糖基转移酶在植物次生代谢途径中的研究进展_郭溆.pdf

2012第十四卷第六期Vol.14 No.6 World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 收稿日期：2012-05-06 修回日期：2012-12-14 国家自然科学基金项目 （30900113） ： 基于宏量 ESTs 的蛇足石杉转录组分析及石杉碱甲合成酶 （HAS） 基因的鉴定研究， 负责人： 罗红梅。 通讯作者：陈士林，本刊编委，教授，博士，中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所所长，主要研究方向：中药资源学， E-mail： slchen。 糖基转移酶在植物次生代谢途径中的研究进展 郭溆罗红梅宋经元孙超 （中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所/濒危药材繁育国家工程实验室北京100193 ） 陈士林 （中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所/濒危药材繁育国家工程实验室北京100193 ） （中国中医科学院中药研究所北京100700 ） 摘要： 糖基转移酶 （GT） 是能够催化糖基从激活的供体转移到特定的受体分子上的一类酶， 在 生物体中普遍存在， 形成超基因家族。 糖基转移酶广泛参与植物生命活动的各种生物学过程， 尤其在 植物次生代谢途径中发挥重要作用。本文概述了糖基转移酶在植物次生代谢途径中的研究进展， 描 述了该基因家族及其与植物次生代谢途径进化的关系， 并总结了目前糖基转移酶类基因克隆的方法 和新策略。 关键词： 糖基转移酶植物次生代谢途径 doi: 10.3969/j.issn.1674-3849.2012.06.004 植物通过次生代谢产生大量非生长发育所必 需的小分子有机化合物， 种类繁多， 化学结构迥异。 现在已知大约有 10 万种次生代谢物， 包括糖苷、 萜 类、 酚类、 黄酮类、 香豆素、 木脂素、 生物碱、 甾类、 皂 苷、 多炔类、 有机酸等， 许多次生代谢产物都具有重 要的药理活性和经济价值1。次生代谢产物是在结 构的基本骨架形成之后， 再经过羟基化、 甲基化、 酰 基化或者结合小分子等修饰，最终生成各种终产 物。糖基化即是一种广泛存在的化合物修饰方式， 也是生物体内重要的转化反应许多代谢产物 合成的最后一步， 也是非常重要的一步， 往往都发 生糖基化反应2。催化糖基化反应的酶即为糖基转 移酶 （Glycosyltransferase, GT, EC 2.4.x.y） 3。 糖基转移酶类是通过合成糖苷键将糖基连接 到特定受体的一类酶。该类酶广泛存在于各种原核 生物、 真核生物、 古生物和病毒中， 能识别不同受 体、 供体及形成多种多样的产物。在植物中， 糖基供 体是核苷二磷酸化的含糖基化合物，包括 UDP-葡 萄糖 、 UDP-半乳糖、 UDP-鼠李 糖、 UDP-木糖和 UDP-葡萄糖醛酸等，其中以 UDP-葡萄糖最为常 见； 受体可以是糖类、 脂类、 蛋白质、 抗生素和核酸 等； 产物包括各种单糖、 多糖、 复合糖 （糖脂、 糖蛋 白） 和糖苷化合物 （如花色素个苷、 黄酮糖苷） ， 可催 化产生 和 两种不同键型的糖苷键4,5。 通过全基 2126 世界科学技术中医药现代化思路与方法 World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 因组数据发现，真核生物基因组里大概有 1%的基 因编码糖基转移酶6。 一、糖基化在植物次生代谢物合成中的作用 从化学角度来看， 糖基转移酶可以改变被修饰 物的化学稳定性、 水溶性。花青素能够决定植物的 花和果实颜色，但在胞质或液泡 pH 下花青素会自 动变为无色的花色素阳离子， 若使其 3-OH 糖基化 就能够抑制这种转换， 增加芳香环稳定性。色素的 多重化学修饰可以产生一些独特的性状， 这在果实 和花色改造工程中具有极大应用潜力710。糖基化 可以影响代谢产物的停留区域， 使一些小分子化合 物在某一固定位置 （如液泡里） 积累， 也可以使一些 疏水性化合物糖基化而驻留在亲水环境中11。甜叶 菊（Stevia rebaudiana） 叶片中富集了大量的甜菊糖 苷， 其甜度大约是蔗糖的 300 倍。甜菊苷在质体中 起始合成， 然后在甜菊双糖苷的 C-4 羧基位置糖基 化形成甜菊苷， 之后转运到液泡。因为甜菊苷只在 这一步糖基化之后才开始积累， 所以一般认为这一 步对于甜菊苷转运至液泡是至关重要的。利用功能 基因组学的方法在甜叶菊叶中克隆到 3 个糖基转 移酶基因 （UGT74G1、 UGT76G1 和 UGT85C2） ， 体外 实验表明它们都选择性的在甜菊醇 （Steviol） 的不同 位点进行糖基化12。糖基化的化学作用还包括改变 小分子物质的化学活性， 从而产生解毒的功能。镰 刀霉 （Fusarium） 是禾谷类粮食作物生长发育过程中 的常见真菌， 镰刀霉能产生毒素脱氧雪腐镰刀菌醇 （Deoxynivalenol, DON） ，对植物细胞的生长和人类 健康都有严重危害。拟南芥 （Arabidopsis thaliana） 中 的一个糖基转移酶 UGT73C5 能将这种毒素糖基化 从而使毒性丧失， 过表达 UGT73C5 的转基因植株对 该毒素的抗性增强13。一些植物抗毒素， 如生氰糖 苷 CNGs 以非活性的前体形式大量存在于液泡中， 当遭到食草动物或者病原侵害时，植物组织破碎， 立刻与 -葡萄糖苷酶和 -醇腈酶反应，释放出具 有毒性的氰化氢， 达到防御的目的14。 糖基化在调节植物体内激素的活性水平中也起 到了重要作用， 除乙烯外， 植物体内其他经典激素的 糖基化物均已经被发现。但是糖基化调节激素平衡 的机制还存在争议。研究发现在生长素 （IAA） 、 脱落 酸 （ABA） 、 细胞分裂素 （CKs） 、 油菜素内酯 （BRs）调 控过程中，糖基转移酶都是通过分解代谢来降低甚 至完全消除植物激素的生物活性；其机制可能是影 响受体对激素的识别，也可能是改变了激素某些方 面的理化性质。糖基化的激素分子既可以作为失活 产物被代谢掉， 也可以作为过渡状态被储存， 在需要 时被 -糖苷酶水解即可恢复活性。 木质素的生物合 成前体是一种糖基化物，可以将木质素前体从细胞 内跨膜运输至细胞外， 对木质素的合成至关重要15。 一般认为， 结合小分子是一种激素失活机制11。 但是 最近在茉莉酸信号活性的研究中发现，当茉莉酸结 合异亮氨酸分子的时候， 其生物活性增强， 这表明结 合小分子也能够增强激素的生物活性16。 糖基也是一些活性分子不可缺少的组成成分。 在皂角苷的 C-3 位上存在一条寡糖链， 此寡糖链在 跨膜运输中起作用并具有明显的抗真菌活性， 若除 去该寡糖链就导致该类化合物失活17。另外， 一些 葡萄糖酯类具有辅酶的作用， 其轭合物和生物合成 中间体在代谢途径中具有酯基转移作用。Sinapoyl glucose 在拟南芥叶子中是 Sinapoylmalata 合成的一 个重要辅助化合物， 在拟南芥种子中是抗营养化合 物 Sinapoylcholine 合成的的重要辅助化合物18,19。 二、糖基转移酶基因家族及其与 代谢途径进化的关系 根据底物识别、序列相似性和系统进化分析， 糖基转移可以被分为 91 个基因家族。其中， 与植物 次生代谢相关的基因大部分都属于 Family I 6。 Family I 中的糖基转移酶的底物都是小分子亲脂性 化合物，糖基化反应发生在其-OH、 -COOH、 -NH2、 -SH 或 C-C 基团上20。 催化次生代谢的糖基转移酶的一级结构有一 个共同特点在 C-末端有一个由 44 个氨基酸组 成的保守区域， 即 PSPG box （Plant Secondary Product Glycosyltransferase box） 21。在 Family I 中， 有 50%左 右的糖基转移酶基因都含有 PSPG box， 推测这一保 守序列可能与结合糖基供体尿嘧啶核苷二磷酸-糖 （UDP-sugar） 有关。 N-末端序列变异较大， 可能与识 别和结合不同受体有关。在蛋白质结构水平上， 通 过对蒺藜苜蓿 （Medicago truncatula） 中的糖基转移酶 UGT71G1 和供体 UDP-葡萄糖共结晶结构的分析， 表明糖基转移酶含有两个 Rossmann 卷曲 （ 结 构） ，其 C-末端为活化供体结合区， N-末端为受体 结合区，并发现了 C-末端保守区特定氨基酸残基 2127 2012第十四卷第六期Vol.14 No.6 World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 在结合糖供体中所起的作用22。 通过拟南芥基因组分析，在拟南芥中发现了 119 个基因编码可能的糖基转移酶13。通过序列比 对， 这些基因被分为 14 个。同源性分析发现拟南芥 内的糖基转移酶基因具有较高的相似性。将拟南芥 中的糖基转移酶基因与其他物种的进行比对， 发现 虽然很多酶的活性和底物相似，但是序列差异较 大。进化树分析显示， 玉米和豆科植物中的糖基化 细胞分裂素酶基因与拟南芥中的 5 个糖基化细胞 分裂素酶基因位于不同的分支上23。在拟南芥中， 超过 1/2 的糖基转移酶不含有内含子，其余基因含 有 12 个内含子。通过保守序列和内含子位置分 析， 推测拟南芥糖基转移酶基因在进化过程中至少 发生过 10 次独立的内含子插入和 12 次的内含子 丢失现象4。 越来越多的基因组数据表明， 作为一个含有上 百个成员的大基因家族， 糖基转移酶基因进化不是 独立进行的， 其进化需要考虑 3 种因素： 一是一个 基因家族形成后， 旁系同源基因比单拷贝基因更容 易被选择和突变24； 二是在一条代谢途径中存在大 量的基因共调节和蛋白间相互作用， 这可能是相同 代谢途径中的酶的协同进化的结果25,26； 三是化学 分析表明在代谢途径之间， 一些化合物是相互排斥 的， 比如茄科中的萜类生物碱和类固醇生物碱27。 这 种相互排斥表明一种化合物只要在植物体内的积累 量已经达到可以保护植物免受伤害时，就不需要再 积累其他类似化合物， 避免不必要的能量消耗。 糖基转移酶的进化还依赖于基因重复 （Gene du plication） 。作为一个大的基因家族， 糖基转移酶主要 进行串联重复， 而不是片段重复28。拟南芥中的 UGT 基因都有一个共同的起源29。这暗示在其他物种的基 因组中，所有的 UGT 可能也都是起源于同一个祖先 的大基因家族。这也意味着可能存在一部分 UGTs 基 因家族是独立起源的。因此， 不能通过序列分析来推 断糖基转移酶基因的底物特异性和功能。 糖基转移酶 成为植物自身防御的第一道防线， 能够不断缓冲环境 压力并做出适应环境变化的改变。 它们在植物次生代 谢中具有很高的可塑性， 能够高速周转。 三、糖基转移酶基因克隆的方法及新策略 植物中第一个被发现的糖基转移酶基因是控 制玉米种子黑色素沉积的 Bronze1 基因，是诺贝尔 奖获得者 McClintock 发现的，该基因编码产生黄酮 糖苷的 UDP-糖基转移酶30。随着生物技术的发展， 生物化学、 生物信息学、 分子生物学和遗传学等方 法都已经成功的运用于糖基转移酶基因的克隆、 鉴 定与分析。经典的生物化学方法就是通过分离纯化 方法获得具有特定糖基转移酶活性的蛋白，然后根 据蛋白质序列克隆相应的基因序列， 苦柚 （Citrul） 中 与苦味形成相关的鼠李糖基转移酶基因就是通过这 种方法克隆到的31； 生物信息学则是根据糖基转移 酶基因的保守序列，对目的植物的 EST、 cDNA 文库 或基因组序列进行同源比对，从中发现可能的糖基 转移酶基因， 通过搜索王不留行 （Saponaria vaccaria） 发育种子的 EST 数据库， 找出并克隆了王不留行中 参 与 己 糖 酯 类 生 物 合 成 的 糖 基 转 移 酶 基 因 UGT74M132； 分子生物学方法是根据糖基转移酶基 因的保守序列，设计简并引物并通过 RT-PCR 方法 克隆糖基转移酶基因，或者采用差异显示文库筛选 方法克隆基因， 在蒺藜苜蓿 （Medicago truncatula） 中， 通过分析 Affymetrix arrays 基因芯片的方法， 观察在 受 MJ 诱导的情况下细胞内转录组基因表达的变化 情况， 预测了 9 个糖基转移酶基因33； 遗传学方法主 要是通过突变体筛选分离目的基因，通过筛选蓝色 荧光突变体，从拟南芥中克隆到一个与蓝色荧光形 成有关的糖基转移酶基因 UGT74F234。然而传统的 基因序列获取方法只能获得单一基因，无法对糖基 转移酶这种大的基因家族进行全面的系统的研究。 随着拟南芥、 水稻等模式植物基因组测序工作 的完成，植物学的研究已经进入了后基因组时代， 即功能基因组时代。功能基因组学（Functional ge nomics） 作为一个崭新的研究领域， 强调发展和应用 整体的 （基因组水平或系统水平） 实验方法， 基本策 略是从研究单一基因上升到从系统角度研究所有 基因， 分析基因组序列信息、 阐明基因功能35,36。但 是拟南芥基因组测序采用的 Sanger 测序法， 测序费 用高、 数据量小， 在研究中无法用于大批量的基因 序列的获得。随着测序技术的发展， 以 454 测序仪 （Roche GS FLX sequencer） ， Illumina/Solexa （Illumina Genome Analyzer） 和 Solid 测序仪 （ABI SOLID se quencer） 为代表的第二代测序平台的广泛使用， 基 因组测序进入一个高速发展的全新时代。三大测序 平台都采用焦磷酸测序的原理， 具有测序通量高、 读 长长、 成本低的特点， 越来越大的应用到转录组的研 2128 世界科学技术中医药现代化思路与方法 World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 究。 Li 等372010 年运用高通量 454 GS FLX 对 5 年生 甘草营养器官的转录组进行测序，通过生物信息学 分析获得了糖基转移酶关键基因 172 条。Sun 等38 2010 年运用高通量 454 GS FLX 对 4 年生西洋参根 的转录组进行测序，获得了 235 条糖基转移酶候选 基因序列，通过甲基茉莉酸诱导和组织特异性表达 分析锁定了 4 条可能参与人参皂苷生物合成的糖基 转移酶基因。功能基因组学和高通量的分析方法促 进了鉴定糖基转移酶的准确性和高效性。 单分子实时测序技术， 亦被成为第三代测序技 术，其工作原理是用一种聚合酶将 DNA 的复制限 制在一个微小的空隙中， 给各种碱基加上荧光示踪 标记， 当碱基合成 DNA 链时， 这些荧光标记就会发 出不同颜色的闪光， 根据闪光颜色就可以识别出不 同的碱基。与二代测序技术相比， 在测序长度和测 序速度上都具有明显的优势，单次测序读长达到 2500 bp， 从样品制备到序列信息获得可在一天内完 成，模板制备不需要 PCR 扩增，深度不受序列 GC 含量差异的影响，可测定 100%A+T 序列，灵活性 高。虽然目前单分子实时测序技术的准确率仅有 85%左右，有待于进一步提高，但它代表了未来测 序技术发展的趋势。随着单分子实时测序技术的不 断改进， 必将大量用于基因组及转录组测序， 这将 为进一步开展糖基转移酶基因的克隆及功能鉴定 提供一个更快速更有效的方法。 四、总结与展望 做为一个广泛参与多种代谢途径的多基因家 族， 糖基转移酶需要对植物生长、 发育和环境等多 种变化做出响应， 直接参与植物不同次生代谢产物 的合成和降解等生物学过程， 因此植物次生代谢途 径中糖基转移酶的研究具有重要的科学意义。虽然 许多植物糖基转移酶的活性及底物特异性在体外 实验中都已被检测和鉴定， 但是其在生物体内的功 能还需要进一步证实。令人鼓舞的是， 迄今为止发 现的大多数植物糖基转移酶的生化特征与其在植 物中的生理特征是一致的。因此， 糖基转移酶的体 外酶活性研究为其在植物体内的功能分析提供了 良好基础。越来越多的植物糖基转移酶的生物学功 能被鉴定， 这将为阐释维持细胞稳态的分子机制和 植物生长发育规律提供新的见解。植物糖基转移酶 在酶法合成糖复合物中具有重要的应用价值， 同时 在改善作物品质方面也具有广阔的应用前景。 参考文献 1Wink M. Functions of Pl ant Secondary Metabolites and their Ex ploitation in Biotechnology. Sheffield Academic Press, 1999. 2Vogt T, Jones P. Glycosyltransferases in plant natural product syn thesis: characterization of a supergene family. Trends in plant sci ence, 2000, 5(9):380386. 3Hu Y, Walker S. Remarkable structural similarities between diverse glycosyltransferases. Chemistry 2. Institute