（遗传学专业论文）山药多糖提取工艺优化及结构分析.pdf

摘要 山药( d 幻5 c o 陀口凸d 加尬jd p c m p ) ，又名白苕、土薯、大薯、薯 药，营养丰富，具有很高的药疗价值。本草纲目记载：山药性温、 味甘平、无毒，健脾胃、益肺肾、涩精止泻；山药还具有抗衰老、 抗氧化、提高应激力、增强免疫力、降血脂、抗肿瘤、抗突变等功 效，山药中起到药疗作用的主要成分是山药多糖。本文主要研究山 药多糖的提取工艺、分离纯化及多糖的结构分析。提取工艺主要考 虑浸提水溶液温度、p h 值、料水比和浸提时间对多糖得率的影响， 研究最佳的粗多糖浸提工艺参数；首先进行单因素试验，在此基础 上采用正交实验进行分析，进而采用中心组合设计进行中试，最后 经统计软件m a t l a b 编程进行多元线性回归分析得到山药粗多糖较优 化提取工艺为：p h 值为9 1 3 ，料水比为l ：5 5 ，浸提温度8 5 左右， 沉淀时酒精浓度7 0 ，离心转速1 9 0 0 g ，所提取的粗多糖含纯多 糖为20。分离纯化从山药入手，脱除蛋白质与酒精沉淀后，采用离子交换树脂d e a e 一5 2 和s e p h a d e x g l o o 进行分离，结果得到 中性和酸性两种不同性质的多糖，中性多糖和酸性多糖颜色均为为 纯白色。气相色谱分析表明：山药中性多糖主要由鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖组成，其组成比例为8 ：1 6 ：2 5 ：1 0 ，酸性多糖主要 由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖组成，其组成比例为7 ： 3 ：1 1 ：1 9 ：1 8 。高效液相色谱分析可知中性多糖和酸性多糖的分子。 量分别为1 5 5 9 8 d 和2 1 5 0 0 d ；红外分析可知中性多糖和酸性多糖分 别含有吡哺糖和q 糖苷键构型。 浙江大学坝i 学位论文 p r o f e s s i o n a ls t a t i s t i c a ls o f t w a r e t h eo p t i m a l e x t r a c t i n g p r o c e d u r ew a sp h 9 1 3 ，山er a t i o between脚teriala n dw a t e r1 ：5 5，u n d e rt h i s conditionst h e p o l y s a c c h a r i d ep u r i t yi nc n l d ei s2 0 f o rpurification o f p o i y s a c c h a r i d e ，t h e p r o t e i ns h o u l db er e m o r v e d 士r o m t h e supematant，t h e n t h ep o l y s a c c h a r i d ew a sp r e c i p i t a t e d a g a i nw i t he t h a n o la t t h ec o n c e n t r a t i o no f 7 0 f 0 1 l o w i n g ，i o n e x c h a n g e c o l u m nd e a e 一5 2 a n d s e p h a d e xg 一1o oc o l u n m c h r o m a t o g r a p h y w e r eu s e da st h e1 a s t stepo fi s o l a t i o n a tl a s tt w o m a i np o 】y s a c c h a n d ee l e c t r i f e m u s polysacchandea n d n o n e l e c t r i f e r o u sp o l y s a c c h a r i d ew e r e s e p a r a t e df 0 h nt h e di()sc()蹭c!扫俄8 觏sd e c m g ，w h i c hc a n b eu s e df o rs t n l c t u r e a n 出y s i s g a s c h r o m a t o g r a ma n a l y s i s s h o w e dt h a tt h e e l e c t r i f e r o u sp o l y s a c c h a r i d e w a s m a d e u po f ，n o n e l e c t r i f e r o u sp o l y s a c c h a r 主d ew a sm a d eu po f ，h p l c a n a l y s i s t e s t i f i e dt h em o i e c u l a rw e i g h to fe i e c t r i f e r o u sp o l y s a c c h a r i d e a n dn o n e l e c t r i f e r o u sp o l y s a c c h 砸d ea r e1 5 9 8 8a n d2 1 5 0 0 d ，i n f a r e d s p e c t n l m s h o w e dt h a te l e c 讲f e r o u s p o l y s a c c h a 矗d e i s e p i r r i e r s 9 1 y c o s i d i cb o n d ，n o n e l e c t r i f e r o u sp o l y s a c c h 撕d e i sp y r a j l o s e t h i sr e s e a r c hw o 血w o u l de s t a b l i s h a s t r o n g b a s e m e n tf o rt h e a p p l i c a t i o n so f d i o j c o 坩口扫以加m jd p c m p p o l y s a c c h a r i d e i nd r u gi n d u s t 彤 a n da l s op o i n to u tt h ee f f i c i e n tw a yt oi n d u s t r i a l i z e de x 廿a c to fd i 。占他。 白以施m sd 已c m 已p o l y s a c c h a r i d e k e y w o r d s ：d i o s c d 地口6 口搬纪sd 已c m 已p o l y s a c c h a r i d e p u f i f i c a t i o n s e p a r a t i o n s t m c t u r ea n a l y s i so p t i i n i z a t i o n 6 浙江人学颂士学位论文 分子量测定常用的方法有层析柱法和高效液相色谱法。赵国华等人以 d e x t r a n 系列标准品的分子量与对应的洗脱体积作标准曲线，再根据多糖的洗脱 体积求得分子量：乔善义等人采用h p l c 法检查所得多糖的纯度和测定分子量， 由标准d e x t r a n ( 分子量分别为5 2 7 0 0 ，4 3 0 0 0 ，2 1 4 0 0 ，1 7 5 0 0 ，5 0 0 0 ) 的分子量 对数与保留时间求得标准曲线，求m 回归方程，再根据保留时间求出样品的分 子量。 1 3 课题立项依据和研究内容 范俊安等人进行过山药多糖提取工艺的优化研究m 1 ，但是分析简单，统计 分析不完善，可信度不高，因而有必要对提取工艺重新进行优化并进。步放大， 以适应工，规模化生产的需要。赵国华等人从山药中分离卅了中性多糖| 2 “，但 没有分离卅过酸性多糖，对山药酸性多糖组成、结构、分子量分析至今没有相 关文献报道。 本研究将采用单因素设计、正交试验和中心组合试验，结合数理统计方法 进行工艺优化，并采用多元线性回归分析建立数学模型，最终获得最佳多糖提 取工艺，为工业化放大提供基础。同时进行山药酸性多糖和中性多糖分离纯化， 在此基础上测定多糖的分子量、组分和摩尔比，并用现代仪器分析表征多糖的 部分结构。 浙江人学硕十学位论文 第二章材料与方法 2 1 仪器和设备 b s 1 6 0 a 自动部分收集器卜海沪西分析仪器厂 t h 一型梯度混合器卜海精科实业有限公司 b t i 0 0 1 0 0 m 型恒流泵保定兰格叵流泵有限公司 分光光度计h p 一6 0 1 0美国惠普公司 离心机2 0 p r 一5 2 d日本日立公司 真空泵s h b 1 l l郑州长城科工贸有限公司 旋转蒸发器r 系列卜海申生科技有限公司 纯水蒸馏器d 1 8 l d c卜海申胜生物技术有限公司 磁力搅拌器7 8 一l a杭州仪表厂 微量分析天平l i 海精密科学仪器有限公司 玻璃板，毛细管，层析缸，吹风机校设备科 电热干燥箱d h g 一9 1 4 0 al 海一恒科技有限公司 p h 计德国c h e c k e r n e x u s6 7 0f t 一取傅立叶变换红外光谱分析仪 美国m c o l e t 公司 h p 6 8 9 0 气相色谱仪美国 h c e r s 高效液相色谱仪w a t e r s 公司 2 2 主要材料和试剂 d e a e 一5 2 填料国药集团化学试剂有限公司 d e x t r a nt 一系列北京经科公司 s e p h a d e xg 1 0 0卜海化学试剂厂 蓝色葡聚糖国药集团化学试剂有限公司 透析袋( 截留m l j 4 ，o o o )， l 海生工 毗啶卜海凌峰化学试剂有限公司 盐酸羟胺浙江杭州双林化工试剂厂 乙酸酐卜海凌峰化学试剂有限公司 9 5 ( 食用级) 乙醇杭州常青化工有限公司 1 6 浙江人学硕十学位论文 第二章材料与方法 2 1 仪器和设囊 薹￥一；? ! 蚕誊钳”骓配野掣琶h 兰“篱戥潍明瞪 器董一唆罄增匾目每西盛浓m 雩喁膨哨叫1 妻薹l 螂i 醣酆瑞醛晡西葑誉鞋裂r 拳亨箬薹 翼葡羹嚣囊童囊琵 羔格些婴豆忑瞪 刁馕蓬目i 篓塑一l 墓冀尊冀毳霎 荔潇h 譬雩耋莲：毫卜”托糖硼篓蓄戡驵酆 鲤雅瑟是复是争萋g f i 鬟静飘鳓巍莺嘉 霪囊叁鋈墓蓥h u b 和几个与之不可 分离的u s b 功能设备。图2 8 是复合设备的逻辑结构图。 2 3 4 数据流模型简介 有了上一节对u sb 主机和设备的认识，这一节我们介绍u s b 系统的数据流。 在这里我们不关注信号具体的物理形式和传输方式等细节，相关的内容将在后面 几节介绍。 简单的说，数据流发生在主机和u s b 设备之间，我们以常用的分层模型介 绍u sb 系统的数据流。如下图2 9 所示： ”5 ” 客户较仲世= ： 剖应： 聃能瞿 m c d l 弧b 拳婉转件l f i u s 8 生控制嚣 l iii ii 临b 泌i 聃l 浙江人学i ! il 学位论文 9 8 浓硫酸，卜海试剂总厂 氯仿 杭州高晶精细化工有限公司 d 一果糖卜海伯奥生物科技有限公司 蔗糖中国医药( 集团) 卜海化学试剂公司 d 一葡萄糖汕头市光华化学厂 d 一木糖中国医药( 集团) 卜海化学试剂公司 鼠李糖中国医药( 集团) _ _ 海化学试剂公司 d 一半乳耱 二海恒信化学试剂有限公司 d 一甘露糖北京化学试剂公司( 比利时进口分装) 阿拉伯糖中国医药( 集团) 卜海化学试剂公司 2 3 实验方案和技术路线 2 3 1 多糖提取工艺步骤 p h 值，温度、时间 山药洗净去皮，匀浆- 加适量的水制成山药溶液+ 蒸发浓缩+ 乙醇沉淀多糖+ 离心分离多糖- 冷冻干燥 得粗多糖 2 3 2 分离纯化步骤 称取2 0 0 9 洗净去皮的新鲜山药，匀浆，在料水比l ：5 ，浸提温度8 5 ， 调节p h 值到8 o 条件下浸提1 1 1 r 后，1 9 0 0 g 离心1 0 1 1 1 i n 取卜- 清，加入3 0 中 性蛋白酶4 2 作用2 1 1 r ，离心取卜清浓缩到2 0 0 m 1 ，1 9 0 0 g 离心2 0 血n 后取卜 清加入酒精浓度到7 0 ，1 9 0 0 g 离心l o i i l i n 取沉淀溶于水后再透析2 3 d ， 将透析后糖液浓缩到1 0 m l 。将此样液首先卜- d e a e 一5 2 层析柱，分离m 中性多 糖和酸陛多糖后再卜- s e p h a d e x g 一1 0 0 柱层析，由此可得到纯净的山药多糖。 2 3 3 多糖含量测定 测糖的方法主要采用苯酚硫酸法。 标准曲线的绘制：称取烘干至恒重的无水葡萄糖1 9 9 ，溶于1 0 0 0 叫重蒸水 中，配成1 9 l 的标准溶液。然后将标准溶液稀释成浓度( 取l i r d 稀释1 0 0 倍， 浙江大学钡士学位论文 2 m l 稀释l o o 倍，3 r n l 稀释1 0 0 倍) 为1 9 ，3 8 ，5 7 ，7 6 ，9 5 ，1 1 4 ，1 3 3 ，1 5 2 “g m l 的溶液，用移液器各取溶液0 6 i i l l 溶液置于1 0 1 1 1 1 干燥的试管中，加入5 0 9 ，l 的 苯酚溶液1 2 m 1 ，用漩涡混合器混匀后，迅速加入6 o r n l 浓硫酸，漩涡振荡混匀 后室温放置3 0 1 1 1 i n ，在波长4 9 0 n m 测定吸光度，用蒸馏水代替葡萄糖溶液做空 白对照。以吸光度为纵坐标，糖浓度为横坐标得标准曲线。根据葡萄糖标准曲 线可以测定寡糖或多糖的含量。 取样液o 6 m 1 ，加入1 2 m 1 苯酚溶液，摇匀再加入6 m 1 浓硫酸剧烈振荡，放 置3 0 r n i n 后测其吸光度，在根据吸光度从曲线卜读出相应的糖含量。标准曲线 见图2 1 。 1 0 01 2 0 1 ，i o 鞯沐i 皇( pg 加1 ) 图2 一l 苯酚硫酸法测糖含量标准曲线 标准曲线方程为：a 4 9 0 一o 0 0 6 2 c + o ，0 2 1 5 r 2 = o 9 9 测糖含量时将所测到的吸光度代入标准曲线即可求出所测溶液的糖含量。 2 3 4 蛋白质含量的测定 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质 具有吸收紫外线的性质，在2 8 0 n m 有最大吸收峰。在此波长范围内，蛋白质溶 液的光吸收值( a 2 8 0 ) 与其浓度成正比关系，可用作定量测定。但是不同的蛋白 质和核酸的紫外吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在。一定的误差。 但可以作为初步定量的依据。 试剂 !：；-l n v ；o 0 型采冬一 浙江人学顺f 学位论文 标准蛋白溶液：准确称取标准蛋白质，配制成浓度为1 m 咖l 的溶液。 待测蛋白溶液：配制成浓度约为l m m l 的溶液。 操作方法 标准曲线的绘制：安下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。用石英比色杯 在2 8 0 n m 波长处分别测定各管溶液的a ：8 0 。以a 2 8 0 值为纵坐标、蛋白质浓度为 横坐标绘制标准曲线，所得到的蛋白质标准溶液见表2 一l 、标准曲线见图2 2 。 表2 一l 蛋白质标准溶液 序号l ， 4567 一 标准蛋白质溶液m l l234568 蒸馏水m l 76543 7 0 蛋白质浓度，( m g m l ) o 1 2 5o 2 5 0o 3 7 50 5 0 00 ，6 2 5o 7 5 01 0 0 a 1 8 0 0 0 7 40 1 5 l o 2 3o 3 0 7o3 8 70 4 5 7o 6 1 7 0 40608 监白质浓度( m g m 1 ) 图2 2 蛋白质含量测定标准曲线 所得到的标准曲线方程为：a 2 8 0 o 6 1 9 c o 0 0 3 r 2 = o 9 9 9 9 样品测定：取待测蛋白质溶液2 m l ，加入蒸馏水6 m l ，摇匀，按匕述方法在2 8 0 n i n 波长处测定光吸收值，并从标准曲线卜查m 待测蛋白质的浓度。 2 3 5 蛋白质的脱除 在浸提的山药多糖溶液中加入2 中性蛋白酶，4 2 作用2 h r 后，离心除去 浙江人学坝 学位论文 蛋白酶，卜清液中加入酒精沉淀得到粗多糖，：岛粗多糖透析可除去大部分降解 的蛋白质。 2 3 6d e a e 一5 2 柱层析分离山药多糖 d e a e 一5 2 的全称是二乙胺基乙基纤维素，即c e l l u l o s e d e a e 5 2 ，种弱 阴离子。离子纤维素交换树脂有开放性的支持骨架，大分子能自由地进入和迅 速地扩散，因而对大分子的吸附容量较大，有的甚至能可逆地吸附相当于它们 本身重量半的生物大分子。离子纤维素卜的交换基团排列松散，对生物大分 子的吸附不太牢固用温和的洗脱条件就可以将其洗脱下来。因此不至于引起 生物大分子的变性。 d e a e 5 2 上柱前的预处理 蒸馏水浸泡l 一2 天后，用o 5 m 的n u a o h 溶液冲洗，再用蒸馏水洗至中性， 然后用0 5 mh c l 溶液冲洗，用蒸馏水洗至中性后，再以o 5 mn a o h 溶液冲洗， 这样重复处理三次后用蒸馏水洗至中性，装柱。用蒸馏水平衡4 8 1 1 r 或3 个柱床 体积，暂用。 样品的预处理 样品的预处理见2 3 1 2 ，拄尺寸为2 6 5 5 c m ，填料高3 5 c m 。流速1 m l ，i i l i n ，每管 3 m l 。卜样量1 0 m 1 ，糖浓度l o m m l 3 0 m m 1 。 洗脱液 蒸馏水洗脱液：为中蒸水。 另外称取5 8 ，4 j 4 9 n a c l 溶解于l 0 0 0 i i l l 水中配成i m 的n a c l 溶液待用。 梯度洗脱液：右池混合池中为蒸馏水，左池贮存池中为等体积的l mn a c i ，可 以产生0 一o 5 m 的n a c l 梯度| 2 6 | 。 装柱 装柱见2 3 6 4 d e a e 的再生 每次d e a e 一5 2 填料使用后必须再生，再生时先用3 个柱床体积左右的o 5 m n a o h 洗脱柱体，再将填料取出用蒸馏水洗脱直到洗脱后的水p h 值呈中性。将 填料取m 装柱，用蒸馏水平衡晚即可使用。 2 3 7s e p h a d e xg 一1 0 0 柱层析 进行s e p h a d e xg 1 0 0 柱层析主要是检验多糖的纯度。 上样液的准备 卜样液为经过2 3 5 操作步骤后的多糖溶液，流速o4 m l i i l i n ，每管3 m l 。 s e p h a d e xg 一1 0 0 的预处理 将s e p h a d e xg 1 0 0 用适量蒸馏水浸泡1 2 h r 后，1 0 0 溶胀4 h r ，抽气装柱，用 p b s 和o 1 mn a c l 溶液平衡4 8 l r 。 洗脱剂 洗脱剂为o 1 mn a c l 溶液，乜可以用梯度洗脱见2 3 5 3 。 装柱 柱的尺寸为2 6 9 0 c m ，填料高7 0 c m 。用经d e a e 纯化过的多糖溶液 二样， 卜样量1 0 m l ，糖浓度1 0 5 0 m m l 。 装柱是凝胶层中+ 个关键的操作步骤。装柱时先向柱中加入约l 3 高度的 洗脱液，在搅拌下，：恪烧杯中的凝胶悬浮液倾入拄中，待底面，卜 沉积起l 一2 c m 凝胶柱床后，打开柱的出口，随着下面水的流m ，卜 面不断加入凝胶悬浮液， 这样凝胶颗粒便连续缓慢沉降，待沉积面离柱的顶端约3 5 c m 处停止装柱，然 后用洗脱缓冲液平衡，+ 般用3 5 倍柱床体积的缓冲液在恒定的压力下过柱。 样品上柱及洗脱 】：柱前仔细检奄柱床表面是否平整，如果发现有凹凸不平的情况，可用细 玻璃棒轻轻搅动表面，使凝胶重新自然沉降直至表面平整。：睁柱床表面存留有 较多的洗脱液用吸管吸去，留下高于柱床表面2 c m 的体积，将柱的出口打开， 使洗脱液流至距柱床表面l 一2 m m 时关闭出口，以层析允许最小体积的样品， 用滴管缓慢加入柱内，打开m 口，使样品渗入凝胶内。当样品：降近完全渗入凝 胶时，用滴管仔细加入约4 c m 柱高洗脱液，然后接上衡压洗脱瓶( 盛洗脱液) 开始洗脱。 洗脱液应与浸泡凝胶时所用的溶液。致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会 发生变化而影响分离效果。洗脱液多采用部分收集器收集| 。 2 3 8 多糖分子量测定、结构及组成分析 1 多糖分子量测定 高效液相凝胶排阻层析( h i 啦p e r f 0 h n a i l c eg e lp e 咖e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ， h p g p c ) 装置： 2 l 浙江人学颂：l 学位论文 【2 】薄层层析分析 展层荆及显色剂 展层剂：冰乙酸：氯仿：水= 2 l ：1 8 ：3 显色剂：2 二苯胺丙酮溶液：2 苯胺丙酮溶液：8 5 磷酸= 5 ：5 ：l 操作程序 将薄板点有样品的端浸入展层剂( 注意应使玻璃板| i 涂有硅胶g 的面朝卜i ， 切勿使样品原点浸入溶剂) ，盖好层析缸盖一卜行展层，当展层剂前沿离薄板顶 端儿厘米时即可停止展层，取出薄板用吹风机吹干。 在通风厨中用显色剂喷雾，使薄板均匀湿润，然后在8 5 烘箱中烘3 0 i n j n 左右。 3 多糖特定结构 预备工作 称取1 5 m g 经纯化、干燥的多糖样品，与1 5 0 m g 的k b r 混合均匀，并在玛瑙研 钵中允分研磨，压制成薄网片，然后置于p e 一5 7 7 型红外分光光度计卜进行测 试，扫描范围4 0 0 0 一2 0 0c m “ 分析方法 红外光谱仪是分析多糖结构有力的工具，例如用多糖的特征吸收峰来鉴定多糖， 8 9 0 c m “吸收峰来判断b 一糖苛键的存在，8 4 0 c m l 吸收峰来判断0 l 一糖苷键的 存在，毗喃糖苷在h o o 一1 0 l o 间应有三个强吸收峰，而呋喃糖苷在相应区域只 出现两个峰，8 1 0 、8 7 0c m _ 1 是甘露糖的吸收峰，1 2 6 0 与1 7 3 0c m 一是酯基或。 一乙酰基的特钲。此外红外光谱在3 5 0 0c m “处有无吸收常用来判断甲基化反应 是否完全。3 5 0 0 一3 0 0 0c m “( o h ) ，1 6 3 9c m ( c = h ) ，1 4 5 9 一1 3 8 2c m l ( c o ) ，1 1 6 3 1 0 1 9c m 一1 ( c 。o ) ，9 3 4c m 一1 ( c h ) 1 2 9 i 浙江大学砸l 学位论文 第三章山药多糖提取工艺优化 山药为薯蓣科植物薯蓣的块茎，是常用中药，具有补脾养谓、生津益肺和 补肾涩精之功效，山药多耱是山药主要活性成分，本章对山药水溶性多糖的提 取工艺进行初步研究。 3 1 单因素实验 3 1 1 温度对得率的影响 为考察温度对多糖提取得率的影响，固定p h 8 o 、料水比l ：3 、作用时问 1 i l r 、酒精沉淀最终浓度7 0 、离心速度1 9 0 0 g 等工艺条件，进行变温试验， 实验结果见图3 1 ，数据分析见表3 一l 。 塞 斛 妻嘶 蚺。5 图3 1 漫提温度埘粗多糖得率的影响 表3 一l 变温实验数据分析表 1 4 5 温度( 多糖得率温度 6 0 7 0 。c8 0 9 0 l o o 重复。( ) o 0 4 70 1 3 3o 5 90 6 50 6 2 重复二( ) 0 0 4 2o 1 2 50 6 30 6 20 6 6 重复三( ) o 0 4 4o 1 2 80 6 4o 6 3o 6 4 平均得率( ) o 0 4 4 3 o 1 2 9o 5 8o 6 3o 6 4 从表3 一l 可知，同样条件下的实验重复了三次，各自标准差最大为o 0 1 6 ， 最小为o 0 0 2 5 2 ，说明三组数据的重复性较好，符合实验的要求。从图3 一l 的温 度曲线可以看m ，温度接近9 0 时再升高多糖得率卜升缓慢，可能是因为在温 度卜升会对多糖存在降解作用。 3 1 2p h 值对多糖得率的影响 为考察p h 值对多糖提取得率的影响，固定温度8 5 、料水比l ：3 、作用 时间l h r 、酒精沉淀最终浓度7 0 、离心速度1 9 0 0 g 等工艺条件，进行p h 值 变化试验，实验结果见图3 2 ，数据分析见表3 2 。 嚣 再o 6 5 延06 蠢0 5 5 o 5 0 4 j 0 4 。3 5 o3 02 5 0 2 图3 2p h 值对多糖得率的影响 99j 洲值 表3 2 p h 值变化对多糖得率影响数据分析表 多糖得率口h 77 588 59 重复一( ) 0 4 2o 5 3o6 2o 5 5o ，4 9 重复二( )0 5 3 o 4 4o 5 5o 5 20 5 3 重复三( ) 0 4 7o 5 0o 5 20 4 90 4 8 平均得率( 1o 4 7 3 0 4 9 0o 5 6 30 5 2o 5 0 标准差( s )o 0 5 5 o 0 4 6o 0 5 lo 0 3o 0 2 7 而降低，可能是因为在多糖的量相同的情况下多糖浓度越浓酒精沉淀出奇勺多糖 就越多。因为多糖是可以与水以任意比互溶的，当水量越多时，相同浓度的酒 精就越难以j 瞎多糖沉淀m 来，故选取定的科水比也较为重要。 3 1 4 酒精最终浓度对多糖得率的影响 为考察酒精浓度玎多糖提取得率的彭j 向，固定p h 80 、料水比l ：5 、作用 时问l 1 r 、浸提温度8 5 、离，、返度1 9 0 0 g 等工芝条件，进行酒精浓度变化 试验，实验结果见图3 4 ，数据分析见袭3 4 。 2 5 。 2 i l5 ul 0 0 厂一一。 2 ( j3 04 0邬6 07 u8 0 g 。1 0 ( 酒精浓1 盘( j 图3 4 酒精浓度对多糖得率的影响 表3 4 酒精浓度变化对多糖得率影响数据分析表 多糖浓度酒精浓度 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 重复( 多糖舍耸g ，) 1 1 6 3 5“6 0 31 6 07 01 6 9 ，2 11 7 5 1 01 6 20 7 1 5 04 3 重复二( 多糖舍颦h i i l i ) 03 51 1 6 1 81 7 0 7 21 7 8 2 l1 8 5 i1 6 6 0 71 5 65 2 重复三( 多糖岔颦“删) 1 0 7 2 91 0 9 3 31 6 57 l1 7 3 6 51 8 0 6 71 7 0 3 l 1 5 02 5 平均多糖含量u g n ) l l l3 31 1 38 51 6 57 l1 7 3 ，6 91 8 0 2 91 6 6 1 51 5 24 标准差( s ) 46 13 9 15 0 l4 5 05 0 14 1 235 7 浙江人学顾l j 学位论文 由表3 4 可以看出，在7 0 左右的酒精浓度时沉淀m 的多糖得率最高。 3 1 s 提取时间对多糖得率的影响 为考察浸提时间对多糖提取得率的影响，固定p h 8 o 、料水比1 ：5 、浸提 温度8 5 、酒精沉淀最终浓度7 0 、离心速度1 9 0 0 g 等工艺条件，进行浸提 时间变化试验，实验结果见图3 5 ，数据分析见表3 5 。 01 5 0l o0 5 0 1 0 0 图3 5 提取时间对多糖得率的影响 捉取叫问( m i n ) 表3 5 浸提时间对多糖得率影响数据分析表 得率时间i o 3 06 09 01 2 01 5 0 重复( ) o 3 0 o 2 40 3 70 ，4 00 4 1o 4 2 重复二( ) o 2 2o2 90 3 9o 3 90 4 2o 4 3 1 重复三( )o 1 9 0 3 l0 3 8o 3 80 3 903 8 l 平均得率( ) 0 2 40 2 8o 3 8o 3 9o 4 0o 4 1 i 标准差( s )o 0 5 7 0 0 3 6o o lo 0 1o 0 1 5o 0 2 6 由表3 5 可以看出，一个小时以内对多糖得率影响较大，一个小时以后多糖得 率，卜 升缓慢，可能是在高温环境下随时间延长多糖稳定性越差而导致多糖降解。 3 1 6 不同的离心转速多糖得率的影响 为考察离心转速对多糖提取得率的影响，固定p h 8 o 、料水比l ：5 、作用 时间l 1 r 、酒精沉淀最终浓度7 0 、浸提温度8 5 等工艺条件，进行离心转速 变化试验，实验结果见图3 6 ，数据分析见表3 6 。 j ， r 叭0 n 0 0 o 一墨甜采盎簪= 浙江大学坝l 一学位论文 ： 矗 三 【酬 ! 蠹 特 6 0 一一。一 4 0 00 0 01 4 0 01 9 0 02 4 0 02 9 0 03 4 0 03 9 0 04 4 0 0 转速l g 图3 6 不同离心转速对多糖得率影响 表3 6 离心转速对多糖得率的影响数据分析表 得率转速( g ) 5 0 01 3 n n1 9 妻妻2 4 0 03 l o o3 9 n n 重复( 多糖含量p g ，“) 1 0 5 9“2 2 31 2 6 5 9；8 2 31 1 6 6 2i i l 5 6 重复二( 多糖含量p g j ；j ) i i o 1 8；5 6 71 3 0 5 51 2 0 8 4i i 0 1 91 0 5 6 4 重复三( 多糖含量p g i i i ) 1 0 3 8 91 1 83 21 2 9 6 3i i 77 71 1 2 3 61 0 3 8 9 平均浓度( 多糖含量h g j 诵； 1 0 6 6 6“5 4 l1 2 8 9 2i ；8 9 5i i 3 0 61 0 7 0 3 标准差( s ) 32 l3 5 32 妻曼1 6 63 2 74 0 2 由表3 6 可知，转速大约在1 9 0 0 g 左右最为合适，太低会导致多糖离心 沉淀不彻底，太高的转速可能会导致多糖分解，从而降低多糖得率。 3 2 提取工艺正交优化实验 从单因素试验可知，作用温度和浸提时间在经过特定的一点后多糖得率变 化并不明显，考虑到能耗和生产时间，控制温度为8 5 、作用时间为1 h r ；单 因素试验也说明酒精沉淀时浓度控制在7 0 、离心为1 9 g 比较合理，这两 因素是多糖浸提出来的后续步骤对提取得率没有影响。故选取p h 值和料液比 进行正交优化，因素水平表见表3 7 ，实验结果见表3 8 ，并对实验结果进行极 差和方差分析，方差分析结果见表3 9 。 一 一 一 一 一 表3 7 因素水平表 因素水平 12 a ( 初始p h ) 7 58 o 85 b f 料液比)l ：4 5 l ：5 l ：5 5 表3 8 正交试验结果 abcd多糖得率f ) 处理号 p h 作用时间 空列空列l 一 ll1110 0 6 3 9 5 o 0 6 9 4 8o 1 3 3 4 2l222o 0 5 9 5 7 o 0 6 1 9 40 1 2 1 5 31333o 0 6 5 6 8o 0 6 6 7 9 o 1 3 2 5 42 l23o 1 7 6 lo i 6 9 3o 3 4 5 4 5223l0 1 9 1 7o 1 8 6 5o 3 7 8 2 62312o 2 6 0 90 2 7 1 3o 5 3 2 2 73 l3 2o 5 1 3 3o 5 2 1 51 0 3 4 8 832130 4 4 8 lo 4 1 7 70 8 6 5 8 93 3 2lo 5 9 8 6o 5 7 6 51 1 7 5 l o 3 8 7 4l ，5 1 3 61 5 3 1 41 6 8 6 7 2 r 3 7 7 92 3 4 1 4 。7 1 8 9 岸l 1 2 5 5 81 3 6 5 51 6 4 2 01 6 8 8 5 k ! 3 0 7 5 71 8 3 9 81 5 4 5 51 3 4 3 7 足3 。 o 1 2 9 lo 2 5 2 3 k _ _ _ 0 2 0 9 3o 2 2 7 6 n 一 _ 。 o 5 1 2 60 3 0 6 6 墨 ro 3 8 3 5o 0 7 9 0 1 极兼分析 第步，计算各列( 郎因素) 每水平的平均数置。 以因素a ( 即第一列) 为例，由于包含因素a 的每冰平有3 次试验，且每次 试验做2 次( 即重复数为2 ) ，将其归为一组，则有因素a 第一水平组的试验结 果的总和耳为： k 。= 0 0 6 3 9 5 + o 0 6 9 4 8 + 十o 0 6 6 7 9 0 3 8 7 4 浙江人学颂十蹲2 位论文 回归系数的估计间互不相关，因而很容易写出各个系数均为显著的回归方程。 该设计可先自行确定m 。，然后根据因子数p 及采用全面试验还是部分实施，由 m 。去查my 的值| 3 2 】( 见表3 一l o ) 表3 1 0 二次回归正交设计参数y 、n 于数与方案 脚 p 2 2 p = 3p _ 4p = 5 ( 1 2 实施) l】o o o 】2 1 51 4 1 4l ，5 4 6 2l - 0 7 712 8 51 4 8 31 6 0 6 31 1 4 81 3 5 31 5 4 61 6 6 4 41 2 1 41 4 1 41 6 0 61 7 1 8 5i 2 6 71 4 7 l1 ，6 6 41 7 7 2 本试验殴计在中心区域进行2 次试验，即m 。= 5 ，则y = 1 2 6 7 ，总试验次数n = 2 2 + 2 x 2 + 5 = 1 3 。 p = 2 的中心组合设计方案为： 表3 1 l 中心组合试验设计方案 试验号x lx 2 lll m 口= 2 。= 4 2l一i 31l 41 5 y0星号点2 d 一4 6 y 0 7 o v 8oy 嚣 0o中心点m 。 oo 挂 oo oo 1 3oo 根据表3 1 1 确定影响因子的取值：p h 值( x 【) 、料水比( x 2 ) 的实际取值 水平通过以下a d i m e n s i o n a l 方程确定删： x l = ( x 1 一8 5 ) o 5x 2 = ( x 2 o 1 8 1 8 ) 0 0 1 7 5 式中，x ，x ：为各因子的编码水平，x - 、x 2 为各因子的实际水平，各数值见表 3 1 2 ，中性组合设计及其试验结果见表3 一1 2 。 浙江大学坝：l 学位论文 其中y 表示多糖得率，x 表示p h 值，z 表示料水比。 拟合优度检验得到样本判定系数r 2 ，o r 2 l ，r ：越接近于l ，回归超平面拟 合程度越高。在计算结果输出中r2=0，788，说明y的变动中有78，8可以由自变 量x和z解释。x对y的相关系数为o82448，z对y的相关系数为o026485，说明ph 值对多糖得率的影响较料水比要显著； 采用f 检验检验回归方程的显著性f = 8 5 5 f 0o l ( 2 ，1 0 ) = 6 7 ，表明回归方程显著。 根据回归方程，在x = 9 1 3 ，z = o 1 8 1 8 条件下，y 得到最大值o 7 4 7 l 通过从l ，5 虹山药中提取多糖验证： x = 9 1 3 ，z = o 1 8 1 8 ，y = 0 8 5 1 6 称取5 0 0 ? 萋尉霉糕点掣基鏊野龃涵馐堰高卿瑶穗g 攀己驯咖骈萌甄善鑫嚣 鐾娶导i 的带宽和端点特性。大多数管道在u s b 设备被配置后才建立。但 有一个消息管道比较特殊，它称为缺省管道，是主机上u s b 系统软件和设备端 点0 之间连接。它在设备插入，系统对设备供电后立刻建立。主机与它通信，对 设备进行配置。在设备正常工作时，主机用它对设备进行一些基本的控制。 u s b 数据传输的这种t r 蛆s a c t i o n 机制允许主机对一些流管道进行控制。从 硬件上来说，这样做的好处是可以保护缓冲区，防止其溢出( 0 v e mm ) 或不足 f u n d e 1 1 ) 。比如，u s b 用n a k 握手信号来调节数据传输速率。当数据接收方 ( r e c e i v e r ) 的缓冲区尚未准备好时，它向数据发送方( t r a i ls m i t t e r ) 发送一个n a k 信号，表示它正忙，目前不能接收数据。数据发送方( t r a l l s m i 龇r )接到n a k 后会 在合适的时候重复上一次的t r a n s a c t i o n 。这种数据流控制机制使得主机与多路 u s b 设备进行通信时显得十分灵活。 2 4 1 容错性以及错误的检测和恢复 由于以下的这些特性，使得u sb 具有很强的容错性： 信号传输采用差分码，并有屏蔽措施，提高了信号传输的可靠性。 对数据采用c r c 校验保护。 实时地检测设备的插入和拔出，系统对资源重新分配。 对被破坏的包和传输过程中丢失的包，协议采用超时机制进行错误状态自恢 浙江大学坝：l 学位论文 其中y 表示多糖得率，x 表示p h 值，z 表示料水比。 拟合优度检验得到样本判定系数r 2 ，o r 2 l ，r ：越接近于l ，回归超平面拟 合程度越高。在计算结果输出中r 2 = 0 ，7 8 ! 笨击靼叫蚧雏鼎g i 即秭掣矗鬟曷 是；肚l 稀。i 匿g 荔羹器毫昂告! i b ；# 誉8 璧惹晶犄揎筝；j l 薹 ；= 律辫l 薹 唑零毒圳篓州阿爨誉雨翻点将与主机进 行通信。在这之后是一个或多个数据包传输( 有的 t r a i l s a c t i o n 也可不需要进行数据包传输) ，传输方向也由令牌指定。最后是沿数据传输的反方向发送一个 握手( l a i l d s h a k e ) 包。主机和设备端点之间的逻 辑连接称为管道( p i p e ) 。u s b 定义了两种管道：流 管道(s仃e锄pipe)和消息管道州e s s a g e p i p e ) 。其中消息管道有特定的结构。不同 的管道有不同的带宽和端点特性。大多数管道在u s b 设备被配置后才建立。但 有一个消息管道比较特殊，它称为缺省管道，是主机上u s b 系统软件和设备端 点0 之间连接。它在设备插入，系统对设备供电后立刻建立。主机与它通信，对 设备进行配置。在设备正常工作时，主机用它对设备进行一些基本的控制。 u s b 数据传输的这种t r蛆s a c t i o n 机制允许主机对一些流管道进行控制。从 硬件上来说，这样做的好处是可以保护缓冲区，防止其溢出( 0 v e m m ) 或不足 f u n d e 1 1 ) 。比如，u s b 用n a k 握手信号来调节数据传输速率。当数据接收方 ( r e c e i v e r ) 的缓冲区尚未准备好时，它向数据发送方( t r a i l s m i t t e r ) 发送一个n a k 信号，表示它正忙，目前不能接收数据。数据发送方( t r a l l s m i 龇r ) 接到n a k 后会 在合适的时候重复上一次的t r a n s a c t i o n 。这种数据流控制机制使得主机与多路 u s b 设备进行通信时显得十分灵活。 2 4 1 容错性以及错误的检测和恢复 由于以下的这些特性，使得u s b 具有很强的容错性： 信号传输采用差分码，并有屏蔽措施，提高了信号传输的可靠性。 对数据采用c r c 校验保护。 实时地检测设备的插入和拔出，系统对资源重新分配。 对被破坏的包和传输过程中丢失的包，协议采用超时机制进行错误状态自恢 复( s e l f r e c o v er y ) 。 浙江人学砸【二学位论义 ，但是多糖含量基本上不变。 4 2 中性多糖分离纯化 4 2 ld e a e 一5 2 柱层析 d e a e 5 2 柱层析洗脱条件控制为柱尺寸为2 6 5 5 c m 、填料高3 5 c m ，每 3 m i n 收集。管，每管3 m l ，流速1 m l 1 1 1 i n ：卜样量1 0 蚰，糖浓度l o m g r n l 一 3 0 m g m l ，洗脱液为水。 1 5 0 1 0 0 3 5 0 01 02 0 3 ( )i 05 06 07 08 0 9 0 洗脱管数 网4 一l 山药中性多糖d e a e 一5 2 柱层析洗脱曲线 中性多糖采用蒸馏水洗脱，因其不带电荷，基本不与d e a e 柏结合或者说 结合力非常弱，用水即可将其洗脱下来。从图4 一l 可知洗脱峰为甲峰、峰形 比较对称，初次分离即达到了较为满意的效果。但仅仅经过d e a e 柱层析并不 能说明它是单- 组分，有必要进行s e p h a d e x 柱层析，因此进一步收集5 5 7 2 管波峰组分进行下_ 步s e p h | a d e x 柱层析。 4 2 2 中性多糖s e p h a d e xg 一1 0 0 柱层析 从d e a e 柱层析所收集到的样品用旋转蒸发器浓缩到l o 础以内 二样，柱的 尺寸为2 6 9 0 c m 、填料高7 0 c m ，上样量l o i n l ，糖浓度为1 0 一5 0 m g r n l ，来源 为经d e a e 纯化过的多糖溶液。洗脱液为o 1 5 mn a c l 溶液，流速控