（细胞生物学专业论文）日本七鳃鳗口腔腺grimin基因的生物学活性研究.pdf

e t 本七鳃鳗口腔腺g ri m i n 基因的生物学活性研究 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导r 所取得的研究成果。 论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写 或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助， 均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：参昨黻 日期： 学位论文版权的使用授权书 研厶) 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：1 拣娩：耘 指导教师签名 日期 摘要 g r i m i n 为源自于日本七鳃鳗口腔腺的g r i m - 1 9 样抗肿瘤基因重 组蛋白。g r i m 一1 9 是新近发现的一种”细胞死亡激活因子”，由于 g r i a i 一1 9 能特异性抑制s t a t 3 ( s i g n a lt r a n s d u c e r a na c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t i o n ，信号转导与转录活化因子) 分子发挥作用来阻断肿 瘤细胞的信号传递途径，促进肿瘤细胞凋亡或者逆转恶性表现型， 而日本七鳃鳗g r i m i n 与g r i m 一1 9 具有相同的功能结构域及较高的序 列同源性，这使得g r i m i n 有望成为高效低毒、副作用小的抗肿瘤基 因工程新药。 鉴于此，本论文从日本七鳃鳗中提取g r i m - 1 9 的同功能基因， 将其命名为g r i m i n ，并对其进行了初步的研究和验证。 本课题组已先期完成七鲤鳗口腔腺e d n a 文库的构建，所构建的 库容量为2 1 1 0 e p f u m l 。随机挑选单克隆单向测序后，共得到 1 2 8 1 条有效e s t 序列。对其进行生物信息学分析后，发现了1 条能 翻译出g r i m 一1 9 结构域的e s t 序列。对此段m r n a 进行全长钓取、开 放阅读框寻找、测序及b l a s t i n g 同源性比较后，发现此一功能基因 与非洲蟾蜍g r i m 一1 9 的同源性为6 6 ，与河豚g r i m 1 9 的同源性为 6 8 。根据其设计引物进行r t p c r ，获得了g r i m i n 的4 2 9 b p 的功能 基因。进一步将此功能基因构建入表达载体p e t 2 3 b ，并转化入克隆 菌d h 5 a 后进行阳性转化子的筛选鉴定。 本论文主要将带有组氨酸标签的p e t 2 3 b - g r i m i n 重组质粒从克 隆菌中提取出，然后c a c l ：法转化入表达菌e c o l ir o s e t t a 中进行 i p t g 诱导表达；经组氨酸亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化。 表达产物为包涵体，进行包涵体透析复性后得到有生物活性的蛋白， 将其命名为g r i m i n 蛋白。 获得了具有生物活性的g r i m i n 蛋白之后，本论文进一步进行了 对g r i m i n 的生物学活性的检测。培养入脐静脉内皮细胞e c v 3 0 4 及 人自血病细胞h l 6 0 ，收集细胞，利用m t t 比色法，双苯并咪唑( h o e c h s t 3 3 2 5 8 ，h o ) 染色及流式细胞仪分析等实验证明，g r i m i n 蛋白具有 抑制肿瘤细胞生长并促进其发生凋亡的生物学活性；而且本课题 对g r i m i n 进行了质脂体包被的小规模实验，以使包被g r i m i n 蛋白 透过细胞膜质脂双分子层而达到细胞内起作用，本实验是以未加蛋 白作用的细胞和未加蛋白仅加脂质体的细胞分别作对照；加入蛋白 和脂质体混合物的结果与对照相比：结果显示经过脂质体包裹的蛋 白作用的细胞出现明显的细胞凋亡，并且脂质体对细胞没有任何刺 激作用，从而证明了可以利用脂质体包被作为药物剂型在抗肿瘤药 物中加以应用。 总之，本论文为了研究g r i m 一1 9 诱导肿瘤细胞凋亡方面的作用， 成功地通过基因工程手段从日本七鳃鳗口腔腺中获取了新的功能基 因以及蛋白，并较为系统地对g r i m i n 的相关生物学活性进行了初步 研究。这些实验结果都提示了g r i m i n 作为一种肿瘤细胞死亡催化剂 的潜在应用价值。 关键词：6 r i m in 6 r im 一19 细胞凋亡 基因工程生物活性 日本七鳃鳗口腔腺g r j i l l i 基因的生物学活性研究 1 前言 日本七鳃鳗( l a m p e t r aj a p o n i c a ) 属圆口纲( c y c l o s t o m a t a ) 、 七鳃鳗目、七鳃鳗科、七鳃鳗属，是迄今发现的最古老的无颁脊椎动 物。其为海洋洄游性鱼类，成体生活在海洋，经常用吸盘附在其它 鱼体上吸食其血与肉，七鳃鳗的这种独特的生活习性暗示着其体内 必定含有某些不同于其它生物物种的生物活性物质。 g r i m i n 为源自于日本七鳃鳗口腔腺的g r i m 一1 9 样抗肿瘤基因重 组蛋白。g r i m - 1 9 是新近发现的一种”细胞死亡激活因子”，由于 被干扰素b e t a 和视黄酸所诱导表达而得名，在多数真核生物中普遍 存在。它可以引起多种肿瘤细胞发生凋亡，受i f n r a 联合刺激后表 达上调，反义敲除g r i m 1 9 可以抑制干扰素( i f n ) 和反式视黄酸 ( a l l t r a i l s - r e t i n o i ca c i d ，r a ) 诱导的细胞凋亡从而刺激细胞过度 增殖。研究表明，g r i m 一1 9 蛋白与胚胎早期发育川、细胞凋亡：肿 瘤抑制等密切相关“”“，并在局限性回肠炎( c r o h nd i s e a s e ) 3 、 k a p o s i s 肉瘤”1 等多种疾病上引起关注g r i m - 1 9 可以通过抑 制s t a t 3 的活性而特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而“杀死”肿瘤 细胞”1 。 s t a t 3 在细胞内起着重要的信号传递作用，负责将细胞外的信 号传递到细胞核，通过诱导靶基因转录表达从而引起系列的生物 刺激效应。已有相当多的证据表明活性s t a t 3 在细胞恶变过程中起 关键性作用，许多肿瘤来源细胞株都需要s t a t 蛋白( 特别是s t a t 3 ) 来保持转变后的表现型，这暗示s t a t 3 是一个癌基因。s t a t 3 蛋白 由于能激活b c i - 2 等抗凋亡基因而与多种类型的恶性肿瘤发生相 关，这些恶性肿瘤包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、皮肤癌、 胰腺癌、卵巢癌以及淋巴瘤和一些类型的白血病。有研究表明，s t a t 3 在约5 0 的乳腺肿瘤中保持持续的活性。科学家发现，所有细胞都 含有s t a t s 蛋白，但在正常细胞中，s t a t 3 的活性只是瞬时的；而在 特定的肿瘤细胞中，这种蛋白的活性则是持续的。由此可见，s t a t 3 是肿瘤治疗的一个极好靶标，s t a t 3 抑制剂将能特异性诱导肿瘤细 胞发生凋亡，从而“杀死”肿瘤细胞，而对正常细胞几乎没有杀伤 作用。研究发现，使用优势分布的阴性抑制剂或者反义寡聚核苷酸 日本七鳃鳗口腔腺g r i r m 基因的生物学活性研究 去除s t a t 3 以后，可以逆转恶性表现型“。”1 。 由于g r i m - 1 9 能特异性抑制s t a t 3 分子发挥作用来阻断肿瘤细 胞的信号传递途径，促进肿瘤细胞凋亡或者逆转恶性表现型，而日 本七鳃鳗g r i m i n 与g r i m 一1 9 具有相同的功能结构域及较高的序列同 源性，这使得g r i m i n 有望成为高效低毒、副作用小的抗肿瘤基因工 程新药 鉴于此，本论文从日本七鳃鳗中成功地提取了g r i m 1 9 的同功 能基因。将其命名为g r i m ir l ，并对其进行了初步的研究和验证。 日本七鳃鳗口腔腺o r i m i n 基因的生物学活性研究 2 日本七鳃鳗口腔腺新功能基因g r in lin 的克隆、 表达及纯化 本实验的基本技术路线为：对前期构建的日本七腮鳗口腔腺 e s t 表达序列标签进行生物信息学分析，发现一g r i m 一1 9 同源序列， 根据其设计引物进行r t p c r 扩增，钓取该新功能基因：将获取的目 的基因与p e t 2 3 b 载体相连接后转化入克隆菌d h 5 0 ，进行阳性转化 子的筛选鉴定；然后将带有组氨酸标签的p e t 2 3 b - g r i m i n 转化入表 达菌e c 0 1 ir o s e t t a 中进行i p t g 诱导表达；经组氨酸亲和层析柱 对表达的重组蛋白进行纯化。表达产物为包涵体，进行包涵体透析 复性得到有生物活性的蛋白，将其命名为g r i m i n 。 2 1 日本七鳃鳗口腔腺新功能基因g rim in 的克隆及序 列分析 ( 该部分试验由大连宝生物协助完成) 2 1 1 材料 新鲜日本七鳃鳗口腔腺取自于黑龙江松花江流域 2 1 2 方法 ( 1 ) 引物设计 根据利用生物信息学手段对e s t 表达序列标签进行分析所发现 的同源序列设计引物。引物序列如下： 5 一p r i m e r ( p t ) ： 5 一x x | c a t a t g k c g g c g t c c a a g g t g a a g c a g 一3 ，含n d ei 内酶切位 点。 3 - p r i m e r ( p 2 ) 3 - x x e ! g ! ! ! | c a c g t g g a a g a g g t g g t t g a g 5 含h i n d l i l 内酶切位点。 使用t a k a r ar n al ap c r ”k i t ( a m v ) v e r 1 1 ( c o d en o d r r 0 1 2 a ) ， 以t o t a lr n a ( 预先提取) 为模板，以0 1 i g od t 为反转录引物反转 录合成c d n a 。 ( 2 ) 以c d n a 为模板，。以p l 、p 2 为引物，使用t a k a r al at a q ” ( c o d en o d r r 0 2 a g ) p c r 扩增目的基因片断。p c r 产物使用t a k a r a 日本七鳃鳗口腔腺g r i m i n 基因的生物学活性研究 a g a r o s eg e ld n p u t i f i c a , t i o nk i tv e t 2 0 ( c o d en o d v s 0 5 ) 切 胶回收，命名为c t 2 4 3 ( p ) ，( 即g r i m i n 目的片断) 溶于1 2 u 1d l t ：0 中，取l u l 进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图f i g 1 。 ( 3 ) 使用t a k a l t ad n al i g a t i o nk i t ( c o d en o d 6 0 2 2 ) 中的 s o l u t i o i li ，将c t 2 4 3 ( p ) 和p m d l 8 - 1 s i m p l e 载体连接后，热转 化至e c o l ic o m p e t e l 3 tc e nj m l 0 9 ( c o d en o d 9 0 5 2 ) 中，涂布平 板，过夜培养菌体。 ( 4 ) 挑选菌落，提取质粒，分别命名为c t , a 2 4 3 ( t ) 一9 、1 0 、1 3 、 1 4 。取1 u l 进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图f i g 2 。 ( 5 ) 将c t 2 4 3 ( t ) 一9 、 c t a 2 4 3 ( t ) 一1 0 、c t a 2 4 3 ( t ) 一1 3 、 c t a 2 4 3 ( t ) 一1 4 质粒分别用b c a b e s tp r i m e tm 1 3 - 4 7 引物进行d n a 测序。测序结果符合要求。 ( 6 )将c t a 2 4 3 ( t ) 一1 0 和p e t2 3 b 用n d ei h i n di i l 双切 酶，并使用t a k a r aa g a r o s eg e ld n ap u r i f i c a t i o nk i t v e t 2 0 ( c o d en o d r 8 0 5 a ) 切胶回收，命名为i n s e t ti 和v e c t o ri ， 取1 u 1 进行琼脂糖电泳，结果如图f i g 3 。 ( 7 ) 使用t a k a l l ad n al i g a t i o nk i t ( c o d en o i ) 6 0 2 2 ) 中的 s o l u t i o ni ，将ir l s e r ti 和v e c t o ri 连接，热转化至e c o l i c o m p e t e n tc e l ld h 5o ( c o d en o d 9 0 5 7 ) 中，涂布平板过夜培养菌体。 挑选菌落，提取质粒。取1 u 1 进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图f i g 4 。 ( 8 ) 将质粒c t p l 2 4 3 - p - 7 和c t a 2 4 3 一p 一8 使用n d ei h i n di i 双酶切进行酶切检测，取1 0 u l 进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图 f i g 5 。 ( 9 )将c t a 2 4 3 - p - 7 、c t a - p - 8 质粒用t 7p r o m o t e rp r i i l l e r 引物进行d n a 测序。测序结果符合要求。 4 日本七鳃鳗口腔腺g r i n l j n 基因的生物学活性研究 2 1 3 结果 ( 1 ) 盯一p c r 结果 根据日本七鳃鳗口腔腺m 刚a 中具g r i m 一1 9 结构域的开放阅读框架序列设计 引物p l 与p 2 ，以r t - p c r 后获得的c 1 ) n h 为模板进行p c r 扩增，获得了预 期的4 2 9 b p 的目的基因( f i g 1 ) ( 2 ) 克隆载体的转化后质粒提取结果 f i l i 盯- p c r 产物 i d l 2 0 0 0m a r k e r ， 1 4 2 9 b p 目的基因 f i - 2 质粒提取 i l _ h i n di i id n am a r k e r 1 c t a 2 4 3 ( t - 9 质牲。 2 c t a 2 4 3 ( t ) 一i 0 质粒： 3 c r a 2 4 3 ( t ) 1 3 盾粒： ( 3 ) 阳性转化子双酶切鉴定 对p c r 扩增获得的阳性菌提取质粒后进行双酶切鉴定，能酶切下来 4 2 9 b p 基因产物的质粒确定为阳性克隆质粒，并命名其为p e t 2 3 b g r i m i n 日本七鳃鳗口腔腺g r i n d n 基因的生物学活性研究 f i g 3 重组质粒 p e r 2 3 b - 6 r i m i n 的n d e l - h i n d i i i j 珏酶切鉴定 m 1 ：d n am a r k e r2 ，0 0 0 i ：i n s e r ti ： ( 4 ) 重组质粒转化入克隆菌d h 5n 后提取质粒，电泳鉴定结果 f i g 4 硼5 d 中提取的质粒鉴定 m ： - h i n di l ld n am a r k e r ： l ：c t a 2 4 3 一p 一7 质粒 2 ：c t a 2 4 3 一p 8 质粒， 3 5 对d h 5a 提取的质粒进行双酶切鉴定结果 6 f i g 5 巧中提取的质 粒n d el h i n d 双酶切鉴 定 m 1 ： - h i n dh id n a m a r k e r ： 日本七鳃鳗口腔腺c , r h n i n 基因的生物学活性研究 2 2g r i m i n 的诱导表达、鉴定与纯化 材料：质粒提取试剂盒、r t - p c r 试剂盒、i p t g 、普通分子量蛋白标准购自 宝生物大连公司；表达蔼e c o l ir o s e t t a 、l t i s t a g 单克隆抗体及组氨酸亲 和层析柱( h i s 啦i n dc o l u m n ) 购自n o v a g e n 公司；山羊抗兔i g g a p 及n b t b c i p 试剂盒( i m i d a z o l e ) 购于华美公司。尿素、咪唑、氯化钠均为a m r e s c o 产品。 方法 2 2 1p e t 2 3 b g ri m in 转化入表达菌 将经鉴定确认的阳性转化子提取重组质粒p e t 2 3 b - g r i m i n ，c a c l 2 法转化至 表达菌e c o l ir o s e t t a 菌中。方法如下： 2 2 1 1 质粒的提取 采用宝生物的质粒提取试剂盒进行。具体如下： ( 1 ) l b ( a m p + ) 液体培养基培养含p e t 一2 3 b 质粒的大肠杆菌d h 5a 。 ( 2 ) 取1 。4m 1 的菌液，1 2 0 0 0g 离心2m i n ，弃上清。 ( 3 ) 2 5 0pl 的s o l u t i o ni ( 含r n a s ea 1 ) 充分悬浮细菌沉淀。 ( 4 ) 加入2 5 0l l1 的s o l u t i o ni i 轻轻地上下翻转混合5 6 次，使菌体 充分裂解，形成透明溶液。 ( 5 ) 加入4 0 0l l1 的c c 预冷的s o l u t i o ni i i ，轻轻上下翻转混合5 6 次， 直至形成紧实集块，然后室温静置2m i n 。 ( 6 ) 室温1 2 0 0 0g 离心5m i n ，取上清。 ( 7 ) 将试剂盒中的s p i nc o l u m n 按置于c o l l e c t i o nt u b e 上。 ( 8 ) 将上述操作6 的上清液转移至s p i nc o l u m n 中， ( 9 ) 将5 0 0i i1 的r i n s e a 加入s p i nc o l u m n 中，3 6 0 0g 离心3 0s ，弃 滤液。 ( 1 0 ) 将7 0 0l l l 的r i n s e b 加入s p i nc o l u m n 中，3 6 0 0g 离心3 0s ，弃 滤液。 ( 1 1 ) 重复操作1 0 。，然后1 2 0 0 0g 再离心1m i n 。 ( 1 2 ) 将s p i n c o l u m n 按置于新的1 5m l 的离心管上，在s p i nc o l u m n 膜 的中央处加入6 0p1 的水或洗脱液，室温静置lm i n 。 ( 1 3 ) 1 2 0 0 0g 离心1m i n 洗脱d n a 。 日本七鳃鳗口腔腺g r i m i n 基因的生物学活性研究 2 2 1 2 制备e c o l ir o s e t t a 感受态细胞，c a c l 2 法进行转化 ( 1 ) 宿主菌e c o lir o s e t t a 接种于2 0 m l a m p - c m p + l b 中培养过夜； ( 2 ) 将部分上述菌液移至5 0m 1l b 三角烧瓶中，3 7 。c3 0 0r p m m i n 强烈 振荡培养3 h ，使细菌的浓度达到5 x 1 0 7 个细胞m 1 。此时，细菌 的o d 6 0 0 一般在0 2 0 3 之间，为对数生长期或对数生长前期； ( 3 ) 培养物于冰上放置1 0m i n ，然后转移到两个5 0m l 离心管中， 4 0 0 0 94 离心l o m i n ( 4 ) 弃上清，倒置离心管i m i n ，流尽剩余液体，然后加入5 m l 用冰 预冷的0 i m o l lc a c l 2 溶液致敏悬浮细胞，冰上l o m i m ( 5 ) 4 0 0 0 x g4 1 2 离心l o m i n 回收细胞，弃上清，每2 5 m i 的原培养物 再加入2 m l 冰冷的0 i m o l l 的c a c l 2 溶液，县浮细胞，置于冰上 3 h ： ( 6 ) 每份2 0 0 u 1 分装细胞： ( 7 ) 加1 0 u l 含4 0 n g 的d n a 溶液至2 0 0 u l 感受态细胞中，温和混匀； ( 8 ) 4 2 热休克9 0 s ，迅速放回冰中，将细胞冷却l 2 m i n 后，加入 8 0 0u1l b ( a m p - c m p + ) 培养基，3 7 2 2 5 r m i n 摇荡培养细菌4 5 9 0 m i n ， 让细菌的质粒表达抗生素抗性蛋白； ( 9 ) 取1 0 0 ”1 转化产物铺于9 0 m m 的l b ( a m p + c m p + ) 琼脂平板上。室温 下放置2 0 3 0 r a i n ，待溶液被琼脂吸收后，倒置平皿于3 7 。c 培养 1 2 1 6 h ； ( 1 0 ) 待l b ( a m p + c m p + ) 琼脂平板上长出菌落后进行阳性转化子的筛选鉴 定。 2 2 2 对重组表达菌的鉴定 采用t 7 通用引物法鉴定，方法如下： ( 1 ) 把培养的转化菌用牙签沾取少点加入到l o u l 灭菌蒸馏水中，用开水 煮沸1 0 m i n ，使菌体裂解 ( 2 ) 以煮好的f o u l 菌体为模板进行p c r 扩正反应，反应体系和反应条件 如下： p c r 反应体系：5 0 u l 1 0 p c rb u f f e r ( m g ”。p l u s )5 u l 日本七鳃鳗口腔腺c n i n l i n 基因的生物学活性研究 d m pm i x t u r e ( 各2 5 m m ) 4 u l 模板d n a l o u l 引物1 ( 2 0 u m ) l u l 引物2 ( 2 0 u m ) l u l t a k a r at a q ( 5 u j 1 ) 0 2 5 u l 灭菌蒸馏水 2 8 7 5 p c r 反应条件为：9 4 预变性lm i n 后，9 4 变性4 5 s ，5 5 复性 4 5s ，7 2 延伸4 5s ，2 5 个循环。最后7 2 延伸7 m i n ( 3 ) 1 琼脂糖凝胶电泳检测 2 2 3 对重组菌进行包涵体和可溶性蛋白的ip i g 诱导表达。” ( 1 ) 挑取阳性转化菌单菌落接种于含氨苄的l b 培养基中于3 7 x 2 培养至 o d 6 0 0 = o 4 0 6 达到对数生长期。 ( 2 ) 加i p t g 至终浓度l m m o l l ，分剔进行5h 的3 7 c 诱导表达与3 0 的低温过夜诱导表达。 ( 3 ) 取上述培养液5 0 0 0g 离心5m i n ，于沉淀中加1 0 01 1 1 的上样缓。 冲液1 0 0 加热3m i n ，上样行1 5 浓度的常规s d s p a g e 电泳。 2 2 4 常规s d s p a g e 鉴定胁1 2 。2 4 1 贮液配制： ( 1 ) 3 0 9 6 凝胶贮备液：2 9 ( w v ) 丙烯酰胺，1 ( w v ) n ，n 一亚甲双丙 烯酰胺； ( 2 ) 1 5m o l lt r i s c l ( p h 8 8 ) ； ( 3 ) 1 o m o l lt r i s e l ( p h 6 8 ) ； ( 4 ) 1 0 s d s ( 5 ) lx t r i s - g l y 电泳缓冲液( p h 8 3 ) ： 2 5 m m 0 1 lt r i s ，2 5 m m o l l 甘氨酸( p h 8 3 ) ，0 1 s d s ； ( 6 ) 10 9 6 过硫酸铵( w v ) ； ( 7 ) t e m e d ( n ，n ，n2 ，n 一四甲基乙酰二胺) ； ( 8 ) 上样缓冲液( 2 xl o a d i n gb u f f u r ) ： 5 0 m o l lt r i s ： 2 5 0 m m o l l 甘氨酸( p h 8 5 ) ： 9 一 日本七鳃鳗口腔腺g d m i n 基因的生物学活性研究 0 1 s d s ： 1 5 n a n o l lt r i s c l ( p h 8 8 ) ： 1 o m m o l lt r i s c l ( p h 6 8 ) ( 9 ) 考马斯亮蓝染色液( 配制好后过滤除颗粒) ： 0 2 5 考r 2 5 0 ，1 0 冰醋酸，4 5 甲醇； ( 1 0 ) 脱色液：3 0 甲酸，1 0 冰乙酸； 2 2 4 2 制备胶板： 1 0 分离胶( 1 5 m 1 ) ：水 5 9 m l 3 0 丙烯酰胺凝胶贮液 5 o m l t r i s c l ( p h 8 8 ) 3 8 m l 1 0 过硫酸铵 。0 1 5 m l 1 0 s d s0 1 5 m l t e m e d2 0 u l 1 5 分离胶( 1 5 m 1 ) ：水 3 4 m l 3 0 丙烯酰胺凝胶贮液 7 5 m l t r i s c l ( p h 8 8 ) 3 8 m l 1 0 过硫酸铵0 1 5 m l 1 0 s d s0 1 5 m l t e m e d 2 0 u l 5 浓缩胶( 1 0 m 1 ) ：水 6 8 m l 3 0 n 烯酰胺凝胶贮液 1 7 m l t r i s c l ( p h 6 8 ) 1 2 5 m l 1 0 过硫酸铵0 1 m l 1 0 s d s0 1 m l t e m e d 5 0 u l 2 2 4 3 电泳：利用p s 一3 0 型、3 0 m h 恒流电源电泳仪( 大连生物科技公司) 进行电泳：上样量为2 0 u 1 2 2 4 4 过夜染色、脱色3 h 2 2 5w e s t e r nb i o t 鉴定 ( 1 ) 将蛋白提取液行1 5 分离胶的s d s p a g e ： ( 2 ) 电转化蛋白至n c 膜上。转化时问为4 0m i n ： 1 0 一 日本七鳃鳗口腔腺c a i m i n 基因的生物学活性研究 ( 3 ) 用i x t b s ( 1 0m m o l lt r i s h c l ，p h7 5 ，7 5m m n l ln a c l ) 洗膜 两次，每次1 0m i n ： ( 4 ) 在封闭液( 3 b s ai n1xt b s ) 温育1h ： ( 5 ) 用l xt b s t t ( 2 0m m o l lt r i s - h c l ，p h7 5 ，0 5m o l ln a c l ，0 0 5 v vt w e e n 一2 0 ，0 2 v vt r i t o nx - 1 0 0 ) 洗两次，每次1 0m i n ； ( 6 ) 用1xt b s 液洗1 0m i n ： ( 7 ) 在l ：1 0 0 0 倍稀释的兔源抗h i s t a g 单克隆抗体中温育1h ： ( 8 ) 用1 xt b s t t 洗两次，每次1 0m i n ； ( 9 ) 用1xt b s 液洗1 0m i n ： ( 1 0 ) 用5 0 0 倍稀释的山羊抗兔i g g - a p 温育1h ： ( 1 1 ) n b t b c t p 染色试剂盒进行显色反应，具体操作同说明书 2 2 6 包涵体形式的重组蛋白6 r i m i l 3 的纯化 因g r i m i n 为带有组氨酸标签的融合蛋白，故组氨酸亲和层析柱( h i s - b i n d c o l u m n ) 对其进行纯化。组氨酸标签可与固相化于n i - n t ah i s b i n d ( 镍一硝 基三乙酸) 树脂上的n i 2 + 结合。非结合蛋白被洗掉后，目的蛋白通过咪唑( 竞 争性配体) 洗脱而重新获得。 具体操作如下： 2 2 6 1 贮液配制： ( 1 ) 8xb i n db u f f e r ： 4 0 m m o l li m i d a z o l e ； 4 m o l ln a c l ； 1 6 0 m o l lt r is h c l ( p h 7 9 ) ( 2 ) 8xw a s hb u f f e r ： 4 8 0m m n l li m i d a z o l e ： 4m n l ln a c l ： 1 6 0m m o l lt r i s h c l ( p h 7 9 ) ( 3 ) 4xe l u t eb u f f e r ： 4m o l li m i d a z o l e ： 2m o l ln a c l ： 8 0m m o l lt r i s h c l ( p h 7 9 ) ( 4 ) 含6 m 尿素的1xb i n db u f f e r ( p h 7 9 ) 日本七鳃鳗口腔腺g r i m i n 基因的生物学活性研究 ( 5 ) 含6 m 尿素的1xw a s hb u f f e r ( p h 7 9 ) ( 6 ) 2 0m m o l llxw a s hb u f f e r ( p h 7 9 ) ： 1 l m l 含6 m 尿素的1xb i n db u f f e r ： 4 1m l 含6 m 尿素的1xw a s hb u f f e r ： 加水至1 0 0 i i l l ( 7 ) 含6 m 尿素的1xe l u t eb u f f e r ( p h 7 9 ) 以上试剂配置好后均0 4 5 u m 滤膜进行过滤。 2 2 6 2 重组g r i m i n 的蛋白质的诱导表达 2 2 6 3 大量包涵体的提取及变性 方法： ( 1 ) 1 0 0 0 0g 离心1 0m i n 收获菌体，倒掉上清后以1 0 0m 1 的原培养液 加4 0 m l 冰冷的1xb i n d i n gb u f f e r ( 5 m m o l li m i d a z o l e ：0 5 m o l ln a c l ： 2 0 m m o l lt r i s - h c ( p h 7 ：9 ) 的比例重悬细胞。 ( 2 ) 将上述样品置于冰浴中超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠。 ( 3 ) 5 0 0 0g 离心1 5m i n 收集包涵体及细胞碎片而使其它杂蛋白留在溶 液中。 弃上清，每1 0 0m l 原培养体积用5 m l 含6 m 尿素的lxb i n d i n gb u f f e r 悬浮沉淀。然后冰浴1 h ，以让蛋白彻底溶解。 ( 4 ) 1 0 0 0 0g 离心3 0m i n 去除不溶成份，留上清。 ( 5 ) 所得上清过0 4 s u m 滤膜。 2 2 6 4 上清用0 4 51 1 m 的一次性除菌滤器过滤。 2 2 6 5 亲和层析： ( 1 ) 吸去h i s b i n dc o l u m n 上室的贮液，并打开下面管口； ( 2 ) 用1 0m l 含6 m 尿素的l xb i n d i n gb u f f e r 对柱子进行平衡； ( 3 ) 上样； ( 4 ) 用1 0m 1 含6 m 尿素的l xb i n d i n gb u f f e r 洗柱； ( 5 ) 用1 0m l2 0m m o l l1xw a s hb u f f e r 洗柱； ( 6 ) 用5 舶1 含6 m 尿素的l xe l u t eb u f f e r 洗脱目的蛋白。 2 2 7 对所得包涵体形式的蛋白进行透析复性，得到有生物 活性的蛋白成分。 1 2 日本七鳃鳗口腔腺g 血血基因的生物学活性研究 包涵体是指细菌表达的基因重组蛋白在细胞内凝集而形成的无活性的固体 聚集体。包涵体难溶与水，只溶于变性剂如尿素( 脲) 、盐酸胍等。本试验利用 尿素使包涵体溶解，加上二硫键还原剂即二流苏糖醇( d t t ) 的作用，错配的二 硫键被打开，蛋白还原成为一级结构的形式，在谷胱甘肽氧化还原体系中，重 新正确地形成二硫键，恢复蛋白活性一1 。具体方法如下： 2 2 7 1 透析袋的处理 配置试剂： ( 1 ) 1 0 0 0 m l2 n a h c 0 3 ： ( 2 ) 1 0 0 0 m ll 村e d t a ( p h 8 0 ) 处理透析袋： ( 1 ) 把透析袋剪成适当长度l o - 2 0 c m 的小段： ( 2 ) 在大体积2 ( w v ) n a h c 0 3 中将透析袋煮沸l o m i n ； ( 3 ) 用蒸馏水彻底清洗透析袋： ( 4 ) 放在l m me d t a ( p h 8 o ) 中煮沸l o m i n ； ( 5 ) 冷却后存放于4 冰箱 2 2 7 2 透析复性 试剂： ( 1 ) 氧化型谷胱甘肽： 还原型谷胱甘肽： d t t ( 二硫苏糖醇) 以上试剂购自于北京经科宏达生物有限公司 ( 2 ) 2 nh c l ( 3 ) l lt e 缓冲液( p h8 o ) l o m o l lt r i s c 1 ( p h8 o ) ： l m m o l le d t a ( p h8 0 ) ( 4 ) 2 l 复性液 1 2 m o l 尿素： 0 2 m o l 氧化型谷胱甘肽： 1 8 m o l 还原性谷胱甘肽： 4 8 9t r i s ： 1 1 6 8 m lh c 】 日本七鳃鳗口腔腺g r i l i i i n 基因的生物学活性研究 ( 5 ) 聚乙二醇( p e g ) 中间分子量2 0 0 0 6 0 0 0 进行复性： ( 1 ) 将三个1 0 0 0 i i l l 的大烧杯用烤箱烘烤1 8 0 cl h ； ( 2 ) 透析袋装入纯化后的蛋白后，置于l l 复性液烧杯中，4 搅拌 透析l h ； ( 3 ) 放入另一个l l 复性液中，4 搅拌透析l h ： ( 4 ) 然后置于1 l t e 缓冲液中，4 搅拌透析l h ； ( 5 ) p e g 包裹浓缩 2 2 8 蛋白浓度测定 2 2 8 1 利用b c a 浓度测定试剂盒( 碧云天生物技术研究所) ： 酶标仪：9 6 孔板 2 2 8 2 测定方法： ( 1 ) 按5 0 体积b c a 试剂a 加1 体积b c a 试剂b ( 5 0 ：1 ) 配制适量b c a 。工作液， 充分混匀： ( 2 ) 将标准品按0 ，2 ，4 ，8 ，1 2 ，1 6 ，1 8 ，2 0 微升加到9 6 孔板的标准品 孔中，加 用于稀释标准品的0 9 n a c l 溶液补足到2 0 微升： ( 3 ) 加1 5 m l 待测蛋白到9 6 孔板的样品孔中，加5 m l o 9 n a c l 溶液稀释： ( 4 ) 各孔加入2 0 0 微升b c a 工作液，3 7 放置3 0 分钟； ( 5 ) 酶标仪检测：测定波长5 9 5 n m ：参比波长6 2 0 n m 2 2 8 3 与复性前蛋白浓度比较，计算复性率 日本七鳃鳗口腔腺g d m h a 基因的生物学活性研究 2 2 9 结果 ( 1 ) 对重组表达菌的鉴定结果 f i g 6t 7 通用引物法鉴定结果 ( a ) d n a m a r k e r 2 0 0 0 ； ( c ) 为目的片断一大小4 2 9 b p ( 2 ) 常规s d s - p a g e 鉴定对重组菌进行i p t g 诱导表达的结果 对重组质粒进行3 7 培养诱导表达，重组蛋白是g r i m i n 基因与组氨酸标签 ( h i s t a g ) 等部分质粒序列共同表达的融合蛋白进行l0 9 6 十二烷基磺酸钠一聚丙 烯酰胺凝胶电泳( s o d i u md o d e c y ls u p h a t ep o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，s d s - p a g e ) 根据c d n a 测序结果及由c d n a 序列推导的氨基 酸序列计算该蛋白的分子量应为2 0 4 2 0 5 1 k d ，因此电泳采用普通分子量蛋白标 准作为蛋白m a r k e r ( 有6 条已知分子量蛋白质，依次为9 7 ，4 0 0 k d ；6 6 ，2 0 0 k d ； 4 3 ，0 0 0 k d ：3 1 ，0 0 0 k d ；2 0 ，i o o k d ：。1 4 ，4 0 0 k d ) ，结果可见在标准蛋白的第5 条带处有清晰的特异性表达带。如图( f i g 7 ) 埘9 7 s d s - p a g e 示p e t 2 3 b - g r i m i n 在e c e l ir m c q t a 中的 诱导表达 l p e t 2 3 b - g r i m i n 未诱导对照；2 蛋白m a r k e r ；3 b s a 标 准；4 ，5p e t 2 3 b g r i m i ni p t g 诱导过表达( 4 2 0 k d a 处过表 达蛋凸条带) 菌体；6p e t 2 3 b 卒质粒对羁 日本七鳃鳗口腔腺g 血l i n 基因的生物学活性研究 ( 3 ) w e s t e r nb l o t 鉴定 h i s t a g 单克隆抗体可以有效检测含有组氨酸标签或不管其周围氨基酸顺 序如何而至少含有5 个连续组氨酸残基的蛋白。因重组蛋白是g r i m i n 基因与 组氨酸标签( h i s t a g ) 等部分质粒序列共同表达的融合蛋白，故可采用h i s , t a g 单克隆抗体进行w e s t e r nb l o t 鉴定。鉴定结果证实诱导的蛋白提取液中有2 0 k d 目标蛋白的存在，这说明了重组蛋白的正确表达( f i g 8 ) 。 f i g 8w e s t e r nb l o t 鉴定结果 1 、2 均为重组蛋白的特异性表达 ( 4 ) 蛋白质纯化结果 对阳性转化菌诱导表达后的包涵体蛋白成分进行组氨酸亲和层析后，将 所得的纯化蛋白行普通s o s - p a g e 。结果显示，纯化蛋白成单条带迁移，分子量 为2 0 4 2 0 5 1 k d 。这表明均质蛋白的成功获得( f i g 9 ) 。 f i g 9h is b i n dc o i t n n 对g r i m i n 重组蛋白进行纯化结果 1 b s a 标准：2 生白m a r k e r ；3h i f i b i n dc o i u m n 对g r i m i n 重 组蛋白纯化所得单一条带4 过h is b i n dc o i u t a n 后的蛋 白提取液5 非目的蛋白的洗脱液 1 6 - 日本七鳃鳗口腔腺g r i n l i n 基因的生物学活性研究 ( 5 ) g r i m i n 蛋白的可溶性诱导 ( 6 ) 蛋白标准曲线的绘制及复性结果 n 1 0s d s - p a g e 示p e t 2 3 b - g r i m i n 在 e c o l lr o s e t l a 中2 8 过夜诱导表达 1 b s a 标准：2 蛋白m a r k c r ； 3p e t 2 3 b g r i m i n 低温过夜诱导； 4 p e t 2 3 b - g r i m i n 未诱导对照； 5p e t 2 3 b 空质粒对照 f 睡l lb c a 法绘制蛋白标准曲线 此包涵体复性率达8 0 ； 纯化蛋白浓度可达1 2m g m 1 ：每升培养物诱导表达后经组氨酸亲和层析 后可获得3 6 m g 的纯化g r i m i n ，经包涵体透析复性后可得到2 8 m g 具有生物 活性的蛋白。 2 2 1 0 讨论 该课题的本阶段工作主要是将重组的质粒转化入表达菌e c o l ir o s e t t a 菌 中，进行i p t g 的诱导表达，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹( w e s t e r n b l o t t i n g ) 的鉴定，在成功表达基础上进一步地进行纯化获取g r i m i n 蛋白以及 通过变复性使其具有生物学活性。 质粒提取主要是利用宝生物公司大连分公司的质粒提取试剂盒进行操作 日本七鳃鳗口腔腺g r i m i n 基因的生物学活性研究 的，继而采用c a c l 。法进行表达菌的转化。对转化所得的表达菌进行转化的鉴定， 结果如f i g 6 显示：所提目的片断为4 2 9 b p 的g r i m i n 功能基因。确定阳性转化 菌后我们对其进行i p t g 诱导表达，i p t g 即1 - 甲基乙基一b - d 1 硫代半乳糖吡喃 糖苷( i s o p r o p y l b d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ) ，其诱导原理为i p t g 能够与乳糖 操纵元的阻遏蛋白结合，使乳糖阻遏蛋白的空间构像变化，四聚体解聚成单体， 失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的 基因得以转录合成利用乳糖的酶类。进行i p t g 诱导的关键是控制诱导的温度、 时间、i p t g 浓度以及菌体密