（遗传学专业论文）乳酸菌表达质粒载体组成型启动子的克隆及表达的初步研究.pdf

摘要乳酸菌表达质粒载体组成型启动子的克隆及表达的初步研究( 摘要)人们普遍认为：赶部分乳酸菌足安全的益生菌。利用某些乳酸菌可以在胃肠道、泌尿、生殖系统中，或粘膜部位黏附存活h 无病原性等特点，以乳酸菌作为活菌口服疫苗或粘膜疫苗载体的研究受到了研究者们广泛的重视。乳酸菌活菌携带抗原可以诱导免疫反应在不同的实验室得到了证明，h 乳球菌在选择抗原诱导免疫反应方而比乳杆菌更加有效。本实验室已经从乳酸蔼保健品中分离筛选到两株可以作为受体菌株的乳酸菌，株a s l 2 9 8 4 和一株a s i2 9 8 6 。在乳酸菌中表达目的蛋白，圈际一精采用n _ ! i s i n 诱导型表达质粒。但该质粒转入这两株乳酸菌之后却无法得到爱自质的离表达，乳酸菌口服疫苗的研究也无法展丌。为了解决这个问题，我们探索缃建缉成型表达质粒。组成型表达质粒相对于诱导型表达质粒，优越性在于进行! - 胀疫酶誓验时不用再幔服任何诱导物质，可以使实验更简单，我们采用了鸟枪法随矧克隆能存乳酸莳中组q 戋，鬯表达的启动于功能，h 段。强质粒p y z 8 0 3 7：b 基础与米自p u c l l 9 舵敞矢启动“佝0 一内酰胺酶基阕作报告揍圜鞫建r 乳酸藩自动j ：探洲载体讨q z 8 0 3 7 a p a m p 。p n z s 0 3 7 能盔乳酸乳球菌、乳酸杆菌桤草芽饱柑。确等乎种革羔舞珊性阿_ j ： 疆i 杆菌中稳娃复制、存在是个j “泛宿主范围的质粒。这样孵入了椿删裁髂的宿主范眠x 省去了j 最组质粒从大肠杆菌转移到乳酸菌等其他菌时的距觅隆步恻。洋自黄肠球菌e n t e r o c o “：“s m c 洳a s l 2 9 8 4 的总d n a 经妇“3 i 酶切后克隆进p n z 8 9 3 7 一ap a m p 探删载体，获得一系列长短不同的插入片段这些插入片段均能启动s 内酰胺酶基因的丧达，序列分析的结果表明插入片段p n z 8 0 3 7 一p 一p a m p 2 具典型的启动于序列结构。由于乳酸菌的益生性，我们也尝试以乳酸菌为载体进：厅肿瘤治疗的初步研究。乳酸菌肿瘤治疗的一个条件是乳酸菌能够在肿瘤中聚集，在喂服肿瘤老鼠乳酸菌后，我们发现粪肠球菌a s l 2 9 8 4 在肿瘤中有一定程度的聚集，粪呖球蔚a s l 2 9 8 4在其它器官中则不会聚集。因而，乳酸菌作为口服疫苗和肿瘤治疗的载体，有一定的研究和买践价值。关键词乳酸菌粪肠球菌口服疫曲组成型表达质粒启动子聚集p n z 8 0 3 7 ap a m p 吗枪法摘要c l o n ec o n s t i t u t i v ep r o m o t e r sa n dc o n s t r u c tc o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o nv e c t o r si nl a b( a b s t r a c t )m o s tl a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) a r ec o m m o n l yc o n s i d e r e da ss a f ep r o b i o t i c s s o m es w a i n so fl a c t i ca c i db a c t e r i aa r ef o u n dt oh a v et h ea b i l i t 。vt oa d h e r ea n dl i v e i nt h eg a s t r o - i n t e s t i n a lt r a c t , u r i n o g e n i t a ls y s t e r mo rm u c o s a lw i t h 【n oc o n t e m p o r a r yi m m u n o g e n i c i t y i m p o r t a n c ei sw i d e l ya t t a c h e dt ot h er e s e a r c ho ft h el a ba sl i v eo r a la n dm u c o s a lv a c c i n e i ti sv e r i f i e di nd i f f e r e n tl a b st h a tt h ea n t i g e n sp r e s e n t e db yl i v el a bc a ni n d u c ei m m u n e r e s p o n s e s l a c t o c o c c u si sm o r ee f f e c t i v ei n 【s e l e c t i n ga f l t i g e nt oi n d u c ei m m u n o l o g i c a lr e s p o n s e ，w h i l et h ep o s i t i v er e s u l to fl a c t o b a c i i l u si sl i m i t e d t w os t r a i n so fl a b - ，o n ec o c c g sa s l 2 9 8 4a n do n eb a c i l l u sa s l 2 9 8 6w h i c ha r et h en o r m a lr e s i d e n t si ni n t e s t i n a lt r a c la n dw h i c hc o u l db et h eh o s tb a c t e r i a a r er e s p e c t i v e l yi s o l a t e df r o ml a bs a n i t a r i a np r o d u c t si no u rl a b n i s i n i n d u c i b l ee x p r e s s i o nv e c t o r sa r ec o m m o n l yu s e dt ee x p r e s ss p e c i f i cp r o t e i n si nl a b h o w e v e r ，w ec a n tg e tt h eh i g he x p r e s s i o no fs p e c i f i cp r o t e i n sa f t e rt r a n s f o r m i n ga i s i n -i n d u c i b l ee x p r e s s i o nv e c t o r si n t ol a b s o ，t h er e s e a r c ho i lt h eo r a l l yt a k e nv a c c i n ei nl g bc a l l tb ed o n e w ee x p l o r et oc o n s t n l c tc o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o nv e c t o r si no r d e rt os o l v et h i sp r o b l e m t h ea d v a n t a g eo fc o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o nv e c t o r si st h a tw er ：e e d：n o tf e e dm i c ew i t hn i s i n ，w h i c hm a k e st h ee x p e r i m e n to no r a l l yt a k e nv i c c l n ei nl a bm o r ee a s i l y ,t h es h o tg u ns t r a t e g ya r eu s e dt oc o n s t r u c tc o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o nv e c t o r si nl a b ap r o m o t e rp r o b ev e c t o ro fl a c t i cb a c t e r i a ，d e s i n g n a t e dp n z 8 0 3 7 一a p a m pb a s e do np n z 8 0 3 7h a sb ec o n s t r u c t e d t h ev e c t 0 1 i c o n t a i n e dar e p o r t e rg e n ee n c o d i n gf o r0一l a c t a m a s e ，w h i c hl a c k e dap r o m t e r s a u 3 a ，r e s t r i c ti o nf r a g l n e n t s ( 1 0 0 5 0 0 b p )f r o me n t e r o c o c c u s a c a l i sa s l 2 9 8 4t o t a ld n aw e r ec l o n e di n t ob a m his i t eo fp n z s 0 3 7 一a p a m p al o to fd i f f e r e n ts i z ef r a g m e n t sw e r es e l e c t e d t h e s ef r a g m e n t sp r o m o t et r a n s c r i p t i o no f0 - l a c t a m a s ei nl a b s e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a ti n s e r t e df r a g m e n ti np n z 8 0 3 7 - a p - p a m p 2c o n t a i n e dt y p i c a lp r o m o t e r ,w ea l s ot r yt ou s el a ba st h ec a r r i e rt od os o m ee l e m e n t a r yr e s e a r c h e so i lt h et u m o rt h e r a p yd u et ot h ec h a r a c t e ro fl a ba st h ep r o b i o t i c s t h ep r e c o n d i t i o nf o rl a ba p p l i e di nt u m o rt h e r a p yi st h ec o n c e n t r a t i o no fl a bi nt h et u m o r w ef o u n dt h a t摘要l a bc a nc o n c e n t r a t ei nt h et u m o ra f t e rf e e d i n gm i c ew i t hl a ba n dt h e yd o n tc o n c e n t r a t ei no t h e ro r g a n s t h i sp h e n o m e n o ni sv e r yi n t e r e s t i n gt or e s e a r c h e r sa n dh e l p f u lt op a t i e n t s s ow es h o u l dc o n t i n u et od or e s e a r c ho nl a bi nt u m o rt h e r a p y k e yw o r d s ：l a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) ；o r a l l yt a k e nv a c c i n e ；c o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o nv e c t o r ；e n t e r o c o c c u sf a c a l i s ；p r o m o t e r ；c o n c e n t r a t i o n ；p n z 8 0 3 7 - a p a m p ；s h o tg u n3鼬舀刖舌乳酸菌( 1 a c t i ca c i d b a c t e r i a ) 在自然界分布广泛，从远古时代，就被人们用于食品加工及保存中，特别是用于奶制品生产和肉、蔬菜、面包的发酵等方面。一些乳酸菌是人和动物的胃、肠、口腔、雌性生殖道的共生菌，可以促进人和动物的健康，已经成为最重要的益生菌。利用乳酸菌作为表达系统最吸引人的是因为乳酸菌安全、没有内毒素，表达的外源蛋白无须经过纯化可以直接连同菌体一起服用。再者，乳酸菌可以在肠道中存活定植，口服基因工程乳酸菌后，乳酸菌表达的用于治疗或免疫作用的蛋白就可以源源不断在肠道中生产并起到相应的作用。胆乳酸菌却不是高效表达外源蛋白的好材料。因为通常情况下乳酸菌表达的效率是不高的，这也和乳酸菌分子遗传学的研究起步较晚，对乳酸菌的基因转录和翻译的调控及蛋白分泌的机制了解得还不够深入有关。随着乳酸菌各类表达元件的分离，相继发展了一系列的适用于乳酸菌的克隆载体、表达载体和整合载体。在作为乳酸菌受体菌的菌株中，应用最多的主要有乳球菌、肠球菌、乳酸乳杆菌等，由于乳酸菌的多种属性，因此国际上构件的一些克隆载体、表达载体和整合载体不一定适合于一切的乳酸菌。这些载体都带有一个或多个编码特定抗生索( 如红霉素、氯霉素) 抗性的基因。虽然这为遗传操作时保持一定的选择压力，对载体的选择作用和筛选转化子是有效的。但将抗生素抗性基因投放到环境中或人或动物体内，由于抗性因子的转移，将给生物安全性带来严重后果。为了防止使用抗生素抗性标记所引起的危害，最有效的办法是用对人体安全的食品级标记替代抗生素抗性标记，以建立食品级选择性标记的载体。此外，由于乳酸菌的安全性，有人已经开始提出乳酸菌肿瘤治疗的初步设想。正是由于乳酸菌多种属性这种原因，将国际上流行的表达载体转入本实验室分离得到的两株乳酸菌后，我们不能得到目的蛋白在乳酸菌中的高效表达。为了解决这个问题，我们尝试构建适合于该两株乳酸菌的表达载体。初步应用构建的启动子探测载体克隆到了可在乳酸菌中表达的启动子功能片段，得到了在粪肠球菌a s l 2 9 8 4 中表达效果好于国际上常采用的表达载体的表达体系。本文同时研究了乳酸菌肿瘤治疗的可能性，发现乳酸菌可以在肿瘤中聚集，因而乳酸菌肿瘤治疗的研究可以深入展开。4第一部分乳酸稿启动子探漉载体的掏建爱应氆第一部分乳酸菌启动子探测载体的构建及应用克隆启动子的一种策略是鸟枪法，构建了一个以0 一内酰胺酶为报告基因，以氯霉素( c m r ) 为抗性标记，在大肠杆菌和乳酸菌中均能稳定复制的启动子功能序列探测载体，大小为3 8 k b 。粪肠球菌a s l 2 9 8 4 和植物乳杆菌a s l 2 9 8 6 基因组分别经s a u 3 a i 部分酶切，l o o b p 至1 0 0 0 b p 大小片段与启动子探测载体连接，转化c o l x d h 5a ，获得能在大肠杆菌中表达a p r 抗性的质粒系列，然后以此系列质粒电转粪肠球菌a s l 2 9 8 4 ，得到能在粪肠球菌a s l 2 9 8 4 中表达报告基因的含启动子功能序列片段的质粒转化子。、材料1 、菌株和质粒a 、菌株：粪肠球菌a s l 2 9 8 4 ( d m e r o c o c c u s 五a e c a l i sa s l 2 9 8 4 ) ：从医药市场上的乳酸菌保健品和食品超市上销售的各种品牌的酸奶样品中分离筛选得到，由本实验室保存。大肠杆菌d h 5 口：s u p e l a c u ( 1 l r 8 0 1 a c za m l 5 ) h s d r l 7r e c al e n d a lg y r a 9 6t h i 一1r e a 1 ，由本实验室保存。b 、质粒：p n z 8 0 3 7 质粒( 大肠杆菌一乳酸菌穿梭质粒，氯霉素抗性，有一个n i s i n 诱导的启动子p n i s a ) ，p s g l l 6 4 质粒( 含有g f p 基因，氯霉素抗性) 由荷兰n i z of o o dr e s e a r c h 赠送。n i s i n 诱导表达质粒p w y 7 1 3 0 一g f p ( 红霉素抗性) 由王荫榆博士构建，本实验室保存。p u c l l 9 质粒( 本实验室保存) 。p g e m - t 栽体购自p r o m e g a 公司。2 、培养基a 、液体m r s 培养基( 乳酸菌专用培养基) ：蛋白胨1 0g 、牛肉膏i 0g 、酵母粉5g 、k 2 h p 0 4 2g 、柠檬酸三铵2g 、吐温一8 01m l 、n a a c5g 、m g s 0 40 5g 、m n s0 10 2 5g 、葡萄糖2 0g ，加双蒸去离子水至8 0 0 ml 使完全溶解，调p h 6 2 6 6 ，补加水至总体积为l m l ，8 磅高压蒸汽灭菌3 0 m jr l 。第一部分乳酸菌启动f 探霸载体的构建致应角b 、固体m r s 培养基：固体m r s 培养基由1 0 0m l 液体m r s 培养基中加1 6g 琼脂粉配成。8 磅高压蒸汽灭菌3 0 m i n 。c 、m r s 高渗培养基：m r s 高渗培养基由1 0 0i i l l 液体m r s 培养基中加入2 0g 的蔗糖配成。8 磅高压蒸汽灭菌3 0 m i n 。d 、改良m r s 培养基：不含牛肉膏的液体m r s 培养基。8 磅高压蒸汽灭菌3 0 m i n 。e 、液体l b 培养基：蛋白胨i 0g 、n a c l1 0g 、酵母粉5g ，加双蒸去离子水至8 0 0 ml 使完全溶解，调p h7 2 、7 4 ，补加水至总体积为i m l ，8 磅高压蒸汽灭菌3 0 m i n 。f 、固体l b 培养基：固体l b 培养基由1 0 0m l 液体l b 培养基中加1 6g 琼脂粉配成。8 磅高压蒸汽灭菌3 0 m i n 。g 、抗生素浓度：用于培养含c m r 质粒的菌株时，氯霉素最终浓度为6l ag m 1 ；用于培养e r 。质粒的乳酸菌菌株时，红霉素最终浓度为2ug m l ；用于培养含a m p 。质粒的菌株时，氨苄青霉素最终浓度为5 0ug m 】当制各乳酸菌感受态时，氨苄青霉素的最终浓度为2 0 pg m ! 。3 试剂和试剂盒a 、酶类：t 4 d n al i g a s e ，r n a s e ，占鲥】i ，p s t i ，x b a i ，溶菌酶等( t a k a r a 生物工程有限公司) 和t a q 酶( 自制) 。b 、主要试剂：i p t g 及x - g a l 购自p r o m e g a 公司：氨苄青霉素、氯霉素、红霉素及d n t p 购自生工生物工程有限公司：n i s i n 购自s i g m a 公司：其他主要试剂为进口产品或国产分析纯产品。g e le x t r a c t i o n 试剂盒购自上海博光生物科技有限公司；t - v e c t o r 试剂盒购自p r o m e g a 公司；d n a l a d d e r 购自t a k a r a 生物工程有限公司。d d h 。0 和i o x p c rb u f f e r 由本实验室制各。c 、主要溶液：s o l u t i o ni ：5 0 m m o l l 葡萄糖，2 5 m m o l l 。t r i s c 1 ( p h 8 0 ) 1 0 m m 0 1 le d t a ( p h 8 0 )第一部分乳酸萄商动f 探漉载体的枷建及疵j js o l u t i o ni i ：0 2 m m o l i 。n a o h ，1 s d s ( 临用莳配制)s o l u t i o nl i i ：6 0 m lk a c ，1 1 5 m l 冰乙酸，用蒸馏水定容至1 0 0 m l 。电转化用的缓冲液p e b 2 ( 改良的p e b ) ：0 5m o l l 蔗糖、0 5m m o l lm g c l 。、1m m o l l 。磷酸钠缓冲液，p h 值为7 4 。n i s i n ：l o m gn i s i n ( 纯度为2 5 ) 溶于l m l o 0 5 h a c 中，取1 0 “l 稀释1 0 0 倍即可使用。l m o l lt r i s c 1 ( p h 7 5 ) ：8 0 m l d d l l ：0 中溶解1 2 1 9t r i s 碱，加0 1 m o l lh c l 约8 o m l 调至p h 7 5 ，混匀后加d d h 。0 至l o o m i 。0 im o l lt r i s c 1 ( p h 7 5 ) 则在该基础上稀释1 0 倍。2 5 蔗糖溶液：2 5 9 蔗糖溶于7 0 m l d d h 。0 中，混匀后加d d t l 。0 至l o o m l ，8 磅高压蒸汽灭菌3 0 m i n 。3 0 m g m e 溶菌酶：取3 0 m g 溶菌酶，溶于l m l 2 5 蔗糖溶液。6 s d s ：6 9 s d s 溶于7 0 m l d d h ：0 中，混匀后加d d h 。0 至1 0 0 m l 。1 0 x p e rb u f f e r ：5 0 0 m m o l lk c l ，1 0 0 n n l n o l l 。t r i s c 1 ，1 5 m m o l 几m g c l 。4 、仪器设备高速冷冻离心机：h i t a c h i2 0 p r 一5 2 d 型台式高速离心机：b i o f u g e p i c o ，h e r a e u s 和t g l - 1 6 c ，上海安亭科学仪器厂p c r 仪：p e r k l i ne l m e rd n at h e r m a lc y c l e r恒温摇床：n e wb r u n s w i c ks c i e n t i f i c ，e d i s o n ，n j ，u s a 凝胶成像仪：u v p ( u l t r a - v i o l e tp r o d u c t s )电热恒温水浴锅：上海医疗器械五j +电热谷风箱：上海市上海县实验仪器厂电热恒温干燥箱：上海医疗器械五厂电源：b i o r a dm o d e l1 0 0 0 1 5 0 0p o w e rs u p p l y 和j m 一2 5 0 ，大连捷运科贸有限公司灭菌锅：m l s 3 7 8 0 ，s a n y 0微波炉：r 6 2 0 0 ，s h a r p水平及垂直电泳槽：上海精益有限玻璃制品仪器厂共聚焦显微镜：l e i c a t c s n t 激光共聚焦扫描显微镜第1 部分乳酸菌毫动子探溅载钵钓枸建及壳珀1 、启动子功能序列探测载体的构建二、方法自行设计一对引物，从质粒p u c l l 9 上扩增一段无启动子的b 内酰胺酶基因( a p a m p ) ，经p g e m t 载体克隆到质粒p n z 8 0 3 7 的删和毖舯i 问，得到在c m平板中生长而在a m p 和c m 双抗平板中不能生长的转化子p n z 8 0 3 7 一ap a m p ，p n z 8 0 3 7 一ap a m p 既是以b 一内酰胺酶为报告基因，以氯霉素( c m 。) 为抗性标记，在大肠杆菌和乳酸菌中均能稳定复制的启动子探测载体，大小为3 8 k b 。1 1 引物的设计与合成根据质粒p u c l l 9 的a m p 基因序列设计引物，以克隆和构建a p a m p 基因( 缺失启动子序列的t 3 一内酰胺酶基因) ；为了克隆方便，在上游引物的5 端加入毖州i 酶切位点，下游引物的5 端加入肋胡i 酶切位点。引物由上海生工公司合成，引物序列如下：u p ：57g g g a t c c c a t a c a c t a t t c r c a g3 d o w n ：5 g g a a t t c c c t a a ( ：t a c g g c t a c3 1 2ap a m p 基因扩增和克隆1 2 1 以质粒p u c l l 9 为模板，p c r 扩增a p a s p a m p 序列。引物：( 十) 57g g g a t c c c a t a c a c t a t t c t c a gt 一) 57g g a a t t c c c t a a c t a c g g e t a c 。p c r 反应体系如下：l o b u f f e r5uld n t p ( 2 5m m o l l )1ul正向弓j 物( 1 0 “m o l l )lul反向引物( 1 0pm o l l )il alt a q 酶( 1u 1 3 l )lul模板d n a ( 5 0n g hl )luld d h 。04 0ul总体积5 0 ul第一部分乳酸茵密动子探泌载体的构建硬赢f b 。p c r 反应条件如下：混匀反应液后，短暂离心，加液体石蜡封盖，然后进行扩增。循环参数为9 4 变性5m i n ：然后9 4 3 0s 一5 5 3 0s 一7 2 4 5s ，共3 0 个循环；最后7 2 延伸1 0m i n 。1 2 2 p a m p 基因与t 载体连接及c o l a ) h 5 转化重组子的鉴定割胶回收p c r 产物( 博光吸附柱式琼脂糖割胶d n a 回收试剂盒) ：割胶回收方法见第一部分：生物信息学方法预测构建启动子，- 、方法，4 与t 载体连接：在2 0 l ll 反应体系中，加入1 5 l 回收的p c r 产物，0 5ui ，t - v e c t o r ，2 i xl1 0 连接缓冲液，0 5 i xlt 4d n a 连接酶，补d d h 。0 至总体积2 0 ul ，混匀，置于1 6 水浴连接过夜。连接产物的转化：( 1 ) 巨c o l id h 5a 感受态的制备：从平板上挑取叵c o i ld h 5o 单克隆到2 m l 液体l b 培养基中活化。以1 的接种量将活化的ec o l id h 5a 菌液接入4 0 m l 液体l b 培养基中，3 7 2 5 0 r p m 振荡培养至0 d 6 0 0 为0 2 左右。置菌液于冰上l o m i n ，移入5 0 m l 离心管中，4 0 0 0 r p m ，4 离心1 0 m i n 。弃上清，加入2 0 m l 0 1 m o l l 预冷c a c l 。液悬浮细胞，冰浴2 0 m i n 。4 0 0 0 r p m ，40 c 离心l o m i i 3 回收细胞，弃上清，加入i m l 预冷0 i m o l lc a c l ：液悬浮细胞，冰浴保存。( 2 ) c a c i 。转化法：取出1 0 0 ul 感受态细胞，加入1 0 ul 连接液，混匀，冰浴3 0 m i n 。4 2 。c 热休克9 0 秒，迅速放回冰中将细胞冷却3 m i n ，加入4 0 0ul 液体l b培养基，3 7 2 5 0 r p m 振荡培养4 5 m i n 。取1 0 0 ul 培养液涂布于含氨苄青霉素、i p t g 和x - g a l 的l b 平板，3 7 。c 倒置培养1 2 小时。ec o l id h 5a 重组子的鉴定：挑取上步平板上的白色菌落，p c r 筛选，然后测序鉴定ec o i ld h 5n 重组子，最后得到t 一p a m p 叵c o i ld h 5a 重组转化子。1 3t 一p a m p ec o l x d h 5q 重组转化子质粒d n a 的制备( 1 ) 质粒常规碱裂解抽提法t ap a m p c o l id h 5a 重组转化子接种于4 0 m l 液体l b 培养基( 含1 0 0 u第一部分乳酸菌寤动子探溅载体的桶建疑心瑁g m l 氨苄青霉素) 中，3 7 。c2 5 0 r p m 振荡培养1 6 个小时。4 ，5 0 0 0 r p m 离心l o m i n 收集菌体弃上清，沥干沉淀后加入4 m l 预冷s o l u t i o ni ，混匀悬浮菌体。加入8 m ls o l u t i o n1 i ，温和地颠倒混匀5 次，冰e 放置5 m i n ，溶液变粘稠后方可进行以下步骤。加入6 m ls o l u t i o ni i i ，温和颠倒混匀数次，冰上放置l o m i n ，见白色沉淀析出。4 ，1 5 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，吸取上清加入0 8 体积异丙醇混匀，室温静置1 0 m i n 。室温，1 5 0 0 0r p m 离心l o m i n ，弃上清，沉淀中加入2 m ld d h 。0 和l m l7 5 m o l ln h n c ，混匀，冰上放置l o m i n 。4 ，1 3 0 0 0r p m 离心l o m i n ，吸取卜清。在上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，混匀。室温，1 3 0 0 0r p m 离心7 m i n , 吸取上清。在上清中加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，混匀。室温，1 3 0 0 0r p m 离心7 m i n ，吸取上清。加入1 1 0 体积的3 mn a a c 和2 倍体积的预冷无水乙醇，混匀，一2 0 放置3 0 m i n 。4 ，1 5 0 0 0r p m 离心l o m i n ，弃上清，沉淀用7 0 乙醇洗涤后晾干。加入3 0uld d h z o 溶解，再加1 “ll o m g m l 无d n a 酶的r n a 酶，于6 5 。c 水浴消化3 0 m i n 。加入等体积聚乙醇沉淀d n a ，干燥后加入3 0uld d h 。0 溶解d n a ，于一2 0 。c 保存待用。1 4 启动子功能序列探测载体p n z 8 0 3 7 一ap a m p 的构建艮d 厅i 、b a m l f f 双酶切质粒p n z 8 0 3 7 和t ap a m p ，纯化。将回收的p a m p 基因连接到双酶切好的p n z 8 0 3 7 载体上，得到启动子功能序列探测载体p n z 8 0 3 7 p a m p ，转化大肠杆菌ec o l id h 5 ，抗性平板挑取转化予。1 4 1 质粒p n z 8 0 3 7 的抽提从抗性m r s 平板上挑取生长的粪肠球菌a s i 2 9 8 4 p n z s 0 3 7 转化子单克隆，抽提质粒d n a ，电泳鉴定，大小在3 0 0 0 b p 左右。乳酸菌质粒的抽提挑取粪肠球菌a s i 2 9 8 4 转化子单克隆接种于液体m r s 培养基中，3 7 。c静置培养过夜。1 0第一部分乳酸菠启动子探泌载体的掏建及商翔5 0 0 0 r p m ，离心5 m i n 收集3 m l 菌液。2 0 0 l0 1 m o l l 、p h 7 5 的t r i s c 1 沈涤沉淀一次。5 0 0 0 r p m ，离心5 m i n ，弃上清，在沉淀中加入2 0 0 i jl 溶菌酶( 3 0 m g m l ) ，3 7 水浴中反应1 5 m i n 。加入4 0 0pl3 s d s 和0 2 nn a o t l 的混合液，混匀后室温下放置7 m i n 。加入3 0 0ulp h 4 8 的冰n a a c ，混匀后冰上放置5 m i n 。4 ，1 3 0 0 0 r p m 离心15 m i n 。取上清，加入6 5 01 1l 异丙醇，室温放置1 0 m i n 。4 ，1 3 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n 。弃上清，沉淀用3 2 0 uld d h 。0 溶解，再加入2 0 0 ul7 5 m o l ln i l 。a c ，最后加入3 5 0 ul 酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 。混匀后，1 3 0 0 0 r p m离心5 m i n 。取上清，加入l m l 预冷无水乙醇，混匀后一2 0 放置3 0 m i n 。4 ，1 3 0 0 0 r p m 离心l5 m i n 。弃上清，7 0 乙醇洗涤沉淀，晾干后溶于4 0uld d h 。0 ，再加入1ull o m g m l 无d n a 酶的r n a 酶，于6 5 c 水浴消化3 0 m i n 。加入等体积聚乙醇沉淀d n a ，干燥后加入3 0uld d h ：0 溶解d n a 。1 4 2 酶切：8 a m i 和尼胡i 双酶切p n z 8 0 3 7 和t - a m p ，取2 i xg 质粒d n a 用于酶切，反应体系如下：1 0 x b u f f e r3 ul8 a m i1ul免钾11 “l质粒d n a2 uld d l l ：02 3 ul总体积3 0 ul混匀反应液，短暂离心，3 7 。c 水浴反应2 个小时。反应完成后用o 8 的琼脂糖凝胶电泳分离d n a ，并割胶回收目的d n a 片段，回收p n z 8 0 3 7 酶切后的大片段和t ap a m p 酶切后大约8 0 0 b p 的小片段，用博光胶回收试剂盒纯化，得到线性的p n z 8 0 3 7 和ap a m p 基因片段，测定d n a 浓度。1 4 3 连接第一部分乳酸麓寤动f 探溉载体的构建及赢mt 4 d n a 连接酶连接回收的p n z 8 0 3 7 和ap a m p 基因片段，反应体系如下1 0 b u f f e r2ult 4 d n a l i g a s e1pl线性p n z 8 0 3 7 回收片段2 “lp a m p 基因片段6 1 1ld d h 。0 9 ul总体积2 0 ul浑匀反应液，短暂离心，1 6 水浴过夜。1 4 4 连接产物的转化( 1 ) 制备叵c 0 1 1d h 5c l 感受态细胞：( 2 ) c a c l 。法转化最c o l id t l 5n 感受态细胞：1 取出1 0 0 ul 感受态细胞，加入1 0 ul 连接液，混匀，冰浴3 0 m i n 。2 4 2 。c 热休克9 0 秒，迅速放回冰中将细胞冷却3 m i n ，加入4 0 0ul 液体l b 培养基，3 7 2 5 0 r p m 振荡培养4 5 m i n 。3 取1 0 0 ul 培养液涂布于含氯霉素的抗生素平板，3 7 倒置培养1 2 时。4 ec o l id h 5q 重组子的鉴定：挑取上步平板上的菌落，然后酶切和p c r 鉴定ec o l id h 5q 重组子，最后得到p n z 8 0 3 7 一ap a m p c o l id h 5 重组转化子。2 、粪肠球菌a 8 1 2 9 8 4 总d n a 的抽提( 1 ) 非变性条件下乳酸菌总d n a 提取方法单菌落接种于l o m l 液体m r s 培养基中，静置于3 7 烘箱中培养过夜于6 0 0 0 9 离心5 m i n 收集1 0 m l 菌液中的菌体用5 0 0 “l0 1 m o l lp h 7 5 的t r i s c 】i 先一一遍菌体在菌体中加入i 5 m l3 0 m g m l 的溶菌酶，混匀将上述混匀的液体于3 7 放置3 0 m i n ，以便破壁于6 0 0 0 9 离心5 m i n 收集沉淀在沉淀中加入4 m ld d h 。0 和8 0 0 “l6 s d s 后混匀在上述液体中再加入3 m l7 5 m o l l n h 。a c ，混匀于6 0 0 0 9 离心5 m i l 3 后取上清在上清中加入等体积的酚氯仿，混匀于8 0 0 0 9 离心7 m i n 后取上清第一部分乳酸蔼寤动子揉溉载体的拇建及戎嗣在上清中加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置l o m i n于1 3 0 0 0 9 离心l o m i n 弃上清收集沉淀用1 0 0 ul7 0 乙醇洗涤沉淀，烘干加入3 0u i d d h ：0 溶解沉淀，同时加入lull o m g m l 无d n a 酶的r n a 酶，于6 5 消化3 0 m i n加入等体积聚乙醇沉淀d n a ，干燥后加入3 0uld d h ：o 溶解d n a ，于2 0 保存待用。3 、鸟枪法捕获启动子3 1 酶切b a m h i 酶切p n z 8 0 3 7 一a m p 质粒，s a u 3 ai 酶切粪肠球菌a s l 2 9 8 4 总d n a ，电泳检测酶切结果，0 8 琼脂糖凝胶电泳，回收p n z 8 0 3 7 一a p a m p 酶切片段和1 0 0 一8 0 0 b p 区间的粪肠球菌a s l 2 9 8 4 总d n a 酶切片段，备用。酶切反应体系如下：( 1 ) 1 0 x b u f f e r3 ulb a m h i1ul质粒2uld d h 2 02 4 1 jl总体积( 2 )1 0 x b u f f e rs a u 剧i染色体d n ad d h 。03 0 ul3 “llul2ul2 4 l 上l总体积3 0 ul混匀反应液，短暂离心，3 7 。c 水浴反应2 个小时。反应完成后用0 8 的琼脂糖凝胶电泳分离d n a ，并割胶回收目的d n a 片段，回收p n z 8 0 3 7 酶切后的线性片段和粪肠球菌a s l 2 9 8 4 总d n a 酶切后1 0 0 - - 8 0 0 b p 区间的片段，用博光胶回收试剂盒纯化，溯定d n a 浓度。3 2t 4 d n a li g a s e 连接酶切产物t 4 d n a l i g a s e 连接回收的p n z 8 0 3 7 一ap a m p 酶切片段和粪肠球菌a s l 2 9 8 4 总1 3第一部分乳酸鸶舀动子探溉载体的构建及应j 自。d n a 酶切片段。反应体系如下：l o b u f f e r2ult 4 d n m i g a s elulp n z 8 0 3 7 一a m p 酶切片段2ul粪肠球菌a s l 2 9 8 4 总d n a 酶切片段6 uld d h 2 09 u i 总体积2 0 ul混匀反应液，短暂离心，置于1 66 c 水浴连接过夜。3 3 连接产物转化大肠杆菌ec o l id h 5 ( 1 ) 制各c o l id h 5a 感受态细胞：( 2 ) c a c l 。法转化ec o l id h 5 感受态细胞：3 4p n z 8 0 3 7 一p a m p e c o l a ) h 5o 重组转化子质粒d n a 的制备( 1 ) 制各所有阳性转化子的质粒。质粒常规碱裂解法抽提大肠杆菌质粒ec o l id h 5 重组转化子接种于4 0 m l 液体l b 培养基( 含1 0 0 ug m l 氨苄青霉素) 中，3 7 2 5 0 r p m 振荡培养t 6 个小时。4 ，5 0 0 0 r p m 离心l o m i n 收集菌体弃上清，沥干沉淀后加入4 m l 预冷s o l u t i o ni ，混匀悬浮菌体。加入8 m ls o l u t i o ni i ，温和地颠倒混匀5 次，冰上放置5 m i n ，溶液变粘稠后方可进行以下步骤。加入6 m ls o l u t i o i li h ，温和颠倒混匀数次，冰上放置l o m i n ，见白色沉淀析出。4 ，1 5 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，吸取上清加入0 8 体积异丙醇混匀，室温静置l o m i n 。室温，1 5 0 0 0r p m 离心l o m i n ，弃上清，沉淀中加入2 m ld d h ：0 和l m l7 5 m o l ln h 。a c ，混匀，冰上放置l o m i n 。4 ，1 3 0 0 0r p m 离心l o m i n ，吸取上清。在上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，混匀。室温，1 3 0 0 0r p m 离心7 m i n ，吸取上清。在上清中加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，混匀。室温，1 3 0 0 0r p m 离心7 m i l 3 ，吸取上清。1 4第一部分乳酸萄寤动f 探汹载钵的构建致商 q加入1 1 0 体积的3 mn a a c 和2 倍体积的预冷无水乙醇，混匀，一2 0 。c 放置3 0 m i n 。4 ，1 5 0 0 0r p m 离心l o m in ，弃上清，沉淀用7 0 乙醇洗涤后晾干，加入3 0pld d h ：0 溶解，再加lpll o m g m l 无d n a 酶的r n a 酶，于6 5 水浴消化3 0 m in 。加入等体积聚乙醇沉淀d n a ，干燥后加入3 0uld d h ：0 溶解d n a ，于一2 0 。c 保存待用。3 5 转化粪肠球菌a s l 2 9 8 4( 1 )乳酸菌感受态的制各：从平板上挑取粪肠球菌a s l 2 9 8 4 的单克隆，接种于l o m l 的液体m r s 培养基中，3 7 。c 静置培养过夜。取i m l 培养的菌液，接入9 m l 的液体m r s 高渗培养基中，3 7 。c 静置培养3 4个小时。加入氨苄青霉素，混匀后继续培养1 r 个小时。置菌液于冰上l o m i n ，移入5 0 m l 离心管中，4 0 0 0 r p m ，4 离心l o m i n 。弃上清，加入l o m l 电转化用的缓冲液p e b 2 ：悬浮细胞，冰浴2 0 m i n 。4 0 0 0 r p m ，4 离心l o m i n 回收细胞，弃上清，加入2 0 0 ul 电转化用的缓冲液p e b 2 ：悬浮细胞，冰浴保存。( 2 )电转：取4 0 pl 感受态和2 - 4 pj 。质粒，混匀，冰上放置5 m i n ，转移入电击杯中。在电容1 2 5 uf 、电阻2 0 0 q 、电压1 8 0 0 v 条件下，电击4 8 m s 。电击后加入4 0 0 pl 液体m r s 高渗培养基，混匀，将混合液移入1 5 m le p p d o r f 管中，3 7 静置培养2 个小时。取1 0 0ul 菌液涂布于含氯霉素抗性的m r s 平板上，3 7 。c 静置培养过夜。( 3 )转化子的鉴定：从抗性m r s 平板上挑取生长的粪肠球菌a s l 2 9 8 4 转化子单克隆