（细胞生物学专业论文）prc1在细胞胞质分裂过程中作用机理的研究.pdf

山东大学博士学位论文 p r c l 在细胞胞质分裂过程中作用机理的研究 中文摘要 真核细胞的细胞周期是由一系列细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶( c d k s ) 精确 地调控着，同时，该类蛋白激酶的活性又是由与其结合的各种不同细胞周期蛋白 ( c y c l i n s ) 调控。细胞有丝分裂时期的最重要调控因子是c d k l c y c l i n b l 蛋白 激酶复合体。该蛋白激酶复合体对相应底物的磷酸化作用控制着细胞有丝分裂时 期各种结构的形成以及有丝分裂过程的正常进行。 细胞有丝分裂过程中，由骨架蛋白一微管蛋白( t u b u li n ) 形成的特异性纺 锤体结构对姐妹染色体的分离以及细胞最终分裂起着至关重要的作用。在有丝分 裂中期与后期之间，从纺锤体两极延伸到细胞中央的微管紧密地结合捆柬在一 起，形成指状交叉的纺锤体中央区结构( s p i n d l em i d z o n e ) 。该结构对细胞胞质 分裂阶段，分裂沟的形成及收缩以致细胞最终完全分裂发挥无可比拟的作用。 p r c l 蛋白最初是在体外寻找c d k 蛋白激酶的作用底物时发现，进而被证实 在细胞有丝分裂期可以被c d k l c y c l i n b l 蛋白激酶磷酸化。随后，p r c l 又被证实 可以在体内、体外结合捆束微管结构( b i n d i n ga n db u n d l i n gm i c r o t u b u l e s ) ， 显示该蛋白分子与细胞有丝分裂时期纺锤体( m i t o t i cs p i n d l e ) 形成及功能密 切相关。应用显微注射抗体或细胞转染小分子干扰r n a 技术抑制p r c i 的正常功 能，导致细胞不能完成正常分裂，形成双核细胞，说明p r c l 蛋白分子作用在细 胞分裂的最后阶段一胞质分裂期( c y t o k i n e s i s ) 。同时，我们早期的研究证实 p r c l 蛋白分子可以结合驱动蛋白分子k i f 4 ，因而在纺锤体上被转运至纺锤体中 央区，并且该转运是由p r c l 蛋白分子的磷酸化去磷酸化精确的调控。然而，p r c l 蛋白究竟在细胞胞质分裂时期发挥什么样的作用，又是如何发挥这些作用。其具 体调控机制目前尚不完全清楚，仍有待于进一步调查研究。 本课题研究是在以往研究的基础上，通过分析微管结合与捆束蛋白p r c l 的 蛋白分子结构功能特性，探讨其在纺锤体中央区形成过程的作用；在此基础上， 深入研究c d k i c y c l i n b l 蛋白激酶磷酸化对p r c l 蛋白功能的调控。通过大量的 分子生物学以及细胞生物学实验研究，最终明确p r c l 在细胞有丝分裂过程中的 调控途径，进而阐明细胞有丝分裂时期纺锤体中央区的形成机制。 山东大学博士学位论文 【目的】 通过分析p r c l 蛋白分子的结构特性，研究p r c l 蛋白的生物学特性并结合其 在细胞内的功能作用，探讨p r o l 对细胞有丝分裂纺锤体中央区( s p i n d l e m i d z o n e ) 结构形成的决定性作用。 【方法】 1 通过体外细菌诱导表达p r c l 蛋白，经层析柱分离获得p r c l 聚合体； 2 通过体内共转染表达带有不同标记的p r c l 蛋白或其缺失突变体，经免疫共沉 淀试验鉴定p r c l 自身聚合的功能区； 3 通过蔗糖密度梯度离心非同步化细胞裂解物，分析细胞内源性p r c l 形成多聚 体；再应用抗磷酸化p r c l 抗体分析检测磷酸化p r c l 的分布情况； 4 通过细胞免疫荧光染色技术，对细胞内磷酸化的p r c l 进行定位分析； 5 应用小分子r n a 干扰技术，对细胞内p r c l 的功能进行研究； 6 应用细胞内表达外源性相关蛋白对小分子r n a 的干扰作用实行解救 ( r e s c u e ) ； 7 应用活细胞跟踪摄像技术( 1 i v i n gc e l li m a g i n g ) 观察细胞内过表达 c y c l i n b l a 9 0 对p r c l 以及纺锤体的影响； 8 应用计算机软件重建纺锤体的三维立体结构( 3 dr e c o n s t r u c t i o n ) ，进而更 清晰地观察研究细胞内纺锤体的结构变化。 【结果】 1 经体内、体外试验证实，p r c l 蛋白分子可以形成自身多聚体( 四聚体， t e t r a m e r ) ； 2 经真核细胞表达质粒共转染试验证实，p r c l 蛋白分子的自身聚合功能区位于 氨基端1 8 4 个氨基酸； 3 经蔗糖密度梯度离心试验证实，细胞内源性p r c i 蛋白分子可以形成多聚体， 然而磷酸化的p r c l 蛋白不能形成多聚体； 4 经小分子r n a 干扰及其解救实验证实，p r c l 蛋白是纺锤体中央区形成的必须 蛋白： 5 经小分子r n a 干扰试验证实，p r c l 蛋白聚合捆束微管的生物学功能不依赖于 其结合蛋白k i f 4 。 4 山东大学博士学位论文 【结论】 1 p r c i 在体内、体外均可以形成自身多聚体； 2 p r c i 在有丝分裂早期的磷酸化状态抑制该蛋白分子形成自身多聚体； 3 p r c i 自身多聚体特性在有丝分裂时期纺锤体中央区的形成发挥巨大的作用。 【关键词】 p r c i ；细胞有丝分裂；纺锤体中央区；蛋白磷酸化；细胞周期调控 山东大学博士学位论文 t h er o ieo fp r c lino y t o k in e sis a b s t p a c t s r e g u l a t i o no ft h ec e l lc y c l ei n v o l v e ss t e p sc r u c i a lt ot h ec e l l t w o k e yc l a s s e so fr e g u l a t o r ym o l e c u l e s ，c y c l i n sa n dc y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e s ( c d k s ) ，d e t e r m i n eac e l l sp r o g r e s st h r o u g ht h ec e l lc y c l e c y c i i n sf o r m t h er e g u l a t o r ys u b u n it sa n dc d k st h ec a t a l y t i cs u b u n i t so fa na c t i v a t e d h e t e r o d i m e r ：c y c l i n sh a v en oc a t a l y t i ca c t i v i t ya n dc d k sa r ei n a c t i v ei n t h ea b s e n c eo fap a r t n e rc y c li n w h e na c t i v a t e db yab o u n dc y c li n ，c d k s p e r f o r mac o m m o nb i o c h e m i c a lr e a c t i o nc a l l e dp h o s p h o r y l a t i o nt h a t a c t i v a t e so ri n a c t i v a t e st a r g e tp r o t e i n st oo r c h e s t r a t ec o o r d i n a t e de n t r y i n t ot h en e x tp h a s eo ft h ec e l lc y c l e d u r i n gc e l ld i v i s i o n ，i ti sc y c l i n b i - c d k ic o m p l e xt h a ti t sa c t i v a t i o nc a u s e si n i t i a t i o no fm i t o s i s ，a n d s u b s e q u e n t l y ，i t sd e a c t i v a t i o nc a u s e st h ec e l lt oe x i tm i t o s i s t h ec e n t r a lm a c h i n ei nc e l ld i v i s i o ni st h eb i p o l a rm i t o t i cs p i n d l e ， a na p p a r a t u st h a tp a r t i t i o n st h ed u p l i c a t e dg e n o m eo fam o t h e rc e l l e q u a l l yi n t ot w od a u g h t e rc e l l s t h es p i n d l ei sc o m p o s e dl a r g e l yo f m i c r o t u b u l e s _ _ - r e l a t i v e l yr i g i db u th i g h l yd y n a m i ct u b e sf o r m e db yt h e p o l y m e r i z a t i o no ft u b u l i np r o t e i n s d u r i n ga n a p h a s ear e m a r k a b l e t r a n s i t i o ni ns p i n d l es t r u c t u r eo c c u r s ac o n s p i c u o u sn e t w o r ko f a n t i p a r a l l e l n o n k i n e t o c h o r e i n t e r d i g i t a t i n gm i c r o t u b u l e s ( m w s ) a s s e m b l e sb e t w e e ns e p a r a t i n gc h r o m o s o m e s t h i su n i q u es t r u c t u r ei s r e f e r r e dt oa st h es p i n d l em i d z o n e t h em i d z o n ei sb e li e v e dt ob er e q u i r e d f o rt h em a i n t e n a n c eo fo v e r a l ls p i n d l ea r c h i t e c t u r e ，s p i n d l ee l o n g a t i o n ， a n dc l e a v a g ef u r r o wp o s i t i o n i n g p r c l ( p r o t e i nr e g u l a t i n gc y t o k i n e s i s1 ) o r i g i n a l l yw a si d e n t i f i e da s ac d ks u b s t r a t ei na n 跏v i t r op h o s p h o r y l a t i o ns c r e e na n dw a ss u b s e q u e n t l y s h o w nt ob eam i d z o n e a s s o c i a t e dp r o t e i nr e q u i r e df o rc y t o k i n e s i s p r c i f o r m so i i g o m e r si nv i v oa n dh a s1 i i 娃一b i n d i n ga n d b u n d i i n ga c t i v i t i e s c d k p h o s p h o r y l a t i o no fp r c ia p p e a r st ob ei m p o r t a n tf o rs u p p r e s s i n gp r c i 6 山东大学博士学位论文 m t b u n d l i n ga c t i v i t yi ne a r l ym i t o s i s i na d d i t i o n ，p r c ls p e c i f i c a l l y i n t e r a c t sw i t ht h ek i n e s i n m o t o r p r o t e i n ，k i f 4 d u r i n g t h e m e t a p h a s e t o a n a p h a s et r a n s i t i o n ，k i f 4t r a n s l o c a t e sp r c ia l o n gm t st ot h e p l u se n d so fi n t e r d i g i t a t i n gm i t o t i cs p i n d l e s ，a n dt h et i m i n go ft h i s t r a n s l o c a t i o ni sc o n t r o l l e db yc d kp h o s p h o r y l a t i o no fp r c i p r c ii st h u s ag o o dc a n d i d a t ef o rb u n d li n gi n t e r d i g i t a t i n gm t st of o r mt h em i d z o n e i nt h i ss t u d y ，t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fp r c lw a sa n a l y z e da n di t s o l i g e r m e r i z a t i o nd o m a i nw a sm a p p e db y v i t r oa n d n 订v oe x p e r i m e n t s a n dt h e nt h i sd o m a i n sr o l eo nt h ef o r m a t i o no fm i t o t i cs p i n d l em i d z o n e w a si n v e s t i g a t e d f u r t h e r m o r e ，t h er e g u l a t i o nr o l eo fp h o s p h o r y l a t i o no f p r c ib yc d k l c y c l i nb 1k i n a s ew a sa l s os t u d i e d t h ea i mo ft h i ss t u d yi s t oe l u c i d a t et h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo ff o r m a t i o no fm i t o t i cs p i n d l e m i d z o n eb ym i c r o t u b u l e sb i n d i n ga n db u n d l i n gp r o t e i n ，p r c i o b j e c t i v e s ：t oa n a l y z e t h em o l e c u l a r s t r u c t u r ea n db i o l o g i c a l c h a r a c t e r i z eo fm i c r o t u b u l eb i n d i n ga n db u n d l i n gp r o t e i n ，p r c ia n dt h e n s t u d yi t sd e t e r m i n a n tr o l eo nf o r m a t i o no fm i t o t i cs p i n d l em i d z o n e m e t h o d s ： 1 s t u d yp r c io l i g o m e r i z a t i o ni nv i t r ou s i n gi n d u c t i o no fb a c t e r i a ； 2 s t u d yp r c io l i g o m e r i z a t i o n 力，订v ou s i n gc u l t u r e dh e l ac e l l s ： 3 s t u d yo l i g o m e r i z a t i o no fe n d o g e n o u sp r c ii nh e l ac e l l su s i n gs u c r o s e g r a d i e n ts e d i m e n t a t i o n ： 4 s t u d ys u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d p r c l u s i n g i m m u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n gi nf i x e dh e l ac e l l s ： 5 s t u d yr o l eo fp r c li nm i t o s i su s i n gs m a l li n t e r f e r e n c er n at e c h n i q u e ： 6 s t u d yr e s c u eo fp r c i r n a iu s i n ge x p r e s s i o no fe x o g e n o u sp r o t e i n s ： 7 s t u d yp h e n o t y p eo fe x p r e s s i o no fc y c l i nb 1 a 9 0i nh e l ac e l l su s i n g l i v i n gc e l li m a g i n g ： 8 s t u d y f o r m a t i o no fm i t o t i c s p i n d l e m i d z o n e u s i n g 3 d i m m u n o f l u r o r e s c e n c er e c o n s t r u c t i o ni m a g i n g 7 山东大学博士学位论文 r e s u l t s ： 1 p r c lc a ns e l f - o l i g o m e r i z et ot e t r a m e rb o t hi nv it r oa n di nv i v o ； 2 t h eo l i g o m e r i z a i t o nd o m a i no fp r c ll o c a l i z e so ni t sn h 2 一t e r m i n u s1 8 4 a m i n oa c i d s ： 3 e n d o g e n o u sp r c ic a no li g o m e r i z ee x c e p tp h o s p h o r y l a t e df o r m ； 4 p r c li sr e q u i r e df o rt h ef o r m a t i o no fm i t o t i cs p i n d l em i d z o n e ： 5 k i f 4i sn o tr e q u i r e df o rm tb u n d l i n ga c t i v i t yo fp r c i c o n c l u s i o n s ：p r c lc a ns e l f - o l i g o m e r i z ei n t ot e t r a m e ri nc e l l sh o w e v e r p h o s h o r y l a t i o nn e g a t i v e l y i n h i b i t st h i s a c t i v i t y d u r i n g m e t a p h a s e t o a n a p h a s et r a n s i t i o n ，d e p h o s p h o r y l a t i o no fp r c ip r o m o t e si t s o l i g o m e r i z a t i o na c t i v i t ys oa st oh e l pt h ef o r m a t i o no fm i t o t i cs p i n d l e m id z o n e k e y w o r d s ： p r c l ；m i t o s i s ；m i t o t i cs p i n d l em i d z o n e ；p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o n ；c e l l c y c l ec o n t r o l 8 山东大学博士学位论文 b p e b 符号说明 b a s ep a i r碱基对 e t h i d i u mb r o m i d e溴化乙啶 e d t a e t h y l e n ed i a m i n et e t r aa c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 p b s r p m 嘶s p h o s p h a t e b u f f e rs o l u t i o n 磷酸盐缓冲液 r o t a t i o np e rm i n u t e每分钟转速 t r i h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e三羟甲基氨基甲烷 d n t p d e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e脱氧核苷三磷酸 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳 s d s a p s s o d i u m d o d e c y ls u l p h a t e十二烷基磺酸钠 过硫酸铵 t e m e d n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y le t h l e n e d i a n i n en ，n ，n n - 四甲基乙 d t td i t h i o t h r e i t o l p m s f p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e f b sf e t a lb o v i n es e r u m d m e md u l b c c o sm o d i f e d e a g l em e d i u m 二胺 二硫苏糖醇 苯甲基磺酰氟 胎牛血清 d m e m 培养基 i p t g i s o p r o p y l t h i o - d g a l a c t o s i d e 异丙基硫代- d - 半乳糖昔 a m pa m p i c i l l i n e k a n k a n a m y c i n s i r n as m a l li n t e r f e r e n c er n a y f py e l l o wf l u o r e s c e n c ep r o t e i n 氨苄青霉素 卡那霉素 小分子干扰r n a 黄色荧光蛋白 9 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 坪 日期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 撇：坪翩躲避一 山东大学博士学位论文 刖昌 细胞周期( c e l lc y c l e ) 是细胞周而复始的生长分裂周期，或者指亲代细j 裂结束到子代细胞分裂结束所经历的过程。细胞周期主要分为4 个时期：g ( d n a 合成前期) ，s 期( d n a 合成期) ，g 2 期( d n a 合成后期) 以及m 期( 有j 裂期) 。d n a 的复制度细胞的有丝分裂是细胞周期中两个最关键的过程。有 裂由wf l e m i n g ( 1 8 8 2 ) 年首次发现于动物及e s t r a s b u r g e r ( 1 8 8 0 ) 年发 植物。特点是有纺锤体和染色体出现，予染色体被平均分配到子细胞。有丝一 过程是一个连续的过程，为了便于描述人为的划分为六个时期：0 ( i n t e r p h a s e ) 、前期( p r o p h a s e ) 、前中期( p r o m e t a p h a s e ) 、中期( m e t a p h a s 后期( a n a p h a s e ) 和末期( t e l o p h a s e ) ( 图1 ) 。其中间期包括g 。期、s 期和g 。 主要进行d n a 复制等准备工作。问期之后的五个时期即是细胞有丝分； ( m i t o s i s ) ，是细胞周期中唯一可以直接借助显微镜肉眼观察到的细胞分裂韧 细胞分裂的最后阶段也可以称为胞质分裂( c y t o k i n e s i s ) ，是指细胞核分裂! 后的细胞质分裂。胞质分裂的任何异常都会导致细胞分裂不能正常完成，最1 形成多核细胞以至细胞突变成痛细胞。 图1 正常哺乳动物细胞( h e l a 细胞) 有丝分裂各个时期。 山东大学博士学位论文 细胞有丝分裂期主要有两个特征性的结构：一是染色体( c h r o m o s o m e ) 的形成 及分离；二是纺锤体( m i t o t i cs p i n d l e ) 的形成。纺锤体是一种微管蛋白构成的 动态结构，其作用是在分裂细胞中牵引染色体到达分裂极。纺锤体对于染色体的 正确分离起着关键作用。纺锤体在胞质分裂阶段，其中部微管数量增加，其中掺 杂有高电子密度物质和囊状物，这一结构称为纺锤体中央区( c e n t r a l s p i n d l e s p i n d l em i d z o n e ) 。研究发现，纺锤体中央区的形成及功能对于正确的 胞质分裂以至细胞分裂十分关键，然而详细机制仍不清楚。随着科学研究的进展， 越来越多的纺锤体中央区蛋白分子被发现，对它们的结构与功能的研究成为细胞 周期研究领域的又一个崭新的亮点。 p r c l ( p r o t e i nr e g u l a t i n gc y t o k i n e s i s1 ) 蛋白分子是由d r w e ij i a n g 在1 9 9 8 年寻找与细胞周期调控有关的细胞周期蛋白依赖性激酶( c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e s ，c d k s ) 的作用底物时发现的一种新蛋白分子。p r c i 基因定 位于人的1 5 号染色体( 1 5 q 2 6 1 ) ，编码6 2 0 个氨基酸组成的蛋白分子，分子量 约为7 1 k d a ( 图2 ) 。该蛋白分子在细胞内的表达明显受细胞周期的调控，主要在 细胞有丝分裂期( mp h a s e ) 表达。j i a n g 通过体内、体外实验证明p r c i 蛋白分 子是一个新的c d k 作用底物，主要的磷酸化位点在第4 7 0 和4 8 1 苏氨酸( t h r 4 7 0 和t h r 4 8 1 ) 。同时这两个氨基酸也非常符合c d k 激酶的识别位点基序( m o t i f ) ， 分别是t 4 7 0 p s k 和，i i 8 1 p g k 。p r c i 的这两个磷酸化位点表明该蛋白分子在细胞周期 的不同时期具有磷酸化修饰作用，然而该修饰作用的具体生物学意义仍不清楚。 应用特异性抗p r c l 多克隆抗体进行细胞内免疫荧光染色显示，p r c i 蛋白分子在 细胞周期的不同时期具有显著不同的定位。在有丝分裂间期定位在细胞核内，当 细胞进入有丝分裂期，细胞膜溶解后，p r c l 蛋白分子定位于纺锤体并在有丝分 裂后期转移至纺锤体中央区( m i d z o n e ) ，最终定位于中体( m i d b o d y ) 。向细胞内 显微注射p r c i 蛋白的抗体导致细胞有丝分裂不能正常进行，最终细胞胞质分裂 失败，形成双核细胞。这些现象表明p r c i 与细胞有丝分裂，尤其是胞质分裂相 关。稍后，d r w e ij i a n g 与其合作者通过体内体外实验，进一步研究证实p r c l 蛋白分子是一种微管结合蛋白( m i c r o t u b u l ea s s o c i a t e dp r o t e i n ，m a p ) 。p r c i 蛋白分子结合微管的功能区域位于该蛋白分子的中间区，然而出乎意料的是， p r c l 的磷酸化作用并不影响该蛋白分子与微管的结合作用，预示该磷酸化修饰 与p r c i 蛋白分子的其它生物学特征有关。通过小分子r n a 干扰作用，他们证实 山东大学博士学位论文 p r c l 与纺锤体中央区结构的形成与其功能的正常发挥密切有关。然而，p r c l 蛋 白分子在细胞有丝分裂过程中的具体作用机制以及磷酸化修饰作用对该蛋白分 子功能的影响仍然不清楚。最近，我们实验室应用小分子r n a 干扰技术结合驱动 蛋白分子的功能率选发现p r c i 蛋白分子与驱动蛋白分子k i f 4 在特定的时间及空 间相结合，从而决定了p r c i 蛋白分子在纺锤体上的转移。同时，这种特异性结 合是受p r c l 蛋白分子的磷酸化修饰精密的调节。具体调控机制是，在细胞有丝 分裂早期，p r c i 蛋白分子被细胞周期蛋白依赖性激酶c d k l c y c l i n b l 磷酸化， 因而磷酸化的p r c l 蛋白分子不能与k i f 4 结合；当细胞进入有丝分裂晚期时，由 于c d k l c y e l i n b l 激酶活性的消失，p r c l 蛋白分子的磷酸化状态无法维持，在 磷酸酶的去磷酸化作用下，p r c l 蛋白分子发生去磷酸化反应，从而导致p r c l 蛋 白分子与k i f 4 驱动蛋白分子相结合，并被转移至纺锤体的中部，参与纺锤体中 央区结构的形成。 该课题研究是在以往研究的基础上，运用先进的细胞生物学及分子生物学技 术，如分子克隆、细胞转染、小分子r n a 干扰、活细胞显微摄像等，研究探讨在 哺乳动物细胞有丝分裂期，微管相关蛋白分子p r c i 形成自身聚合体，同时该特 性受c d k l c y c l i n b l 蛋白激酶的精确调控，最终明确p r c i 蛋白分子对纺锤体中 央区结构的形成与功能及在细胞胞质分裂过程所起的关键性作用。 1 2 山东大学博士学位论文 孽嘲n 鬈缸孽包如审9 摹勺孽曩搿o 审孽每掌e 嘲_ g o 尊口如墨霉黼t i , t aq 窜每譬q 穗t t蕈x口曩 vi r曩 口 厶vl i d , e 4l 2 毫擘7 童，：i ，i o g 孽哟坩g e t 9 脯- 白b _ 叼l a d l m 脚撒御删, m c l l - 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p r c l 由美国s a l k 研究所d r t o n yh u n t e r 实验室 馈赠。 抗体： 以p r c l 蛋白分子羧基端6 0 1 - 6 2 0 氨基酸为抗原制备的多克隆抗体 ( a n t i - p r c la n t i b o d y ) 由美国s a l k 研究所d r t o n yh u n t e r 实验室馈赠。来 源于山羊的抗磷酸化p r c i ( p h o s p h o t h r 一4 8 1 ) 多克隆抗体( a n t i - p r c l p a n t i b o d y ) 购自于美国s a n t ac r u z 生物公司。偶联吸附珠( b e a d s ) 的单克隆抗 体a n t i - f l a g 购自于美国s i g m a 公司。单克隆抗体鼠抗f l a g 以及鼠抗m y c 由美 国s a l k 研究所d r t o n yh u n t e r 实验室馈赠。 细胞培养基： d m e m 培养基购自于g i b c o 公司。胎牛血清( f b s ) 购自于h y c l o n e 公司。胰 蛋白酶购自于g i b c o 公司。 限制性内切酶及其它： 所有限制性内切酶以及d n a 连接酶，碱性磷酸酶等均购自于n e we n g l a n d b i o l a b s 公司。t a qd n a 聚合酶购于t a k a r a 公司。 p c r 试剂： 实验用各种p c r 引物均购自于s i g m a 公司。 1 4 山东大学博士学位论文 1 7 m m , , a b r p r i m e r 霸& 憾4 墅爹罄p 艘啪 垂亟 黧嬲塑翻l点 a g a t c t c e t c c c o c c a j u i t t a a t a c g t c e t r g o b c a a t t g t g a g c g 甜t a a c “t t c c c c t c a g a a a t a a t t t t g t t t a a c t t t a a “a g g a g & 触l蚴巡磐堡豳 t a t a c c a t g g c c 8 c e a t c a t c a t c a t c a t c a c a 。c 8 c 蕊c c t 0 e t 雠e 口c s c g o c 0 e e t 0 0 e t a g c a t g a c t c 0 j g g a c a g c h t g i y s ，罩r 劓i s h i s h i 辩 h i s h l s r 孽r g i y l o u v a l p r o a r 够i y s e r n ；t i q s c d r t t h r g i y g i y g i g i 8 v it l w c n b i n 一照蚓避! 艇l 墅! 毖掇塑l 趣! 黧! 盟 a t g g g t c g c g g a t c c g a a t t c g a g c t c e g t c g a c a a g c t t g c o g c c g c a c t c g a g c a c c a c c a e 孙c 直c c k c t g a “t c c c t t a a c a j u i j g c c c p e t - 2 b o l ， h t g i y a r g g i y 蓐r c i u p h e g