2 c y c l i n e 、h s a s 6 、h s a s 5 、c e p l1 0 、c e p 2 5 0 c n a p l 、 结构蛋白4 1 ( s t r u c t u r a lp r o t e i n4 1 ) 、c p a p 和c e n t r i n 等等。有些蛋白既存在于 中心粒部分也分布在p c m 部分。c d k 2 c y c l i n e 和p l k 4 在中心粒的复制中具有 重要作用。 1 ) c e n t r i n 定位在中心粒远端的管中( d i s t a ll u m e n ) 也存在于p c m 和胞质 中，在衣藻虫鞭毛中具有微管切割的作用，在酿酒酵母中的同源物c d c 3 1 参于纺 锤体极的复制和分离( m a c ke ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 2 ) p l k 4 激酶在中心粒的增殖中有重要作用( k l e y l e i n s o h ne ta 1 ，2 0 0 7 ) 。过 表达p l k 4 会同时新形成多个原中心粒( 3 8 个) ，呈花瓣状分布。在p l k 4 的作 用下，h s a s 6 ，c p a p ，c e p l 3 5 ，g a m m a t u b u l i n 和c p l l 0 参与到原中心粒形成 的不同阶段和不同结构中。h s a s 6 只是短暂出现在原中心粒上，c p a p 与c e p l 3 5 在母中心粒和新形成的原中心粒的近端管中形成一个核心结构，c p ll o 在早期就 被招募到原中心粒的远端，并且随着原中心粒的远端一起延伸。c p a p 的过表达 会导致中心粒过度延伸，而c p l l 0 的缺失也会引起中心粒的长度增加，两者相 互抑制共同保证中心粒复制具有合适的长度( k o h l m a i e re ta 1 ，2 0 0 9 ；s c h m i d te ta 1 ， 2 0 0 9 ；t a n ge ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 3 ) c e p 2 5 0 c n a p l 蛋白和n e k 2 激酶都定位在中心粒的近端( p r o x i m a l e n d s ) 。c e p 2 5 0 c - n a p l 在有丝分裂前期的中心体定位大大减少，在中期向后期 转换时才又渐渐在中心体上聚集。n e k 2 的过表达会导致中心体分裂的提前 ( p r e m a t u r ec e n t r o s o m es p l i t t i n g ) 。c e p 2 5 0 c - n a p l 在中心体上的定位受到n e k 2 a 激酶的调控，在两个中心体间起到了分子胶的作用，对中心体的连接( c e n t r o s o m e c o h e s i o n ) 产生影n l 甸( m a y o re ta 1 ，2 0 0 0 ；m e r a l d ia n dn i g g ，2 0 0 1 ) 。 4 ) 结构蛋白4 1 ( s t r u c t u r a lp r o t e i n4 1 ) 是个8 0 k d 的蛋白，最初是在成熟 红细胞膜骨架中发现的，不定位在哺乳动物中心体上，后来用高分辨率电子显微 镜发现，此蛋白沿着中心粒的壁以及中心粒周围丝状网络的纤维定位。结构蛋白 4 1 有很多亚型，其中4 1 r - 1 3 5 存在于非红细胞中，与其他p r o t e i n4 1 r 8 0 的区 别在于其n 端有2 0 9 个氨基酸的区域( h e a dd o m a i n ，h d ) ，4 1 r - 1 3 5 可以与n u m a 在间期的核上形成复合物，在核中和胞质中都有定位，间期、有丝分裂期及分裂 后期都有中心体定位。用酵母双杂交方法筛出了c p a p 蛋白的c 端可以与4 1 r 的n 端相互作用。c p a p 是g a m m a t u b u l i n 复合物的一部分，可以与7 - t u b u l i n 发 7 第一章绪论 生共沉淀反应( h u n ge ta 1 2 0 0 0 ) 。c p a p 是本论文研究的主要目标蛋白，将在后 面进行详细描述。 p c m 部分的蛋白主要参与中心体的复制和微管的成核作用。主要包括： 1 ) g a m m a t u b u l i n 环状复合物。m o r i t ze ta 1 ( 1 9 9 5 ) 从果蝇胚胎分离的中心 体中发现了直径类似于微管( 2 5 2 8n m ) 的环状复合物，在不含微管的纯化中心 体里它定位在p c m 中( m o r i t ze ta 1 ，1 9 9 5 ) 。后来z h e n ge ta 1 ( 1 9 9 5 ) 提纯出一种球状 蛋白复合物类似于开环螺旋结构，定义为g a m m a - t u b u l i nr i n gc o m p l e x ( t t u r c ) 。 7 t u r c 在体外可能是通过为微管成核提供模板而发生微管成核作用，它决定了每 根微管的原丝数目和极性。7 t u r c 主要包括a 、p 、? - t u b u l i n 和其他一些蛋白。 r a n b p m 与g a m m a - t u b u l i n 共定位，并参与微管成核。乳腺癌和卵巢癌相关蛋白 b r c a l 也可与g a m m a t u b u l i n 共沉淀。b r c a i 是r n a 聚合酶i i 复合物中的成员， 共活化p 5 3 介导的转录。c p a p 也可以与y t u b u l i n 发生共沉淀，是复合物的一员 ( h u n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) 。还有一种i 扫g a m m a t u b u l i n 与p e r i c e n t r i n 形成的复合物存在于 p c m 中，虽然它也可以与成核微管的负端发生作用，但它与? t u r c 的复合物是不 同的。 2 ) p c m 的网格复合物部分含有1 2 1 5 u m 的纤维，它们并不结合蛋白也不含 有y t u r c ，其主要功能是为与微管成核有关的蛋白提供一个支架。微管的分布在 整个细胞周期中是不断变化的，p p 4 在微管成核位点的失活中有作用，它还会影 响果蝇中心体的组装。 3 ) 热休克( h e a ts h o c k ，h s p ) 蛋白或压力蛋白( s t r e s sp r o t e i n s ) 是p c m 中的 另一类重要蛋白，包括h s p l1 0 、9 0 、7 0 、6 0 和s h s p 等五个家族。它们对压力或 损伤提供耐受性。t c p 1 是其中的一种，可以指导一些骨架蛋白如0 【、p 、丫微管 蛋白，a c t i n ，c e n t r a c t i n 等进行骨架折叠，在微管成核中具有一定作用。 4 ) p l k l 、a u r o r a 等激酶也是p c m 蛋白，他们的过表达会引起中心体的增殖 以及非整倍体的产生等现象( m a y o r e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 5 ) 另外，很多控制g 2 m 期进程的蛋白如c y c l i n a 、c y c l i n b 、c d k 2 、p r o t e i n 1 4 3 3 、p 5 3 j f f l p r b 等也存在于p c m 中。 6 ) k a t a n i n 可以切割微管的负端并解聚稳定的微管。 p c m 的组成和功能比较复杂，还有很多蛋白及其功能有待发现。 更外层的o u tc e n t r o s o m a ld o m a i n 的蛋白通常会通过微管被运送到中心体内 层各区域后行使功能，d y n a c t i nc o m p l e x 存在于o u tc e n t r o s o m a ld o m a i n 和p c m ，此 复合物对胞质中d y n e i n 介导的膜泡运输有共活化作用。d y n a c t i nc o m p l e x 包括至少 7 个多肽，分子量从2 2 1 5 0 k d 不等。 1 ) p 1 5 0 g t 倒是其中的一个亚基，含有微管结合结构域、a c t i n 相关蛋a r p l 8 第一章绪论 结合结构域以及d y n e i n 相互作用结构域。类马达蛋i 刍h s e 9 5 就是通过p 1 5 0 吲删与 d y n a c t i nc o m p l e x 相连的。在有丝分裂期h s e 9 5 连接着中心体和中心体相关微管， 它对于g 2 期中心体运动微管的形成是必须的，对于有丝分裂时期微管的形成有 一定作用，另外它还影响了n u m a 等蛋白从p c m 向外的运输( m a c ke ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 2 ) c t r l 2 0 抗原是h s p 7 0 伴侣分子家族的一员，参与中心体与高尔基体的 连接( m a c ke ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 9 第一章绪论 表1 1 中心体各部分的重要蛋白( a z i m z a d e ha n db o r n e n s ，2 0 0 7 ) 。 t a b l ei s e l e c t e dl i a to f c e n t r o s o t r u z lp r o t e i n sg r o u p e db yd o m a i n 第一章绪论 1 2 3 中心体周期 电镜观察发现：中心体在整个细胞周期中表现出一系列的形态变化( 图1 3 ) 。 根据形态变化，中心体周期又可以细分成一系列的不连续事件。通常包括( 1 ) 中心粒分开或垂直定向解除( d i s e n g a g e m e n to rd i s o r i e n t a t i o n ) ；( 2 ) 子中心粒 复制( d u p l i c a t i o n ) ：包括中心粒的成核( n u c l e a t i o n ) 与延伸( e l o n g a t i o n ) ； ( 3 ) 中心体成熟( m a t u r a t i o n ) ；( 4 ) 中心体的分离( s e p a r a t i o n ) 包括中心体c o h e s i o n 的断裂即中心体分裂和中心体的分离两个过程。中心体的周期由可逆的磷酸化和 蛋白水解作用调控( m e r a l d ia n dn i g g ，2 0 0 2 ) 。 中心粒垂直定向解除：中心体的定向解除发生在有丝分裂中期向后期转变过 程中或早g 1 期。此时细胞含有一个中心体，包括两个垂直排列相互紧密连接的 中心粒，子中心粒是在上个细胞周期中被合成的，母中心粒是在至少两个细胞周 期前合成的。中心体的定向解除是指两中心粒间的紧密连接解除，并在两个中心 粒的近端形成松散的连接，两个中心粒不再呈直焦的关系。此过程的精确机制还 不清楚，有一些推测认为：蛋白酶s e p a r a s e 解开了中心粒间的紧密连接，但两中 心粒仍然被松散的纤维状结构连接，这种连接在中心粒复制时一直存在，所以也 可称为中心体的c o h e s i o n ( a z i m z a d e ha n db o r n e n s ，2 0 0 7 ) 。中心粒的定向解除与母 中心粒间连接结构的重新建立有关，这个母中心粒间的连接在g 2 m 期解聚，被 称为c e n t r o s o m es p l i t t i n g ，中心体的分裂。另一种推测认为，中心体的定向消除 是中心体复制的前提，新的原中心粒是在靠近母中心粒近端的地方开始形成的。 活细胞试验证实了中心体在整个细胞周期中具有不可思议的动态过程。中心粒的 定向解除和成熟中心体向分裂沟的移动可能是细胞胞质分离时中体( m i d b o d y ) 剪切的重要步骤。蛋白水解在中心体调控上的作用还需要进一步研究，不过很有 可能某种蛋白在中心体的定向解除中起作用，使中心体