（有机化学专业论文）脂肪酶催化合成糖酯的研究.pdf

中文摘要 酶是一类高效的生物催化剂，脂肪酶( e c 3 1 1 3 ) ，全称甘油三酰酯水解酶， 因其作用底物广，对温度、有机溶剂的耐受性好，适合用于有机合成的研究。脂 肪酶催化合成糖酯的反应条件温和、区域选择性好，但是目前用于合成糖酯研究 的脂肪酶大都价格昂贵，难以大量应用。本文尝试采用一种廉价的脂肪酶c a n d i d a 印进行催化合成糖酯的研究。 实验发现固定化脂肪酶c a n d i d as p 催化活性高，适于催化酯化反应。考察温 度、p h 值、初始水活度、有机溶剂对酶的酯化活性的影响发现：在正己烷中催 化正丁酸与正丁醇的反应，脂肪酶在5 0 活性最高，最适宜的p h 值和初始水活 度分别为8 0 和0 ，脂肪酶在极性较弱的疏水性溶剂中能保持较高活性。 本文采用多相法，以丙酮为辅助剂，成功地用固定化脂肪酶c a n d i d as p 催化 完成了葡萄糖与硬脂酸的酯化反应，对产物的分析表明反应区域选择性生成葡萄 糖单酯，与文献报道采用其它脂肪酶催化的结果相似。文中详细考察了各种反应 条件对转化率的影响，实验发现，l m m o l 葡萄糖与l m m o l 硬脂酸反应的最适条 件为：温度3 5 ，初始水活度0 7 5 ，0 4 9 脂肪酶作催化剂，2 m l 丙酮为辅助剂， 0 8 9 分子筛做吸水剂，剧烈震荡反应4 8 h 后转化率为4 0 4 。进一步研究不同底 物的反应情况发现，脂肪酶对中长链脂肪酸的催化效果较好，但是这种方法只适 用于催化单糖的酯化反应。 对反应初速度和产出速率的研究表明，与采用c a l b ，m m l 等脂肪酶作为 催化剂的反应相比，c a n d i d as p 催化合成糖酯的反应初速度相当，说明脂肪酶 c a n d i d a s p 对糖酯的合成反应有良好的催化能力，但是脂肪酶对有机溶剂的耐受 性差、固定化载体造成传质困难等因素导致产出速率较低。 采用以乒乓机制为基础的动力学方程研究了脂肪酶催化糖酯合成的反应动 力学，拟合曲线与实验数据符合得很好，动力学参数显示酶的酰化过程是反应的 控制步骤，但是反应过程中酶的表观活力迅速下降。 关键词：脂肪酶糖酯c a n d i d a s p 动力学 a bs t r a c t l i p a s e ( e c 3 1 i 3 ) p r i m a r i l yr e s p o n s i b l ef o rt h eh y d r o l y s i so fa c y l g l y c e r i d e s ，i s w i d e l yu s e di no r g a n i cs y n t h e s i sa st h e yc a na c c e p taw i d er a n g eo fs u b s t i t u t e sa n da l e q u i t es t a b l e i n n o n a q u e o u so r g a n i cs o l v e n t s av a r i e t yo fl i p a s e sh a v e b e e n s u c c e s s f u l l yu s e dt oc a t a l y s et h er e a c t i o nb e t w e e ns u g a ra n df a t t ya c i d sb u tt h eh i i g h p r i c e so fl i p a s ep r e v e n tt h e mf r o mi n d u s t r i a lu s e al i p a s et h a ti sr e l a t i v e l yc h e a pi s a p p l i e di nt h i sw o r kt op r o d u c es u g a re s t e r s f i r s ti m m o b i l i z e dl i p a s ec a n d i d as p i ss l e e t e df o ri t sh i g he s t e r i f i c a t i o na c t i v i t y a n dt h ee f f e c t so ft e m p e r a t u r e ，p hv a l u e ，w a t e ra c t i v i t ya n do r g a n i cs o l v e n t so nt h e 翻l l z y m ea c t i v i t ya r em e a s u r e d r e s u l t ss h o wt h a ti tg e th i g h e s te s t e r i f i c a t i o na c t i v i t ya t 5 0 ( 2i nh e x a n e ，ap hv a l u eo f8 0 ，v e r yl o wi n i t i a lw a t e ra c t i v i t ya n dh y d r o p h o b i c c a l lh e l pi tk e c ph i g h e ra c t i v i t y as o l i dp h a s em e t h o d i s a p p l i e dw i t hi m m o b i l i z e dl i p a s ec a n d i d as p a s b i o c a t a l y s ta n ds m a l la m o u n to fa c e t o n ea sa d j u v a n tt oc o m p l e t et h er e a c t i o nb e t w e e n g l u c o s ea n ds t e a r i ca c i d a n a l y s t sc o n f i r m e dt h ep r o d u c ta n ds h o wt h a tm o n o e s t e ri s r e g i o s e l e c t i v e l yp r o d u c e da si sr e p o r t e di nl i t e r a t u r e s p a r a m e t e r sa f f e c t i n gc o n v e r t i o n a 1 1 ee x a m i n e da n dam a x i m u mc o n v e r t i o no f 4 0 4 i sg a i n e di nt h er e a c t i o no fi m m o l g l u c o s ea n dl m m o ls t e a r i ca c i da f t e r4 8 hi n t h ec o n d i t i o no 3 5 c ，i n i t i a lw a t e r a c t i v i t yo 7 5 ，0 4 9a 圪y 功峨2 m la c e t o n ea n do 8 9m o l e c u l a rs i e v ea sw a t e ra b s o r b a n t a c i d sw i t hm e d i u mt ol o n gc a r b o nc h a i n sa r ef a v o r e di nt h er e a c t i o na n do n l yt h e a c y l a t i o no f m o n o s a c c h a r i d e si ss u c c e s s f u l l ya c h i e v e d c o m p a r e dw i t ht h er e s u l t sc a t a l y z e db yo t h e rl i p a s es u c ha sc a l - ba n dm m l ， t h ei n i t i a lr e a c t i o nr a t ei nt h ee x p e r i m e n ti sc o m p a r e a b l e ，s h o w i n gt h ea b i l i t yo f c a n d i d as p t of a c i l i t a t et h er e a c t i o nw h i l et h ep r o d u c t i v i t yi sr e l a t i v e l yl o wm a y b ea s ar e s u l to f p o o ro r g a n i cr e s i s t a n ta n db a dm a s st r a n s f o rc a u s e db yt h ee n z y m ec a l d e r am a t h e m a t i c a le x p r e s s i o nc o r r e s p o m i b l et oas i m p l i f i e dp i n g - p o n gm e c h a n i s m i se m p l o y e dt oe x z a m i n et h ek i n e t i c so ft h er e a c t i o na n di tf i tw e l lt ot h ee x p e r i m e n t a l d a t a r e s u l t si n d i c a t et h ea c y l a t i o no ft h ee n z y m ei st h er a t e l i m i t i n gs t e po ft h e r e a c t i o na n dav e r yr a p i dd e a c t i v a t i o ni sp r e d i c t e db yt h ek i n e t i cm o d e l k e y w o r d s - l i p a s e ，s u g a re s t e r , c a n d i d as p ，k i n e t i c s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨洼盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：氩昂 签字日期：2 汐v 7年6 月，苫日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫鲞态鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫盗盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：趣昂 签字日期：2 口印年6 月，髫日 导师签名：彳 签字日期：夕 日 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 进入2 l 世纪，能源危机、环境压力等加速了碳氢化合物经济向碳水化合物 经济的转变，以生物催化为核心的环境友好、过程高效的生物炼制正在生物基化 学品、生物能源，生物材料等方面发挥着越来越重要的作用，推动着生物技术的 崛起。 现代工业中，科学家们不断的努力开发性能优异的高效催化剂，而在生物界 中，这样的过程已经进行了亿万年，并筛选出了催化效率、选择性远胜人工合成 催化剂的产品酶。如今，科学家们已经可以从自然界中找到对我们有价值的酶 并进行筛选优化，使之更适合我们的需求，来经济高效的完成采用其它方法难以 完成的任务。 1 9 8 4 年有机溶剂中酶催化酯化反应的完成开创了酶催化的新篇章【l 】，到今 天，已经有大量的酶被用于催化完成各种各样的有机反应，脂肪酶就是其中重要 的一种，它主要被用来完成和酯键相关的水解和酯合成反应，具有反应条件温和、 区域选择性好等优点，已被用于油脂工业、药物中间体合成等诸多方面，有的已 经实现工业化【2 】。 表面活性剂是在生产生活中广泛应用的一类化学品，大量合成表面活性剂的 应用给环境造成了很大影响，因此生物表面活性剂因其环境友好、来源广泛等特 点越来越受到科学家的关注。酶催化合成糖酯类表面活性剂的研究就是在这一背 景下兴起的，酶催化方法反应条件温和、选择性好，有机溶剂用量少，是一种极 具潜力的合成糖酯的方法。在这里，首先介绍酶及酶催化的基础知识，然后对糖 酯类表面活性剂的合成方法作了简单的总结。 1 2 酶与脂肪酶 1 2 1 酶的概述 1 2 1 1 酶的认识过程 酶是一种生物催化剂，人们对酶的认识来源于长期的生产和科学研究的实 第一章绪论 践。早在十九世纪末人们意识到在生物体内可能存在一种类似催化剂的物质，并 将这类物质称为“f f f l z y l n c ”，中文译为“酶”，此后人们逐渐认识到酶的本质其实是 一种具有特殊功能的蛋白质。现在已经证明，所有的生物都能合成自身所需要的 酶。然而1 9 8 2 年以后陆续发现某些r n a 也具有酶的催化功能，使人们认识到， 酶不都是蛋白质。 1 2 1 2 酶的定义 现代科学家认为，酶是由活细胞产生的，能在体内或体外起催化作用的一类 具有活性中心和特殊构象的生物大分子，包括蛋白质和核酬3 1 。 1 2 1 3 酶催化反应的特征 酶具有一般催化剂的特征，能够加快化学反应的速度，但并不能改变化学平 衡，同时与化学催化剂相比，酶具有其独有的特钳3 1 。 a 催化效率高。酶催化反应的速率比非酶催化反应的速率高1 0 8 1 0 2 0 倍，比 一般催化剂高1 0 7 1 0 1 3 倍 b 酶的催化活性易受环境变化影响。一般催化剂在一定的条件下就会中毒而 失去催化能力。酶是生物大分子，对环境的变化敏感 c 酶的催化活性可以被调节控制 d 具有高度专一性。酶往往只能催化一种或一类紧密相关的反应，这是酶与 非酶催化剂的重要区别之一 1 2 1 4 酶的催化机理 。 为了揭示酶的催化过程，解释酶催化的种种特征，科学家们提出了很多家说 3 1 。其中主要有锁钥假说( 1 0 c ka n dk e ym o d e l ) ，三点附着假说( t h r e ep o i n t a t t a c h m e n tt h e o r y ) 和诱导契合假说。 1 2 2 脂肪酶 1 2 2 1 脂肪酶概述 脂肪酶( 1 i p a s e ) 是水解酶类的一种，国际命名法为e c 3 1 1 3 ，它的全称是甘 油三酰酯水解酶，其基本功能是催化甘油酯水解为甘油和脂肪酸【4 】。脂肪酶广泛 存在于动物肝脏、植物种子和微生物中。目前商品化的脂肪酶大多来源于微生物， 采用基因工程通过发酵等方法制得的。主要的生产厂家有丹麦的n o v o - n o r d i s k , 荷兰的g e n e n c o ri n t e r n a t i o n a l ，德国的b o e h r i n g e r - m a n n h e i m 等。一些常用的商品 化脂肪酶见表1 1 。 第一章绪论 表1 - 1 几种重要的商品化脂肪酶5 】 坠! 宝! ：! 兰2 罂i 璺磐i r t 弛tc 竺姗婴i a l l y a v a i h b l el i p i 璺：宝i _ 来源代码选择性应用 来源于哺乳动物器官的 h u m a np a n c r e a t i cl i m s eh p l p o r c i n ep a n c r e a t i cl i p a s ep p l 来源于真菌的 c a n d i d a r u g o s a c r l c a n d i d aa n t a r c t i cbc a l b r h i z o m u c o r 小i e h e irm i h u m i c o l a l a n u g i n o s a h l l r h i z o p u sd e l e m a r r d l c a n d i d ac y l i n d r a c e ac c l 来源于细菌的 a n - 1 ，3 s n - 1 ，3 s n - 1 ，3 册一1 ，3 s r l - 1 ，3 有机合成 有机合成 有机合成 奶酪加工 清洁剂 油脂工业 奶酪加工 p s e u d o m o n a sc a p a c i a p c l -。 有机合成 风p 甜如聊d 即砸聊p 疗面c n 口p m ls 刀1 3清洁剂 1 2 2 2 脂肪酶的结构 长期以来，脂肪酶的结构一直是困扰生物学家和化学家的一个谜团。直到上 世纪几十年代初，人们才采用x 射线晶体衍射法测定了两种酶的晶体结构，揭 示了脂肪酶非同寻常的立体结构【5 】：脂肪酶的活性中心存在一个由三个氨基酸 ( 丝氨酸组氨酸天冬氨酸) 组成的三联体，这个活性中心上方有一个螺旋片断， 或者说是一个“盖子”，这个盖子的外表面相对亲水，而其面向催化部位的内表面 则相对疏水。在通常的水溶液当中，活性中心被这个盖子盖住，而在油水界面， 由于界面能的作用，酶的空间构象发生变化，盖子打开，使活性中心暴露在反应 体系当中，这使得底物与酶的结合能力增强，此时底物就很容易进入疏水性的通 道而与活性部位结合，形成酶底物复合物，促进反应进行，这就是脂肪酶为什 么只在两相界面起作用的原因。对酶与底物的共晶体的x 射线晶体衍射分析也 强有力的证明了这一点。 1 2 2 3 脂肪酶的固定化 脂肪酶在油水界面的催化作用使其具有极大的应用潜力，尽管游离酶的应用 技术已经很成熟，但是游离酶不能重复使用，难以实现过程的连续化，同时高温、 极端p h 值、有机溶剂等条件下，游离酶的分子结构很容易被破坏。酶的固定化 第一章绪论 在一定程度上解决了这些问题。目前常用的商品化脂肪酶绝大多数都是固定化 酶，例如丹麦诺维信公司开发的用于有机合成的商品化产品n o v o z y m3 8 8 、 n o v o z y m4 3 5 、l i p o z y m er m i i v i 、l i p o z y m et l1 0 0 l 等产品都是以多孔树脂( 例 如大孔丙烯酸树脂平均孔径1 0 0 2 0 0 r i m t 6 ) 为载体的固定化酶。本人实验中采用 的也是固定在棉布上的脂肪酶。 目前酶的固定化大致分为四判7 】：吸附法、共价法、交联法、包埋法。 a 吸附法 吸附法包括物理吸附和离子吸附，主要依靠蛋白质和载体间的结合力联结， 作用力较弱，酶易脱落，但载体选择范围较广，固定化操作过程简单，吸附法是 经济上最具吸引力的固定化方法， b 共价法 共价结合法是固定化酶研究中最活跃的一类方法。酶蛋白分子上功能基和固 相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接，结合力牢固，使用过程中 不易发生酶的脱落，稳定性能好。缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂，反 应条件也比较强烈所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。 在固定化中所使用的载体可分为有机高分子载体、无机载体和复合载体三大类 c 交联法 交联法的主要特色是用多功能试剂进行酶蛋白分子之间的交联，基本原理是 酶分子和多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网架结构。多功能试剂制 备固定化酶方法可分为：( 1 ) 单独与酶作用；( 2 ) 辅助蛋白质与酶共存时，多功能 团试剂交联；( 3 ) 酶吸附在载体表面上再交联；( 4 ) 多功能团试剂与载体反应得到 有功能团的载体，再连接酶。最常用的交联试剂是戊二醛。这类方法的优点是酶 与载体结合牢固，不易脱落，稳定性较高，试剂价格低廉，固定化成本低；缺点 是有的方法固定化操作较复杂，进行化学修饰时易造成酶失活， d 包埋法 包埋法是将酶物理包埋在高聚物内。这种方法反应条件温和，很少改变酶结 构。适用于大多数酶、酶制剂及完整的微生物细胞，但只有当底物和产物都是小 分子的条件下适用由于采用包埋法固定化酶时，酶被完全地限制在微囊或凝胶 内，本身的性能根本不发生变化，酶的活性不会受到影响。 除了上述几种传统的酶固定化方法，其它的新型固定化方法【8 】如通过辐射、 光、等离子体、电子等新方法制备高活性固定化酶；采用酶的定向固定化技术可 以提高酶的固定化量，同时使酶的活性位点充分暴露，提高固定化酶的催化活性； 多酶固定化技术把不同来源的酶与整个细胞的生物催化性能相结合，实现多酶共 固或整个细胞的固定化，充分发挥了不同酶各自的优势。这些方法已经日益受到 第一章绪论 研究者的重视 目前，固定化酶技术已成为酶工程研究的重点和热点之一。研究探索新的酶 固定化技术( 如流体聚合包埋技术、纳米粒子原位共聚包埋等) 、提高固定化酶活 性收率、延长半衰期、降低成本将成为固定化酶研究领域的主要研究内容。充分 利用具有适宜生物相容性及亲水性的天然载体、运用当代高新技术对天然载体修 饰改性以及开发合成性能优良的新的酶固定化载体材料、研究高分子材料与特定 无机材料的复合材料以及合成酶固定化智能载体材料等将是固定化酶载体材料 今后发展与应用的方向。 1 2 2 4 脂肪酶的催化机制 脂肪酶是丝氨酸水解酶，遵循一个乒乓反应机制( 图1 1 ) 。在催化时，一个 酰化酶在酰化步骤时形成，在这里丝氨酸的羟基是由酰基供体( 第一个底物， l 屺o o r ，) 来酰化的，然后释放出第一个产物( h o r ) 。酰基受体( 第二个底物， h o r ”) 再在脱酰化步骤与酰基酶作用形成第二个产物( r c o o r ”) 和自由酶。 这两个过程均经过了酶一底物复合物这一中间体。在自然反应中，酰化受体是水， 但原则上可以是其它任何亲核试剂。 o o r ：l o r + h o e n z = = = = 富= r 八or h o e n z 酶一底物复合物 o r 八0 r ”+ h o e n z o l | h o r a e n 酶一产物复合物 d h o r 酰化 d 儿e n z 靴酶 “o 彤脱酰化 图1 - 1 脂肪酶的催化机制9 】 f i g u r e1 - 1t h ec a t a l y t i cm e c h a n i s mo f l i p a s e 在水中被乳化的酯的酶法水解不服从简单的米氏动力学。水不溶性底物的水 解涉及脂肪酶在底物水界面的吸附。在许多情况下，该吸附与酶的构象变化相 关。因此，其反应速率是水溶性脂肪酶对界面的吸附平衡的函数，依赖于整个界 面的面积。当底物是可溶的，在有机溶剂中脂肪酶也是活泼的，在这样一个体系 中，可以忽略吸附步骤来简化动力学，从而可以使用通常酶动力学模式 1 2 2 5 脂肪酶催化的反应类型 在自然界中，很多中动植物都以甘油三酰酯的形式储存能量，脂酶( e s t e r a s e ) 第一章绪论 是动植体内用来水解这一类物质的酶类，脂肪酶是一种特殊的酯酶，它只在油水 界面起作用。与其它的酶类相比，脂肪酶所能催化的底物范围广，而且对有机溶 剂的耐受性更强，可以催化多种类型的反应，所以具有更大的应用潜力。脂肪酶 催化的反应类型可以分为： a 水解反应 脂肪酶的基本功能是催化甘油三酰酯的水解，同时一系列不同分子量的酯、 硫醇酯、聚酯等都可以作为酶催化水解反应的底物。脂肪酶催化油脂的水解也是 目前脂肪酶最广泛的应用领域。 b 酯合成反应 脂肪酶的基本功能是催化酯的水解，但是这一反应的自由能很小，接近 0 k j m o l 4 ，所以反应平衡受反应物浓度影响很大，通过改变反应条件，如在无水 体系或有机溶液中可以很容易的使水解反应发生逆转，进行水解的逆反应即酯化 或酯交换反应。 脂肪酶催化的反应可以分为酯化、酯交换、酸解和醇解反应，其中后三种又 可以统称为转酯化反应，另外除了催化酸与醇的酯化反应外，还可以催化酰胺的 合成。 h y d r o l y s i s r c o o r + h 2 0 = r c o o h + r o h s y n t h e s i s r c o o h + r o h = r c o o r 。+ h 2 0 r c o o r + r ”c o o r ；= = r c o o r + r ”c o o r r c o o r + r - o h = ；皇= r c o o r ”+ r o h r c o o r + r ”c o o h ；= r ”c o o r + r c o o h 图1 - 2 脂肪酶催化的反应类型【1 0 】 f i g u r e1 - 2l i p a s e - c a t a l y z e dr e a c t i o ns t y 7 l e s 1 3 脂肪酶的应用 1 3 1 脂肪酶在工业中的应用 1 3 1 1 脂肪酶在烘烤中的应用 脂类是人们了解和使用时间最长的面包改进剂，而脂肪酶最近才被用作面包 - 6 第一章绪论 改进剂。对脂肪酶功能的研究一直在进行着，但大部分都是基于脂类在生面团和 烘制过程中的作用。使用脂肪酶可以获得理想的效梨1 1 】，如提高生面团的稳定性、 改善生面团的处理性质、提高气空的稳定性，从而获得漂亮、均匀的面包心结构 和较大的面包体积。 脂肪酶修饰面粉中原有的或添加的脂类，而所添加的脂肪酶是否有益则取决 于水解产物的作用。某些水解产物具有相当的表面活性，或者比未经修饰的脂类 有更好的表面活性，因而使生面团具有更加稳定的气孔。这样也会获得更好的面 包心结构并增加生面团的稳定性和产品的体积。在所有可能的反应产物中，但甘 油酯是众所周知的烘制过程中的面包心柔软剂，因为他们可能与淀粉形成复合体 从而减少退化，而脂肪酶正是可以催化产生这类物质。 除以上几点外，脂肪酶对面团还有较好的面团调理功能，使面团操作性更好， 与其他酶制剂如葡萄糖氧化酶等复配有更好的协同增效作用，能使面包体积更 大，急胀更好，组织更细腻。 1 3 1 2 脂肪酶在乳制品中的应用 脂肪酶在乳品中的应用主要是在干酪生产中，用于加速干酪的成熟 1 1 1 。s o o d 曾在碎凝乳中添加解脂酶m y ( m e i t o ，j a p a n ) 发现，添加解脂酶的企达干酪游离挥发 性脂肪酸含量远较未添加的高，挥发性游离脂肪酸含量随成熟期延长而升高。米 曲霉中分离的脂酶添加到干酪中可使干酪风味发展很快，但需和蛋白酶共同作用 才能使干酪的风味平衡。h u i n g 曾用米黑毛霉的脂酶对两种风味截然不同的意大 利干酪f o r t i n a 和r o n a n o 的影响做了研究，使用脂酶的比对照的风味评分高5 倍 之多。 现在的干酪生产一般都是同时添加蛋白酶和脂肪酶，以促进干酪的成熟，使 干酪产生出其特有的风味，还可以缩短成熟时间，提高生产效率。 1 3 1 3 脂肪酶在油脂工业中的应用 脂肪酶是目前油加工领域应用最为广泛的一种酶【2 1 1 1 ，脂肪酶分解油和脂肪 的特性，使得其可以利用特殊的脂肪酸生产油和脂肪产品，脂肪酶还可以将脂肪 酸重排，进而获得具有其它物理性质的脂肪和油产品。 根据脂肪酶催化的特异性，将其分为三大类：非特异性脂肪酶、特异性脂肪 酶和脂肪酸特异性脂肪酶。不同种类的脂肪酶催化油脂酯交换的过程和产物各 异。 常用非特异性脂肪酶作催化剂，这类酶对甘油酯作用的位置无特异性，其产 物类似于化学酯交换得到的产物，它在含水量高的情况下将甘三酯水解为游离脂 肪酸和甘油，仅有少量中间产物如单甘酯，双甘酯存在，一些微生物能产生这一 第一章绪论 类脂肪酶。 使用l ，3 特异性脂肪酶催化酯交换反应，若不考虑副产物时，酰基转移仅 限于s n - 1 ，s t l 3 位，所产生的甘三酯混合物是化学催化方法所不能达到的，但是 脂肪酶催化酯交换反应过程中会伴随着水解和酰基转移等副反应，致使产物不单 一。因此反应时要严格控制反应条件，反应时间不宜过长，否则会产生许多不希 望得到的副产物，一些微生物能产生这一类脂肪酶，动物胰脏产生的以脂肪酶及 米糠的解脂酶等即属于这一类特异性脂肪酶。甘三酯和游离脂肪酸的混合物可以 作为脂肪酶的催化反应基质，在反应时特定的游离脂肪酸与特定的的酰基互换， 产生新的甘三酯。 1 3 1 4 脂肪酶在清洁剂中的应用 在洗涤剂中加入酶可以提高去污力、降低表面活性剂和三聚磷酸钠的用量， 使洗涤剂朝低磷或无磷化的方向发展、减少环境污染、发挥洗涤的新功能。酶作 为一种生物制剂，无毒并能完全生物降解、对环境的生态平衡起良性的作用f l 羽。 人们对穿过的衣服附着污垢的分析发现，人体表面分布着由皮脂腺分泌的皮 脂类脂肪污垢、皮肤表面老化的表皮角质层碎片类蛋白污垢、大气中游离的灰尘 无机污垢，其中脂肪污垢，据季节和衣服种类的不同约占总污垢量3 4 。以前的 洗涤剂，仅靠表面活性剂的作用不能完全除去浸入纤维中的各种甘油三酸酯类脂 肪污垢，这种残留的脂肪污垢和空气中的氧起反应，使纤维变黄变黑。而脂肪酸 。能高效地将甘油三酯分解为容易去除的脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯和甘油等， 因此大大提高了对脂肪污垢的去除。 1 3 1 5 脂肪酶在纸浆、造纸工业中的应用 生物脱墨是当今国内外废纸回用研究的热点之一，国内外用于废纸脱墨的酶 主要是纤维素酶和半纤维素酶，对其它酶则涉及较少。纤维素酶和半纤维素酶虽 然脱墨效果好，但对纸浆强度和得率的破坏却很大。脂肪酶在脱墨过程中主要是 以分解油墨与纤维表面的连结料的方式释放出油墨粒子，对纤维强度和纸浆得率 的影响较小，因此在脱墨应用中有较大的潜力。 1 3 2 脂肪酶在有机合成中的应用 1 3 2 1 脂肪酶催化的肽合成 研究人员很早就发现脂肪酶除了可以催化酯的合成之外还可以催化肽键的 合成反应，肽合成反应是脂肪酶催化反应的最初应用之一。与用于合成肽键的蛋 白酶不同，脂肪酶不仅可以作用于l 氨基酸，还可以作用于d 氨基酸【1 0 】，应用 第一章绪论 范围更广。同时由于脂肪酶不能催化肽键水解，所以脂肪酶催化的肽合成反应是 一个不可逆反应。 1 3 2 2 脂肪酶催化手性药物合成 一 绝大多数药物分子具有手性，传统化学合成的手性药物多数以消旋体形式上 市，1 9 9 2 年美国f d a 开始要求手性药物以单一对映体( 对映体纯) 形式上市， 同样食品和农药也存在手性要求。对映体纯药物可用手性合成和手性拆分方法制 备。在手性药物的合成中或消旋体拆分中，利用酶催化方法称为研究的热点。 有关脂肪酶作为催化剂进行立体选择性合成物的研究很岁1 3 4 】。涉及手性 化合物最广泛使用的生物催化反应是外消旋体的动力学拆分，其它的生物催化立 体选择性的方法是前手性和内消旋化合物的不对称转化，但是这些方法应用较少 在动力学拆分中，一个对映体与拆分试剂反应要比另一个更快。拆分试剂通 常用催化量。动力学拆分可以分为经典的动力学拆分和动态动力学拆分【9 】( 图 1 3 ) 。分别如图所示： 三：三s 卜q卜q 在酶催化经典动力学拆分中，在催化剂和拆分试剂存在下，两个对映体反应 速度不同，它们反应速率的不同只依赖于与手性拆分试剂的相互作用和它们各自 非对映异构体过渡态间自由能的不同，在热力学控制下都可以得到1 0 0 的转化 率或一个热力学平衡，在这两种情况下，生成等量的对映异构体产物。因此在实 际应用中通过控制条件在反应完成前停止，可以达到最大收率是5 0 。当只有一 个对映异构体是所要化合物时，这样的结果不能让人满意。动态拆分就是在此基 础上发展起来的增加了一个消旋步骤的动力学拆分。如果k 僦准及产物不发生消 旋化，该方法可以提供1 0 0 反应最快的对应体，图1 - 4 就是一个动态拆分的例 子【”】。而且，与经典拆分相比，产物对映体过量不依赖于转化率。在这一过程中， 关键步骤是消旋化，消旋化的速率应该比反应最快的对应体的下一步反应更快， 第一章绪论 而且产物不应该被消旋化。 动力学拆分根据拆分底物的不同分为手性酰基受体的动力学拆分和手性酰 基供体的动力学拆分。在动力学拆分的众多底物中，各种伯醇【1 6 1 、仲醇17 1 、各 种胺【1 8 1 等都是作为酰基受体被拆分的。手性酰基供体的动力学拆分则研究较少。 【1 6 】 e = 5 5 图1 - 4 动态动力学拆分实例n 习 f i g u r e1 4a ne x a m p l eo fd y n a m i ck i n e t i cr e s o l u t i o n h 昙火。h 1 8 1 c a l - b 【1 8 】- n h 2 o e 9 9 i m e c 6 h 11 o h h 图1 5 酰基受体的动力学拆分的实例 f i g u r e1 5e x a m p l e so f k i n e t i cr e s o l u t i o no f a c y la c c e p t o r 【1 7 】 e 3 0 0 1 3 2 3 脂肪酶催化生物表面活性剂的合成 表面活性剂是一类具有表面活性的化学品，无论是在工业生产方面还是人类 日常生活方面，表面活性剂的使用越来越广泛。但是，现在使用的绝大多数类型 的表面活性剂都是化学方法合成的。这种方法不可避免地给人类的生存环境带来 污染和破坏。 生物表面活性剂是指利用酶或微生物的生物催化和生物合成方法生产得到 的具有表面活性的物质，如糖脂类、氨基酸类、蛋白质类等，与化学表面活性剂 警 瓷羚 第一章绪论 相比，是一类环境友好的表面活性剂。应用酶法合成的生物表面活性剂主要有以 下几种类型l l 刿： a 酶法合成单酰化甘油脂类生物表面活性剂。工业上单酰化甘油脂的合成多 是在2 4 0 c 一- - 2 6 0 c 高温和高压下进行，能源消耗大且产物不易他离j 。利用酶 法的常温和常压则可以节省能源，同时减少热降解副反应的发生。单酰化甘油脂 主要是通过l ，3 特异性脂酶催化动植物油类或脂肪的甘油解( g l y c e r o l y s i s ) ，水解 或醇解反应得到。对于特殊的单酰化甘油脂也可以通过酶催化甘油和脂肪酸的直 接缩合生成 b 酶法合成糖脂类生物表面活性剂。糖脂是由糖和长碳链羧酸( 或羧酸酯) 发 生酯化( 或酯交换) 反应得到的化合物，在自然界中广泛存在。按结构上含糖基的 多少来划分，糖脂可以分为单糖酯，如甘露糖脂；又糖脂，如海藻糖脂；多糖脂， 如e m u l s a n 。糖酯是一类非常重要的非离子表面活性剂，具有优良的表面性能， 如多e m u l s a n 的乳化性能非常好，能使原油和水相对稳定；同时糖酯也具有多种 多样的药理作用和免疫功能。利用脂肪酶的区域选择性，可以很容易地从糖类和 脂肪酸或甘油三酯等价廉易得的原料出发合成酯化位置特定的糖酯。而且，反应 条件温和，操作方便。关于脂肪酶催化合成糖酯的方法将在下一节中详细介绍。 c 酶法合成氨基酸类生物表面活性剂。氨基酸类表面活性剂乳化作用良好， 去污能力强，与其它各种表面活性剂的相容性也很好，同时具有优良的抗微生物 性能。在合成洗涤剂、化妆品、食品工业以及制药等方面的应用越来越受到人们 的重视。中科院上海有机化学研究所的李祖义【1 8 】等就采用脂肪酶n o v o z 、r n l e4 3 5 作催化剂合成了几种氨基酸类表面活性剂。 酶法合成表面活性剂的主要优点是其环境友好性，可以有效地减少生产过程 中有害物质的排放，降低能耗，符合当今绿色化工的要求；同时由于脂肪酶的区 域选择性，可以合成一些具有特殊结构的分子，简化反应流程；另外酶催化产物 一般副产物少，产品外观、气味好。但是由于脂肪酶价格昂贵，现在还很少能够 应用于工业生产。 1 3 2 4 脂肪酶用于生产生物柴油 生物柴油是以含油植物、动物油脂以及废食用油为原料制成的可再生清洁能 源，主要成份是中长链脂肪酸甲酯。酶法合成生物柴油具有条件温和、醇用量小、 无污染排放的优点。但目前主要问题有：对甲醇及乙醇的转化率低，一般仅为 4 0 6 0 。由于脂肪酶对长链脂肪醇的酯化或转酯化有效，而对短链脂肪醇( 如 甲醇或乙醇等) 转化率低，而且短链醇对酶有一定毒性，酶的使用寿命短。副产 物甘油和水难于回收，不但对产物形成抑制，而且甘油对固定化酶有毒性，使固 第一章绪论 定化酶使用寿命短。目前采用的脂肪酶多为n o v o z y m e4 3 5 等，催化效果较好但 价格昂贵。北京工业大学的谭天伟【2 啦! 】采用帆布固定的c 融够脂肪酶催化生 物柴油，另外通过分布加入甲醇的方法，减小了甲醇对酶的毒化作用，1 2 5 h 后 酯化率为9 2 8 。与其它酶催化方法相比，这种脂肪酶价格相对较低，回收利用 简单，便于工业化生产，具有很好的应用前景。 1 3 2 5 脂肪酶催化聚酯的合成 酶催化法是一种新型的生物合成方法，已经广泛应用在合成聚合物的研究。 相比于传统的合成方法，酶催化聚酯合成具有许多突出的优点：具有高效的对映 选择性和区域选择性；可以在多种不同的介质中进行反应；酶本身来源于可循环 资源，无毒无害；酶催化聚酯合成反应不需要除水和隔绝空气；可以使反应在温 和的条件下进行；可以催化化学方法难以完成的大环内酯开环聚合。目前采用脂 肪酶催化合成的聚酯的方法有开环聚合反应、缩聚反应和酯交换反应等圈，并且 可以用来区域选择性的合成一些具有特殊构型的聚合物。 1 3 2 6 其它精细化学品的合成 除了上述一些应用之外，脂肪酶催化的方法还被用于各种中低分子量的酯的 合成，例如月桂酸丁酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、丙酸异丁酯等，它们一般都具有 特殊的香味，被用于香水、化妆品、食品等领域 1 4 生物表面活性剂糖酯的酶法合成 1 4 1 糖酯简介 1 4 1 1 生物表面活性剂 生物表面活性剂是生物( 主要是微生物) 合成的低分子量、具有表面活性的物 质【2 3 】。它们的分子结构主要由两部分组成：一部分是疏油亲水的极性基团，如单 糖、聚糖、磷酸基等；另一部分是由疏水亲油的碳氢链组成的非极性基团，如饱 和或非饱和的脂肪醇及脂肪酸等。 微生物产生的生物表面活性剂包括许多不同的种类。依据他们的化学组成和 微生物来源可分为糖脂、脂肽和脂蛋白、脂肪酸和磷脂、聚合物和全胞表面本身 等五大类渊。 与传统的化学表面活性剂相比，生物表面活性剂具有很多优点，例如表面活 性高，乳化能力强；环境友好，能被生物完全降解；生物相容性好；具有特殊的 官能团，分子结构类型多样；生产工艺简单；生产原料来源广泛等。目前已广泛 第一章绪论 用于石油开采业、环境工程、食品工业、农业和精细化工等行业。 1 4 1 2 糖酯作为生物表面活性剂 糖类碳水化合物是具有丰富来源的天然产品，由于糖化学稳定性好，易生物 降解，而且是一种可再生资源，目前以糖结构中的羟基为亲水基开发的糖类表面 活性剂研究十分活跃。糖酯作为一种生物功能分子和化工原料具有重要价值。高 级脂肪酸的糖酯是一种高效无毒的非离子型表面活性剂，它广泛应用于食品、医 药、发酵及石油化学工业领域。按结构上含糖基的多少来划分，糖脂可以分为单 糖酯，如甘露糖脂；又糖脂，如海藻糖脂；多糖脂，如e m u l s a n 。 糖酯大多无臭无味，但十二碳以下的脂肪酸的糖酯有苦味，随着脂肪酸碳链 加长，其非极性增加，使单糖酯的熔点降低，糖酯较低的c m c 和较好降低表面 张力的能力，其起泡性较低。糖酯生物降解完全，对人体无毒，无刺激性，可用 作食品及医药的乳化剂。糖酯可制成h l b 值从1 一1 5 的产品，单酯含量越多， 以及引入的烷基链越短则其h l b 值越高，水溶性越好【2 5 1 。 糖基作为亲水基赋予表面活性剂一些独特的功能 2 6 1 ：( 1 ) 糖基的引入使表面 活性剂具有非常好的生物降解性能和毒理学性质( 2 ) 含有多个羟基的极性端基 赋予糖基表面活性剂更强的亲水性( h y d r o p h i l i c i t y ) 和憎油性( 1 i p o p h o b i c i t y ) ，使得 糖基在油水体系中具有更优越的界面化学性质，( 3 ) 糖基具有络合金属离子的作 用。一些糖基非离子表面活性剂具有较强的抗硬水能力，( 4 ) 糖基使表面活性剂 具有抗菌杀虫活性，如蔗糖醋具有杀虫和广谱抗茵活性。 1 4 2 糖酯的传统合成方法 糖酯的合成主要为酯交换反应，生产方法很多，主要有溶剂法、微乳化法和 无溶剂法等【2 5 1 。 1 4 2 1 溶剂法 最早由s n e l l 在1 9 5 6 年提出。它是将蔗糖溶于d m f 中，加入脂肪酸甲酯， 在催化剂( 甲醇钠) 存在下，加压6 0 反应3 h ，产物提纯后得到产品，产率5 5 。此法中d m f 不易回收，成本高，且有毒性。 改进的溶剂法中加入了助溶剂，使反应体系呈均一相，反应速度加快。又由 于低碳烷基苯和甲醇无共沸现象，溶剂和助溶剂可以回收。反应温度8 0 左右， 6 6 k p a 。催化剂可以是碳酸钾，溶剂较多使用二甲基亚砜及助溶剂低碳烷基苯。 1 4 2 2 微乳化法 是将无毒的丙二醇代替d m f ，并利用表面活性剂油酸钠皂，将蔗糖和脂肪 第一章绪论 酸甲酯以微滴情况下进行酯化反应，反应温度为1 5 0 1 7 0 1 2 ，0 7 - - 0 8 k p a ，并 加入碳酸钾作催化剂。反应分为两个阶段，第一阶段为脂肪酸甲酯和丙二醇间酯 交换，生成丙二醇单酯，在第二阶段则有丙二醇二酯生成，约在2 0 脂肪酸转 化为丙二醇二酯时，开始迅速生成蔗糖酯，反应过程中需要不断蒸出丙二醇，使 反应向糖酯一边转化。蒸馏过程中要保持料液透明无晶体析出。 此法的