（遗传学专业论文）人类双特异性磷酸酶的克隆和功能研究.pdf

摘要 y 彳? 0 6 4 j 双特异性蛋白磷酸酶是酪氨酸蛋白磷酸酶家族中的一个新兴家族，它们可以同 时使磷酸化的醯氨酸残基和丝苏氨酸残堪太磷酸化。它们在有丝分裂信号传导调 控、胞外刺激和细胞周期等通路中起重要作用。通过大规模人类c d n a i 则序并结合 牛物信息学分析，我们从胎脑c d n a 文库兜隆了5 条v h r 类似双特异性磷酸酶亚家族 ， 成员，并对其中的一条d u s p i8 做了初步的基吲功能研究。o u s p i 8c d n a 有2 4 5 0 x , i 碱基，编码一个i8 8 个氨基酸的多肽，包含一个双特异性蛋白磷酸酶结构域，仙是没 有c h 2 结构域。r t p c r 显示，d u s p i8 在大多数组织中部有表达，尤其在肝脏、脑、 了宫和睾丸中高表达。d u s p l 8 基因位f 染也体2 2 q 1 2 1 。g s t - d u s pj 8 融合蟹自具 有显著的磷酸酶活性，其最适p h 值和最适温度分别是6 0 , u 5 5 c ，以m n ”为辅因了。 抑制剂分析结果表明，碘乙酸能够强烈抑制其活性。d u s p l8 在c y s l 0 4 ，a r g l l 0 ，s e r li i 的突变蛋白磷酸酶活性几乎完全丧失。以酪氨酸磷酸化和苏氨酸磷酸化多肽为底物， 证明t d u s p l 8 的双特异性磷酸酶催化能力i 采用酵母双杂交技术筛选人类胎脑文 ， 库，我们获得了可能与d u s p l8 存在相瓦作用的蛋白质，并用g s t 融合蛋白p u l l d o w n 分析验证了d u s p l8 , h 催乳素受体结合蛋白的相瓦作用。 我们从人类胎脑c d n a 文库中克隆了一条编码人类转录凶j a p 2b 类似篮白的 基因，命名为t f a p 2 b l l ，该基因定位于2 2 号染色体6 p f 2 1 2 i i 。t f a p 2 b lj 举因e d n a 全k 2 0 7 6 b p ，编码个4 5 2 个氨犟酸的蛋白质。逆转录p c r 分析发现，该璀凶在成人 胸腺，前列腺，小肠，骨骼肌，了宫，脑利睾丸组织高表达。 | 、 ? 关键词：双特异性磷酸酶；t f a p 2 b l l ：酵母双杂交；逆转录一p c r g s t 融合蛋白p u l l d o w n s ) 析 a b s t r a c t d u a l s p e c i f i c i t yp r o t e i np h o s p h a t a s e s ( d s p s ) c o n s t i t u t e an e wf a m i l yo f p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e s ( p t p s ) c h a r a c t e r i z e d b y t h e a b i l i t y t o d e p h o s p h o r y l a t e b o t h p h o s p h o t y r o s y l r e s i d u e sa n d p h o s p h o s e r y l t h r e o n y l r e s i d u e s t h e yp l a yr o l e si n t h er e g u l a t i o no fm i t o g e n i cs i g n a lt r a n s d u c t i o nf o r e x t r a c e l l u l a rs t i m u l a t i o na n dt h ec e l ic y c l e b yl a r g e s c a l es e q u e n c i n ga n a l y s i so f t h eh u m a nf e t a ib r a i nc d n al i b r a r ya n db i o i n f o r m a t i c a ia n a l y s i s w ej s o l a t e d5 h u m a nv h r 1 i k e d u a l s p e c i f i c i t yp r o t e i np h o s p h a t a s e sg e n e s a n d f u n c t i o n r e s e a r c hh a db e e nm a d et oo n eo fl h e m d u s p l8 t h ed u s p 7 8c d n aw a s2 4 5 0 b a s ep a i ri n l e n g t h e n c o d i n g a18 8 一a m i n o a c i dp o l y p e p t i d ew h i c hh a dad s p m o t i fb u tl a c k i n gt h ec h 2d o m a i n r t p c rr e v e a l e dt h a lt h ed u s p l 8w e r e e x p r e s s e di nm o s t t i s s u e sw ee x a m i n e dh i g he x p r e s s i o n sw e r ed e t e c t e di ni i v e r b r a i n o v a r ya n dt e s t i s t h ed u s p l 8 i si o c a l i z e di n2 2 q 1 21 d u s p l 8f u s e df o g s ts h o w e dd i s t i n c tp h o s p h a t a s ea c t i v i t yt o w a r dp - n i t r o p h e n y lp h o s p h a t ew i t h o p t i m a ip h 6 0 a n do p t i m a lt e m p e r a t u r e5 5 m n ”e n h a n c e de n z y m ea c t i v i t y i n h i b i t o r so fd u s p l 8w e r ea l s oe x a m i n e d i o d o a r e t i ca c i ds t r o n g l yi n h i b i t e dl h e p h o s p h a t a s ea c t i v i t y m u t a t i o n si ns e l e c t e ds i t e sr e v e a l e dt h a tc y s 一10 4 a r g 。110 a n ds e r 一111 p l a y e di m p o r t a n t r o l e si n p h o s p h a t a s ea c t i v i t y o fd u s p l 8 g s t d u s p l8s h o w e dp h s p h a t a s ea c t i v i t yt o w a r do l i g o p e p t i d e sc o n t a i n i n gp t h r a n dp t y r i n d i a t i n gt h a td u s pi sa p r o t e i np h o s p h a t a s ew i t h d u a ls u b s t r a t e s p e c i f i c i t y u s i n gt h ey e a s tt w o h y b r i ds c r e e n i n go fah u m a nf e t a lb r a i nc d n a l i b r a r y w e h a v ei d e n t i f i e dan e wi n t e r a c t i o n p a r t n e ro fl h eh u m a nd u s p 侣 p r o t e i n ，p r a ( p r o l a c t i nr e c e p t o r a s s o c i a t e p r o t e i n ) t h e d u s p 一18 一p r a i n t e r a c t i o nw a sc o n f i r m e db yg s tf u s i o np r o t e i np u - d o w na s s a y s w ej d e n t i f i e dan o v ejh u m a n t r a n s c r i p t i o n f a c t o ra p 20j i k e g e n e ( 胡户2 b l 7 ) ，w h i c h j sl o c a t e do nh u m a nc h r o m o s o m e 6 p 1 21 2 1 1 t h e t f a p 2 b l ic d n ai s2 0 7 6b a s ep a i r si n l e n g t he n c o d i n g a4 5 2 a m i n oa c i d p o l y p e p t i d er e l a t e dl oh u m a n a p 一2p r o t e i nr t p c ra n a l y s i ss h o w si t s r e l a t i v e l y h i g he x p r e s s i o nj e v e ii n a d u l lt h y m u s ，p r o s t a t e ，s i n a i li n t e s t i n e s k e l e t a lm u s c l e ， p l a c e n t a ，b r a i n ，a n dt e s t i st i s s u e s k e yw o r d s ：d u a l s p e c i f i c i t yp h o s p h a t a s e ；t f a p 2 b l i ；r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p c r g s tf u s i o np r o t e i np u l l d o w na s s a y 第一部分：综述 蛋白质的磷酸化去磷酸化作用是调节蛋白质生物活性的重要方式，在细胞 增殖，分化，黏附，迁移，凋亡，新陈代谢以及细胞信号传导等许多细胞过程 中都起到至关重要的作用。蛋白质的磷酸化水平是通过蛋白激酶和蛋白磷酸酶 的相互调节相互拮抗共同维持的【1 】。蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程是一个 动态的可逆的过程，这种动态的平衡因素被形象的比喻为“阴”和“阳”。这种 可逆的蛋白磷酸化去磷酸化系统几乎涉及到所有的尘婵过程。与细胞代谢的其 它调空方式相比，其优点主要表现在以下几个方面：( 1 ) 可以调控细胞内已经 存在的酶的活性，与酶的重新合成和分解相比，不仅节省原材料，而且能事使 调控反应更加迅速有效。( 2 ) 蛋白磷酸化去磷酸化在信号传递过程中可以对外 来信号进行级联放大，从而增加细胞对外来刺激的反应灵敏性。( 3 ) 与其它调 节方式如产物反馈抑制，变构调节相比，蛋白磷酸化去磷酸化较少受细胞代谢 产物的影响，可以准确转移的对信号作出反应。( 4 ) 蛋白激酶和磷酸酶一儿被 激活，其活性可以通过某些方式( 如自身磷酸化去磷酸化) 维持较长的时州， 在持续调控反应中发挥重要作用。研究表明，几乎所有的蛋白激酶都可以对自 身进行磷酸化修饰，这种自身磷酸化修饰既可以发生于不同酶分子之间又可以 发生于分子之内【2 】。在人体内存在多达2 0 0 0 多种蛋白激酶和1 0 0 0 多种蛋白 磷酸酶，形成一个复杂的调节网络，调节着细胞的复制、生长、凋亡等过程， 控制着生物体的生长发育直至衰老死亡。 在原核生物和真核生物中都存在大量的蛋白激酶和磷酸酶。人类基因组大 约编码2 0 0 0 个蛋白激酶，包括丝氨酸苏氨酸特异性的蛋白激酶( 如酪蛋白激 酶，c a m p 依赖的蛋白激酶等) ，酪氨酸特异性的蛋白激酶( 如胰岛素受体，p p 6 0 “。 等) 以及双特异性的蛋白激酶( 如m k k ，p 3 4 等) 【3 】。在人类中大约存在1 0 0 0 种蛋白磷酸酶。长期以来，普遍认为在细胞的磷酸化去磷酸化系统中激酶处于 核心地位，而磷酸酶仅仅是作为激酶磷酸化的逆过程起作用，因此磷酸酶特别 是非代谢磷酸酶的研究受到了忽视。但后来发现，有些磷酸酶本身可以作为受 体直接感受胞外信号分子的刺激而引发胞内的信号传递，另外有些磷酸酶如 m k p 1 可以感受紫外线照射，氧化压力，热应激和细胞因子刺激等而发生表达 量的变化【4 】：磷酸酶对底物的特异性虽然没有激酶强，但仍然存在很强的特 异性。因此有必要对蛋白磷酸酶系统的深入的进行研究。 磷酸酶的分类 根据其去磷酸化位点的特异性n j 以将磷酸酶分为丝苏氨酸特异性的磷酸酶 和酪氨酸特异性的磷酸酶两大类。酪氨酸特异性的磷酸酶又可以分为三类：( 1 ) 经典的酪氨酸磷酸酶，包括膜结合的酪氨酸磷酸酶和胞质磷酸酶。( 2 ) 双特异 性磷酸酶( d u a ls p e c i f i c i t yp h o s p h a t a s e ) 。( 3 ) 低分子量酪氨酸磷酸酶( l o w m o l e c u l a rw e i g h tt y r o s i n ep h o s p h a t a s e ) 。经典的酪氨酸磷酸酶和双特异性磷酸 酶在一级结构上存在较高的同源性，都具有( h v ) c x ；r ( s t ) 模式结构。而低 分子量的酪氨酸磷酸酶与上述两种酪氨酸磷酸酶之阳j 没有序列t - 的相似性，其 氨基酸数目一般在2 0 0 个氨基酸以下。但低分子量酪氨酸磷酸酶具有c x ；r 的 模式结构。 作为一类特殊的酪氨酸磷酸酶，双特异性磷酸酶既可以对其底物蛋户鲐苏 氨酸上的磷酸进行去磷酸化，又可以对酪氮酸上的磷酸进行去磷酸化作 。通 常其酪氨酸磷酸酶活性要比丝苏氨酸磷酸酶活性高4 0 到5 0 0 倍【5 】，这也是 双特异性磷酸酶被归为一类酪氨酸磷酸酶而不单独分类的原因。此外，从一级 结构上来看，双特异性磷酸酶的催化结构域具有典型的酪氨酸磷酸酶结构域特 征。事实上，双特异性磷酸酶的底物并彳i 局限于蛋白质，著名的抑癌荩因 p t e n m m a c 【6 】本身编码一个双特异性磷酸酶，它所作用的底物是细胞膜t 的磷酸肌醇【7 】，能够对3 ，4 一磷酸肌醇二磷酸和3 ，4 ，5 - 磷酸肌醇三磷酸分 子糖环上的3 位磷酸进行去磷酸化【6 ，7 ，8 】。再如人类x 染色体连锁的肌管萎 缩症的致病基因m t m 所编码的双特异性磷酸酶可以对肌醇三磷酸p 1 3 p 分子糖 环上的3 位磷酸进行去磷酸化【9 ，1 0 ，1 l 】。 r 丝苏氨酸 j 特异性磷酸酶 g l y 的点突变。由于这一半胱氨酸是酪氨酸磷酸酶催化磷 酸基团水解的活性中心，因此这两种蛋白都不具有磷酸酶活性，但是如果将该 位点的甘氨酸突变回半胱氨酸后就使其具有了双特异性磷酸酶的催化活性 【5 2 】。该基因是首次发现的天然存在的双特异性磷酸酶相关显性负突变的例 r ，这提示双特异性磷酸酶家族中存在某种更为精细的活性调节机制。 酪氨酸磷酸酶的催化机制 所有的酪氨酸磷酸酶都具有( h v ) c x ；t ( s t ) 保守序列，这一序列构成一个 磷酸结合噜普结构即p - l o o p ，而主链上的氮原子和精氨酸的胍基基团则在同底 物结合和催化时对磷酸基团上的平伏氧原子超定向协调作用。 这一p 1 0 0 p 结 构的立体几何构型为两种反应过渡态提供很好的空1 1 日j 互补构象，而精氨酸侧键 所提供的双齿状相互作用也是催化活性所必须的【5 3 ，5 4 】。 酪氨酸磷酸酶所催化的磷酸单酯键水解作用是一个两步反应。第一步 b 酶 活性中心的半胱氨酸残基对底物分子上的磷酸基团进行亲核进攻。在脂键断裂 的同时，出一个广义酸性残基为离去基团氧原子提供一个质子。这样第一次取 代反应的结果是导致磷酸基团通过硫脂键与亲核基团共价结合【5 5 ，5 6 】。在第 二步取代反应时，该磷酸一酶反应中间体被水分子水解，从而使酶分子重置并释 放出磷酸根离子。半胱氨酸残基的p k a 值为8 3 ，因而是一个较好的亲核基团。 保守序列中丝氨酸残基或苏氨酸残基中的羟基对活性中心的半胱氨酸中的巯基 起稳定作用，并起到进一步降低其p k a 值的作用。同时p l o o p 结构位于一个。 螺旋的n 木端也对巯基基团的稳定化有所贡献。定点突变分析表明，位于活性 中心半胱氨酸残基之前的组氨酸残基虽然不与硫原子直接接触，但对其p k a 值 也有很大贡献。为磷酸基团氧原子提供质子的广义酸性基团，一般是天冬氨酸， 对于酪氨酸磷酸酶的催化也是至关重要的，该残基的突变，可大大降低酶的转 换数。 a b o 。、o “、严、一一 一s 一第飞 i 。，。矿一 o 一弋岁 。乒、o 一 口一一 一。一 q 一宁 一i f - 幽5 ：酪氦酸磷酸酶的催化中心( 左图) 平催化机理( 矗幽) 。 所有的酪氨酸磷酸酶都遵循相同的催化机制，但为什么双特异磷酸酶既可 以催化丝苏氨酸残基又可催化酪氨酸残基上的去磷酸化，而其它酪氨酸磷酸酶 仅能催化酪氨酸残基上的去磷酸化昵? 对双特异性磷酸酶和经典酪氨酸磷酸酶 的高级结构的解析与比较可以为之提供比较满意的解释。目前，已经有很多双 特异性磷酸酶被结晶并解析出高级结构，包括v h r 【5 7 】，m k p 1 ，m k p 2 ，m k p 3 和m k p x 等。分析表明，虽然双特异性磷酸酶和经典的酪氨酸磷酸酶的活性 中心，即p 1 0 0 p 在一级序列和高级结构都具有相似的保守结构，但二者的活性中 心催化裂隙的深度存在显著差别。双特异性磷酸酶如v h r 的活性中心的“口 袋”结构深度为6 a 左右，包饶在其周围的原子主要由p 1 0 0 p 本身的钱基提供： 相比之一f ，经典的酪氨酸磷酸酶如p t p l b 的活性中心催化裂隙深度为9 a 左右， 包绕在其周围的原子除了由p 1 0 0 p 提供外，还有其它空问上临近的氨基酸残基。 利用含有磷酸化酪氨酸和磷酸化苏氨酸的多肽对其研究发现，磷酸化酪氨酸多 肽和磷酸化苏氨酸多肽上的磷酸基团都可以进入v h r 蛋白的活性“口袋”与 半胱氨酸接触，然而仅仅磷酸化酪氨酸多肽上的磷酸基团j 能进入p t p l b 的活 性“口袋”与半胱氨酸结合。由此可见，双特异性磷酸酶和其它酪氩酸磷酸酶 催化特异性的差别是由于其活性中心所在的催化“口袋“的深度差异造成的。 9 双特异性磷酸酶广泛存在于各种生物中 不仅在高等生物中，在果蝇酵母等真核生物以及原核生物中都存在双特异 性磷酸酶 5 8 1 。在一种革兰氏阳性菌s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r 中克隆出了一种双 特异性磷酸酶s p p a ，如果从s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r 剔除该基因将导致该细菌的 生长抑制【5 9 】。虽然s p p a 既有丝苏氨酸又有酪氨酸磷酸酶活性，但陔磷酸酶 并不具有哺乳动物双特异性磷酸酶所共有的催化结构域序列特征 r h v ) c x ；t ( s t ) 。在y a r r o w i al i p o l y t i c a 酵母中的分泌蛋白也分离出一种双特异 性磷酸酶，分子量大小为3 3 k d a 6 0 1 。此外，双特异性磷酸酶v h 一1 和y o p h 就 是分别从牛痘和y e r s i n i a 细菌中克隆得到的，前者是天花的病原体，而后者则 是黑死病的致病菌。研究表明y o p h 在宿主细胞的细胞质中表达，这埘y e r s i n i a 细菌的毒性是必须的。在果蝇中，p u c k e r e d 基因编码一个双特异性磷酸酶，参 与m a p k 信号途径的调节。该基因的突变可以导致果蝇背向闭合发育异常 【6 1 】。可见，双特异性在从原核生物到包括酵母在内的低等真核生物以及人类 中部广泛存在，发挥着多样的生物活性。 双特异性磷酸酶的系统命名 由于双特异性磷酸酶的发现途径多种多样，近l o 年来数目不断增加，其命 名缺乏一定的规则性。近来，人类基因组协会( h u m a ng e n o m eo r g a n i z a t i o n ， h u g o ) 命名委员会( h t t p ：w w w g e n e u c l a c u k n o m e n c l a t u r e ) 推荐对哺乳动物 中发现的双特异性磷酸酶采用统一的命名规则，即按”d u s p ”+ “数字编号”命 名，如m k p 一1 即为d u s p l ，v h r 被命名为d u s p 3 。 系统名 其它名称 氨基酸 亚类 人类染色 生物学功能 称数目体定位 m k p i c l l 0 0 m a p k 途径，钒化热j 长，j ，生k d u s p l 3 6 7 a ai 5 q 3 4 h v h l p t p n l 0 了l 秀甘表达 m a p k 途径土葵表达f 廿71 土f 织， d u s p 2p a c l3 1 4 a ai 2 q i i 定位f 核 d u s p 3v h r l8 5 1 7 q 2 i m a p k 途件 d u s p 4m k p 2 h v h 2 厂r y p l 3 9 4 a ai 8 0 1 2 一p 1 m a p k 途舱，角树种到接 小 d u s p 5l t v h 33 8 4 a ai 1 0 q 2 5 m a p k 途径，定位十核 d u s p 6m k p 3 p y s t l3 8 l a ai 1 2 q 2 2 - q 2 3 m a p k 途行，定位t 胞赝 d u s p 7m k p x p y s t 23 2 0 a a n ， 3 p 2 i m a p k 途 m a i k 途径生k i x l1 年n 腆岛袁诱 l 。t ，s r sh b 5 h v h 86 2 5 a aii ip i5 5 导表丛，定位r 胞赝 表l ：目前已经确定的舣特异性磷酸酶。 o 系统名 其它名称 氨基酸人类染色 称 数目 亚类生物学功能 体定位 m a p k 途杼，仅表达十胎盘、肾和 d u s p 9 m k p 43 8 4 a a l x q 2 8 胎h r ；定位十胆质和细胞核 m a p k 途 千，广谦表达h 山刺激 d u s p l 0m k p 54 8 2 a ai i q 4 i 济旨表达 定位十核，口f 直接jr n a 和剪 d u s p l lp l r l3 3 0 a a l v 2 p 1 2接了作用参j 核m r n a 剪 接 d u s p l 2y v i i d u s p l3 4 0 a al v i q 2 i - q 2 2定位十核内，只右一锌指结构域 牢丸和骨骨占肌特异表达，精r d u s p l 3t m d p1 8 8 a al i 1 0 q 2 22 发生和成熟自关 m a p k 途柞，参jc d 2 8 和t c r d u s p l 4m k p 6 m k p ll9 8 a a1 117 q 1 2 共激活t 细胞浠导表丛i l - 2 d u s p i5b a 2 4 3 j 1 66 2 4 3 a a l i 2 0 q i i2 l d u s p l 8 1 8 8 a a i i 2 2 q 1 2 i、 m k p 7 6 6 5 a ai 1 2 p 6 m a p k 途径 与c d k 和o d e 2 丰日互作用，参 k a p c d ii2 1 2 a l ai i 1 4 q 2 2 细胞川期训榨 与葡糖激酶相互作用，参j 糖酵 g k a p 3 3 9 a a i v 解调节 m a p k 途释，底物n ：m k ki ：游， j s p 1 1 8 4 a ai 6 p 2 5 表脱_ 【激活m a p k 鲎 j 挈丸特异性表达，叮使m a p k 芏i f l m w d s p 21 9 4 a a1 | 山失括 l a f o r i n 3 3 1 a a i v 6 q 2 4 进行性l l t n 阼挛忡癫痫敛炳皋 抑煽基闪，多种遗传疾船和肿 p t e n ，m m a c l4 0 3 a an ， 1 0 q 2 2 - q 2 3 痈发生自关。 参相1 】胞周期洲摔，包拈 c d e 2 5i v、 c d c 2 5 a c d e 2 5 b 耵lc d c 2 5 c f y v e + d s p、l l l、 s t y x s t n s2 2 3 2 0 5 a a 1 4 q 2 2 i 尤磷瞻酶活忖，址h ：负突变 d u s p 8 pd u s p p h v h 4 1 0 q l i2戕牡 表i ( 续) ：目前已经确定的烈特异性磷酸酶。 第二部分：双特异性磷酸酶的克隆及生物信息学分析 引言 生物信息学是8 0 年代以来迅速发展起来的一门新兴学科，随着人类组计划 的进行以及基因组时代、后基因组时代生物学及其相关研究领域所产生的海量 数据的积累，生物信息学已经成为自然科学领域最重要的研究课题之一。 生物信息学是以概率论、数理统计、神经网络模型等数学方法作为基础， 利用数据库、网络，等计算机技术作为工具，以生物学相关研究领域h 益积累 的海量数据作为材料对各种来源的生物学数据进行整合、分析、对比从而获得 有用信息的一门学科。生物信息学领域的研究可以分为三个层次：( 1 ) 数学算 法和计算机算法的开发。如用于序列同源性分析的b l a s t 算法，f a s t a 算法 等序列比对和多序列比对算法；用于进化树的c l a s t w 算法，f i t c h 算法等；以及 h i d d e nm a r k o v 模型，神经网络模型等。该层面主要涉及的是数学方法的利用。 ( 2 ) 数据库的开发管理，生物学应用软件的开发维护，以及各种在线数据库和 应用程序的界面编制。目前，各种通用及专门的生物学数据库不断增加，如 g e n b a n k ，e m b l ，d d b j ，g d b ，k e g g ，y g d 等。各种生物学软件也不断涌现，如g c g 软件包，g e n r u n n e r , g e n d o c ，a n t h e p r o t 等生物学软件。许多生物学应用程序和数 据库都提供在线使用与查询服务。该层面主要涉及的是计算机及互联网的利用， 目前主要由一些生物学公司如c e l e r a ，a f f i m a t r i x ，b i o b a s e 等以及一些大学和科研 机构承担该工作。这一层面的发展极大的方便了与日俱增生物学数据的发掘与 利用。( 3 ) 数据挖掘与利用，综合利用上述生物学资源结合本身的研究领域提 取有用的生物学信息。如利用g e n b a n k 的e s t 库等数据库对人类的基因定位及 剪接形式进行大规模预测【6 2 】；利用转录因子数据库，搜索基因组中各个基因 转录起始的转录结合位点并对基因的组织特异性进行预测；利用蛋质结构数 据库和小分子化合物结构数据库，通过计算结合能预测蛋白质靶点可能结合小 分子从而辅助药物的筛选与开发；比较基因组学也是属于该研究领域。 从应用的角度上看，生物信息学的研究主要有以下几个方面： ( 1 ) 基因组分析。包括各种模式生物，病原性生物和经济生物基因组测序 分析；通过基因序列预测编码蛋白，进而预测蛋白高绒结构，预测蛋l ，1 质牛物 学功能，阐明结构与功能的关系：基于基因序列和功能分析对艇凶进干r 分类： 在基因组水平研究单基因疾病和多基因疾病的致病机制：研究命基例组赫吲的 定位，编码m r n a 的剪接形式及其在空间卜的组织分伽，在时州t ：的发育表达 调控和诱导表达调控；比较基因组学，研究不同物种之间的基因进化关系，基 因迁移：研究基因组的详细结构，分析其保守转录调控模式等与基因的表达有 关的保守结构及相互调节关系；大规模的基因功能研究，如酵母全基凶组6 0 0 0 多个开放阅读框基因干扰实验数据库【6 3 ，6 4 】，酵母蛋白质组酵母双杂交矩阵 6 5 】，蛋白复合物研究1 6 6 以及酵母全蛋白质组蛋白亚细胞定位分析等【6 7 】； 小鼠大规模基因敲除研究等。目前人类基因组草图已经完成，酵母，线虫，果 蝇，拟南芥等模式生物的基因测序也已经结束，并有数目f 1 益增加的原核生物 和真核生物全基因组序列测序工作j 下在进行。这些数据的不断积累既为生物学 研究提供了不少有用的数据信息，又为对这些数据的加工整理工作提出了挑战。 ( 2 ) 基因芯片开发与分析。这一技术具有高度并行化，多样化，自动化的 特点，被广泛应用在测序，转录情况分析。不同基因性细胞的表型分析以及基 因诊断药物设计等领域，成为后基因组时代基因功能分析和药物丌发的支撑技 术之一。 ( 3 ) 药物丌发。基因组研究对药物学和药理学研究产生了重大影响，尤其 为新药筛选，药靶设计和分子药理学研究，以及疑难病的药物设i - t , n 途径选择 等提供了新的方法基础。综合利用各种生物信息学资源可以大大缩短新药的丌 发周期，对已有药物进行改造降低其毒副作用，并可以指导刀：发针对于个人遗 传背景的个性化药物。 需要指出的是上述三个领域的研究虽然相对独立，但在后基因组基因功能 研究时代已经被密切的联系在一起。将各方面来源的生物信息学资源整合对实 验工作进行指导辅助已经成为现在基因功能研究的特点，灵活有效的运用这些 资源可以大大提高基因功能研究的效率，节约时间和资源。 我们在大规模人类c d n a 测序时克隆得到条全长新基因，该基因编码一 个1 8 8 个氨基酸的蛋白质。该蛋白质与m k p 一6 ，m k p l ，p a c 一1 等双特异性磷酸 酶具有较高的同源性，结构域分析表明该蛋白具有一个明显的双特异性磷酸酶 催化结构域。生物信息学分析及一系列实验证据表明浚蛋白确实是个双特异 性磷酸酶，因此经国际人类基因命名委员会( c o m m i t t e eo fh u m a ng e n e n o m e n c l a t u r e ，h t t p ：w w w g e n e u c l a c u k n o m e n c l a t u r e ) 同意，将其命名为双特异 性磷酸酶1 8 ( d u a ls p e c i f i c i t yp h o s p h a t a s e1 8 ，d u s p l 8 ) 。在人类中目前已经发 现了约3 0 种双特异性磷酸酶，其中正式以双特异性磷酸酶命名的包括d u s p l 8 在内有1 8 种。为对人类基因组所编码的双特异性磷酸酶数目有个螺休f l 认 识，我们对人类基因组中所有编码双特异性磷酸酶催化结构域的c d n a 进行了 分析，结果发现，除了已经明确功能的双特异性磷酸酶外，尚宵l3 条人类未知 功能c d n a 编码的蛋白质具有典型的双特异性磷酸酶催化结构域，我们设计引 物克隆了其中的四条，并对其做了生物信息学分析和初步的功能f i j f 究。 1 材料和方法 1 1 实验材料 1 1 1 组织材料 正常人】8 周胎脑：j j d j l 由上海市第一人民医院提供，取全脑组织，用生理 盐水洗去血污后于液氮中冻存。 1 1 2 主要试剂酶类 o l i g o ( d t ) 纤维素：美国g i b c o 公司产品。 t 4d n a 多聚核菅酸激酶( t 4d n ak i n a s e ) ，英国b i o l a b s 公td 产舳。 t 4d n a 连接酶( t 4d n a l i g a s e ) ，英国b i o l a b s 公司产品。 t 4d n a 聚合酶( t 4d n a p o l y m e r a s e ) ，英国b i o l a b s 公司产品。 1k b d n a 分子量m a r k e r ，美国g i b c o 公司产品。 n o ti 限制内切酶，英国b i o l a b s 公司产品。 b a r nh i 限制内切酶，英国b i o l a b s 公司产品。 e c o r i 限制内切酶，英国b i o l a b s 公司产品。 x h oi 限制内切酶，英国b i o l a b s 公司产品。 t a q p l u sd n a 聚合酶，上海生工生物工程公司。 s u p e r s c r i p ti i 逆转录试剂盒，美国g i b c o 公司。 s m a r te d n a 建库试剂盒，美国c l o n t e c h 公司产品。 b i g d y ep r i m e r 和b i g d y et e r m i n a t o r 测序试剂盒，美国p e r k i n g 公司产品。 r e a l p r e p 9 6 质粒抽提试剂盒，德国q i a g e n 公司产品。 q 1 a q u i c kp e r 纯化试剂盒，德国q i a g e n 公司产品。 q l a q u i c kp c r 割胶回收试剂盒，德国q i a g e n 公司产品。 1 1 3 菌株和质粒 大肠杆菌d h 5 a 菌株：基因型s u p e 4 4 ，l a c u l 6 9 ，( 士8 0 1 a c z a m i5 ) ，h s d r 1 7 ，r e c a l ，e n d a l ，g y r a 9 6 ，t h i 一1 ，r e l a l ，本实验室保存 大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 菌株：基因型f 一，o m p t ，h s d s b ， ( r b 一，m b 一) ， d c m ，g a l ，( d e 3 ) ，本实验室保存 克隆载体p b l u e s e r i p t s k ，购自美国s t r a t a g e n e 公司 原核表达载体p g e x 2 t ，购自美国c l o n t e c h 公司 原核表达载体p g e x 4 t 1 ，购自美国c l o n t e c h 公司 1 1 4 常用试剂配制 溶液d ：4 m o l l 异硫氰酸胍，2 5 m m o l l 柠檬酸钠，o 5 十：烷基肌氨酸钠 4 o 1 m m o l l 3 巯基乙醇。配制方法：在于烤过的试剂瓶中称取2 5 0 克异硫氰 酸胍溶于2 9 3 m l 双蒸水中，加l 7 6 m 1 0 7 5n l m o i l 的柠檬酸钠( p h = 7 0 ) 和 1 0 十二烷基肌氨酸钠，使用前每5 0 r n l 溶液中假如o 3 6m l d 巯基乙醇 o 7 5m o l l 柠檬酸钠( p h7 0 ) ：在干烤过的试剂瓶中秤取4 4 1 3 9 柠檬酸j 三 钠，加m i l l i q 水1 6 0m l 溶解后，加n a o h 调节至p h7 0 ，在干烤过的量 筒中定容至2 0 0m l 后高压灭菌。 无r n a 酶的0 5m o l le d t a ( p h8 , 0 ) 溶液：取新领的e d t a ，用干烤过 的烧杯和药匙称取1 4 6 1g ，溶于8 0m lm i l l i q 的水中，完全溶解后用干烤 过的量简定容至1 0 0m l 。 无r n a 酶的2m o l ln a a c ( p h4 0 ) ：在干烤过的试剂瓶中秤取n a a c 3 h ，o 5 4 2 2 g ，加m i l l i - q 水1 5 0m l 溶解，以冰醋酸调节至p h4 0 ，于干烤过的 量筒中定容至2 0 0m l ，高压灭菌。 水饱和酚：商品苯酚加热融化后倒入园底烧瓶中丌始蒸馏，弃1 8 0 前镏 份，收集1 8 2 馏份( 每瓶约3 0 0m 1 ) ， 加m i l l i q 水饱和，充分摇匀后 4 静置分相，根据有机相体积加0 1 8 一羟基喹啉，颠倒摇匀后4 静 置分层。 氯仿一异戊醇( 4 9 ：1 ) ：取干烤过的量筒量取4 9 0m l 氯仿及1 0m l 异戊醇， 倒入干烤过的试剂瓶中充分摇匀备用。 l m o l l t r i s h c i ( p h 7 5 ) ：于干烤过的试剂瓶中秤取t f j s 2 4 2 2g ，加j 6 0 m j m i l l i q 水溶解，加浓盐酸调至p h7 5 ，于干烤过的量筒中定容至2 0 0m l ， 高压灭菌。 1 0 十二烷基肌氨酸钠：在干烤过的试剂瓶中秤取2 0g 十二烷基肌氨酸钠， 加m i l l i - q 水1 8 0m l ，6 5 溶解混匀，加m i l l i q 水定溶至2 0 0m l ，倒入 试剂瓶中混匀备用。 1 0m g m l 溴化乙锭( e b ) ：在1 0 0m ld d h 2 0 中加入1 g 溴化乙锭，磁力搅 拌至完全溶解，然后转移至用铝箔包裹的棕色瓶中，室温保存。 1 上样缓冲液；0 5 m o l ln a c i ，1 0m o l l t r i s h c i ( p h 7 5 1 ，1 0m o i l e d t a 0 5 s d s 。 1 沈脱缓冲液：10m o l lt r i s h c i ( p h7 5 ) ，1 0m o l le d t a ，0 2 s d s 。 5 f i r s t s t r a n db u f f e r ：2 5 0m o l lt r i s h c i ( p h8 3 ) ，3 7 5m o l lk c i ，3 0m o i l m g c i ! l c o l u m nb u f f e r ：10m o l lt r i s h c i ( p h74 ) ，3 0m o l lk c i ，3 0m o l ln a c l o 5m o l le d t a 3 m o l l n a a c ( p h4 8 ) ：n a a c 3 h 2 0 4 0 8 1 克，加水溶解后用冰醋酸渊常p h 至 4 8 ，定容至1 0 0m l ，高压灭菌。 4m o i l l n h 。a c ：无水n h 4 a c 3 0 8 克，加水溶解并定容至1 0 0 m l l b 培养基：蛋白胨1 0g 、酵母粉5g 、n a c i1 0g ，加8 0 0 m ld d h ! o 搅拌奄 充分溶解，加5 mn a o h 调p h 值至7 0 ，定容至1 l ，分装成每瓶1 0 0m l 灭菌。 l b 固体培养基：l b 培养基分装成每瓶2 0 0 m l ，加入3g 琼脂粉后灭菌。 1 0 0m g m l 氨苄青霉素：0 5g 瓶装氨苄青霉素注入5m l 灭菌水充分溶解， 分装于1 5 m l 离心管中。 t r i s ，s d s ，十二烷基肌酸钠以外试剂的d e p c 处理，上述r n a 试剂如e d t a 等按常规配制后假如o i d e p c ( v ) 过夜，高压灭菌。 5 0 x t a e ：t r i s 碱2 4 2 g 加d d h ，o 6 0 0m l 充分溶解，加冰乙酸5 7 1m l 、0 5 m e d t a ( p h 8 0 ) 1 0 0m l ，定容至ll ，分装灭菌。 d n a m a r k e r ：d i g e s t e db o e h e r i n g m a n n h e i m ，5ug d n ah i n d l l l l0 uit e a 1 1 5 主要仪器设备 a b i3 7 7 型及a b i3 7 0 0 型d n a 自动序列分析仪，美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司产品 g e n e a m p 9 6 0 0p c r 仪，美国p e r k i ne l m e r 公司产品 n e o c o o l 冷冻真空干燥箱，日本y a m a t o 公司产品 s i g m a 9 6 孔板离心机，f r 2 0 0 ，美国s i g m a 公司产品 e p p e n d o r f5 4 1 5 c 台式高速离心机，德国e p p e n d o r f 公司产品 h e t t i c he b a l 2 r 台式高速冷冻离心机，德国h e t t i c h 公司产品 h i t a c h ih i m a cc r 2 1 型高速冷冻离心机，日本h i t a c h i 公司产品 g e n e q u a n ti i 型紫外分光光度计，美国p h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 u l t r o s p e c4 0 0u v v