（遗传学专业论文）一个新的人类精子发生相关蛋白激酶基因的克隆及功能研究.pdf

摘要 f 精子发生是指在睾丸中二倍体的精原细胞分化成为单倍体精子的复杂过 、 程。尽管精子发生的分子机制仍不明确，但蛋白磷酸化被认为在这一过程中起 、p 玎 重要作用。j 从人类胎脑c d n a 文库中我们克隆到两个克隆，分别长1 8 4 0 b p 和 】5 7 1 b p ，后者仅比前者在3 一非翻译区少了约3 0 0 个核苷酸，被命名为精子发生 ， 相关蛋白激酶( ( s p e r m a t o g e n e s i s - r e l a t e d p r o t e i nk i n a s e ，简称s p k ) 。两者拟编码 3 2 2 个氨基酸残基，并在氨基酸水平上与长1 5 k b 的人类p d z 结合激酶有9 9 、一 的同源性。精子发生相关蛋白激酶被定位在染色体8 p 2 1 2 区。n o r t h e r n 杂交显 示精子发生相关蛋白激酶在睾丸中有显著表达，而在其它七种组织脾脏、 胸腺、前列腺、卵巢、小肠、结肠和白细胞中末见表达，推测精子发生相关蛋 白激酶在细胞分裂活跃的组织中有高表达。原位杂交表明精予发生相关基因在 小鼠成熟睾丸中主要表达在生精小管的外层细胞中，而这一层细胞主要包含分 裂活跃的精原细胞和初级精母细胞。以上实验结果不仅进一步为精子发生相关 蛋白激酶p d z 结合激酶参与细胞分裂提供了强有力的支持，还证明精子发生相 关蛋白激酶可能在精子发生过程中起着极其重要的作用。，厂 关键词：蛋白激酶，精子发生，p d z 结合激酶 伸图分类号：q 7 5 3 ，q 4 9 2 4 ) 、 j 0 ，乏元：要茗雩彳锄i 、姜亏，乃勺“7 囊琴 彩 、吖氟；、 c l o n i n g a n dc h a r a c t e r i z a t i o no f an e wh u m a n s p e r m a t o g e n e s i s - r e l a t e d p r o t e i nk i n a s eg e n e a b s t r a c t ：s p e r m a t o g e n e s i s ，p r o d u c t i o no ff u n c t i o n a ls p e r mc e l l si n t h et e s t i s ，i sa c o m p l e xp r o c e s s i nw h i c hd i p l o i ds p e r m a t o g o n i ad i f f e r e n t i a t ei n t om a t u r eh a p l o i d s p e r m a t o z o a a l t h o u g ht h em o l e c u l a r m e c h a n i s mi su n c l e a r , p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o n i sc o n s i d e r e dt ob eo n eo ft h ei m p o r t a n tr e g u l a t o r ye v e n t si ns p e r m a t o g e n e s i s w e r e c e n t l y i s o l a t e d2e d n ac l o n e s ，d e n o t e ds p k ( s p e r m a t o g e n e s i s r e l a t e d p r o t e i n k i n a s e ) ，f r o me d n al i b r a r yo f h u m a n f e t a lb r a i n o n ei s1 8 4 0 b pa n da n o t h e r1 5 7 1 b p w h i c hi s v 3 0 0 b ps h o r t e ra t3 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n t h e yb o t he n c o d eap u t a t i v e3 2 2 a m i n oa c i dp r o t e i nw h i c hi s9 9 i d e n t i c a lt oh u m a np d z - b i n d i n gk i n a s e ( p b k ) ，a n 15 k bm i t o t i ck i n a s eg e n e c h r o m o s o m a ll o c a l i z a t i o no fs p k w a s a s s i g n e dt o8 p 2 1 2 n o r t h e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a ts p km r n aw a sp r e d o m i n a n t l ye x p r e s s e di n t e s t i sb u tn o ti n s p l e e n ，t h y m u s ，p r o s t a t e ，t e s t i s ，o v a r y , s m a l li n t e s t i n e ，c o l o n a n d p e r i p h e r a l b l o o dl e u k o c y t e i ns i t uh y b r i d i z a l t o nl o c a l i z e dt h es p km r n ai nt h e o u t e rc e l ll a y e ro fs e m i n i f e r o u st u b u l e si nw h i c he x i s t e ds p e r m a t o g o n i aa n dp r i m a r y s p e r m a t o c y t e s t h e s e o b s e r v a t i o n sn o t o n l y c o n f i r mt h er e s u l tt h a ts p k p b k p a r t i c i p a t e si nc e l ld i v i s i o n ，b u ta l s os u g g e s t t h ei n v o l v e m e n to fs p ki nt h ep r o c e s so f s p e r m a t o g e n e s i s k e y w o r d s ：p r o t e i nk i n a s e ，s p e r m a t o g e n e s i s ，p d z b i n d i n gk i n a s e 型型盟燮 日u舌 1 蛋白激酶的结构及功能 蛋白激酶被定义为能把磷酸基团从磷酸供体转移到底物上的受体的一类 酶。充当磷酸供体的通常是a t p 的y 磷酸基团或其它核苷三磷酸的y 一磷酸基团。 f m 受体通常是底物上的特定氨基酸残基。蛋白激酶广泛存在于生物体内不同细 胞中，并在许多细胞过程中起着重要作用，例如细胞增殖，分化，粘附，迁移， 代谢和信号传导等。据推测，人类基因组中约含有2 0 0 0 个蛋白激酶基因，占编 码蛋白基因的2 - 4 f 1 1 。 h a n k s 和h u n t e r 通过绘制系统进化树作为蛋白激酶分类的基础，对蛋白激 酶进行分类，他们把真核生物蛋白激酶分为五大类【2 】： la c g 类，包括环核苷酸依赖家族( p k a 与p k g ) ，蛋白激酶c ( p k c ) 家族，与p k a 和p k c 相关的激酶家族，磷酸化g 蛋白偶联受体的激酶家 族，出芽酵母a g c 相关的激酶酪氨酸激酶，核糖体s 6 激酶家族，出芽酵 母d b f 2 2 0 激酶家族，丌花植物“p v p k i 家族”的同源蛋白及其它相关家 族，共1 4 个激酶家族； 2 c a m k 类，包括由钙钙调蛋白调控的蛋白激酶家族，s n f l a m p k 家族及其 它相关家族，共3 个激酶家族； 3 c m g c 类，包括细胞周期蛋白依赖激酶( c d k s ) ，e r k ( m a p ) 激酶家族， 糖原合成酶3 ( g s k 3 ) 家族，酪蛋白激酶i i 家族，c l k ( 类似c d k 的激酶) 家族及其它相关家族，共5 个激酶家族： 4 传统的蛋白酪氨酸激酶( p t k ) 类，分为穿膜与非穿膜两个亚类，包括s r c 家族，b r k 家族，t e c 家族，c s k 家族，f e s ( f p s ) 家族，a b l 家族，s y k z a p 7 0 家族，j a k 家族，a c k ，f a k ，表皮生长因子受体家族，e p h e l k e c k 受体家 族，a x l 家族，t i e t e k 家族，血小板生长因子受体家族，成纤维细胞生长 l j j = l 子受体家族，胰岛素受体家族，l t k a l k 家族，r o s s e v 家族，t r k r o r 家 族，d d r t k t 家族，目f 细胞生长因子家族，线虫k i n l 5 1 6 家族及其它穿膜酪 氨酸激酶，共2 4 个激酶家族； 5 其它蛋白激酶类，包括p o l o 家族，m e k s t e 7 家族，m e k k s t e l l 家族，n i m a 家族，w e e i m i k l 家族，转录调控相关的激酶家族，r a f 家族，活化素t g f l 3 一受体家族丌佗植物受体激酶家族，包含亮氨酸拉链的“混合谱系” ( m i x e d - l i n e a g e ) 激酶家族，c a m k l 家族，p k n 家族的原核蛋白激酶及其 它相关家族，e1 4 个激酶家族。 根据蛋白激酶的底物特异性，也可对蛋白激酶进行分类。但出于蛋白激酶 翌坠型生燮 通常有多种底物，因此以接受磷酸基团的特定氨基酸残基为分类标准比底物作 为分类标准更加可靠。据此可以把激酶分为五大类 3 】： 1 幺幺苏氨酸激酶( e c 2 7 1 0 ) ：以羟基作为磷酸受体； 2 酪氨酸激酶( e c 2 7 1 1 ) ：以苯酚基作为磷酸受体； 3 组氨酸激酶( e c 2 7 1 2 ) ：以组氨酸、精氨酸或赖氨酸作为磷酸受体： 4仁胱氩酸激酶( e c 2 7 1 3 ) ：以半胱氨酸作为磷酸受体； 5 天冬酰胺或谷胺酰胺激酶( e c 2 7 1 4 ) ：以酰基作为磷酸受体。 第、一i 类激酶是迄今研究地比较透彻，数量最多的两类激酶，而后j 类 激酶数量较少，分类标准以及作用方式等的研究也不够深入，因此，也有人把 激酶大致分为两大类，即丝苏氨酸激酶和酪氨酸激酶。随着蛋白激酶基匿i 数量 的不断增加，又发现了一种既能磷酸化底物上的丝苏氨酸残基，又能磷酸化酪 氰酸钱基的双重底物特异性蛋白激酶，它一般被归入丝苏氨酸激酶类。 所有的丝，苏氨酸激酶和酪氨酸激酶的氨基酸序列中都含有一段比较保守的 僻化结构域，由2 5 0 3 0 0 个氨基酸残基组成。这种催化结构域有3 方面功能： 1 a t p 或g t p 的结合和定向，有二价阳离子( m 9 2 + 或m n 2 + ) 参与形成这复 合体： 2 底物蛋白质或肽的结合和定向； j 催化a t p 或其它核苷三磷酸的的y 塥酸基团转移到受体丝苏氨酸或酪氨酸 的羟基上 虽然催化结构域在每一个激酶氨基酸序列中的位置并不固定，但在大部分 ，社哑基的激酶中，它位于肽链的羧基端，而氨基端往往作为调节区域。在多亚 碴激酶中，催化结构域覆盖整个激酶氨基酸序列的现象也很普遍( 4 。 通过对已有的蛋白激酶进行序列比较以及对切去部分n 端或c 端后的蛋 7 1 激酶的酶活性分析发现，在催化结构域中，有1 2 个亚结构域( 亚结构域i x l ， f ，哑绐掏域v i 包含v i a 和v i b ) 的氨基酸序列是十分保守的，包含不变或 女近4 ：变的氨基酸残基，它们被一些低保守的氨基酸残基分隔开。这些高保守 的结构域在激酶活性方面起重要作用。h a n k s 和h u n t e r 对3 7 0 种蛋白激酶的氨 l 。【酸序列进行比较，将保守性在9 5 以上的氨基酸残基作为不变或接迈4 ：变氦 l 酸( 表1 ) ，结合依赖c a m p 的蛋白激酶饯催化亚基( p k a c a ) 的晶体结构( s 】， 发现激酶催化结构域折叠成大、小两叶状( 1 0 b e ) 结构，小叶包含亚结构域i i v ， 核洚= - ：磷酸的锚定和定向有关，大叶包含v i a x i ，与底物的结合和磷酸基 的转移宵关，哑结构域v 则可能是两部分的联接【2 ，4 1 ： 、哐结构域i 位于催化结构域的氨基端，它含有共有序列：甘氨酸一x h 氨 舷* x 甘氨酸x 一缬氨酸( g x g x x g x v ，x 代表任意氨基酸残基) 。亚结构域i 折 爵成个p 片层一转角一p - 片层结构，好象一把钳子把a t p 上、d 一磷酸基团 复日人学坝1 。学位沦文 包裹并固定住。从亚结构域i 共有序列的第一个甘氨酸起向前七个氨基酸残基， 通常是一一个疏水性氨基酸残基，这就是催化结构域氨基端的边界。 亚结构域i i 含有一不变的赖氨酸( k ) 残基，它与a t p 的仪、p 一磷酸基团 相丘作用，协助固定a t p 并使a t pj 下确定向。它还能与亚结构域i i l 中的谷氨 酸形成能桥。 距结构域i i i 形成0 【螺旋结构，它包含一一接近不变的谷氨酸( e ) 残基，这 个谷氨酸残基位于螺旋的的中部，能使亚结构域i i 中的赖氨酸残基与a 、p 一磷 酸基团的作用更加稳定。 亚结构域i v 内没有不变或接近不变的氨基酸贱基，功能也不很清楚。 亚结构域v 形成一个非常疏水的p 片层结构，把催化结构域的两叶连接在 一起。 亚结构域v i a 折叠成一个较大的a 一螺旋结构贯穿整个大叶，其中没有一个 氨基酸残基与a t p 或底物相作用，推测可能只是起维持催化结构域三维结构的 作用。 亚结构域v i b 含有共有序列：组氨酸一精氨酸一天冬氨酸一亮氨酸一赖氨酸x x 一 天冬酰胺( h r d l k x x n ) ，其中天冬氨酸残基( d ) 和天冬酰胺残基( n ) 在各 种激酶中是不变的。亚结构域v i b 形成p 片层一环一p 一片层结构，此环被称 作催化环。不变的天冬氨酸残基位于环内，它作为质子受体，可能是催化活性 中最关键的一个氨基酸残基，。赖氨酸残基( k ) 可能通过中和y 一磷酸基团的负 电荷从而帮助磷酸基团的转移。不变的天冬酰胺残基( n ) 一方面稳定催化上不， 另一方面螯合次级m 9 2 + 离子，使m g 。离子能够连接d 和y 一磷酸基团。 亚结构域v i i 中含保守的天冬氨酸苯丙氨酸甘氨酸( d f g ) 序列。天冬 氨酸钱基( d ) 能螫舍初级m 9 2 。离子，使m 9 2 + 离子连接b 和y 一磷酸基团，从而定 向v 一磷酸基团以利转移。 亚结构域v i i i 含有高保守的丙氨酸一脯氨酸一谷氨酸( a p e ) 序列，谷氨酸 残基( g ) 能与亚结构域x i 中的精氨酸残基( r ) 相互作用，稳定大叶的结构。 哑结构域v i i i 可能在底物的识别中也起着重要作用。实验表明，亚结构域v l l l 能与假底物抑制蛋白结合，并且许多激酶的激活需要亚结构域v i i i 中氨基酸残 基的磷酸化，如p i c a c a ，若要达到最高活性，需要亚结构域v i i i 中的1 9 7 位 苏氨酸残基磷酸化。磷酸化后，1 9 7 位苏氨酸残基上磷酸基团中的氧原子与精 氨酸1 6 5 、赖氨酸1 8 9 和苏氨酸1 9 5 形成氢键，从而使亚结构域v i i i 保持稳定 的活性构型，使得底物能够m 确定向。 亚结构域i x 含一接近不变的天冬氨酸( d ) ，它的作用是稳定催化上不。监 结构域x 在所有亚结构域中最不保：于，其功能还不清楚。亚结构域x l 位于催 化结构域的羧基端，它含有一接近不变的精氨酸( r ) 。 墅丛塑竺塑丛 催化结构域小叶 催化结构域大叶 亚结构域l 怛结构域i l 、1 f 结构域川 瓶结十勾域v 1 甘氨酸5 0 ，5 2 ，5 5 赖氨酸7 2 谷氨酸9 2 尢 连接序列 盯结构域v无 理结构域v i a 哑结构域v i b 亚结构域v i i 亚结构域v i i i 亚结构域i x 哑结构域x 哑结构域x i 无 犬冬氨酸1 6 6 ，大冬酰胺1 7 大冬酰胺18 4 谷氦酸2 0 8 无 无 精氨酸2 8 0 表1 催化结构域中不变或接近不变的保守氨基酸残基 ( 氮基酸残基位置以依赖c a m p 的蛋白激酶a 催化亚基( p k a c c t ) 为参照) 亚结构域v i b 中的保守共有序列在丝苏氨酸激酶和酪氨酸激酶中是不同 的：、皿结构域v i b 在丝苏氨酸激酶中的共有序列通常为天冬氨酸一亮氨酸一赖氨 酸_ x x 天冬酰胺( d l k x x n ) ，与此相对的是在s r c 超家族类酪氨酸激酶中的共 宵序列为天冬氨酸一亮氨酸精氨酸一丙氨酸一丙氨酸天冬酰胺( d l r a a n ) ，其它 酪氨酸激酶中的共有序列为天冬氨酸一亮氨酸一丙氨酸一丙氨酸一精氨酸一天冬酰胺 ( d l a a r n ) 。这可以作为预测蛋白激酶属于哪一类的证据。 蛋白激酶所导致的蛋白质磷酸化普遍存在于生物体多种细胞中，同时，激 酶的磷酸化作用与磷酸酯酶的去磷酸化作用使蛋白磷酸化成为一个可逆的过 程，被h u n t e r 等形象地形容为中国传统的阴和阳【6 】。这种可逆的蛋白质磷酸 化现象几乎涉及所有生理过程，除了调节酶活性这一主要功能之外，从磷蛋白 在胚胎发育中的营养作用到细胞的生长发育、分裂分化的调控、粘附迁移、信 号传导、基因表达等等无不发生蛋白质的可逆磷酸化。与细胞代谢的其它调控 方式相比，其优点主要表现在以下几个方面：1 ) 可以控制细胞内已存在酶的“活 r ：酶量”，与酶的重新合成与分解相比，能使调控反应更加迅速而有效；2 ) 蛋 【7 l 磷酸化在信号传递过程中最重要的特点是对外界信号具有级联放大作用，胞 外的信号即使很微弱，但在一系列反应中，前一反应的产物是后反应的催化 利，每次修饰就产生一次放大作用，最终可以放大成千上万倍：3 ) 与其它调节 力式相比，蛋白磷酸化较少受胞内代谢产物的影响，能比较准确而且号一对信 号作m 反应；4 ) 蛋白激酶一旦被激活，其活性可通过某些方式( 如自身磷酸化) 维持较k 时问，因此在持续调控反应中起重要作用，研究表明，几乎所有的蛋 i i 激胁郁r 叮以进行自身磷酸化，这种作用既可以发生在酶分子之问，也可以发 生伍分r 之内【7 】。人体内多达2 0 0 0 种的蛋白激酶基因及1 0 0 0 种磷酸酯酶基 防l 所翻译出的各种蛋白激酶和磷酸酯酶，在人体中形成一个庞大的网络结构， 复呈叁堂堂旦兰兰型 渊节着生物体的正常生长发育，直至衰老死亡。 2 m a g u k s 家族和d i g 基因在信号传导途径中的作用 细胞通过激活信号传导途径从而接受外界信号并作出反应，这一过程是山 膜表匝的受体介导，并有包括激酶在内的许多信号蛋白分子的参与。研究发现， 这些蛋白在胞质中并不是自由存在的，而是通过支架蛋白( s c a f f o l d i n gp r o t e i n ) 彤成多分子复合物。不仅如此，在多细胞生物中，参与信号传导的蛋白更集中 在质膜的特定区域，如细胞连接或者细胞顶端侧部或底端侧部的表面。一方面 通过把信号分子有选择地置于适当的受体位置，使信号传递效率得以加强，另 方面在空间上限制了信号级联反应，从而允许不同的传导途径使用相同的中 间产物，但仍能够导致不同的下游应答。例如：在发育中的果蝇眼中，s e v e n l e s s s ( s e v ) 基因与表皮生长因子( e g f ) 共用相同的胞内信号传导中间途径，包括 r a s ，r a f 和m a p 激酶，却能引起各自特定的下游反应，并且这两种反应在果蝇 眼的正常发育中互不交叉。支架蛋白是一类包含多个能介导蛋白一蛋白相互作用 结构域的蛋白分子，这些结构域包括s h 3 结构域，p d z ( p s d 9 5 d i s c s l a r g e z o 1 ) 结构域等等。支架蛋白通常含有一至数个这类结构域，并且有的结 构域出现不止一次。 m a g u k s ( m e m b r a n e a s s o c i a t e dg u a n y l a t ek i n a s eh o m o l o g s ，膜相关的鸟苷 酸激酶同系物) 家族是近年来发现的类支架蛋白分子，它几乎存在于所有多 细胞生物中。这一家族的蛋白都含有以下几类结构域( 从氨基端到羧基端) ：1 ) 1 3 个p d z 结构域；2 ) s h 3 结构域；3 ) 与鸟苷酸激酶同源的结构域( g u k 结构域) ；4 ) 有的蛋白在s h 3 和g u k 结构域中间还含有一酸性功能单元，称 为h o o k 结构域。p d z 等结构域能介导蛋白一蛋白相互作用，通过这些蛋白蛋 自相互作用结构域，实现多信号蛋白复合物的形成及膜表面受体的聚集。 m a g u k s 家族按照其含有的结构域j i 同及序列相似性，可以分为以下四 个亚家族( 图1 ) ： 1 类d i g 的m a g u k s 蛋白 果蝇肿瘤抑制基因d i g ( 1 e t h a l ( 1 ) d i s c s 1 a r g e ) 是最早克隆的一个m a g u k s 家族成员。这一亚家族成员都含有与d i g 相似的结构域，包括三个p d z 结构域， 个s h 3 结构域和一个g u k 结构域，有的还含有h o o k 结构域。成员组成主 要足栗蝇d i g 蟹冈和人同源基因h d l g ，哺乳动物的突触密度蛋白p s d 一9 5 s a p 9 0 和c h a p s y n 一110 ，神经内分泌蛋白d i g s a p l 0 2 及人p d i i g k i a a 0 5 8 3 等。 2 类z o 一1 的m a g u k s 蛋白 哺乳动物的z o 一1 、z o 一2 、z o 一3 和果蝇t a m o u 基因组成这亚家族。哺乳 复旦大学硕士学位论文 基因定位于分隔连接( s e p t a t e j u n c t i o n ) 中。 z o - 1 的m a 鼠1 k s 蛋白都含有三 个p d z 结构域，一个s h 3 结构域和一个g u k 结构域，而与其它亚家族不同的 是在氨基端含有一段富含脯氨酸的区域。这一亚家族的成员在结构上非常相似， 唯一的区别是它们的羧基端各不相同，提示它们具有不同的生物功能a 3 类p 5 5 的m a g u k s 蛋白 这一类蛋白以人类p 5 5 蛋白为代表，它们都含有一个p d z 结构域，一个s h 3 结构域和一个g u k 结构域。p 5 5 蛋白最早从红细胞膜中分离出来，也存在于其 它细胞中。p 5 5 蛋白是一种十六烷酰化的蛋白，能够与红细胞的4 1 带蛋白相结 合。这一亚家族还包括哺乳动物的d 1 9 2 和d 1 9 3 蛋白。 6 复旦大学磺士学位论文 图1 m a g u i o 四个亚家族的结构特征。 ( a ：类d l g 亚家族，b ：类z o - 1 亚家族，c ：类p 5 5 亚家族， d ：类l i n - 2 亚家族。图中“h s ”表示人，“d m ”表示果蝇，“c c ”表示线虫。) 4 类l i n - 2 的m a g u k s 蛋白 此亚家族的代表是线虫l i n - 2 同源蛋白。类l i n - 2 的m a g u k s 蛋白都含有 一个p d z 结构域，一个s h 3 结构域和一个g u k 结构域。它们的羧基端与p 5 5 蛋白很相似，而氨基端又与钙钙调蛋白依赖性激酶类似。这一家族的蛋白还包 括人c a s k 蛋白及果蝇和爪蟾的c a m g u k ( c m g ) 蛋白。 目前研究认为，m a g u k s 蛋白的功能主要体现在两个方面：一是调控细胞 结构和细胞连接的形成；二是形成蛋白复合物，一方面介导信号传导，另一方面 集聚受体成簇，从而提高信号传导效率和速度。 许多种m a g u k s 蛋白是细胞连接复合物的重要组成部分。比如，果蝇的 d i g 蛋白定位于细胞分隔连接，并且对分隔连接的形成是必需的，同时由于它在 维持正常上皮的极性方面也是必不可少的，因此有人把d i g 蛋白与哺乳动物的紧 密连接相等同。p 5 5 与h d l g 在人类红细胞中能够形成所谓形状稳定蛋白复合物 ( s h a p e - s t a b i l i z i n gp r o t e i nc o m p l e x ) ，从而连接细胞骨架和质膜，维持红细胞的正 常形状，使红细胞能够更有效地进行气体交换。z o 1 、2 、3 是紧密连接的重要 组成部分，三者形成复合物；既能聚集密闭因子( o c c l u d i n ) ，又能与a - 连环蛋白 7 型型塑笪型丛 连坏蛋白和肌动蛋白微丝相结合。 m a g u k s 蛋白与参与信号传导的蛋白通过p d z 等结构域形成蛋白复合 物，一方面这使得信号传导顺利进行，如p s d 一9 5 s a p 9 0 ，它能够同时与n m d a 受体及神经一氧化氮合成酶结合，这种结合既能使信号分子富集，又能使n m d a 受体与神经一氧化氮合成酶在空间上靠近。另一方面，m a g u k s 蛋白能把膜表 面的离子通道或受体聚集，从而提高信号传导效率。如d i g 通过p d z 结构域与 s h a k e r 蛋白的羧基端结合，使s h a k e r 类钾离子通道在膜表面聚集成簇。 m a g u k s 蛋白的功能决定了它们在信号传导中的重要作用，既能组织、 装配信号分子，又能聚集信号分子，从而提高信号传导的速度和特异性，并且 也降低了信号交叉的可能性【8 ，9 】。 d i g ( 1 e t h a l f l ) d i s c s l a r g e ) 基因是m a g u k s 蛋白家族中最早克隆到的一个 肇因。1 9 8 9 年，w o o d s 等从果蝇的基因组文库中克隆到d i g 基因，并对此基因 在果蝇幼虫发育过程中的作用迸行了研究，发现d i g 基因的缺失能导致成虫盘 的成瘤性过度生长并失去上皮细胞的结构和细胞分化能力，直至幼虫死亡。推 测可能是由于d i g 的缺失导致接触抑制丧失，因此把d i g 归为肿瘤抑制基因 f 1 0 1 。d e n i e l s 等通过免疫荧光实验发现d i g 蛋白集中于侧向细胞膜顶端，即位 r 分隔连接部位，它在维持细胞的极性方面起重要作用【1 1 。人源化的d i g 基 阅丁1 9 9 4 年由l u e 等克隆，他们还证明了h d t g 蛋白能够与红细胞4 1 带蛋白 相结合。 d i g 蛋白含有三个p d z 结构域，个s h 3 结构域和一个g u k 结构域，人 源化的d i g 蛋自在s h 3 和g u k 之问还有一段h o o k 结构域( 图1 a ) ，这六个 结构域的功能各不相同。h o u g h 等通过把部分结构域缺失的d i g 基因转到d i g 完全缺失的d l g r n 5 2 突变体中，观察是否能补偿其功能的方法，研究各个结构域 对功能的影响f 1 2 1 。他们发现：1 ) p d z l 、2 结构域在所有m a g u k s 蛋白中结 构最接近，功能有重叠，而与p d z 3 则无论从进化上还是助能上都有很大匦别， p d z 2 结构域对d i g 定位于分隔连接是必不可少的。s o n g y a n gz 等发现p d z l 、 2 能以别蛋白质羧基端谷氨酸( 丝氨酸苏氨酸) 一x 一( 缬氨酸，异亮氨酸) 特钳 序列( e ( s t ) x ( v i ) ) ，并特异性地与之结合【1 3 】；2 ) s h 3 结构域虽然对分隔连 接的定位并不是必须的，但在分隔连接的形成和维持中是必不可少的，s h 3 结 构域中即使只有一个氨基酸残基发生突变，也能导致分隔连接的缺失和细胞的 过度生长= ：3 ) h o o k 结构域的缺失使d i g 蛋白无法定位于细胞膜上从而导致 分隔连接无法形成，最终结果是使细胞骨架无法形成，细胞失去对其生长的控 制而过度生长；4 ) g u k 结构域与真正的鸟苷酸激酶相比，某些与活性相关的 氨基酸残基发生改变或缺失，因此并不具备鸟苷酸激酶活性。g u k 结构域对d i g 的功能来说并不是必须的，即使g u k 结构域完全缺失的d i g 基因也能使d l g m 5 2 复且人学坝i j 学位论文 突变体恢复正常生长，而且g u k 结构域缺失越多，d i g 蛋白更能发挥功能，因 此推测g u k 结构域可能是d i g 蛋白的一段负调控区域。然而这种负调控需要 l j 其它蛋白相结合来完成，从而实现对细胞增殖的调控。 h o u g h 等发现p d z 2 和或p d z 3 结构域的缺失不会破坏细胞连接的结构， 但却能引起细胞的过度生长。这似乎与w o o d s 等的推测不谋而合r 他们认为并 一二是细胞连接本身引起细胞成瘤性生长，而是细胞连接中的某些结构调控着细 l 也 - k k 【1 4 】。因此d i g 的突变( 特别是那些影响d i g 中形成连接及影响定位的 突变) ，导致细胞连接不能形成或不能正确定位，才使得d i g 中调控生长的结构 4 ：能发挥f 常作用。 以上研究表明，d i g 不仅参与细胞连接与信号蛋白复合物的形成，并且具 有调节细胞生长的功能。但是d i g 作为支架蛋白在聚集并组装信号蛋白复合物 过程中介导何种信号途径至今仍不清楚。 3 p d z 结合激酶的克隆及功能研究 p d z 结合激酶( p d z b i n d i n gk i n a s e ，简称p b k ) 是由g a u d e t 等克隆，并 f2 0 0 0 年5 月1 0 同公开 1 5 1 。他们以人的h d l g 基因为诱饵，通过酵母双杂 交系统，从7 5 万个单克隆中最终筛选到两个克隆含有p b k 基因片段，再从h e l a 细胞c d n a 文库中克隆到全长基因。p b k 基因的全长c d n a 为1 5 k b ，编码3 2 2 个氨基酸残基，其一级结构符合蛋白激酶的1 2 个催化亚结构域特征。其羧基端 含有p d z 结构域结合特征序列：谷氨酸一苏氨酸一天冬氨酸缬氨酸( e t d v ) 。体 外实验表明，p b k 仅与h d l g 的p d z 2 结构域结合，而不与其它结构域结合，如 e t d v 序列发生突变，则结合也不能发生。但是通过免疫共沉淀并未从细胞中 分离到h d l g 与p b k 结合复合物。p b k 的m r n a 在胎盘中含量极为丰富，而在 心、肺、肝、骨骼肌、肾和胰腺中含量很低，脑中未见分布，推测可能是由于 胎盘细胞分裂活跃所致。未磷酸化的p b k 在体外不能表现其激酶活性，磷酸化 扁4 达到活性状态，并且p b k 能够自我磷酸化。研究发现，只有在有丝分裂期 ( m 期) 才能从细胞中分离到有活性的p b k 蛋白，而合成期( s 期) 则未分离 到，推测p b k 是一种有丝分裂相关的激酶。把含有p b k 与c d c 2 细胞周期因子 b 的载体共转化到s f 9 细胞中也能从中分离到有活性的p b k 蛋臼。若把未磷酸 化的p b k 蛋白与c d c 2 细胞周期因子b 蛋白进行体外磷酸化反应发现，虽然p b k 蛋白能被磷酸化，但并不具有激酶活性，推测c d c 2 细胞周期闲子b 在体内并不 是直接磷酸化p b k ，另一种可能是p b k 的激活除了被c d c 2 自h 胞周期因子b 磷 酸化外，还需要其它翻译后修饰。以上结果表明，p b k 在受到上游信号调控后 发生磷酸化，随后调控细胞有丝分裂，这其中可能还需要结合h d l g ，以与下游 9 复且人学坝i 学位论文 蛋自发，j 二作用。 4 精子发生及参与精子发生过程的激酶基因 精f 发生是指在睾丸中形成成熟精子的过程，是从二倍体的原始生殖细胞 分裂、分化成单倍体的成熟精子。胚胎发育早期已经形成的原始生殖细胞迁移 剑挈丸后形成精原细胞，当生物体性成熟后，精原细胞迅速分裂，一部分仍形 成精原细胞并维持二倍体形式及分裂能力，另一部分通过有丝分裂以及减数分 裂笫次分裂的d n a 复制过程形成初级精母细胞，初级精母细胞仍为二倍体， f hd n a 含量加倍。随着减数分裂继续进行，同源染色体分开，形成单倍体的 次级精母细胞。当减数分裂第二次分裂完成后精子细胞生成，随后通过一系列 变态反应成为成熟的精子。精子发生与卵子发生过程区别在于：1 ) 精原细胞是 小间断地完成分裂、分化过程，而不象卵子发生存在较长的静止期：2 ) 一个精 原细胞最后生成四个成熟精子，而一个卵原只生成一个成熟卵子。与精子发生 过程相对应的是精子生成、成熟的场所生精小管的结构。生精小管的细 胞结构按照精子发生的过程由外到早分别为精原细胞，初级精母细胞，次级精 母细胞，精子细胞和成熟精子，中间腔室为精子离开生精小管的通道( 图2 ) 1 6 。 i 问此通过免疫组化、免疫荧光或原位杂交等方法，很容易确定大量表达特定基 【太l 的细胞在尘精小管中的位置，从而确定这种基因作用于精子发生的哪个阶段。 图2 生丰占小管结构及精子发生过捌示意f l5 】。 复口人：学坝i 掌位沦文 至今仍不明确精子发生的分子机制，但由于蛋白激酶在细胞周期和细胞分 裂调控中的重要作用，对精子发生过程中蛋白激酶的研究成为探索精子发e 分 j - 机制的热点。已经有许多在睾丸组织中特异高表达的的蛋白激酶被克隆，并 刈它们的功能进行了初步研究，这包括酪氨酸激酶c - a b l 【1 7 】和f e r t 【1 8 】，丝 力，氨酸激酶t s s k l 和2 【1 9 】、t e s k 2 2 0 】，双重底物特异性蛋白激酶t e s k l 2 1 ， 2 2 l 等。根据这些激酶基因在睾丸中的高表达、幼年和成年小鼠睾丸中的表达差 片、激酶活性等等推测它们在精子发生中起着重要的作用。但大部分研究仍只 集一 ，在激酶本身性质的研究，因此进一步的工作将有助于揭示这些激酶基因的 牛物功能及精子发生的分子机制。 复口人学坝学位论义 材料与方法 i 材料 1 1 # 要试剂和酶类 引物山上海生一r 公司合成 d n a 提取液：复旦大学遗传所国家重点实验室产品 t a q 酶，复旦大学遗传所国家重点实验室产品 e l o n g a s ee n z y m em i x ，g i b c o 公司产品 q i a q u i c kp c r p u r i f i c a t i o nk i t ，q i a g e n 公司产品 q i a q u i c kg e le x t r a c t i o nk i t ，q i a g e n 公司产品 q i a p r e ps p i nm i n i p r e pk i t ，q i a g e n 公司产品 b ；g d y et e r m i n a t o r 测序试剂盒，p e r k i ne l m e r 公司 m i c r o s p i ns e p h e d e xg 一2 5c o l u m n ，a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 氯化钙：a m r e s c o 公司进口分装 t r i s ：分析纯，b o e h r i n g e rm a n n h e i m 公司产品 乙二腹凹乙酸( e d t a ) ：分析纯，安徽合肥工业大学化学试剂厂 琼脂粉：纯化，上海生物化学试剂公司 琼脂糖：上海y i t o 企业有限公司 氨苄青霉索：上海四药股份有限公司 b a m hi 、e c o ri 限制性内切酶，b i o l a b s 公司产品 t 4d n a 连接酶，b i o l a b s 公司产品 n ，n ，n 7 ，n7 四甲基乙二胺( t e m e d ) ，f l u k a 公司产品 n ，n 哑甲双丙烯酰胺，f l u k a 公司产品 丙烯酰胺，f l u k a 公司产品 过硫酸胺，s i g m a 公司产品 考马斯亮监r 2 5 0 ，a m r e s c o 公司产品，华美分装 | 一烷基磺酸钠( s d s ) ：s e r v a 公司产晶，华美公司分装 1 2 主要仪器设备 s c s 一2 4 型温控摇床，上海市离心机械研究所产品 s d j 一超净j 作台，上海淀山湖净化i 卫解产品 v 1 6 一央心式垂直电泳槽电泳装置，r 海精益有机玻璃制品仪器 f r - 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a r g f lu 1 6 9d e o rr e c a le n d a h s d r i7 ( k 呱+ ) p h o a s u p e 4 4 丸t h i 一1g y r a 9 6r e l a l 融合表达载体p g e x 一2 t ，a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 2 方法 2 1e d n a 文库的构建与基因序列的测定 墩水囊法引产之正常1 8 周胎儿的全脑组织，用一步法提取总r n a 后绛 o l i g o ( d t ) 纤维素柱分离纯化得到m r n a ，利用c l o n t e c h 公司的s m a r tp c r e d n al i b r a r yc o n s t r u c t i o n 试剂盒构建文库。用d y et e r m i n a t e 方法测定基因5 ， 型坠型坐丝丝 端序列，得到约5 0 0 b p 的有效序列，与n r 数据库进行b l a s t n 比较，若比较 结果表明该基因片段与数据库中其它基因或片段的同源性在9 0 以下，我们将 其判断为候选新基因，然后再对这些候选新基因的的3 端进行序列测定，并用 p r i m e 卜w a l k i n g 方法测定其全序列。每一份测序结果都将进行b l a s t n 的同源 性检索。对于测定完全序列并判断为新基因的克隆，为保证序列的可靠性，再 从基因的3 和5 端分别w a l k i n g 到5 和3 端，基因的5 端和3 端还分别用d y e p r i m e r