（遗传学专业论文）人pirh2基因剪接本2相互作用蛋白的初步研究.pdf

论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果论文中 除了特别加以标注和致谢的地方外不包含其他人或其它机构已经发表或撰写 过的研究成果其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确 的声明并表示了谢意 作者签名 纭伟 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定即：学校有权保 留送交论文的复印件，允许论文被查阅藕借阅：学校可以公布论文的垒部或部 分内容可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文保密的论文在解密后 遵守此规定 僦名：；益焦导师签名：堑量垒鱼日期：丝! ! ： 复旦大学硕士学位论文人p i r h 2 基斟剪接本2 相互作用蚩白的初步研究 中文摘要： 人p i r h 2 蛋白是一个新发现的泛素蛋白连接酶e 3 ，受到p 5 3 的诱导表达，又 能促进p 5 3 蛋白的泛素化降解，因此，p i r h 2 通过一种负反馈途径调控p 5 3 的转 录激活和细胞生长抑制功能。已有的研究表明p i r h 2 在肺癌和前列腺癌组织中过 量表达，p i r l l 2 的过量表达与癌症发生具有很强的相关性。此外，研究还发现p i t h 2 参与雄激素受体信号传导途径。 p i r h 2 剪接本2 ，p i r h 2 b 是我们实验室发现的p i t h 2r i n g 指结构域突变的剪 接异构体。我们通过r e a l - t i m ep c r 检测p i r h 2 a 和p i r h 2 b 在7 9 对肝癌和癌旁组 织中的表达，结果显示p i r h 2 a 和p i r h 2 b 都可能与肝癌的发生有密切关系。为进 一步研究p i r h 2 b 的功能，我们利用酵母双杂交技术以p i r h 2 b 为“诱饵”蛋白筛 选人胎肝e d n a 文库中，结果发现了1 2 个p i r h 2 b 的相互作用蛋白。我们选取 m t 2 a ，a r f 4 两个蛋白做了进一步研究。g f p 和r f p 荧光蛋白标记后显示p i r h 2 b 能分别与a r f 4 和m t 2 a 共定位于哺乳动物细胞中。p i r h 2 b 与m t 2 a 的相互作 用暗示p i r h 2 b 可能与m t 2 a 共同参与癌症的发生过程，而p i r h 2 b 与a r f 4 的相 互作用则说明p i r h 2 b 还可能参与了膜运输和膜结构的调控过程。 对p i r h 2 b 相互作用蛋白及其与癌症相关的分子机制的进一步研究有助于新 的抗癌药物的开发以及寻找新的癌症诊断、治疗的分子标记。同时发现的这些“猎 物”蛋白是否也与野生型p i r h 2 相互作用，它们是否是p i r h 2 的底物，值得做进 一步的研究。 关键词：p i r h 2 ，p i r h 2 b ，荧光定量p c r ，酵母双杂交，m t 2 a ，a r f 4 ，p u l l d o w n a s s a y , 荧光共定位 2 复旦大学硕士学位论文 人p i r h 2 基因剪接本2 相互作用蛋白的初步研究 a b s t r a c t ： p i r h 2 ，ar c c e m l yi d e n t i f i e du b i q u i t i n p r o t e i nl i g 鲫ee 3 ，c a np r o m o t ep 5 3 d e g r a d a t i o nv i au b i q u i t i n a t i o n p i r i l 2p a t i c i p a t e si n 孤a u t o r e g u l a t o r yf e e d b a c k p t h a tc o r l 仃o l sp 5 3 鼬l c t i o 胚i i l c l u d i i 唱p 5 3 _ d e p e n d c m 咖l s a c t i v a t i o na n dg r o w t l l h “b i t i o n p i r l l 2h a sb e e nf e p o n c do v e r c ) 叩r e s s e di l ll 吼gc 卸c e r 锄dp r o s 诅t ec 孤c 盯 w 池as 仃o n gc o r r e l a t i o nb 嘶e e ni n c r e a s e dp i r h 2e x p r e s s i o n 卸dc a r c i n o g e n e s i s m o r e o v e r ，p i r l l 2w 嬲r e p o n e dt op a n i c i p a t ei na n d r o g r c c e p 幻rs i g l l a l i i l gp a t h w a y p i d l 2 仃a 珊c r i p tv 撕a i i t2 ，p i r l 曲，i d e n t i f i e db yo u rl a b o r a l o r ) ，i sap i d l 2r g d o m a i nm u t a l l ta l t e m a t i v es p l i c i n gf o 眦w ep e 墒彻e dr e a l - t i m ep c ri n7 9i i v e r c 卸c e r 锄dn o 册a 1t i s s u c sa n dt h er e s u l ts h o w sp i r h 2 a 锄dp i m 2 bm a yb eb 0 恤 i 1 1 v o l v e di nc a r c i n o g e n e s i s f o rm r t h e rs t u d y w e 哪e dp i r h 2 b 西ab a i tt os c r e c na h u m 卸f 毫t a jl i v e rc d n a l i b r a r y 峭i n gy e a s tt 、v o - h y b r i d 船s a ya n df o u n d1 2p r e y s w e c h o s em t 2 a 粕da r f 4f o rf u r c i l e rs n l d y g f p 锄dr f p 协g g e d 缸i o np r o t e i 璐s h o w s p i r l l 2 ba n dm t 2 a ，a i u 4c o l o c a l i z e di nm 锄m a i i a i lc e l l sr e s p e c t i v e l y t _ h e i m e m c t i o no fp i r h 2 ba n dm 砣as u g g e s 乜p i r i l 2 bm a yi n v o l v ei i lc a r c i n o g e n e s i s t o g e t h e r 埘t 1 1m t 2 a ，w h 订ep 曲2 bi i l t e r a c t i n g 谢t h u 强4m a yi n d i c a t e s p i r l l 2 b p a r t i c i p a t e si i lt l l e 陀g u l a t i o no f m e m b 啪e _ a 伍c k i n ga n d 曲r i l c t i l r e t h es t u d yo fp i r l l 2 bw i l ls t i m u i a t e 缸t t l e ri n v e s t i g a t i o 璐t oe x p l o n e w a n t i c 锄c e rd m g s 锄df i n db i o m a r k e r sf o rc a n c e rd i a g n o s i s 姐dt h e r a p yn 、v i ub eo f g r e a t 、o n i lt os t i l d yw h e t l l e rt i l e s ep r c y si n t e r a c t s 、v i t l l 、】v i l d 啊p ep i r l l 2 粕da r et l l e c a n d i d a t cs u b s t r a t e so f p i r t l 2 k e y w o r d s ：p i 越，p i r h 2 b ，t e a l - t i m ep c r ，y e a s tt 、v o - h y b r i ds y s t e m ，m 配a ，舢讧4 ， p u l l - d o w l l 船s a y ，n u o r e s c e n tc o l o c a l i z a t i o n 3 复旦大学硕士学位论文人p i t h 2 基因剪接本2 相互作用蛋白的初步研究 f i g u r e1 u b i q u i t i np a t h w a y si nt h er e g u l a t i o no f p r o t e i nd e g r a d a t i o na n df u n c t i o n t r o i q u i t i ni sf i r s ta t t a d 他dt oe 1u b i q u i t i n - a c t i v a t i n ge n z y i n ei nt h ep i 联船m o f a t p t h ea c t i v a t e du b i q u i t i ni st h e nu a n s f e r r e dt oe 2u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n ge n z y l n e e 3 u b i q u i t i nl i g a s er e c o g n i z e sap r o t e i ns u b s t r a t e , r e c r u i t sae 2 - u b i q u i t i nc o m p l e x , a n d c a t a l y z e su b i q u i t i nt r a n s f e rf r o me 2t os u b s t r a ：t c as i n g l er u no f t h er e a c t i o nc a u s e s m o n o u b i q u i t i n a f i o no f at a r g e tp r o t e i nt h a tc o u l dc h a n g ei t sf u n c t i o n , w h e r e a s m u l t i p l er u n so f t h er e a c t i o nl e a dt op o l y u b i q u i t i n a f i o no f t h es u b s t r a t e d e p e n d i n go n u b i q u i t i n u b i q u i t i nl i n k a g e ，p o l y u b i q u i t i n a t e dp r o t e i n sg a l le i t h e rb ea c t i v a t e d ( t h r o u g hk 6 3l i n k a g e ) ，o rr e c o 掣1 i z e da n dd e g r a d e db yt h e2 6 sp r o t e a s o m e ( t h r o u g h k 4 8 l i n l m g e ) 图片来源：y is u n ( 2 0 0 6 ) e 3u b i q u i t i nf i g a s e s 嬲c a n c e rt a r g e t sa n db i o m a r k c r s n e o p l a s i a8 ( 8 ) ，6 4 5 - 6 5 4 m d m 2 ( m m i n ed o u b l em i n u t e - 2 ) 是最早发现的一个p 5 3 的e 3 酶。m d m 2 包含 有一个i t g 指结构，具有e 3 酶活性。它能泛素化p 5 3 蛋白，导致p 5 3 的降解。m d m 2 能介导p 5 3 的核质穿梭，改变p 5 3 的亚细胞定位。m d m 2 对于调控p 5 3 蛋白水平起 着关键性的作用。在正常状态的细胞中，m d 玎也与p 5 3 结合并导致p 5 3 的降解，使 复旦大学硕士学位论文 人p i t h 2 基因剪接本2 相互作用蛋白的初步研究 得p 5 3 的蛋白量保持在一个很低的水平。当细胞受到不利刺激，例如放射性照射 或使用抗癌药物，导致d n a 损伤，p 5 3 会被磷酸化和乙酰化，从而与m d m 2 分离， 并发挥转录激活活性，诱导下游基因的表达，最终导致细胞生长抑制和细胞凋亡。 研究者发现由于p 5 3 导致的细胞凋亡，m d m 2 1 一细胞是致死的；而m d m 2 1 一，p 5 3 叫一则挽救了细胞。由于m d m 2 对与p 5 3 功能的重要影响，m d m 2 在人类中的同源蛋 i 刍h d m 2 被认为是一个很有希望的抗癌靶点。通过抑$ i j h d m 2 的作用，可以激活p 5 3 的功能，从而诱导肿瘤细胞的周期控制和细胞凋亡。目前，这方面研究已经取得 实质性进展，开发了多种抗癌药物。 p i r h 2 是最近发现的一个新的泛素蛋白连接酶e 3 ，能够促进p 5 3 蛋白泛素化降 解。p i r h 2 基因编码一个2 6 1 个氨基酸的蛋白，包含一个锌指结构域( z nf i n g e r d o m a i n ，6 2 8 0a a ) 和一个环指结构域( i u n g h 2d o m a i n ，1 4 5 1 8 6a a ) 。完整 的r i n g 指结构包含有e 3 酶的活性。r i n g 指家族成员都具有一个r i n g 指结构， 含有8 个保守的c y s 和h i s 残基，与两个z n 离子结合，形成交叉环形。根据与z n 离 子结合的第五个残基是h i s j 丕是c y s ，可分为两种r i n g 指结构，c 3 h c 4 和c 3 h 2 c 3 。 p i r h 2 所具有的r i n g 指结构域则属于c 3 h 2 c 3 类型，是泛素连接酶家族成员所具 有的保守结构。 2 0 0 3 年，r o g e rel e n g 等人报道p i r h 2 能与p 5 3 相互作用并促进p 5 3 的泛素 化降解，并受到p 5 3 的诱导表达。同时他们检测到p i r h 2m r n a 在肝中表达量最 高，睾丸和心脏中次之，肌肉和脾中最低。因此，和m d m 2 一样，p i r l 正也是通 过负反馈调控途径( a u t o r e g u l a t o r yf e e d b a c kl o o p ) 控制p 5 3 的功能。p i r h 2 通过 与p 5 3 的直接相互作用和其自身的e 3 酶活性抑制p 5 3 的转录激活功能，并影响 p 5 3 介导的细胞生长抑制和细胞周期控制。已有的研究发现p i r h 2 在肺癌、前列 腺癌中过量表达。这些发现与p i r h 2 的过量表达降低了p 5 3 的蛋白水平并导致癌 症发生的假设是一致的。对p i r h 2 功能的研究表明p i r h 2 是一个很有希望的治疗 癌症的分子靶点，对p i r h 2 的进一步研究将有助于开发新的抗癌药物和癌症预防、 诊断的分子标记。 除了与p 5 3 的相互作用，研究者还发现p k h 2 参与雄激素受体( a n d r o g e n r e c e p t o r ，a r ) 介导的信号通路。雄激素信号转导通路参与前列腺的发育、分化 和癌变。p i r h 2 与该通路中的多个组分相互作用，包括：a r ，t i p 6 0 ( t a t i n t e r a c t i v e 6 复旦大学硕士学位论文人p i r h 2 基吲剪接本2 相互作用蛋白的初步研究 2 材料和方法 2 1 材料 2 1 1 菌株 1 a b l ei t h ee i ? 白以s t r a i n su s e di nt h i ss t u d y 菌株名称说明 t o p l o b l 2 1 【rm r c a ( m 丌- 1 1 s d 砌“s - m c r b c ) 巾8 0l a c z m 1 5 l a c x 7 4d e o r r e c a la m d l 3 9 ( 盯a - l e u ) 7 7 6 9 7g a l ug a l kr p s l ( s 仃r ) e n d a ln u p g 】。 用于质粒扩增。 f - o m p t h s d s ( r b + m b 一) g a ld c m m e t 。 用于g s t 融合蛋白的表达。 a h l 0 9 y 1 8 7 购自于c l o n t e c h 公司。 m a t a ，仃p 1 - 9 0 l l e l l 2 - 3 ，1 1 2u m 3 5 2l l i s 3 - 2 0 0g a l 4 g a l 8 0 l y s 2 ： g a l lu a s - g a l l t m h i s 3g a l 2 u a s g a l 2 t t a d e 2 u r a 3 ：m e l l u a s m e l l l m l a c z ，m e l l 。 用于酵母双杂交系统。 购自于c l o n t e c h 公司。 m a t a ，u r a 3 5 l l i s 3 - 2 0 0a d e 2 - 1 0 1 仃p l 一9 0 l l e l l 2 - 3 ，1 1 2 ，g a l 4 m e t g a l 8 0 u r a 3 ：g a l l u a s g a l l l = c 蛆 a l a c z 。 用于酵母双杂交系统的m a t i n g 测试。 2 1 2 细胞系 h e l a 细胞和肝癌细胞h e p 3 b 由复旦大学遗传所提供，用于荧光共定位。 8 复旦大学硕士学位论文人p i t h 2 基因剪接本2 相互作用蛋白的初步研究 t a b l e4 s e q u e n c eo fp r i m e r su s e di nt h i ss t u d y p g b k t 7 一p i r h 2 bf p g b k t 7 一p i r h 2 br p g a d t 7 一p i r h 2 bf p g a d t 7 一p i r h 2 br p g b k t 7 一p i r h 2 b nr p g b k t 7 一p i r h 2 b cf p g b k t 7 一m t 2 af p g b k t 7 一m t 2 ar p g a d t 7 一m t 2 af p g a d t 7 一m t 2 ar p g a d t 7 一a r f 4f p g a d t 7 一a r f 4r p g a d t 7 一a i g lf i ) g a d t 7 一a i g ir i ) g a d t 7 一r 3f 1 ) g a d t 7 一r 3r f ) g e x 一5 x 一卜m t 2 af f ) g e x 一5 x 一卜m t 2 ar p g e x 一5 x 一1 一a r f 4f p g e x 一5 x l a r f 4r p g e x 一5 x 一1 一a i g lf p g e x 5 x 。1 。a i g lr p g e x 。5 x 1 r 3f p g e x 一5 x l r 3r p e g f p 。c 1 p i r h 2 bf 5 - g a g c a t a t c g g c g a c g g c c c g 6 g 一3 5 g g a g t c g a c g c t a c t t c a t c a t c c 一3 同p g b k t 7 一p i r h 2 bf 5 - g a g c t c g a gg c t a c t t c a t c a t c c 一3 5 一g a g g t c g a c t c c a c a g t t t t c a c a c - 3 5 g a g c a t a t g g g 从t t t g t a g g a t t g g 一3 5 - g a g c a t a t g g a t c c c a a c t g c t c c t g c g c c g - 3 5 一g g a g t c g a c t c a g g c g c a g c a g c t g c a c t t g t c c - 3 同p g b k t 7 一m t 2 af 5 一g a g c t c g a g t c a g g c g c a g c a g c t g c a c t t g t c c 一3 5 - g a g c a t a t g g g c c t c a c t a t c t c c t c c c t c t 一3 5 一g a g c t c g a g t t 从c g t t t t g a a a g c t c a t t t g a c - 3 5 _ g a g c a t a t g g c g c t t g t c c c c t g c c a g g t g c 一3 5 一g a g c t c g a g t c a t t c c a a t t t a g g c t t t t c t t t c - 3 5 一g a g c a t a t g g g g g a t g c c c t a c c c c c c t t c c - 3 5 一g a g c t c g a g t c a g g c t g g g a g c g c c g c t g t g t g g 一3 5 一g c c g a a t t c g a t c c c 从c t g c t c c t g c g c c g - 3 5 一g a g c t c g a g t c a g g c g c a g c a g c t g c a c t t g t c c - 3 5 一g c c g a t t c g g c c t c a c t a t c t c c t c c c t c t 一3 5 一g a g c t c g a g t t 从c g t l 丁t g a a a g c t c a t t t g a c - 3 5 一g c c g a a t t c g c g c t t g t c c c c t g c c a g g t g c 一3 5 一g a g c t c g a g t c a t t c c 从t t t a g g c t t t t c t t t c - 3 5 一g c c g 从t t c g g g g a t g c c c t a c c c c c c t t c c - 3 5 一g a g c t c g a g t c a g g c t g g g a g c g c c g c t g t g t g g 一3 5 - g a g c t c g a gg c g g c g a c g g c c c g g g 一3 i o 删刚删m 洲 删 川 洲 川删删删删删删删 脚 川 脚 m 脚 删 脚 m m 复旦大学硕士学位论文人p i t h 2 基因剪接本2 相互作用蛋白的初步研究 p e g f p c 1 。p i r h 2 br p c m v h a m t 2 af p c m v 。h a 。m t 2 ar p c m v 。h a 2 。a r f 4f p c m v 。h a 2 。a r f 4r p c m v 。h a 2 a i g if p c m v h a 2 。a i g lr p c m v 。h a 2 r 3f p c m v 8 a 2 r 3r p d s r e d l 。c 1 。m t 2 af p d s r e d l c i 。m t 2 ar p d s r e d l n 1 。a r f 4f p d s r e d l 一n i a r f 4r p d s r e d l n 1 a i g l f p d s r e d l 。n i a i g lr p d s r e d l 。n 1 r 3f p d s r e d l 一n 1 一r 3r e c o r i s f i l x h o i 1 7d j - i i e c o r i h i 仃a i i i e c o r i 1 仃a i i i e c o r i s “1 s f i l h i n d i s a li h i n d l s a li h i n d l i i s a li g c 啦丛卫g c t a c t t c a t c a t c c 一3 一t t a g g c c a t g g a g g c c a t g g a t c c c 从c t g c t c c t g c 一3 一t t a c t c g a g t c a g g c g c a g c a g c t g c a c t t g t c c g a c 一3 - t a c a a g c t t g c c a c c a t g g g c c t c a c t a t c t c c t c c 一3 一g c c g a a l v r c a c g t t t t g a 从g c t c a t t t g a c a g c c 一3 一t a t a a g c t t c c c a c c a t g g c g c t t g t c c c c t g c c - 3 一g c c g 从t t c t t c c 从t t t a g g c t t t t c t t t c t c t t c 一3 - t a c a a g c t t g c c a c c a t g c c a g t g c c t g c t c t g t g c c t g 一3 - t a t g a a t t c g g c t g g g a g c g c c g c t g t g t g g a g t c t c 一3 一t t g g c c a t t a c g g c c a t g g a t c c c 从c t g c t c c t g - 3 一 i t g g c c g a g g c g g c c t c a g g c g c a g c a g c t g c a c 一3 一t a c a a g c t t g g c c t c a c t a t c t c c t c c c t c t 一3 一g c c g t c g a c t g a c g t t t t g a a a g c t c a t t t g a c a g c c - 3 一t a c 从g c t t g c g c t t g t c c c c t g c c a g g t g c 一3 一g c c g t c g a c t g t t c c a a t t t a g g c t t t t c t t t c t c l v r c 一3 一t a c 从g c t t g g g g a t g c c c t a c c c c c c t t c c - 3 叫c g t c g a c t g g g g c t g g g a g c g c c g c t g t g t g g a g t c t c 一3 2 1 5 主要试剂和试剂盒 m a t c h m a k e rg a l 4 酵母双杂交系统3 ( c l o n t e c h ) ，c l o n t e c h 人胎肝e d n a 文库 购自美国b d 公司。t a q 酶，p f u 酶，d n a 限制性内切酶，t 4 d n a 高效连接试剂 盒购自t a k a r a ( 大连) 公司。y e a s te x 仃a c t ，b a c t o p e p t o n e ，b a c t o - a g a r , y e a s t n i t r o g e nb a s e ( y n b ) w ，oa m i n oa c i d s 购自美国d i f c o 公司。x g a l ，3 a t ( 3 一a m i n o 1 ，2 ，4 一t r i a z o l e ) ，2 1 2 3 0 0 u m 玻璃珠购自美国s i g m a 公司。 i r i s ，p e g 3 3 5 0 ， 巯基乙醇购自德国m e r c k 公司。单链鱼精d n a ( s s d n a ) 购自上海博采生物技 术公司。n c 硝酸纤维素膜( n i t r o c e l l u l o s em e m b r a n e ) 购自s h l e i c h e r & s c h u e l l 公 司。酵母s d 培养基的氨基酸d r o p o u t 混合物购自美国b d 公司。 o n p g ，t r i t o nx 1 0 0 ，t w e e n 2 0 ，。细胞裂解液，细胞固定液购自碧云天生 物技术研究所。p v d f 膜购自b i o r a d 公司。g l u t a t h i o n es e p h a r o s e4 b 购自于 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 复旦大学硕士学位论文 人p i r l l 2 基因剪接本2 相互作用蛋白的初步研究 a _ pb u 脉：n a c l5 8 5 9 ，m g c l 21 0 2 舀1 mp h 9 5 嘣s1 0 0 m l ，d d h 2 0 定容至1 l a 1 0 丽春红s ：丽春红so 1 9 ，三氯乙酸1 5 9 ，磺基水杨酸1 5 9 ，d d h 2 0 定 容至l o o m l 。 封闭液( 使用当天配制) ：l p b s + o 0 5 t 、e e i l 2 0 + 5 脱脂奶粉( 过滤后使用) 。 d m e m 完全培养基：含1 0 新生牛血清，1 0 0u m l 青霉素，1 0 0 m l 链霉 素。 2 1 7 主要试验仪器 1 ) 超纯水系统( m i l l i qp l u s ) 2 1p l 2 0 0 2 型电子天平( m e t t l e r ) 3 ) 8 0 超低温冰箱限e v c os c i e m i n c ) 4 ) 蛋白电泳电源( b i o r a d ) 5 ) 蛋白电泳槽( b i o r a d ) 6 1 半干式电转移仪( b i o r a d ) 7 ) c 0 2 培养箱( t h e 珊o ) 8 ) 3 k l o 低温离心机( s i g m a ) 9 ) 荧光显微镜( 0 l y m p 岫) l o ) p c r 仪( h y b a i d ) 2 2 方法 2 2 1 序列分析 d n a 序列用b l a s t h 或b l a s t x 在n c b i 的核酸数据库查寻。用d n a m a n 进行d n a 和氨基酸序列比对，p r i m e r5 进行引物设计。推测的氨基酸顺序用 b l a s t p 在蛋白质数据库中寻找同源序列。 2 2 2 大肠杆菌感受态制备及转化 t o p l 0f 菌种划l b 平板，3 7 孵育过夜。取单菌落转接种至3m l 无抗性的 l b 液体培养基中，3 7 2 5 0r l 珊振摇培养过夜。次日取o 5m l 接种至5 0m ll b 培养基中，3 7 振摇培养约2 3h ( 振摇速度约为2 0 0 - 3 0 0f p m ) ，待o d 6 0 0 值达 到0 4 o 6 时将烧瓶取出立即置冰浴1 0 一1 5m i l l 。4 5 0 0 0r p m 离心5m i n ，弃培 1 4 复旦大学硕士学位论文人p i t h 2 基因剪接本2 相互作用蛋白的初步研究 1 1w e e k ) 1 1 - 3 w e 口k s ) ( 3d a y s - 1w e e k ) ( 3d a y s - 1w e e k ) u s es e q u e n t j a io rs i m u i r a i l e o u $ m e t h o d s l l s e c u o n i x b l i ( 3 h n h i g hs t r i n g e n c y ：$ d - a d e - h i s - l e u - t r p ) a - g a m e d i u m s t r i n g e n c y ：s o - h i s l e u - l r pl o ws t r i n g e n c y ：s d - l e u - t r ps e c t i o n i x c l1 5d a y s - 2 week) 墨皿墨皿墨盈is e c u e n xif i g u r e 3 o v e r v i e wo f p e r f o r m i n ga y e a s tt w o - h y b r i d screent h i sp i c t u r e i sc i t e df r o mc l o n t e c hm a t c h m a k e rg a l 4t w o h y b r i ds y s t e m3 & l i b r a r i e su s e rm a n u a 2 2 4a d 文库扩增 2 2 4 1 文库扩增 取文库菌液2 0 p l ( 根据滴定的浓度算出所用的文库量) ，稀释至1 2 m l l b + a m p 培养基中，混匀，取4 0 0 p l 涂布3 0 块1 5 0 m m 的l b + a m p 平板，静置， 待菌液完全吸收后，将平板倒置，3 0 培养约4 0h r 。 2 2 4 2 菌体收集 1 6 复旦大学硕士学位论文人p i t h 2 基因翦接本2 相互作用蛋白的初步研究 母菌株a h l 0 9 ，p g b k t 7 p i r h 2 b 、p g b k t 7 和p g b k t 7 l a m 分别转化酵母菌株 y 1 8 7 。按照以下3 组排列： 1 1 p g a d t 7 一g e n e a h l 0 9 + p g b k t 7 - p i r h 2 b y 1 8 7 2 1 p g a d t 7 - g e n e a h l 0 9 + p g b k t 7 y 1 8 7 3 、p g a d t 7 g e n e a h l 0 9 + p g b k t 7 一l a m y 1 8 7 将两种酵母共同接入o 5m ly p d a 液体培养基中，充分震荡使细胞分散。 3 0 ，2 2 0r p m 摇过夜( 2 0 2 4 h ) 。取1 0 0 肛1 菌液涂s d t l 平板，把平板放3 0 烘箱培养2 4 天。待菌落长出后，挑取单克隆在s d t r p - l e u h i s a d e + 2 5 r a m3 a t 平板上划线，并做f i l t e r 检测，观察3 个报告基因的表达情况。 2 2 1 0 酵母双杂交载体互换验证蛋白质相互作用 利用n d ei 酶和p s ti 酶将p i r h 2 b 基因从p g b k t 7 载体切下并连接到已同样 酶切的p g a d t 7 载体上；同样用n d ei 酶和p s ti 酶将p r e y 基因从p g a d t 7 载 体酶切下并连接到p g b k t 7 载体上。经d n a 测序验证两个基因与相应载体o r f 的一致性。将 1 ) p g a d t 7 p i r h 2 b + p g b k t 7 一g e n e ， 2 ) p g a d t 7 - p i r h 2 b + p g b k t 7 3 ) p g a d t 7 + p g b k t 7 一g e n e ， 4 ) p g a d t 7 + p g b k t 7 4 组质粒分别共转化a h l 0 9 ，检测3 个报告基因表达情况。 2 2 1 l 片段缺失实验确定相互作用区域 2 2 1 1 1 截短体载体的构建 将p i r h 2 b 蛋白分成两段，分别是p i r h 2 b n ( 1 - 1 0 6a a ) 和p i r h 2 b c ( 1 0 6 1 8 8 a a ) 。 设计引物p c r 扩增基因片段p i r h 2 b n 和p i r h 2 b c ，分别克隆到p g b k t 7 载体上。 将 1 1 p g b k t 7 一p i r b 2 b n + p g a d t 7 - m t 2 a ； 2 、p g b k t 7 - p i r h 2 b c + p g a d t 7 - m t 2 a 3 1 p g b k t 7 p i r h 2 b + p g a d t 7 - m t 2 a 复旦大学硕士学位论文人p i t h 2 基因剪接本2 相互作用蛋白的初步研究 3 组质粒分别共转a h l 0 9 。检测转化子的三个报告基因的表达情况。 2 2 1 1 2o n p g 方法测定p g a l 酶活性 在2 5 m ls d t l 液体培养基中接种共转化的单菌落，3 0 ，2 5 0 r p m ，摇床培 养过夜；取适量种子液转接5 m ly p a d 培养基，接种量控制在o d 6 0 0 值约为0 5 。 3 0 继续培养至o d 6 0 0 达到1 0 1 5 ：取少量培养液测定并记录o d 6 0 0 值，剩余 培养液分装于e p p e n d o r f 管中( 做两份平行样记录培养液体积v ) ，离心，除去 上清；加入5 0 0 i mzb u f f e r 悬浮菌体，离心，除去上清；加入1 0 0 肛1zb u f f e r 再悬 浮细胞，于液氮中反复冻融，使细胞破裂；再加入7 0 0 u jzb u f f e r 与巯基乙醇的 混合液于样品中，加入1 6 0 山o n p g ( 4 m g m l ，溶于zb u f f e r 中) ，3 0 1 2 水浴，开 始计时：检测反应液的颜色变化，有黄色形成后，添加4 0 0 1 a l1 m n a e c 0 3 于反应 管中，停止反应，并记录时间t ( 一般反应时间在5 m i n 2 4 h r ) ；离心，取上清移 入比色皿中，测o d 4 2 0 吸收值并记录，以对照菌株a 作为空白对照；计算p g a l 活性，3 - g a l = 1 0 0 0 x o d 4 2 0 ( t x v x o d 6 0 0 ) 2 2 1 2 体外结合实验 2 2 1 2 1 大肠杆菌诱导表达g s t 融合蛋白( p e t 融合蛋白表达与g s t 相似，把 诱导条件改为2 2 6 h r ) 1 ) 在3 m ll a ( l b 中添加a m p i c i l i n 至终浓度1 0 0 i t g m 1 ) 中接种已转化 p g e x 一5 x l 和p g e x - 5 x - l - g e n e 的b l 2 1 菌株( p e t 表达质粒p e t - 3 2 a 和 p e t - 3 2 a g e n e ) ，3 t c 过夜培养。 2 ) 测o d 6 0 0 值，取适量培养液( 一般为2 m 1 ) 转接于5 0 m ly t g ( 含a m p i e i l i n 1 0 0 1 a g m 1 ) 中，使o d 6 0 0 值为0 1 。 3 ) 3 0 c ，2 2 0r p m 培养至o d 6 0 0 值为0 6 - 0 8 ( 约2 h r ) ，加5 0 u l1 0 0 r a mi p t g 于 培养液中，2 7 c ，2 2 0r p m ，l h r ( 可以根据表达情况改变，如蛋白容易降解 可以降低温度，延长表达时间) ，诱导g s t 融合蛋白的表达。 4 ) 7 0 0 0r p m 离心5 m i n ，收集菌体，去上清；用1 0 m l 预冷的p b s 洗涤( p e t 融 合蛋白用b i n d i n gb u f f e