（细胞生物学专业论文）涉入小立碗藓（physcomitrella+patens）干旱应答蛋白质的分离和鉴定.pdf

首都师范大学硕士论文 摘要 干旱是影响植物生长发育的重要逆境因子，研究植物抗旱的分子机制，通过 转基因技术改善重要农作物抗旱性能，已成为我国粮食生产中急需解决的重大课 题。 苔藓植物往往具有很强的抗旱能力，是研究植物抗旱分子机制的良好材料系 统。小立碗藓( 珊坶砌抛妇p 纰船) 是一种对干旱有着极强抵御能力的苔藓。 本研究从生理学入手，利用当前最先进的蛋白质组学研究技术，研究小立碗藓干 旱应答蛋白的分离和鉴定问题，提出植物干旱应答中可能的新基因和新蛋白，对 阐明植物的抗旱机理具有重要的理论意义和实践意义。 我们测定了在干旱处理及复水过程中的小立碗藓的多个生理指标，认为p o d 活力、可溶性糖及游离脯氨酸含量的升高是小立碗藓抗旱的生理证据。又通过标 准2 d e 及最先进的双向荧光差异凝胶电泳( d i g e ) 技术，分别构建了小立碗藓 茎叶体干旱处理3 天及复水6 天的蛋白质组表达谱。与正常生长条件下的小立碗 藓相比，发现7 0 个上调下调超过2 倍的差异蛋白质点。经m a u ) i - 1 o r o f 和 n 孤o m f ri c rm s m s 质谱分析，数据库检索，已鉴定其中8 种蛋白为己知蛋 白质，而其余6 2 个蛋白在现有数据库中未获鉴定结果，应为未知蛋白。8 种已 知蛋白质的功能是：与植物抗逆相关的蛋白质，如脱水蛋白，硫氧还蛋白过氧化 酶；与细胞分裂相关蛋白质，如c d c 4 8 、r s h 同源物；以及分别与光合作用及 呼吸作用相关的r u b i s c 0 活化酶和n a d h - 泛醌氧化还原酶2 3 k d a 亚基；还有 两种目前未发现其具体功能的蛋白质，如细胞内病源相关蛋白类似物和 p h y s c o m i 仃i n 通过生理学和蛋白质组学分析，本研究确定小立碗藓是一种高度耐旱的高等 植物，在分子水平上初步发现其具有特殊的耐旱机制。 关键词：小立碗藓，干旱，抗氧化酶，离子，可溶性糖，脯氨酸，差异蛋白质组， 2 一d e ，d i g e ，n a n o l c - f ti c rm s m s 首都师范大学硕士论文 a b s t r a c t d r o u g h ti s eo f t h e r i o l l se n v i m 砌e n t a ls 臼f e 鹃e sa f f e c t i i i gp l a n t 掣o w t h ad e 盯 蚰d e 培t 柚d i n go ft h em o l e c u l 缸m e d 咖n i s m st h r o u g hw h i c hp i a n t s 代s p dt od l d u g h t i so ff i l n d a m e n t a li n l p c l n a n c ct 0p i a n tb i o l o g y a n di ti sav e r yi m p o r t a n tp r o b l 锄f o r a 鲥c u l t i l r et oi n l p f o v es 仃c 豁吼咖c ci nc r o p sb y 仃距s g 咖cs 仃a t e g i e s m g e n e r a l ，m sh 勰h i g ht o l e 啪c ca g a i n s td r o u 曲t i ti sav e r y9 0 0 dm a t e r ：i a lf o r s t u d y i n gt h em o l e c u l 盯m e c h 舡妇so f 妇g h tt o l e 瑚c c p j 磅删扔纠缸p 鲥日播i s h i g ht o l 伽a g a i n s td r o u g h t i np l 卸【协ht h j s s t l l d y ，丘 体y ，w e s t i l d i c d p h y s i 0 1 0 醪o f 用筘c d m 溉砌彤枷s s e c o n m y ，w es 印啪锄柚di d c n t i 丘c d t h c p r o t e i n st h a tm s p o 硒et od r 叫g h tt h r o u g h t h em ta d v 卸c c dt e i 曲n o l o g yo f p r o t m i 锚 a t p r c s c n t w e b r i n g 姗棚s 咖e 哪掣i n a n d p r 0 妇s t h a t p r o b a b l y 托s p o n t o d i 伽g h t t h es t u d i 锚c o n t r i b u t en e w e v i d e n c ef o re l u d d a t i n gt h cm 盹缸m i s mo f 砒鹤 觚dw o u l db e n e 丘tt 0b o t hp m d l l d i o na n dt h c o f y w 毫m e 船u r e ds c v e r a lp h y s i o l o g i c a li n d e x e s0 f 用驴仞所批p 4 姗s w bf 0 岫dn ” a c t i v i t y o fp o d ，c o n t e n to f l u b l e 蛳g a ra n dp r o l i n ew e r ci n c r c 镐c dw h j 协氍伽批p 口f 绑岫d 盯d c h y d r a t i 髓e ya t h ee v i d e n c c st h a t 用驴c d 晰衙譬砌 脚泐幽h i g h l 灿l e 船ma g a i n s td 枷g b t t 舢u g h2 - d ea n dd i g e p r o t e o m em a p s w e n s t r u c t e df b r 也e 珊”积期l f 抛f 缸p 碍蛔惦謦血e t o p h 讲璐硼d 盯s t 觚【d a r d 粤口w i h o o n d i t i 蛆s ，d e h y d m t i o na n dr c h y d m t i o n t b t a u y ，7 0p r o t c i 璐t h a tw e r ec h a n g e dm 眦 t h 蛆2f o l d sw e m 趾a l y z c db ym a id i t o f - t o fm s m s 柚dn 锄o l c f ri c r m s m s n o w8l m o 铆1p m t e i 璐狮dm 姐y 朋l 【n o w np r o t e i n sw e r ei d 蛐t i 丘c dw i n l d a t a b 鹤es e 蛐舀p e r o 】【i 】暇l 傩i n 趾dd e h y d 疏la d c f c n p i o t e i 璐1 钾op m t e i 璐 聆l 删t o um v i s i 帆眦c d c 4 8h 伽o l o 舀f c s hh 锄o i o g 皿讹黜咖p i o t c i n s w h i c ha i n v o l v c di n e r 盱p 砒w a y 鲫c h 硒r u b i s c 0a c t i v 勰e ，n a d h u b i q u i n e 吲曲re l d l m 撇2 3l 【d as u b u n i t 髓眦撒a l s o 咐op r 0 劬st h a t 也cf i l n c 哟ni s 眦i l 。o w n 鲫c h 勰i n _ i r a c e n l l l 缸p a t h o g c n e s i s r c l a l e dp r m e i n l i k ep r o t c i n a n d p h y s c o m i 仃i n k e yw o r d s ：脚卵蜊 抛如朋f 绷，d e h y d 硎吗a n n o x i d 跹te n z 肿伪，i o 璐，s o l u b l e s u g 碣p r o l m ，d i 恤lp r o t e 0 忸e ，2 d e ，d i g e ，n 锄o c f ti c rm s ，m s 首都师范大学硕士论文 缩写 2 一d e c a d c a t c b b c d c c h a p s c m d i g e f f 口g l c 缩写表 a b b r e v i a t i o n 英文全称 c a t a l a o m 嬲e a n tb h 玲 o e nd i v i s i c y d e 3 【( c h o l 锄i d o p r o p y d d h c h y l a i 如1 删曲】1 一p r o p a s i l l p b 仰a 把 d r y w e i g b t d i t b i o t h i t o l e l 哪唧馏yi o n i 龃t i 蛆 d 【p r e 豁e d 龄q l i e n 啦 f i e 曲w 啦越 i e l 疵觚s i n g 蛔m o b m z e dp hg r a d i e m i j q u i dc h 舢a 姗g m p h y 中文名称 双向电泳 碰撞活化电离 过氧化氢酶 考马斯亮蓝 细胞分裂周期 3 一f ( 3 一胆酰胺丙 基) _ 二乙胺1 一丙磺 酸 碰撞诱导解离 双向荧光差异凝 胶电泳 干重 二硫疏糖醇 电喷雾电离 表达序列标签 傅立叶转换离子 回旋共振 鲜重 等电聚焦 固相化p h 梯度 液相色谱 r 删 叩 麟 断 一 首都师范大学硕士论文 胚胎形成晚期 丰富蛋白 m a l d i 1 d f m a t r i xa i s t c dl 栅d c f p d o 嘶o n 妇i 吐m eo fn i 曲t 基质辅助激光 解吸附离子化 飞行时间 m s m s 蹦s n a d h s d s s o d t c a m a 鹳印e c 灯o m e 缸y t h n 蛔m 鹤s p c 咖m c t r y n 妇，痂咖血d e a d 址d i n u d t i d e p c p d d cm a 鹤丘n 铲r p f i n l i n g p h 蛐y l m t h y l m n y ln u 耐d c p 豇o x i d a s c q d m p o km 琳刮i 曲t 础b u l o s e - 1 ，5 - b i p b o p h a l e 瑚曲咧a 耐b x 娌脚l 撇 s 0 d i u md o d y ls u 觚 s u p e m x i d cd i s l n 曲嘴 t r i c h l m a 雠a c i d 质谱 串联质谱 烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸 肽质量指纹图谱 苯甲基磺酰氟 过氧化物酶 四极杆飞行时间 1 5 - 二磷酸核酮 糖羧化加氧酶 十二烷基磺酸钠 超氧化物歧化酶 三氯乙酸 m 一 啪 一 一 首都师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 蒯纂 2 0 0 6 年5 月2 5 日 首都师范大学学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学 位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出 版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 钥暴 2 0 0 6 年5 月2 5 日 首都师范大学硕士论文 第一章导论 干旱是影响植物生长发育的重要逆境因子，会导致作物产量降低甚至死亡， 并且使生态环境日益恶化，在诸多自然逆境中占首位，其危害程度相当于其他危 害之和。在植物从水生向陆生过渡时，各类植物形成了独有的干旱抵御机制。这 些机制一直是植物学研究的一个重要领域( b 1 u m w a l d ，2 0 0 0 ；s h i n o z a 】d 和 y 锄a g u c h i s h i z a 虹，2 0 0 0 ；蹦g h t 和l 【n i g h t ，2 0 0 1 ；1 m 勰h o w ，2 1 ；) 【i o n g 和2 如，2 0 0 1 ；s e 虹等，2 0 0 3 ；s h i 】绉l d 和d 髓n i s ，2 0 0 3 ；s h i 吣z a l d 等，2 0 0 3 ； 孤l ，2 0 0 3 ) 。我国是水资源严重短缺的国家，干旱和半干旱耕地为5 7 亿亩， 占全国耕地面积的3 8 。在全国粮食主要生产她的华北、东北和西北地区，每年 因缺水造成粮食减产7 0 0 8 0 0 亿公斤。由于人为因素及自然因素的影响，干旱土 地面积仍在不断地增加。随着我国经济、社会的发展，农业用水和工业、生活用 水的供需矛盾日益突出。因此，研究植物抵御干旱胁迫的分子机制，通过转基因 技术改善重要农作物抗旱性能，已成为我国粮食生产中急需解决的重大课题。 众所周知，苔藓植物往往具有极强的抗旱能力。苔藓植物的形态和生活史不 同于开花植物。开花植物以二倍体的孢子体世代占据主要生活史，往往以许多特 化的形态结构适应陆地环境，如具有表皮和分枝发达的根系等，形态结构复杂， 细胞种类众多；而苔藓植物恰好相反，其单倍体的配子体世代在生活史中占据优 势，缺乏适应陆生环境的特异性组织结构，形态结构简单，细胞种类较少。因此， 苔藓植物的抗旱机制可能有别于开花植物，属于主要依赖细胞内的代谢调控反应 抵御干旱的高等植物。它们是研究植物抗旱分子机制，精确阐明分子功能的良好 材料系统。 比较基因组学研究证明：在小立碗藓( p j 咖脚研衙如脚晚船) 中，虽然其单 倍体转录组与拟南芥基因组比较相似( n i s h i y 锄a 等，2 0 0 3 ) ，但对干旱的抵御 能力上却大大强于拟南芥。这种植株结构简单，易于培养；单倍的配子体在生活 史中占优势；干旱抵御能力强；并且目前已经成功进行基因敲除( r e s 】d ，2 0 0 3 ) ， 这些优点使得小立碗藓成为植物功能基因组学研究的重要模式植物。然而，迄今 为止，人们对小立碗藓抵御干旱的分子机制的科学理论严重缺乏，对其中蕴含的 首都师范大学硕士论文 干旱应答基因和蛋白质的分离鉴定就显得十分迫切。针对现状，本研究从生理学 入手，利用当前最先进的蛋白质组学研究技术，研究小立碗藓干旱应答蛋白的分 离和鉴定问题，提出植物干旱应答中可能的新基因和新蛋白，服务于提高作物抗 旱性的遗传改良工程。 一、小立碗藓的分布状况及生活史 苔藓是地球上最古老的陆生种群之一，大约起源于5 亿年前( h e 幽m 姐等， 2 0 0 1 ) 约有2 3 0 0 0 种。小立碗藓属于葫芦藓科立碗藓属，其分布非常广泛，无论 高山、平原还是极冷的南极地区，酷热的热带地区，甚至少有植被的沙漠地区， 都有其分布( k e n r i c k 等，1 9 9 7 ；n i c k f t 等，2 0 0 0 ) 。作为最早的陆生植物之一， 并有如此广泛的分布，苔藓必然承受了无数极端环境的考验，包括强紫外线的照 射、温差的巨大变化和缺水。苔藓能幸存至今正是因为对这些极端生境有很强的 抗性，因此被称为极端生境的先锋植物。 小立碗藓的生活史以能够进行光合自养的单倍体配子时代占优势，孢子体寄 生在配子体上。单倍的配子体阶段又被分成两个截然不同的阶段：原丝体和茎叶 体阶段。原丝体阶段的丝状结构由绿丝体和轴丝体细胞构成，这些细胞由顶端生 长点和顶端分生组织或次顶端细胞发育而来，是单层细胞结构。茎叶体有能进行 光合自养的无输导组织的茎组成，茎上生有叶、生殖器官以及从茎的底部生出的 丝状假根( r e s l 【i ，1 9 9 8 ) 。典型的苔藓生活史开始于单倍的孢子体，由孢子体 萌发产生原丝体，原丝体先由顶端细胞经一系列分裂形成的绿丝体细胞组成。绿 丝体顶端细胞经过转变，继续分裂形成轴丝体。轴丝体和绿丝体的次顶端细胞进 行有限次数的分裂形成侧枝。很多侧枝在强光条件下发育成绿丝体，其他发育成 轴丝体和芽。至此苔藓的生长从二维原丝体生长转变成三维的植物体生长，进入 茎叶体阶段。芽继续生长产生配子和配子囊，苔藓有雌雄异株和雌雄同株的，精 子器成熟后顶端裂开，精子溢出体外，借助水游到颈卵器附近，进入颈卵器，与 卵子接合，形成合子，合子在颈卵器内发育成胚。胚逐渐分化形成蒴柄和孢蒴。 蒴柄深入母体形成基足吸收养料，蒴柄上长有孢蒴，每个孢蒴中产生大量二倍体 孢子。二倍体孢子细胞经过减数分裂形成单倍体孢子。像这样形成苔藓的生活史 循环。下图是小立碗藓的生活史( s c h a e f c r 等，2 0 0 1 ) 。 2 首都师范大学硕士论文 图1 1 小立碗藓的生活史蚴e f e r 等，2 1 ) n 鲥n 1 1t 1 i ei 洫叫eo fp y s m 批朋细 二、小立碗藓具备最原始的耐旱机制 耐旱性对于绿色植物的生殖体系是很普通的现象，比如花粉粒、孢子以及种 子，在它们的原生质体几乎完全失水( 失水达9 0 ) 的条件下仍然能存活并且复 水后能恢复正常生长发育。然而，植物体营养器官能从严重脱水胁追下幸存的并 不多见( 0 h v 盯m j 等，2 0 0 0 ；b e w l e yj d 和k r o c h l 【0j e ，1 9 8 2 ；0 u v 盯m j 和b c w l e y j d ，1 9 9 7 ；p c i r e m b s 】【is 和b a r c h l o nw ，2 0 0 0 ；p r o c t o rm c f 和p 如v c ，2 0 0 2 ； p r o c 衄mc f _ 和t i l b az ，2 0 0 2 ) 。在开花植物中，大约只有3 0 0 种植物的营养器官 能耐旱( p c 鹏m b s l 【is 和b a r t h l o t tw ，2 0 0 0 ；p 1 0 l c c o rm 咖p e n c ev c ，2 0 0 2 ) 。最 近，生物系统发生学研究发现在生物进化过程中，维管植物丢失了像苔藓那样营 养器官能耐旱的性能。苔藓的结构简单可限制水分流失并调节植物体温度( a l p c r t p 和o e c h e lw c ，1 9 8 7 ；a 啪e ，1 9 5 2 ；d i l l 【st j 翻铂p r o c t o rm c f ，1 9 7 6 ：kj a 和s t e w a r tg r ，1 9 7 4 ；n o 仃m ，1 9 7 4 ) 。鉴于苔藓简单的生理构造，一旦体内的 自由水从植物体表面散失，进行光合作用的组织的含水量就能快速地与外界环境 中的水势达到平衡。也就是说，苔藓感受失水比那些结构相对复杂的羊齿类或是 3 首都师范大学硕士论文 被子植物要快的多。事实上，苔藓所能耐受的干旱程度对于蕨类或是开花植物是 致死的( b e w l e yj d 和勋d c h k oj e ，1 9 8 2 ) 。有报道说当细胞水势降到1 5 m p a 左 右时，大多数植物的叶片会萎蔫，而当水势低于1 5 m p a 时植物体会死亡，但是， 苔藓能够在水势低于1 5 0 m p a 时存活( g 世，1 9 9 7 ) 。f r 姐k ( 2 0 0 5 ) 研究发现在 2 0 小时内，小立碗藓丧失了体内9 2 的自由水再恢复到正常培养基上仍然能存 活，即使其叶绿素含量不再能恢复到正常水平。苔藓原生质体的水势与外界环境 能快速达到平衡，这与被子植物耐旱形式有着极大不同( 0 岫v e rm j 和b 唧l e yj d ， 1 9 9 7 ) 。苔藓所表现的耐旱特性是组成型表达的( 0 h v 盯m j 和b c w l e yj d ，1 9 9 7 ， b e w l e yj d 和0 h v e rm j ，1 9 9 2 ) ，这种耐旱方式是植物最原始的耐早形式，已经 引起了研究者的关注( 0 h v e rm ，等，2 0 0 0 ) 三、干旱引起小立碗藓细胞的生理反应 干旱对植物的影响，实际上就是对组成植物体的基本结构单位和功能单位 的细胞的影响。b e w l e y 和o n v 盱( 1 9 9 2 ) 曾概括了植物或植物组织能在脱水胁 迫下存活的两个基本要素，即保护细胞的完整性和修复脱水( 或复水) 导致的细 胞损伤。所有植物都会利用这两点来保护自身，只是不同物种利用的程度和方式 不一样。从对植物种子和被子植物的耐旱研究发现，它们是依靠诱导的细胞保护 机制来抵御水分胁迫( b a n c k 和n e l s ，1 9 9 4 ；b a n e l s 等，1 9 9 3 ；b e w l e y 等， 1 9 9 3 ；b e w l e y 和o h e r ，1 9 9 2 ；b u r k e ，1 9 8 6 ；a o 等，1 9 9 3 ；q o w e 等，1 9 9 2 ； d u ，1 9 9 3 ；g a 伍，1 9 8 9 ；【舶p o l d 等，1 9 9 2 ；0 啦v 盯和b e w l e y ，1 9 9 7 ) 在干旱胁迫下，种子植物中会发生渗透调节物质含量的变化。如脯氨酸含量 会明显升高( s t r i z h o v 等，1 9 9 7 ；h 蹦衄等，1 9 9 r 7 ) 还有一些可溶性糖也会发生 变化( g e i g e n b e r g e r 等，1 9 9 9 ；p n s m i t s 等，1 9 9 5 ) 。f h n l 【( 2 0 0 5 ) 对小立碗 藓进行多种非生物胁迫，再通过c q am 跏a m y s 的方法发现在不同的胁迫生 长条件下一些基因抵御胁迫时会上调。小立碗藓的两个c d n a 片断与大肠杆菌的 b c 暖基因同源，在干旱处理时被诱导上调。该基因编码的蛋白质是胆碱脱氢酶， 能够催化胆碱氧化成甜菜碱醛，并进一步催化氧化成甜菜碱。另外还发现在干旱 处理小立碗藓上调表达的c d n a 所编码的蛋白质中有另一种渗透调节物相关的 酶，它与水稻中的1 吡咯啉5 羧酸合成酶同源，是与脯胺酸合成途径相关的一个 4 首都师范大学硕士论文 酶。当然此类酶的上调表达是否决定了苔藓体内相应渗透调节物含量的增加，尚 需检测生理上的数据来印证。 目前对于苔藓在脱水过程中产生的氧化损伤及其保护机制研究较多。研究发 现干旱胁迫造成的氧化性损伤导致多种类型的细胞损伤，主要的有巯基蛋白氧化 变性、色素减少、光合系统损伤( 特别是在光照条件下) 、脂质过氧化以及膜上 游离脂肪酸的积累( m c l 【i 懿i e ，1 9 9 1 ；s m i r n o 任，1 9 9 3 ) 。保护机制有两种类型， 且二者协同作用( s m i r n o 西，1 9 9 3 ) 。第一种机制是减少脱水产生的自由基数目， 包括一些酶，如过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物岐化酶等。第二种机制就是 再生一些抗氧化剂复合物如v c 、v b 、类胡萝卜素和谷胱甘肽( g s h ) 已有报道发现对耐旱苔藓脱水处理时会引起巯基酶类的氧化失活，这种损伤在于 燥状态下明显持续加重，但在添加了谷胱甘肽( g s h ) 后有所缓解，萎蔫现象能 被减轻( s 唧佛k c ，1 9 7 2 ) 。缓慢干旱山墙藓会导致大约3 0 的g s h 氧化成 g s s g ( 血d s a ，1 9 8 7 ) ，表明干旱胁迫导致苔藓抵御氧化损伤的能力减弱了。 k 研究还发现在对苔藓进行快速干旱时，干旱本身并不引起g s h 氧化，g s s h 的量 不会增加( d h i n d 鼢，1 9 8 7 ) ，但在复水的过程中g s s h 的量明显增加。而在干旱 处理墙藓( z 埘阳距向删妇) 时并不引起g s h 减少( s e e l 等，1 9 9 2 a ) 。这些看似相 互矛盾的结果可能反映了不同耐旱植物采用不同的机制来抵御氧化性损伤。s c c l 等( 1 9 9 2 a ) 还发现z 朋阳螂删妇在被干旱处理的过程中v c 含量下降。与山墙藓 p 对比，对于这种苔藓可能保持g s h 的含量在一个较高的水平是一种更为重要的保 护机制。在脱水的过程中，z 删阳珂b 堋西还能维持的含量，而在其它不耐旱 物种小曲尾藓( 咖以e 砌卵丘枷啬) 当中是消耗殆尽的。说明一些其它的抗 氧化剂比v c 或g s h 更为重要( s c e l 等，1 9 9 2 a ) 。 在苔藓受到干旱胁迫时还会发生脂质过氧化。s c c l 等( 1 9 9 2 b ) 通过测定一 种脂质过氧化的指示剂丙二醛( m a l 衄d i a l d e h y d c ，m d a ) 的含量，说明在非耐 旱苔藓d 即黼中，干旱处理时脂质过氧化，但在耐早苔藓z 埘阳脚缸中并 未发现。不论是在复水或是脱水的配子体当中，不耐旱苔藓脂质过氧化的程度都 比耐旱苔藓高出5 6 倍。s t e w a r t 和b e w l e y ( 1 9 8 2 ) 发现在干旱处理山墙藓时， 一种脂质过氧化酶的活性下降，并指出这可能是耐旱苔藓中存在的特有保护机 制。 5 首都师范大学硕士论文 四、小立碗藓抗旱的分子机理 对苔藓研究表明，在苔藓中的抗逆信号途径及基因的表达情况与种子植物相 比，有共同之处也有很大的差异。近些年研究发现小立碗藓的很多基因在干旱处 理时会诱导上调表达，如表1 1 。 表1 1 干旱诱导表达的基因 h m e1 1g 蛐龆唧髓龉i o n 组山l c e db ，d e h y d n t 蕾o m 6 首都师范大学硕士论文 作为植物抗逆信号途径的中介一a b a ( r o d 【和q i l a 眦o ，1 9 9 4 ；1 9 9 5 ) ， 在苔藓中的研究发现，内源朋l 气在干旱胁迫下诱导上调，从而促进苔藓抗旱，外 源施加地也有利于提高苔藓对干旱的耐受程度( w 甑e r 等，1 9 9 1 ；m i m m i 等， 2 0 0 4 ) 在干旱处理丑船如缸m 坍并对其复水的过程中，使用叶绿素荧光测定外 源a 】b a 对于光系统的影响，发现舢弘参与干旱胁迫的信号转导途径并促进苔藓 抗旱( r i c h a r dp 等，2 0 0 0 ) 。w b 地舯gf h n l 【等( 2 0 0 4 ) 对小立碗藓进行非生物 胁迫，通过c d a n 微阵列技术( c d n a m a c m a m y ) 鉴定了1 9 个干旱诱导上调表达 基因。其中印a ”灯是与水稻的伪a ”腿因同源( s 确。等，2 0 0 0 ) ，编码一 个钙依赖的蛋白激酶，该基因对外源a b _ 锣已反应，表明该基因的上调表达不依赖 于a b a 。基因唧l ( 瑚4 7 和印rz m g 一尸：；，在外源j 忸诱导下上调表达，表 明干旱诱导的信号转导途径与依赖于a b a 的胁迫反应有交叉。即c d 刚7 是与拟 南芥的群7 基因同源( s 确。等，2 0 0 0 ) ，编码一个i e a 1 妣蛋白，r 聊g 1 4 p ， 在大麦当中编码一个叶绿体的氨基酸选择性通道蛋白( b a l d i 等，1 9 9 9 ) 。总体 上看来，舢3 a 在苔藓当中的研究还不是很清楚，a 】b a 感知和应答胁迫信号的功 能还有待讨论。 l 尉基因在种子植物当中只在胚胎发生后期种子中特异性表达( g a l 卸等， 1 9 8 6 ) ，根据l 尉基因表达产物氨基酸序列的不同，u a 蛋白有多种类型，且不 同类型u a 蛋白的特性及表达模式各不相同( d u r c 等，1 9 8 9 ；c 1 l m i n g ，1 9 9 9 ) ， 但在小立碗藓当中只发现了1 型l 王渔蛋白，目己以基因在小立碗藓中只有一个拷 贝( u k 0 勋m i 辄g i 等，2 0 0 5 ) 。1 型u a 蛋白具有高度亲水性，能把足够的水分 捕获到细胞内，从而保护细胞免受干旱胁迫的伤害。因此，1 型u 狐蛋白与植物抗旱 有着密切的联系。在高等植物中，通过b z i p 型转录因子与顺式作用元件结合在转 录水平调节k a 基因表达。b z i p 型转录因子与基因的a b r e 元件相结合诱导其表 达，臃元件包含a c g t 这个核心序列( q u a t 砌。等，1 9 9 7 ) ，在小麦的的e m 启动子区含两个a c g 哜列，在小立碗藓的1 型点基因只含有一个a c g t 序列 ( u k o 皿i s u g i 等，2 0 0 5 ) 。干旱处理小立碗藓时，厶翻基因在转录水平上有 上调( u k 0 m l i 辄g i 等，2 0 0 5 ) 。m i n 锄i 等( 2 0 0 吣认为l e a 蛋白在进行干旱复 水时，对山墙藓质膜的修复起到很重要的作用。 在高等植物遇到水分胁迫时会积累很多蛋白质，除了l 正渔蛋白还有 7 首都师范大学硕士论文 d e h v d 血s ( d h n s ；a o s e ，1 9 9 7 ；s v c 璐s 等，2 0 0 2 ) 。d m 妇家族根据它们保 守的氨基酸序列被分成5 个亚家族，这些氨基酸序列形成y 、s 和k 片断( a o s e ， 1 9 9 7 ；s v e 璐s 帆等，2 0 0 2 ) 。在胁迫的过程中，d h n s 在大多数组织和细胞中积 累，并且大多数定位于植物细胞的质膜和核上，但发现一些d 玎地与叶绿体 ( m u e u e f 等，2 0 0 3 ) 、线粒体( b o r o v s l 【i i 等，2 0 0 2 ) 和液泡膜( h e y e n 等，2 0 0 2 ) 也有相互作用。研究还发现一些d i 玎地在根尖细胞、开放的气孔和维管组织的外 周细胞中组成型积累，表明在非胁迫的条件下这些蛋白质可能在一些特殊的细胞 或组织中起着重要作用( n y l 距d c r 等，2 0 0 1 ) 。迄今为止的研究发现d 皿啦存在 于所有较高等的植物当中，包括被子植物和裸子植物( c 1 0 辩，1 9 9 7 ) 。但是在较 低等的植物中存在这种类似蛋白质的报道还比较少( v c l t 和o h v e r ，2 0 0 1 ) 。 l 棚ms a a v e d m l 等( 2 0 0 6 ) 使用b 妇t h 锄和w 融锄技术发现在用a b a 、n a a 或甘露醇处理小立碗藓时p p d m 忱有很明显的上调，证明小立碗藓中的 p p d m q a 与其他较高等植物中的d h n s 有着相似的功能。为了进一步研究在小 立碗藓中d 她与渗透胁迫的关系，又通过同源重组的方法对d 聊啊基因进行 了敲除，得到突变体砌以。对突变体的生长及胁迫反应进行研究发现，在盐和 渗透胁迫处理后d i l 叫拯救植物恢复正常生长的能力大大减弱了。因此提供了强 有力的遗传学证据证明对于任何经受细胞脱水处理后恢复到正常生长条件下的 植物，d h n s 都起到直接的保护作用。 近十年研究发现有许多基因与植物抗旱相关( s h i l l o z a l d 等，2 0 0 0 ；z h u 等， 2 0 0 2 ；s h i n 睨a l i 等，1 9 9 9 ；) ( i gl 和z h u ，2 0 0 2 ；x i o n gl 等，2 0 0 2 ) ，一些 影响植物抗逆性的重要基因已相继被鉴定和克隆。通过对拟南芥等种子植物的研 究发现干旱诱导基因的表达模式非常复杂，在水分胁迫下有些基因快速表达，也 有些基因在内源植物激素a b a 积累到一定程度才表达。因此将干旱胁迫下基因 的表达调控分为a b a 依赖型和非地依赖型( s h i n o z a l 【i 和 y a m a g l l c h i s h i | 1 0 z a l 【i ，1 9 9 6 ；b m y 等，1 9 9 7 ) 。研究苔藓抗逆基因的表达情况以 及信号传导途径，可以为研究抗逆基因在陆生植物进化过程中所起到的作用以及 基因进化奠定基础，并为研究植物细胞能够抵御环境胁迫的决定性机制提供依 据。 8 首都师范大学硕士论文 五、小立碗藓的蛋白质组学研究进展 现在已经证明，一个基因并不只产生一个相应的蛋白质，它可能会产生几个， 甚至几十个蛋白质。有机体所处的不同环境和本身的生理状态差异，会导致基因 转录产物有不同的剪切并转译成不同的蛋白质。蛋白质再进行各种加工修饰和转 移定位，才具有活性和生物功能，承担相应的生理作用，适应生存环境。正所谓 蛋白质才是基因功能的体现者和执行者。因此仅以基因组水平很难认识生命活动 的全部过程，还需要借助蛋白质组学研究才能真正认识生命的活动规律( b a d e rg d 等，2 0 0 3 ) 。 2 0 世纪9 0 年代中后期，功能基因组学( 缸删i o n a lg c 嗍i c s ) 成为研究的重 心，反向遗传学途径占据了功能基因组学的重要位置。但是，不论是在m q a 水平 还是直接进行基因敲除来研究基因的功能，都有其不可避免的不足之处。事实上 超过8 0 的突变体在表型上并没有任何变化，即使表型上有变化也不能说明是某 一个基因作用的结果( e 疵s 锄i g h a u s 胁等，2 0 0 4 ) 。因此反向遗传学途径研究 基因功能存在一定的局限性。而蛋白组学( 舯d “舳i c s ) 则是其“中流砥柱”。2 0 0 1 年n a t u r c 、s d e n c c 杂志在公布人类基因组序列草图的同时，分别发表了题 为“a n dn o wf o r t h ep r o t c o m e ”、“p r o t e o m i c si ng e m el a n d 的述评和展望，将蛋 白质组学的地位提到前所未有的高度，认为它是功能基因组学前沿研究的战略制 高点。 在陆生植物当中小立碗藓已经被成功进行基因敲除( h 0 h e 和r 酷l d ，2 0 0 3 ) ， 因此成为植物功能基因组学的重要模式系统。人们对小立碗藓突变体的研究已经 取得了一定进展，为了进一步反映其体内参与复杂调控机制网络基因的功能，蛋 白质组学研究势在必行。 5 1 蛋白质组与蛋白质组学 蛋白质组( p r o t e o m e ) 一词是澳大利亚m a c q _ u a r i e 大学的w i l k i 璐和w 皿锄s 在1 9 9 4 年首次提出，第一篇原始论著1 9 9 5 年7 月发表于e l e 咖帅i s 杂 志。蛋白质组学是研究在特定时间或环境下一个细胞、组织或完整的生物体所表 达的全部相应的蛋白质的科学( l l n e t ，2 0 0 0 ) 。从基因到m 】州a 再到蛋白质， 9 首部师范大学硕士论文 最后能体现生命功能的是蛋白质，基因组决定了细胞的遗传特性，但是基因的遗 传信息最终要通过蛋白质的功能来表达。蛋白质组与基因组有着紧密的联系，生 物的蛋白质组由基因组表达而来，因此蛋白质的鉴定必须依据公共数据库中的基 因组信息( k e n t 等，加0 2 ) 。 5 2 蛋白质组与基因组的关系 基因是遗传信息的携带者，蛋白质则是生命活动的执行者，实际上每一种生 命运动形式，都是特定蛋白质群体在不同时间和空间出现并发挥功能的结果，因 而蛋白质组研究是我们理解细胞功能和生命发生发展过程的中心环节，如果不能 共同致力于蛋白质组的研究，那么基因组的研究成果将无法兑现( b 0 i x 等，2 0 0 2 ) 。 基因组学研究的成果是目前已积累了大量的d n a 序列信息，这与各种蛋白 质数据库一起，为蛋白质组学研究奠定了基础。实际上，基因组学和蛋白质组学 是分子生物学研究的不同层次，两者之间互相补充、互相促进。( 图1 2 ) 图1 2 蛋白组学与基因组学的关系( 灰色部分为蛋白组学研究方法，2 d e 为双向凝胶 电泳，m s 为质谱) ( b i 唧2 0 毗) n 扣m 1 - 2 0 瑚哪旺n 瞎p b 缸p m 劬妇a n d 也e i r 础廿伽如群m h ( a p p m 扯h s ，w m c h 删他山枷b 胡血m h 舶v j e w 王n 瑚阳埘a i l 哦c o l o u 删d a r k g r e y 2 d e 咖d i m e 衄蛔a le i 咖p h o 他出；m s ，m 嘲s 弹曲m 珊e n 了) 首都师范大学硕士论文 5 3 蛋白质组学基本技术 蛋白质组学研究分析的技术主要有：用于蛋白质分离的双向凝胶电泳技术 ( 2 n p a g e ) 、用于蛋白质鉴定的e d m 趾降解法测n 端序列技术、质谱技术( m a 鼯 s p e c 虹o m 哪，m s ) 、用于蛋白质相互作用的酵母双杂交系统( y e a s t 细m h y b r i d s y s t e m ) 、蛋白质芯片( p r o t c i nc h i p ) 以及生物信息技术等。通常有三个步骤： 第一，应用2 d b 技术分离样品中的蛋白质；第二，应用质谱技术或n - 端测序技 术鉴定2 - d e 分离的蛋白质；第三，应用生物信息学技术存储、处理、比较获得 的数据。双向电泳技术、质谱技术以及计算机图象分析与大规模数据处理技术仍 为目前蛋白质组学研究的三大基本支撑技术。 5 3 1 双向凝胶电泳 双向凝胶电泳( 锕乎d 硫腻n a le l 咖h o r 鹪i s ，2 - d e ) 是蛋白组学研究中 的核心技术之一，是目前常用的一种能够连续在一块胶上分离数千种蛋白质的方 法，广泛应用于生物学研究的各个方面。2 d e 是由o f a r r e u 于1 9 7 5 年提出的。 其基本原理是：首先等电聚焦( i s o c l e c 岫cf o 哪i n g ，m f ) 将蛋白质沿p h 梯度 分离至各自等电点( i s o e l e c t r i cp o i n t ，p i ) ，通过电荷分离蛋白质；然后沿垂直的 方向进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( s o d i 岫d o d e c y l 札l p h a t c p o l y a c r y l 锄i d eg e le l c c 仃0 p h o r e s i s ，s d s p a ( 、e ) ，通过分子量分离蛋白质。所得 蛋白质二维排列图中每个点代表样品中一个或数个蛋白质，而蛋白质的等电点、 分子量和在样品中的含量也可显现出来( g o r g a 等，2 0 0 0 年) 。 蛋白质二维凝胶电泳利用了蛋白质两个彼此不相关的重要性质对其进行分 离，因此分辨率非常高，一般可分离1 0 0 0 3 0 0 0 个蛋白质，最好的凝胶可分辨 出1 1 0 0 0 个蛋白质点，p i 差别小于0 0 0 3 个p h 单位即可以被分辨，是目前最好 的蛋白分离方法( a l i s o n a ，1 9 9 9 ) 。但目前2 - d e 技术尚未完善，存在许多局 限性如手工操作较多，经验性强，重复性差，疏水蛋白、低表达量蛋白、极酸和 极碱性蛋白、分子量较小和较大蛋白的分离较为困难，高通量自动化尚未达到等。 1 1 首都师范大学硕士论文 5 3 2 生物质谱技术 在蛋白质组学研究流程中，蛋白质鉴定是最关键的一环。生物质谱技术 ( b i 0 - m a 鹳s p e c 胁m e 缸y ) 以其极高的灵敏度和获得结果迅速性使它正成为蛋白 质鉴定分析的主要支撑技术。诞生于2 0 世纪8 0 年代末期的两项软电离质谱技术 电喷雾电离质谱( e s i m s ) 和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 ( m a i d i - t o f - m s ) 所具有的高灵敏度和高质量检测范围( 质量数从几万到几 十万) ，使质谱技术真正走入生命科学的领域，并得到迅速发展。 质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间的质荷比( n 妇) 的差异来分离并确定分子量。它主要有三个步骤，首先是通过离子化装置将分子 转化为气态离子，接着通过质谱分析器按照荷质比( m z ) 不同进行分离，最后 转化到离子检测装置。应用生物质谱技术鉴定蛋白质主要是根据蛋白质酶解后的 肽质量指纹谱( p 印傩em a 龉f h l g e 删n t ，p m f ) 和肽序列标签( p c p t i d e q u c ct a 幅， p s t ) 信息进行蛋白质数据库和核酸数据库搜索。 为了满足高通量、大规模蛋白质组研究的需要，新的生物质谱技术不断出 现。串联质谱( t a l l d e mm s ，m s m s ) 可以获得肽段序列信息。m e d z i h 珊i s 呔y 等( 2 0 0 5 ) 发展m a l d i 1 d f t o f 质谱，擅长高能量碰撞诱导解离( c d ) 和高 速扫描，其获得c d 图谱的速度比普通质谱仪高一个数量级。m u d i q t - o f 这 一先进平台的出现，为自动化高通量的应用提供了广阔的前景。q 砌优异的 质量精度、灵敏度和碰撞活化电离( c a d ) 能力改善了数据库搜索结果，并使其 成为手工测序的有力工具。傅立叶变换离子回旋共振质谱( n i c r m s ) 这一新 技术，可以提供极高的灵敏度和分辨率，质量准确度可优化l 1 0 6 ，这使得它可 以在一次分析中对数百个完整蛋白质分子进行质量测定和定量分析。同时质谱技 术还可用于蛋白磷酸化、硫酸化、糖苷化以及其它一些修饰的研究。 5 3 3 生物信息学 蛋白质组的信息主要包括蛋白质的性质、结构与功能，这也是当前蛋白质 组学研究的主要任务。蛋白质组的研究要求有自动化处理大规模数据的工具，而