（遗传学专业论文）拟果蝇（dsimulans）cuznsod基因反转录序列的发现及初步分析.pdf

摘要 反转录转座( r e t r o t r a n s p o s i t i o n ) 是通过r n a 介导的一种转座方式，也是基 因组产生新基因的主要方式之一。近年来，在脊椎动物和无脊椎动物中，人们发 现数目众多的基因进行了反转录转座，并对这种产生新基因的机制有了较深入的 了解。 发生反转录转座的基因一般称作亲本基因( p a r e n t a lg e n e ) ，发生反转录转座 后，亲本基因本身并不发生变化，而是在基因组的其它位置增加一段亲本基因的 e d n a 序列，这种序列被称为反转录序列( r e t r o s e q u e n c e ) 。一般情况下，有功能 的反转录序列称为反转录基因( r e t r o g e n e ) ，没有功能的就称为反转录假基因 ( r e t r o p s e u d o g e n e ) 。 c u z n s o d 基因是一个单拷贝基因，位于果蝇的3 号染色体上，它编码的 超氧化物歧化酶( c u z ns u p e r o x i d ed i s m n t a s e ) 有抗氧自由基的功效，能抵抗衰 老。在分子系统学研究中，该基因是一个合适的分子标记。在本实验中，首先通 过p c r 方法研究了黑腹果蝇种组( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e rs p e c i e sg r o u p ) 部分 物种的c u z 1 1 s o d 基因，在研究中我们发现拟果蝇( d s i m u l a n s ) 的c u z n s o d 基因发生了反转录转座。通过验证实验显示反转录产生的反转录序列存在于拟果 蝇( d s i m u l a n s ) 的y 染色体上。另外，通过分子钟检验和分子系统学分析显示， 该反转录序列进化速率较快，可能属于反转录假基因。 关键词：反转录转座；反转录序列；拟果蝇；c u z n s o d 基因；y 染色体 a b s t r a c t r e t r o t r a n s p o s i t i o ni saw a yo ft r a n s p o s i t i o nt h r o u g ht h er n a , a n d i ti so n eo ft h e m a i nw a y si nw h i c ht h en e wg e n e sc a nb eg e n e r a t e d i nr e c e n ty e a r s i nt h ev e r t e b r a t e a n di n v e r t e b r a t eg e n o m e s ，i th a sb e e nf o u n dt h a tag r e a tn u m b e ro fg e n e sw e r e r e t r o t r a n s p o s e d a n ds o ，t h i sm e c h a n i s mw h i c hg e n e r a t e st h en e wg e n e sw e r ek n o w l l g r a d u a l l y t h eg a n et h a tw a sr e t r o t r a n s p o s e dw a sc a l l e d p a r e n t a lg e n e ，a f t e rt h e r e t r o t r a n p o s i t i o n ，i tc o u l db en o tc h a n g e d ，as e q u e n c eo fe d n ab e l o n g i n gt o t h e p a r e n t a lg e n ew a sa d d e dt o t h eg e n o m e ，t h es e q u e n c ei sc a l l e d r e t r o s e q u e n c e g e n e r a l l y , i ft h er c t r o s e q u e n c ei sf u n c t i o n a l ，i ti sc a l l e dr e t r o g e n e ；i f t h er e t r o s e q u e n c e i su n f u n t i o n a l ，i ti sc a l l e dr e t r o p s e u d o g e n e c u z n s o dg e n ei sas i n g l e c o p yg e n el o c a t e do nt h e3c h r o m o s o m eo ft h e d r o s o p h i l a i te n c o d e st h ec u z ns u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，ah i g h l ys p e c i f i ce n z y m e t h a tp r o t e c ta e r o b i cc e l la g a i n s tt h et o x i c i t yo ff r e eo x y g e nr a d i c a l s t h ec u z n s o d g e n ei sap r o p e rm o l e c u l a rm a r k e ri nt h em o l e c u l a rs y s t e m a t i c s h it h i se x p e r i m e n t ， h o m o l o g o u sg e n e so fc u z n s o dg e n e o fs o m es p e c i e s b e l o n g i n gt o t h e d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e rs p e c i e sg r o u ph a v eb e e ns t u d i e dv i ap c r d u r i n gt h e e x p e r i m e n t ，t h er e t r o t r a n s p o s i t i o no fc u z n s o dg e n eh a v eb e e nd i s c o v e r e d i n d s i m u l a n s t h er e s u l t so ft h e s u b s e q u e n te x p e r i m e n t s s h o w e dt h a tt h e r e t r o s e q u e n c ee x i s t e do nt h ey c h r o m o s o m eo ft h ed s i m u l a n s b yt h em e t h o d so f t h em o l e c u l a rs y s t e m a t i c s ，i tc o u l d b ec o n c l u d e dt h a tt h ee v o l u t i o n a r yv o l e c i t yo f t h i sr e t r o s e q u e n c ei sq u i c k e ra n di tm a yb ear e t r o p s e u d o g e n e k e yw o r d s ：r e t r o t r a n s p o s i t i o n ；r e t r o s e q u e n c e ；d r o s o p h i l as i m u l a n s ； c u z n s o dg e n e ；y c h r o m o s o m e 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 论文作者签名： 日期：岬年 声带帛 月f 。日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位 论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许采用影 印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前提 下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此 规定) 作者签名厚 指导教师签名： 吒 罐虢狗 i i “ 厉 r 二 挑叩 期 期 日 日 前言 刖吾 基因复制、外显子漂移、反转录转座( r e t r o t r a n s p o s i t i o n ) 和基因融合是产生新 基因的主要机制。在过去几十年中，人们在探讨新基因产生的机制中取得了较大 的进展，但同时也遇到了很大的困难，其根本原因是能够用来探讨这些机制的基 因数目太少。但近年来，由于反转录基因的不断发现，人们已对基因反转录转座 机制有了较深的理解。黑腹果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 作为遗传学研究的 模式生物，人们已经在其基因组中发现有几十个基因发生了反转录转座 ( a k h m a n o v aa e ta 1 ，1 9 9 8 ；e s t h e rb e t r f i ne ta 1 ，2 0 0 3 ：w a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) ，同样，在其 它果蝇基因组中也发现了不少的基因发生了反转录转座( n e u f e l de ta 1 ，1 9 9 1 ； t e r e s al u q u ee ta 1 。1 9 9 3 ) 。基因反转录转座的直接结果是形成该基因的反转录序 列( r e t r o s e q u e n c e ) ，其中有功能的反转录序列称为反转录基因( r e t r o g e n e ) ，没有功 能的反转录序列称为反转录假基因( r e t r o p s e u d o g e n e ) 。反转录基因一般具有组织 表达特异性，涉及到基因功能的补充和重新分配( s o a r e se ta 1 ，1 9 8 5 ；b o e re t a 1 ，1 9 8 7 ；n u r m i n s k ye ta 1 ，1 9 9 8 ) 。目前这一领域的研究方兴未艾。 一、反转录序列 ( 一) 反转录序列及其形成的分子生物学机制 反转录序列是功能基因的m r n a 经过反转录产生的e d n a 整合到基因组中 固定下来形成的d n a 片段。发生反转录转座的功能基因称为其反转录序列的亲 本基因。一般情况下，加工后的m r n a 只能作为合成相应蛋白质的模板，但少 数m r n a 因为自身的特殊结构能够被反转录成c d n a 。这些偶然形成的c d n a 有三种不同的去向( 如图1 ) ，其中的一种就是插入基因组形成反转录序列。不 难看出反转录序列的形成机制和反转录转座子( r e t r o t r a n s p o s o n ) 的转座机制大 致相同，但也有些明显的差别：( 1 ) 功能基因的m r n a 在反转录之前一般会 进行一系列加工，但反转录转座子转录形成的r n a 不在被加工的情况下反转录。 这样导致反转录序列与它的亲本基因在结构上有明显的不同，然而反转录转座子 反转录后形成的序列和以前的反转录转座子序列完全相同。( 2 ) 功能基因的 湖北人学硕十学位论文 m r n a 反转录的引物是其37 端的一段序列，而反转录转座子的r n a 反转录所 用的引物是相应的t r n a ( 例如，耐l ，p i a 家族总是利用t r n a m 。作为反转录 的引物) 。( 3 ) 反转录序列一旦整合到基因组中后，便不会再发生反转录转座了， 但反转录转座子还会不断进行反转录转座，导致反转录转座予的数目不断增多， 这也是基因组中大量重复序列存在的直接原因。 原位虑基因发生 源重组 图1 细胞内m r n a 反转录形成的c d n a 去( 1 地高辛探针标记效率的检测 按照地高辛标记与检测试剂盒( r o c h e ) 的说明书进行检测，方法如下： 1 将试剂盒中的v i a l 4 稀释成1 0 、1 0 0 、1 0 - 1 、1 0 - 2 、1 0 - 3 、1 0 4 p g u l 系列，并 将标记好的探针分别按1 、1 0 、1 0 2 、1 0 3 、1 0 4 、和1 0 5 倍稀释。 2 将标准浓度的探针与标记的探针点在同一张尼龙膜上，每个浓度样品点1 , u l ， 在空气中晾干，8 0 烤膜1 小时。 3 将膜于b u f f e ri 中浸湿后，于b u f f e r i i 中3 7 封阻4 5 分钟。将抗d i g a p 和 a v i d i n a p 按1 ：1 0 0 0 0 分别稀释于b u f f e r i i 中，并将封好的尼龙膜放入相应 的抗体中，使抗体结合3 0 分钟。 4 1 0 0 m l b u f f e r i 漂洗2 次，每次5 分钟。在b u f f e r i i i 中平衡2 分钟。 5 在1 0 0 m lb u f f e r l l i 力h 入4 5 # ln b t 和3 5 # lb c i p ( 地高辛标记与检测试剂盒中的 v i a l 9 和v i a l l 0 ) ，将膜放入其中避光显色1 - 6 小时。 6 将膜放入1 0 0 m lb u f f e r i v 中终止显色反应。根据标准浓度探针和标记探真系 列样品的颜色的深浅，估算标记探针的浓度。 ( 十二) 果蝇唾腺染色体的原位杂交 1 染色体标本的预处理，步骤如下： ( 1 ) 将载玻片放入7 0 的2 x s s c 中温育3 0 分钟。 ( 2 ) 在室温条件下，用2 x s s c 清洗载玻片两次，每次1 0 分钟。 ( 3 ) 在7 0 乙醇中脱水两次，每次1 0 分钟，随后在9 5 乙醇中脱水5 分钟， 自然晾干。这一步实验的主要目的是使染色体能够牢固的附着在载玻片上。 材料和方法 2 去掉内源r n a 的干扰： ( 1 ) 将经过预处理过的载玻片放入一湿盒中，在有染色体的部位滴加5 蛳l 的 r n a s e a ( 1 0 0 u g m l ，溶剂为2 x s s c ) 。盖上盖玻片在室温条件下温育2 小时。 ( 2 ) 在2 x s s c 洗掉盖玻片，随后在2 x s s c 清洗两次，每次5 分钟。 ( 3 ) 在7 0 乙醇中脱水两次，每次1 0 分钟，随后在9 5 乙醇中脱水5 分钟， 自然晾干。 3 染色体的变性处理： ( 1 ) 将载玻片放入o 1 m o l l 新鲜配置的n a o h 溶液中，使染色体变性3 分钟。 ( 2 ) 在在7 0 乙醇中脱水三次，每次1 0 分钟；随后在9 5 乙醇中脱水两次， 每次5 分钟。自然晾干。 4 进行杂交反应：取m l 探针和舡l 杂交缓冲液充分混合，在沸水中随后将混 合液滴加在载玻片染色体的部位，加盖玻片；随后将其放入一湿盒中，在7 6 8 。c 条件下杂交反应过夜。 j 一 5 去掉没有杂交的探针：在2 x s s c 中洗掉盖玻片，随后再在2 x s s c 清洗三次， 每次1 0 分钟，从而去掉没有杂交上的探针，自然晾干后就可以进行荧光原位 杂交检测了。 ( 十三) 原位杂交的荧光检测 1 向载玻片有染色体的部位加抗体i 溶液，加盖玻片，放在3 7 c 的保温皿中孵 育3 0 分钟。 2 去盖玻片，室温下用l x p b s 清洗三次，每次5 分钟。 3 甩干载玻片，加1 0 0 u l 抗体i i 溶液，加盖玻片，放在3 7 c 的保温皿中孵育3 0 分钟。 4 去盖玻片，室温下用l x p b s 清洗三次，每次5 分钟。 5 加l o a l 含有抗淬灭剂的p i 或d a p i ，加盖玻片，放置1 0 分钟。 6 镜检( o l y m p u sb h - 2 荧光显微镜) 。 7 选择完整且伸展较好的染色体照相。 湖北大学硕十学位论文 结果与分析 一、p c r 扩增黑腹果蝇种组物种c u z n s o d 基因的结果 以引物a 、b 来扩增c u z n s o d 基因，如图6 所示。 s 0 d + b 图6 c u z n s o d 基冈的结构。黑框表示的是两个外显子，箭头表示的是进行p c r 扩 增的引物位置及方向。 f i g6 t h es t r u c t u r eo fc u z n s o dg e n er e g i o n t h eb l a c kb o x e sr e p r e s e n tt h et w oe x o i l s ， a n dt h ea r r o w si n d i c a t et h ep o s i t i o na n dt h ed i r e c t i o n so ft h ep r i m e r su s e df o rp c r a m p l i f i c a t i o n p c r 产物电泳结果如图7 所示。 图7 p c r 结果。 f i g7 t h er e s u l t sa r es h o w nf o rp c r ms t a n d sf o rs t a n d a r dm a r k e r , ns t a n d sf o rt h e n e g a t i v ec o n t r o l ， a n dt h en u m b e r1 6s t a n df o r d s i m u l a n s ， d 1 u c i p e n n i s ，d c o n s t r i c t a ，d j a m b u l i n a ，d 1 i n i ，d p a r v u l ar e s p e c t i v e l y 从电泳图可以看出，所有被扩增的物种都有一条1 1 0 0 b p 左右的p c r 条带， 但d s i m u l a n s 同时具有一条4 0 0 b p 左右的条带。在此，将d s i m u l a n s 的两条p c r 结果与分析 条带回收，并进行克隆测序。得到如下序列： 4 0 0 b pr c r b a n d 测序结果： a t g g t g g t i a a a g c t g t c t g c g t a g t i a a c g g c g a t g c c a a c g g t a c g g t t t r c r l l a a c a g g a g a c a g c g g l a c g c c c g t g a a g g t c t c c g g t g a g g t g t g c g g c c t g g c c a a g g g t c t c c a c g g a 盯c c a c g t g c a c g a g t r r g g a g a c a a c a c c a a t g g ( 可g c a t g t c g t c c g g a c c g c a c l t c a a c c c g t g g c a a g g a g c a c g g g g c t c c r g t c g a c g a g a a c c g t c a c c t a g g c g a i t g g g c a a c 茂r t g a g g c c a c c g g c g t c r g c c c c a c c a a g g t c a a c a r c a c c g a ( 1 c a a g a t c a c g c t ( 1 r c g g c g c c g a c a g c 肖t c a t c g g a c g c a c c g l t g t c g t g c a c g c c g a t g c c 脚c c g a t ga = r ( 1 g g c c a g g g t g g a c a c 1 1 0 0 b pp c r - b a n d 测序结果( 小写字母代表的是内含子序列) ： 脚g t g g t i a a a g ( x b t c r g c g t a a 几1 a a c g g c g a t g c c a a g g g c a c g ( 订t t t c t t c g a a c a g g a g g t g a g a a t c c a a a a t c a t t t g a a c t t c t c t g c t c g g c a a a a t a t a c g a a a a a c a g a a g t t c t a a a g g t c a a a t a g c c g g c a g c a c c c g c g g c c c c t c t t c c a c t t c a a a a t g c t g c t t t a a a t g c t t t c a a g c a t t t c a a t t a a g t c c g a t t t g a g t t t a c g c c t a g t c a c c c a g c a a g t g c a c c t t t a t a t t t a t a t a a g c c g c a c a a a a a t g c g c a t a t a t g t a t g t g c g c t c a a g t g c c t a c a g c a a a g g t c a c g a a a t t a g t a c t g g t c g t t a a a a g g g g t t a a g t t a t a a a g g t c t t t c a t c a c t t g t t a g t a a a g t a t c g t t a a a t a t c a a c a a a t g t t t g t t t t a a a a t a a t c a t t a g g a a t a t t g g a a t a a t t a g a a t g a t g t t g t t c a t c a t t a a t t t g t a c a t c c a a g t t a a a g c a g c c a t g t c a a t t g t c a a t t a a a c g a t t a t t a a c t t g a t t a c a g g t t a t g t t t t a g t 舀c g a g g a a a t t t a t g t t t t t a a t c t a t a a a g a t a a c c a a a t g t t t a t t a a g c c g c c t a a a a a t a t t t c c a t t t g a c g t g t g t c t a t t a a c a a a t g t t a a c t t c t a t a a t a a c c t a t t a a c a t a t a a a g t t g g c c a c t c t a g l ：t a t c a t a a t c a t t c a c t a c t a t a c a c a a c t t t t g t c t t a t e a g t a t t t g a g t a t a a t c t g a a g 呵t g g c c t a a t t g t a a c c c a a t c c c t t c a t c c c g c c c a c a g a g c a g c g g t a c g c c c g t g a a g g t c t c c g g t g a g g t g t g c g g c c r g g c c a a g g g t c t c c a c g g a 盯c c a c g t g c a c g a g t 丌g g a g a c a a c a c c a a t g g c r g c a t g t c g t c c g g a c c c c a c l l a 蜘陀c g t ：a t g g a a g g a g c a c g g c g c t c c c g t c g a c g a g a a c c g t c a c c r g g g c g a 几厂i g g g c a a c d t g a g g c c a c c g g c g a c t g c c c c a c a a a g g t c a a c a r i ：a c c g a ( 1 c a a g a t c a c g c r i ：n g g c g c c g a c a g c a r ca ：r c g g a c g c a c c g t t g t c g t g c a c g c c g a t g c c g a t g a t c t c g g c c a g g g t g g a c a c 湖北大学硕十学位论文 从测序结果分析得出，长片段为1 1 2 0 b p ，属于c u z n s o d 基因：小片段为 3 9 0 b p 。3 9 0 b p 片段的序列和1 1 2 0 b p 片段的序列对比，刚好缺乏两个外显子中间 的7 3 0 b p 内含子。在此为了方便，将包含3 9 0 b p 序列的基因命名为、l ，c u z n s o d 基因。也即是在d s i m u l a n s 群体中，存在两种c u z n s o d 基因。 二、对d s i m u l a n s 、i ，c u z n s o d 基因的初步分析 现有的研究都表明，在所有真核生物中，c u z n s o d 基因都是一个单拷贝 基因。拟果蝇( d s i m u l a n s ) 中出现没有内含子的、i ，c u z n s o d 基因，从分子生 物学的角度考虑，存在两种可能性。第一种可能性是因为内含子的丢失，造成了 群体中等位基因多态性( a m yl f e i b e r ee ta 1 2 0 0 2 ) 。这种现象产生的原因是功 能基因的c d n a 与原位点基因之问发生了同源重组。按照这种假设，w c u z n s o d 基因是因为c u z n s o d 基因将内含子丢掉形成的，它们互为等位基因。第二种 可能性是c u z n s o d 基因发生了发转录转座，在基因组中形成了反转录序列 ( r e t r o s e q u e n c e ) 。按照这种假设，v c u z n s o d 基因应该是c u z n s o d 基因的 反转录序列。 三、对、l ，c u z n s o d 基因是否是等位基因的验证 为了检验、l ，c u z n s o d 基因是否是c u z n s o d 基因的等位基因，采用p c r 的方法进行验证。所用引物为a 、c ，其中引物c 位于c u z n s o d 基因的下游 基因e s t 6 上。如图8 所示。 图8 c u z n - s o d 基因的结构和扩增方案。黑框表示的外显子，最右边的一个表示的 e s t - 6 基因的第一个外显子。箭头表示的是进行p c r 扩增的引物位置。 f i g8 t h es t r u c t u r eo fc u z n - s o dg e n er e g i o na n dt h es t r a t e g yf o ra m p l i f i c a t i o n t h eb l a c k b o x e sr e p r e s e n tt h ee x o o s ，t h er i g h to n er e p r e s e n t st h ef i r s te x o oo ft h ee s t - 6g e n e t h e a r r o w si n d i c a t et h ep o s i t i o n sa n dt h ed i r e c t i o n so ft h ep d m e r su s e df o rp c r 结果与分析 按照假设，如果v c u z n s o d 基因和c u z n s o d 基因互为等位基因，那么 p c r 的结果也应该有两条目的带。因为真核生物的m r n a 是单顺反子，所以 c u z n s o d 基因的m r n a 和e s t 6 基因的m r n a 不可能一起被反转录成c d n a ， 并被插入到基因组中的同一个位置。如果假设成立，将出现1 条1 9 0 0 b p 左右的 条带和一条1 1 7 0 b p 左右的条带。p c r 产物电泳结果如图9 所示。 图9 p c r 结果。1 4 表示的是随机选择的4 个不同的拟果蝇( d s i m u l a n s ) 种群。 f i g9 t h er e s u l t sa r es h o w nf o rp c r ms t a n d sf o rs t a n d a r dm a r k e r , s t a n d sf o rt h e n e g a t i v ec o n t r 0 1 a n dt h en u m b e r1 4s t a n df o r4d i f f e r e n tp o p u l a t i o n so ft h e d s i m u l a n s p c r 结果显示，并没有出现预期的两条条带，仅仅出现了1 9 0 0 b p 左右的条 带( 测序结果表明该条带是目的条带) ，而没有出现1 1 7 0 b p 的条带，表明不能扩 增出、i ，c u z n s o d 基因。由此表明v c u z n s o d 基因不可能是c u z n s o d 基因 等位基因。那么按照排除法，v c u z n s o d 基因很可能是c u z n s o d 基因的反 转录序列。然而，我们在随机选择d s i m u l a n s 的任何一单雌系，抽提单只果蝇的 d n a ，并进行p c r ( 利用引物a 、b ) ，只要用来实验的果蝇的数量足够大( 5 0 1 0 0 只) ，总会出现少数果蝇的p c r 结果只有大的条带，也就是说只能扩增 c u z n - s o d 基因，而不能扩增出w c u z n s o d 基因。难道有些特殊果蝇不具有 c u z n s o d 基因的反转录序列? 四、雌雄拟果蝇( d s i m u l a n s ) 之间差异的发现 不同果蝇之间最基本的差异就是雌雄差异，将果蝇区分雌雄，雌果蝇是处 女蝇，抽提单只果蝇的d n a ，并进行p c r ( 利用引物a 、b ) ，实验结果如图1 0 。 湖北大学硕十学伉论文 图1 0 用单只拟果蝇( d s i m u l a n s ) 的d n a 进行p c r 结果。其中1 3 表示的是雌处 女果蝇，4 6 表示的是雄果蝇。 f i g l 0 t h er e s u l t sa r es h o w nf o rp c ru s i n gt h es i n g l ef l yd n a ms t a n d sf o rs t a n d a r d m a r k e r , ns t a n d sf o rt h en e g a t i v ec o n t r o l ，t h en u m b e r1 3s t a n df o rv i r g i n - f e m a l ef l i e s ， a n dt h en u m h e r4 6s t a n df o rm a l ef l i e s 从图中可以看出，雄性果蝇有两条p c r 条带，而雌处女蝇仅有1 1 2 0 b p 的条 带。由此表明雌雄果蝇的的基因组中都应该含有c u z n s o d 基因，但 、i ，c u z n s o d 基因却仅仅存在于雄果蝇的基因组中。从核型角度来考虑，雌雄果 蝇之间不同点在于雄果蝇具有一条y 染色体，但雌果蝇却没有。由此可以推论 、| ，c u z n s o d 基因应该是c l l z n s o d 基因的反转录序列，并且该反转录序列存 在于雄果蝇的y 染色体上，雌果蝇是不具有这种反转录序列的。 五、n s h 验证e c u z n s o d 基因只存在于雄性果蝇中 用v c u z n s o d 基因片段作为探针，采用随机引物法标记，和拟果蝇 ( d s i m u l a n s ) 的唾腺染色体进行荧光原位杂交。因为、l ，c u z n s o d 基因片段和 c u z n s o d 基因的编码区序列同源，所以雄性果蝇的唾腺染色体f i s h 结果应该 有两个杂交点，而雌性应该只有一个杂交点，因为反转录序列存在于y 染色体 上，而雌果蝇是没有y 染色体的。杂交结果如图( 1 1 a ，1 1 b ) 所示。 结果与分析 ( a ) ( b ) 图1 1 ( a ) 雄拟果蝇( d s i m u l a n s ) 唾腺染色体荧光原位杂交的结果( b ) 雌拟果蝇 ( d s i m u l a n s ) 唾腺染色体荧光原位杂交的结果。 f i g n ( a ) f i s hr e s u l to ft h ei n a l ed s i m u l a n s ss a l i v a r yp o l y t e n e 但) f i s hr e s u l to ft h e f e m a l ed s i m u l a n s ss a l i v a r y p o l y t e n e 从图中可以看出，雄性果蝇的唾腺染色体f i s h 结果有两个杂交点，而雌性 果蝇的唾腺染色体f i s h 结果只有一个杂交点，所以基本断定、i ，c u z n s o d 基因 片段应该存在于雄拟果蝇( d s i m u l a n s ) 的y 染色体上。 湖北人学硕十学位论文 讨论 一、i ，c u z n - s o d 基因的序列分析 通过p c r 我们得到拟果蝇( d s i m u l a n s ) c u z n s o d 基因有效序列的为 3 6 6 b p ，这段序列和拟果蝇( d s i m u l a n s ) c u z n s o d 基因的编码区同源性很高， 在此我们对比分析、i ，c u z n s o d 基因的这段序列，结果如图1 0 所示。 mvvka v c v ln gdak mvv kavc v v ngd a n a d g g t g g t i a a a g c t g t c t g c g t a a t t a a c g c 把g a t g c c a a g a r g g t g g t i a a a g c t g t c t l 3 c g 卫气g t l a a c g g c g a r g c c a a c gtvffeoessgtpv gtvff o 0e ssgtpv g g c a c g g t i t r c i t c g a a c a g g a g a g c a g c g g t a c g c c c g t g g g m 虻g g t i r r l 了r r - i a a c a g g a g a g c a g c g g t a c g c c c g t g kvsgevcglakglh kvsgev c glakglh a a g g t ( 1 c g g t g a g g t g t g c g g c c 咖c c a a g g g t ( 1 c a c gfhvhefg dn t n gc gfhvhefg dn t n gc g g 成兀c a c g t g c a c g a g t r r b g a g a c a a c a c c a a t g g c t g c g g a t r c c a c g t g c a c g a g t r r i a g a c a a c a c c a a t g g c t g c c u z n s o d v c u y z n - s o d c u z a s o d v c u z n s o d c u z n - s o d 、i ，c u z n - s o d c u z n s o d v c u z n - s o d c u 亿n s o d v c u z n s o d c u z n s o d 1 l ，c u z n - s o d c u z n s o d 1 i ，c u z n s o d c u 2 ，m s o d i ，c u z n s o d 讨论 ms s gphf npy gkeh mssgphfn py gkeh a t g t c g t c c g g a c c c c a c 丌c a a t c o g i ：i 蝴r ( g c a a g g a g c a c a t g t c g t c c g g a c c g c a c t t c a a c c c g l a t g g c a a g g a g c a c gap v d e n rhlgdlg gap vdenrhlgdlg g g c g c t c c o g t o g 0 g g c c g t c a c c t g g g c g a r r r l j g g c g g g g c t c c t g t o g a c g a g a a o c g l a c c l a g g c ga = r c t g g g c n ieatgdcptkv ni n jeatgvcptkv nl a a c a t i g a g c 把c a c c g g c g a c 眦o c c a c a a a g g r l 泓c a l a a c a t t g a g c c a c c g g c g t c i v c c c a c c a a g g t c a a c a t c td s k itlfgadsli td skl tlfgadsll a c c g a c r c c a a g a t c a c g c i c t f c g g c g c c g a c a g c a r ，i t c a c c g a c t c c a a g a t c a c g c t c i t c g g c g c c g a c a g c a ：r i j 1 grtvvvh a da g rtvvv h a da g g a c g c a c c g t i g t c g t g c a c g c c g t g c c g g a c g c a c c g t t g t o g t g c a c g c o g a l b c c o 亿n s o d 虻u 亿n s o d c u z n - s o d c u z n - s o d c u z n s o d v c u f z n s o d c u z n - s o d vc u z n - s o d c u z n s o d 1 i ，c u z n - s o d c u z n s o d v c u z n - s o d c u z n - s o d v c e z n - s o d c u 亿n s o d v c u z n - s o d c u 7 n s o d 、| ，c u z n - s o d c u z n s o d 1 i , c u z n s o d 图1 2 c u z n - s o d 基因和v c u z n - s o d 基因部分编码区序列及其编码的氨基酸序列。 f i g1 2 t h ep a r t i a lc o d i n gs e q u e n c e sa n dt h ea m i n oa c i dv a r i a n t so ft h ec u z a s o dg e n ea n d i ，c u z n - s o dg e n e 序列对比分析可以发现，在比较的这段区域内，、i ，c u z n s o d