（遗传学专业论文）扁桃泛素降解途径关键酶基因的克隆与表达分析.pdf

摘要 自 交不亲和这一遗传机制对于高等植物实现异花受精和遗传重组具有重要 意义。 大多数扁桃都是高 度自 交不亲和的， 因为异花授粉效率低， 使得扁桃产量 低。 研究其自 交不亲和的分子机制， 有助于扁桃的遗传育种工作。 近年来，自 交 不亲和性的花粉决定因子逐渐被确定为一种f - b o x 蛋白 一s l f ( s - l o c u s f - b o x ) a f - b o x 蛋白是泛素连接酶 ( s c f复合物) 家族的成员， 这提示: 泛素一 2 6 s 蛋白酶 体蛋白 质降解系统在自 交不亲和反应中可能发挥着重要作用。 本实验以扁桃品种“ p i o n e e r ” 为材料。 首先， 利用网上资源及本实验室先前 获得的若干泛素降解途径关键酶的e s t 序列，并运用r a c e和r t p c r技术， 对下列基因进行了克隆和测序工作， 包括泛素激活酶 ( e i ) , 泛素结合酶 ( e 2 ) 和 泛素连接酶 ( e 3 ) 的两 个组分 ( c u l l i n 和s k p l ) ， s l f以 及s - ma w编码基因。 目 前，获得了泛素激活酶e l 的部分c d s序列和其余基因的c d s 全长序列，为 进一步研究它们的功能奠定了 基础。 其次， 利用r t p c r技术， 研究了 上述各基因在扁桃花药、 雌蕊、 花瓣、 粤 片及叶片中的表达情况。结果显示: af基因在花药中专一性表达， s - r n a s 基 因 在雌蕊中专一性表达， 这为它们作为自 交不亲和相关的基因 提供了佐证。 其余 目 的基因在各组织中均有表达， 这可能是因为泛素降解途径作为生物体内蛋白 质 降解的主要途径，会参与植物多种组织中的代谢反应。 最后， 为了验证s l f 蛋白与它可能的底物s - r n a s e 之间是否存在相互作 用， 进行了酵母双杂交实验。 首先， 扩增了两个基因的编码区全长， 分别命名为 p d s l f i 和p d s m 。 然后， 将p d s l f i基因作为诱饵，克隆到酵母表达载体p s o s 上， p d s m基因作为靶蛋白克隆到p m y r 上。 酶切及测序结果表明，目 的 基因正 确地插入了 表达载体， 并分别与s o s 诱饵蛋白 及m y : 序列标签同框翻译。 将p s o s p d s l f + p m y r p d s m共转 化酵母 细胞 后， 酵母不能 在选择 温度 ( 3 7 c ) 下 生长， 说明二者之间不存在物理上的相互作用，与前人的实验结果一致。 关键词:自 交不亲和性 花粉s - 基因 泛素降解途径酵母双杂交 扁桃 ab s t r a c t i n fl o w e r i n g p l a n t s , a w i d e l y u s e d m e c h a n i s m t o p re v e n t i n b r e e d in g a n d p r o m o t e o u t c r o s s i n g i s k n o w n a s s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y ( s i ) . m o s t a l m o n d s d is p l a y h i g h l y s i . t h e p o o r e f f i c i e n c y o f o u t c r o s s i n g m a k e s t h e a m o u n t o f p r o g e n y v e ry l o w . s o t h e i n v e s t i g a t i o n o f t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m s o f s i w i l l b e n e f i t t h e g e n e t i c b r e e d i n g o f a l m o n d . i t h a s r e c e n t l y b e e n d e t e r m in e d t h a t s l f ( s - l o c u s f - b o x ) g e n e s c o n t r a l s i o n t h e p o l l e n s i d e . s l f e n c o d e s a n f - b o x p r o t e i n t h a t i s a c o m p o n e n t o f u b i q u i t i n l i g a s e ( s c f c o m p l e x ) , r a i s i n g t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e u b q u i t i n / 2 6 s p r o t e o l y t i c s y s t e m p l a y s a c e n t r a l r o l e i n t h e d i s c r i m i n a t i o n o f s e l f / n o n s e l f p o l l e n i n t h e r n a s e - b a s e d g s i . we u s e o n e c u l t i v a r o f a l m o n d p i o n e e r a s p l a n t m a t e r i a l s . f i r s t ly , t h e r e a r e s e v e r a l e s t s o f k e y e n z y m e s i n u b q u i t i n / 2 6 s p r o t e o l y t i c s y s t e m i n o u r l a b a c h i e v e d p r e v i o u s l y . u s i n g t h e s e e s t s a n d r e s o u r c e s fr o m n c b i , w e h a v e f i n i s h e d c l o n in g s e v e n g e n e s 妙r a c e a n d r t p c r t e c h n o l o g y , i n c l u d i n g u b i q u i t i n a c t i v a t i n g e n z y m e ( e l ) , u b i q u i t i n c o n j u g a t in g e n z y m e ( e 2 ) , t w o c o m p o n e n t s o f u b i q u i t i n l i g a s e ( c u l li n a n d s 冲1 ) , s l f a n d t w o a l l e l e s o f s - r n a s e s . u p t o n o w , w e h a v e a c h i e v e d p a r t i a l c d s s e q u e n c e o f e l a n d f u l l - l e n g t h c d s s e q u e n c e s o f t h e o t h e r g e n e s . t h e s e r e s u l t s w i ll f a c i l i t a t e t h e i n v e s t ig a t i o n o f t h e i r f u n c t i o n s . s e c o n d ly , w e h a v e s t u d i e d t h e e x p re s s i o n m o d e o f t h e g e n e s l i s t e d a b o v e i n d i ff e r e n t o r g a n s o f a l m o n d , i n c l u d i n g a n t h e r s , p i s t i l s , p e t a l s , s e p a l s a n d l e a v e s . r e s u l t s o f r tp c r re v e a l e d t h a t s l f e x p r e s s e d e x c l u s i v e l y i n a n t h e r s , a n d s - r n a s e e x c l u s i v e l y i n p i s t i l s , s u g g e s t i n g t h a t t h e y m a y p a r t i c i p a t e i n s i re s p o n s e s . o t h e r g e n e s e x p r e s s e d i n a l l o f t h e f iv e o r g a n s . w e p r e s u m e d t h a t a s a m a i n p a t h w a y o f p r o t e i n d e gr a d a t i o n , t h e u b q u i t in / 2 6 s p r o t e o ly t i c s y s t e m i n v o l e i n l o t s o f m e t a b o l i z a b l e p r o c e s s e s i n d i ff e r e n t o r g a n s . l a s t , in o r d e r t o i n v e s t i g a t e w h e t h e r s l f a n d s - r n a s e w i l l i n t e r a c t w i t h e a c h a t h e r , w e p e r f o r m e d y e a s t t w o - h y b r id a s s a y . f i r s t , t h e f u l l - l e n t h c d s o f t h e t w o g e n e s w a s c l o n e d , n a m e d p d s l f 1 a n d p d s m , a ft e r w a r d s , w e c o n s t r u c t e d t w o e x p r e s s i o n v e c t o r s f o r y e as t , p s o s a n d p m y r , r e s p e c t i v l y . t h e n , w e v a l i d a t e d t h a t p d s l f 1 a n d p d s m w e r e i n s e r t e d a c c u r a t e l y i n t o e x p r e s s i o n v e c t o r s , a n d w i l l e x p r e s s e i n t h e s a m e r e a d i n g fr a m e s w i t h s o s b a i t a n d m y r s i g n a l p e p t i d e . t h e r e s u l t s o f y e as t t w o - h y b r i d a s s a y s s h o w e d t h a t t h e re a r e n o p h y s i c a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n p d s l f a n d s - r n as e , c o n s i s t e n t w i t h t h e res u l t s a c h i e v e d fr o m p i n 刀 a t a . k e y w o r d s : s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y , p o l l e n s g e n e , u b i q u i t i n - 2 6 s p r o t e as o m e p a t h w a y , y e a s t t w o - h y b r i d as s a y , a l m o n d , p r u n u s d u l c i s mi l l . 第一章前 普通扁桃 ( 又名巴旦杏，英文名 a l m o n d，学名 p r u n u s d u l c i s m i l l . ) 属蔷薇科李属植物，是仁用桃树种，具有重要的经济、营养和 保健价值。 扁桃果仁的药用功用与杏仁大体相同， 是中医药中不可缺少的药材品种 之一。扁桃果仁肥大，含油量很高， 且营养丰富， 含有多种维生素及矿质元素， 是 营养价值极高的果品，具有良 好的开发前景。此外，扁桃抗寒、耐早，对土壤要求 不严，适应性强，是生态林建设的优选树种。 大多 数扁桃都是高 度自 交不亲和 ( s e l f i n c o m p a ti b i l i t y , s i ) 的， 即不能自 花受 粉。因为异花授粉效率低， 使得扁桃产量低， 所以生产品种和授粉品种的配置非常 重要。长期以来，成功地选育自 交亲和的扁桃品种都是育种工作的重要目 标之一。 对自 交不亲和性的研究， 是改善扁桃育种、 提高受粉效率和产量的 基础。 此外， 从 理论上看， 花粉s - 基因 ( s 代表不育性 一一s t e ri l i t y ) 的鉴定及特性研究对于理解基 于核酸酶的配子体自 交不亲和 ( g s i )的分子机制是非常重要的。 一、自 交不亲和性概述 1 .自 交不亲和 自 交不亲和性又称种内不亲和性， 是指能产生具有正常生殖功能且同期成 熟的 雌雄配子的植株， 在自 花受粉时不能结实或结实极少的 现象。 这是高等植 物在长期进化过程中 形成的一种繁殖体系。 这种体系广泛存在于显花植物的许 多科中， 它使得雌蕊在受精过程中能够拒绝自 身 ( 遗传上相关) 花粉， 并接受 非自 身( 遗 产上 不 相 关) 花 粉川 。自 交 不 亲和 性一方 面有 利于 植 物 ( 尤 其 是 两 性植物) 杂交、 限制近交、 提高植物的生活力，另一方面却使果实产量下降到 只有自交亲和植物的2 0 3 0 %左右，这是果树生产中需要克服的问题。 自 交不亲和性是花粉与雌蕊之间表现抑制作用所致， 实质上是自 花受粉时 受精过程受阻。不同物种受阻的时期有所不同。 根据受精受阻的时期，具有自 交不亲和性的雌雄同花或雌雄同株植物在自 花受粉时有如下几种表现: ( 1 ) 花 粉在柱头上不能正常萌发，如甘蓝、萝卜 、天竺葵、黑麦等;( 2 ) 花粉萌发后 花粉管不能穿透柱头，如白菜等:( 3 )花粉管穿透柱头后不能在花柱中继续延 伸而达到胚囊，如烟草、 矮牵牛等;( 4 ) 花粉管到达胚囊后，精细胞与卵细胞 不能结合，如甜菜等。 上述现象的存在均使得植物受精过程不能完成，因而不 能结实。 在自 然界中， 存在两种自 交不亲和类型:抱子体自 交不亲和 ( s s i ) 和配 子体自 交不亲和 ( g s i ) 。 对于抱子体自 交不亲和的植物， 花粉的行为由 产生花 粉的植株，即抱子体的 s - 基因型决定，主要代表为十字花科植物。对于配子体 自 交不亲和的植物， 花粉的自 交不亲和表现型决定于花粉自 身的单倍型，当花 粉的 孚 多茵 与雌蕊的 s - 基因的其中 之一相同时，花粉就被排斥， 从而表现自 交 不亲和。此类不亲和研究较为深入的包括茄科的茄子 ( s o l a n u m )、番茄 ( 人 y c o p e r s ic o n ) 、 烟草( n i c o t i a n a ) 和矮牵牛( p e t u n i a ) ， 蔷薇科的苹果( m a l u s ) , 扁 桃 ( a l m o n d ) 和梨( 乃 r u s ) ， 以 及 玄 参 科的 金 鱼草( a n t ir r h in u m ) 等 2 1 。 一 般 表现为花粉粒在柱头上能 萌发， 并 进入花柱， 但在花柱中 的生 长受 到 抑 制。 2 .自 交不亲和与s 一 基因 在多数情况下，自 交不亲和性受高度多态的 s - 位点复等位基因控制。目 前 的研究结果表明，s 位点编码两类不同的基因， 其编码产物分别控制花柱和花 粉自 交不亲和性。 在配子体自 交不亲和类型中，雌蕊s - 基因编码一类具有核酸 酶活性的 糖蛋白， 即 s - r n as e 3 1 。 而 花粉 s - ff m年 来则 逐渐被 确定为 一 类 f - b o x 基因 ( s - l o c u s f - b o x , s l f ) a s - r n a s e 和花粉s - 募因共同构成一个s 一 单倍型 ( s - h a p lo t y p e ) ， 控 制自 交 不 亲 和 性的 表 达。 s - 基因 在不同 品 种间 表 现出 高 度的 s - 单倍型多态性，对于二倍体植株来说，这些等位基因的两两组和就构成了不 同的s - 基因型。 核酸酶活 性对于 雌蕊 识别并 拒绝自 身 花粉是 必须的 4 - 6 。 目 前， 己 从多 种植 物中 分离 和鉴 定了s - r n a s e s l? 一 ，0 1 。 有 充分 的 实 验证 据表明 它 们 控制了自 交不 亲 和反应中花柱专一性的表达:首先，s - r n as e的 r n a和蛋白质水平的时空表 达与si的获得相关， 其表达水平在花粉开裂时期最高， 这一时期的自 交不亲和 性也是最强的。 第二，s - r n as e 基因与s - 基药座在遗传上连锁，具有序列多态 性， 表现出 选择 性识 别分 子 应有的 特征 17 ,1 1- 13 1 。 第三， 通过 遗 传转 化实 验 和花 粉自 交亲和突变株的研究， 获得了s - r n a s e 与自 交不亲和性花柱专一性表达的 更 直 接 证 据 i1,14 -17 花粉 s - 基因的鉴定及特性研究是理解配子体自交不亲和的分子机制的关 键之一。它被推测具有以下特征:( 1 )与s - r n a s e 基因紧密连锁，避免因遗传 重组而导致的子代自 交不亲和性的丧失。 ( 2 ) 高度的s - 单体基因型多态性， 赋 予雌蕊一花粉识别反应高度的专一性。( 3 )在花粉中特异性表达。( 4 )能与 s - r n a s e 基因发生物理上的相互作用。近年来，在许多植物中，一种f - b o x蛋 白s l f ，作为花粉自 交不亲和决定因子被鉴定出来。该基因与s - r n a s e 基 因紧密连锁，多种证据表明，该基因符合花粉s - 基因的特点，是花粉s - 基因的 候选基因2 1 例 如， 在 扁 桃 1 8 1 、 梅 ( p r u n u s m u m e ) 19 ,2 0 1 以 及甜 樱桃 ( p . a v i u m ) 和 酸 樱 桃 ( p c e r a s u s ) (2 1 1等 蔷 薇 科 植 物 中， s l f 基 因 与s - r n a s e 基 因 高 度 连 锁， 在 花 粉中专一性表达，并具有很高水平的单体基因型专一的序列多态性 ( 6 8 .4 7 7 6 .4 %) ，与s - r n as e s 的多态性水平吻合。 科学工作者们还研究了玄参 科植物金 鱼草( a n t i r r h i n u m , s c r o p h u l a r i a c e a e ) s - 基因 座的基因 组结 构， 发 现了 一个具有花粉s - 基药特点的f - b o x 基因.ah s l f - 凡。 金鱼草的a h s l f基因也 表现出一定程度的序列多态性 ( 尽管比蔷薇科的s l f基因明显要低) ， 并在花 粉和绒毡层细胞中专一性表达。 此外， q i a o h等人通过免疫共沉淀和酵母双杂 交等技术，证明了a h s l f - s 2的c 一 末端能和 s - r n a s e 相互作用，并能与s c f 复合物中的a s k i 、类c u ll in 蛋白相互作用，它们可能通过形成s c f复合物， 锚定要被降解的s - r n as e 。 他们进一步表明， 经蛋白酶抑制剂处理后， 亲和( 非 自 身) 花粉管的生长受到阻 碍， 而不亲和花粉的 表型不受影响， 这说明2 6 s 蛋 白 酶体的活性对于亲和花粉的生长是必需的。最后，一系列的实验表明， 柱头 蛋白 质的泛素化水平较高， 而当 授粉后， 亲和花粉的s - r n a s e 水平的降低幅度 较 不 亲 和 花 粉 要高 122 1 . p a j a s ij a c ic 等 人 在 矮 牵 牛( p e t u n ia in f la t e , s o l a n a c e a e ) 中的遗传转化实验进一步证实， s l f基因的表达产物即为花粉自 交不亲和的决 定因子，可能参与基于s - r n as e 的 配子体自 交不亲和系统2 3 1 大多数 f - b o x 蛋白都参与泛素介导的蛋白质降解途径， 称为泛素一 2 6 s 蛋白 酶体途径( u b i q u i t i n - 2 6 s p r o t e a s o m e p a t h w a y ) 。 上述实 验结果表明，s l f 蛋白 可能的底物是s - r n as e 。 该蛋白 可能通过与s c f 复合物其它组分的结合， 形成 有功能的泛素连接酶 ( e 3 ) ，专一性的泛素化非同源的 s - r n a s e ，唯独保留同 源s - r n a s e 的活性， 从而诱发自 交不亲和反应2 2 1 多种特异性的f - b o x 蛋白 的存在使得s c f 能够识别多种多 样的底物， 从而参与细胞 分裂、基因转录、 信号转导及发育等的调控(5 0 l 。 在自 交不亲和反应中， s l f 可能 的底物就是s - r n a s e ， 它可能泛素化并降解所有非自 身的s - r n a s e ， 但唯独保留自 身s - r n a s e 的活性，导致花粉管生长受到阻碍并诱发自 交不亲和反应。 三、r a c e技术简介 本实验采用了b d s m a r t t m r a c e c d n a 扩增试剂盒。该试剂盒提供了一种 新的扩增c d n a末端的方法， 这种方法可以同时进行5 和3 - r a c e 扩增。 较之以 往的r a c e 技术，这种方法能够产生更加完整的5 序列信息，且具有方便快捷、 灵 敏 性强、 背景 低等 特点 f5 i 1 b d s ma r t c d n a 的合成机制: b d s m a r t技术提供了 一种在反转录反应过程中 产生全长 c d n a 的方法f5 1 这 是 在b d s m a r t i i t m a寡 核昔 酸 和b d p o w e r s c r ip t t m反 转录 酶的 联 合 作 用下 实现的。 b d p o w e r s c r i p t 反 转录酶是m m l v 变异体，当反转录反应到达r n a 模板 的 末端时，即表现出 末端转移酶的活性，在第一链c d n a的3 末端加上3 - 5 个d c 碱基，见图5 。 p 吻 a + 明几 5 、 乃 “ 、 八 产 . 、 产 以 、 八 产 . 、 产 p o l a 3 、 声产g5 . 0 01, d d s mar t i i t m a o l i g o n u c l e o t i d e 侣 _ , o f g o ( f t p r i t w r 反转录合成第一链，并 伴随加尾 ( d c ) , , g 5 、 八 j 、 八 了 . 、 户 “ 、 八 了 . 、 p d y a 5 口 ， 尸c c c 一. - 曰 -. . . 叱 二 二 二 二 ! 模板转换并延仲 5 .0 0 0 、 n “ 、 八 产 . 、 户 “ v、 尸 日 、 p o 卜 a -c c c二 二 : 二 二 图5 b d s ma r t t m c d n a合成机制 第一链的合成由一个修饰的寡聚 ( d 丁 ) 引物引导合成。 反转录酶到达m r n a 模板末端后，加上若千d c 碱基。b d s m a r 丁” a寡核普酸与c d n a 的末端退火. 并 作为 日 d p o w e r s c r ip t 反 转 录 酶的 延 伸 模 板。 在 b d s m a r t o iig o g 碱 基的 末 端 还含有一段延伸的序列.作为反转录反应延伸的模板。 b d p o w e r s c r ip t 反 转录 模 板 从 n i r n a 分 子 转 换为 b d s m a r t o l i g o ， 产 生 一 个 原始r n a 的完整c d n a 拷贝， 在该拷贝的末端还带有b d s m a r t序列。 由于反转 录的加尾活性在反转录酶到达r n a 模板的 末端时最为有效，因而b d s m a r 7 ， 序 列只加在完整的第一链c d n a s 的末端。 使用高质量的r n a 模板可以 产生最大量的 夕 末端序列。 反转录反应完成后， 第一链c d n a 可以直接用于 5 一 和3 - r a c e p c r反应， 而不需要繁琐的第二链的合成和接头连接过程。技术路线见图6 . 图6 b d s ma r t t m r a c e流程图 四、酵母双杂交技术简介 蛋白 质是生命功能的物质基础， 体内多种生命活动都依赖于蛋白 一 蛋白间的相 互作用，对蛋白质相互作用的研究有助于揭示生命过程的许多本质问题。酵母双 杂交技术是用来检测蛋白 质之间是否存在相互作用的一个非常有效的手段. 它的 可行性、 有效性在验证已知蛋白 质之间的相互作用或筛选与靶蛋白 特异作用的候 选蛋白的研究中已被证实，并被推广到了诸如细胞周期调控、 信号传导、 肿瘤基 因表达等多个研究领域，受到越来越高的重视。 1 .酵母双杂交体系的原理及应用 酵母双杂交体系是由f ie l d s 和s o n g 等在研究真核基因转录调控中首先建立 起来 的 15 3 1 。 典 型的 真 核 生 长 转 录因 子， 如g a l 4 . g c n 4 等都 含 有二 个 不同 的 结 构域:d n a结合结构域( d n a b i n d i n g d o m a i n , 简称为 d b ) 和转录激活结构域 ( a c t i v a t i o n d o m a i n , 简称为a d ) ， 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。 d b 可 识别d n a上的 特异序列，并使a d定位于 所调节的基因的上游，后者可同转录 复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录.单独的d b虽然能和启动 子结合， 但是不能激活转录。 目 前研究中常用d b 基因有: g a l 4 ( 1 - 1 4 7 ) ; l e x a ( 大 肠杆菌转录抑制因子) 的 d n a 一 结合结构域编码序列。常用的 a d基因有: g a l 4 ( 7 6 8 - 8 8 1 ) 和疤疹病毒v p 1 6 的编码序列等。 酵母双杂交体系包含二类载体: 含d b的载体及含a d的载体。 由d b和a d 形 成 的 融合 蛋白 现 在一 般分 别 称 之为 “ 诱 饵 ( b a i t ) 和 “ 猎 物 ” 或 靶 蛋白 ( p r e y o r t a r g e t p ro te in ) 。 在上 述二 类 载体 中 构 建 融 合 基因 时， 要保 证 靶蛋白 基因 与 结 构 域 基因 在 同一阅读框内表达。如果在“ 诱饵” 与“ 猎物” 之间存在相互作用， 那么分别位于 这 两个融合蛋白 上的d b和a d就能重新形成有活性的转录激活因子， 从而激活相 应基因的转录与表达。 这个被激活的、能显示“ 诱饵” 和“ 猎物” 相互作用的基因 称 之为 报道基因 ( r e p o r t e r g e n e ) ， 通过对 报道基因表 达 产物的 检测， 反 过来 可判别作 为 “ 诱饵” 和“ 猎物” 的两个蛋白 质之间是否存在相互作用 ( 图7 ). 编码r - 半乳糖 昔酶的l a c z即为被广泛采用的报道基因。 靶蛋自 诱 饵 蛋 白 dna- bd 一 一g a l u a s!启动子 i报告基因i 图7 经典的双杂交体系模式图 融合苹因在报告株中的表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录， 例如g a l 4 - d b具有核定位序列， 而g a l 4 - a d没有，因此， 在g a l 4 激活结构 域的氮端或碳端还要克隆一段来自s v 4 0 的t - 抗原序列作为核定位信号。 双杂交体系的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报告基因 的重组质粒的宿主细胞。 最常用的是酵母细胞。 在双杂交体系中， 酵母作为报道 株有许多优点: ( 1 ) 易于转化、便于回收扩增质粒。( 2 ) 具有可直接进行选择的标 记基因和特征性报道基因。( 3 ) 酵母的内 源性蛋白 不易同来源于哺乳动物的蛋白 结合。 酵母双杂交体系检测蛋白 之间的相互作用具有以下优点:( 1 ) 作用信号是在 融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了 纯化蛋白质的 繁琐步骤。( 2 ) 检测在活细胞内 进行， 可以 在一定程度上代表细胞内的真实情况。 ( 3 ) 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白 质之间 的微弱的或暂时的相互作用。( 4 ) 酵母双杂交体系可采用不同组织、器官、细胞 类型和分化时期材料构建 c d n a文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多 种不同亚细胞部位及功能的蛋白。( 5 ) 酵母双杂交体系具有高度敏感性.主要是 由 于: 采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白 过量表达. 信号 测定是 在自 然平衡浓度条件下进行， 而如免痊共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多 次洗涤，降低了信号强度。 杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结 合形成转录起始复合物而增强， 后者又与启动子d n a结合， 此三元复合体使其 中各组分的结合趋于稳定. 通过m r n a产生多种稳定的酶使信号放大。同 时， 酵母表型，x - g a l 及h i s 3 蛋白表达等检测方法均很敏感. 作为一种高度敏感、 适用于细胞核内 外以 至于细胞内 外多种蛋白 质在体研究 体系， 双杂交体系主要应用于: ( 1 ) 验证通过其他方法发现的蛋白 质间可能的相 互作用;( 2 ) 确定蛋白 质特异相互作用的关键结构域和氨基酸:( 3 ) 筛选文库以 得到与己 知蛋白 质存在特异相互作用的蛋白质。由于具有相对简便、 快速及不经 蛋白 质纯化即可相接获得编码基因的 特点， 采用双杂交体系从c d n a文库和基因 文库中直接筛选出蛋白 质间 相互作用成为它最具优势之处。由 此而鉴定的 各种受 体、 转录因子、蛋白 激酶、 磷酸化酶、 细胞骨架蛋白以 及参与细胞周期调控、 肿 瘤 发 生的 蛋白 质己 不 胜枚 举 15 4 -5 6 1 t .酵母双杂交体系的缺陷 尽管己 被证实为一种非常有效的方法，双杂交体系也有自 身的一些问 题和缺 点: ( 1 ) 它并非对所有蛋白 质适用.由 其原理所决定， 融合蛋白 的相互作用激活 报告基因转录是在细胞核内 发生的， 而表达的融合蛋白 在细胞内 能否正确折叠并 运至核内是检测成功的前提条件。虽然目 前已经在表达质粒中插入了核定位序 列， 但仍不能排除不少必须经过内 质网 等细胞器进行翻译后加工修饰的蛋白 质， 尤其是胞外蛋白 不能进入核内， 或因产生错误的构象而影响筛查结果， ( 2 ) 假阳 性的发生较为繁多， 在筛库过程中遇到的假阳性可被简单分成三型:i 型:表达 单独的a d - y融合蛋白即可激活转录。i i 型:表达a d - y融合蛋白和空b d载体 即可激活转录。i i i 型:表达a d - y融合蛋白与任意b d融合蛋白即可激活转录。 这其中部分假阳性来源于筛选对象具有类似转录因子的功能， 或在双杂交体系中 能表现出 这种特性。 ( 3 ) 部分假阳性原因不清， 可能与酵母中其他蛋白 质的 作用 有关。( 4 ) 在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白 质常会带来毒性作用，从 而影响 菌 株 生 长 及 报告 基因 的 表型 15 l e ( 5 ) 虽 然 双 杂 交体 系 可筛 选出 大 量蛋白 质 相 互 作 用， 但其中部分蛋白 质可能处于不同的细胞类型、 细胞空间或生长发育的 不同时 期， 生 理状 态下 是 不 可能 发 生 相 互 作 用的 。 因 此， 对 于 筛 选对 象 和 范围 ， 应 有 一 个合适的选择。 3 .酵母双杂交体系的新发展 在双杂交的具体操作中， 虽然筛选本身较为简便， 但由于该体系存在一些自 身问 题， 使得筛选的结果往往会出 现几十、几百甚至更多的阳性克隆， 后续的分 类、鉴别工作直至找到具有意义的 基因片段需耗费大量的时间及精力。 近年来， 双杂交体系的广泛应用促进了 该体系的不断改进与提高。主要体现在: ( 1 ) 发展了 酵母菌株的多重筛选机制。 位于报告墓因上游的启动子是决定 报 告基因表达灵敏性和特异性最重要的因素， 较早的双杂交体系虽然采用了 双重报 告基因， 如h i s 3 和l a c z ， 但它们是受同一启动子g a l i 的调控. 具有相同的1 7 个碱基的b d识别序列，能激活其中之一者很有可能在另一检测中亦呈阳性。目 前设计的酵母菌株往往具有不同启动子调控下的报告基因。 不同 报告基因能同时 产生假阳性反应的机率明显下降. ( 2 )表达型载体的构建也正进行着几方面的改进。首先，融合蛋白被置于一 些可被诱导的启动子调控之下，使蛋白 质在酵母中的表达量能依需要进行调控 5 8 1 。其次， b d或a d与靶蛋白 质的连接方式也不再只是b d或a d的 碳端与蛋 白 质的 氮端，因为蛋白 质的 抓端和其活性也有很大关系， 对于常规连接找不到作 用蛋白的对象， 改用氮端也许能有不同的发现。 双杂交体系中不同载体原来均采 用氨节抗性作为选择标志， 现在己 被改进成具有耐氨节、 卡那霉素或氛霉素等不 同 耐 药基因的 载体15 9 1 ， 使 得原来 繁 琐的 从酵母中 提取出 单 一质粒的 工作 变得轻松 快捷。 ( 3 )用于双杂交筛选的文库不但应有代表每一基因的足够丰富的多样性，而 且由于蛋白质间发生作用的位点可能为蛋白质多肤链的任意位置， 所以对每一基 因 而言， 还 应当 提供尽可能 多 地与a d连 接位点 1 5 7 1 。 插入片段不宜过 大， 否则因 为非特异结合所导致的假阳 性也会明显增多。 选用更适宜的限制性内切酶以构建 适用于双杂交体系的文库是综合提高 双杂交技术的一个重要方面。 ( 4 ) 在双杂交鉴定过程中要经过两次转化， 这个工作量是相当大的， 特别是寻 找新的作用蛋白 质的时候尤其如此。 而且， 酵母细胞的转化效率比 细菌要低约4 个数量级。 因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。b e n d i x e n等人通过酵母接 合型的引 用， 避免了 两次 转化操作， 同 时又提高了 双杂交的 效率。 在酵母的 有 性 生 殖 过 程中 涉 及到 两 种接 合( m a t i n g ) 类型: a 接 合型 和。 接 合 型 ， 这 两 种 单 倍 体 之间 接合能形成二倍体， 但a 接合型细胞之间或任 接合型细胞之间不能接合形成 二倍体。根据酵母有性生殖的 这一特点， 他们将文库质粒转化。 接合型酵母细胞， “ 诱饵” 表达载体转化a 接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔， 再将 两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上 ， 原则上只有诱饵和靶蛋白 发生了 相互作 用的 二倍体细胞才能在此平板上生 长。 单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但d b融 合 蛋白 和a d融 合 蛋白 不 相 互 作 用的 都 被 淘 汰。 长出 来 的 克 隆 进一 步 进 行p 一 半 乳 糖昔酶活力鉴定。这项改进不仅简化了实验操作， 而且也提高了 双杂交的 筛选效 率6 0 1 。目 前此方法已成为酵母转化的主要替代方法， 极大的提高了 可以 被同时检 测的蛋白 质数量 5 4 1 ( 5 )体内进行的双杂交检测往往需要体外的其他方法来验证，为了使后续的 鉴别蛋白质相互作用的步骤更易实施， 有报道将双杂交筛出的基因片段插入一个 带有抗原决定簇标记的质粒载体， 该载体可在哺乳动物细胞中高水平表达被标记 的蛋白质。用b d - x质粒和带有a d - y插入的抗原决定簇质粒载体共转染哺乳动 物细胞，即可直接进行免疫共沉淀检测。应用这一方法己证实了 b c l - x l和 b a d / b a x 之间的 相互作用6 1 1 ( 6 )除了 在 酵 母中 应 用 外， 双 杂 交 体 系也己 扩 展 到 哺 乳 动物 细 胞 16 2 1 。 因 为 哺 乳动物细胞有一个更类似于生理环境的蛋白 质合成、 加工及反应体系， 有利于发 现真实的蛋白 质间的相互作用。该体系除了 构建表达载体外， 还需要构建一个可 被调 控的 报告 基因 载体共同 转染细胞。 黑霉素乙 酞素 转移酶( c h lo r a m p h e n ic o l a c e t y lt r a n s f e r a s e ) 活力 检 测， 细 胞 表 面 标记 分子c d 4 和h y g r o m y c in 抗 性 均可 作 为报告基因来反映蛋白间作用的有无与强弱。 4 .本实验所采用的双杂交体系 本试 验采 用c y to t r a p 载 体 试 剂盒， 该 试剂 盒 采 用s o s 蛋白 介 导 的 双杂 交 体系， 也被作者称为s o s 救活系统( s o s re c r u i t m e n t s y s t e m ) ， 这是一种完全不同 于以 往的 检 测 系统。 c y t o t r a p 系 统使 用 酵 母s x e r e v is ia e 温 度敏 感 突变 菌 株c d c 2 5 h ,它 包 含 一个位于c d c 2 5 基因1 3 2 8 位点的定点氨基酸突变。c d c 2 5 是人s o s ( h s o s ) 基 因在酵母中的同源物， 编码一个鸟昔酸交换因子， 可以结合并激活r a s ， 启动r a s 信号 转导途径。具有c d c 2 5 突变的菌株c d c 2 5 h在2 5 时可以正常生长， 但是 在3 7 时不能生长。而人的h s o s 蛋白可以补充 d c 2 5 的缺陷，并诱发酵母r a s 信号转导途径。 h s o s 的表达及其随之在细胞膜上的定位使得c d c 2 5 h酵母菌株可 以 在3 7 时生长。 h s o s 蛋白 在质膜上的定位是通过双杂交蛋白 之间的相互作用 而实现的 ( 图8 ) 0 细胞膜 豆笼酸燕化 信号片段 祀 蛋 白 诱饵蛋白 ctp h s o s 图8 r a s - 信号途径采用的c y t o t r a p双杂交体系示意图 编码诱饵蛋白 的d n a被克隆到p s o s 载体多克隆位点上， 产生一个由h s o s 和诱饵蛋白 组成的 融合蛋白 。 编码另一 个靶蛋白 基因 被克隆到p m y r 载体多 克隆 位点上，并作为融合蛋白的一部分与载体提供的十四烷基化膜定位信号序列 ( m y r ) 共同表达，该序列可将融合蛋白 锚定在质膜上。 之后，两种融合蛋白 在 酵母c d c 2 5 h中共表达， 将酵母细胞在限制性温度3 7 培养。如果诱饵蛋白 与靶 蛋白有物理作用，h s o s蛋白则被募集到膜上，激活 r a s信号转导途径，并使得 c d c 2 5 h酵母菌株可以在3 7 生长。 本实验使用p s o s 和 p m y r 作为 表 达载体，分别用于构 建和表 达与 h s o s 和 m y r 信 号融合的蛋白。 p s o s 载体包含编码 h s o s 基因的1 到1 0 6 7 个氨基酸及一个3 多克隆位 点， 它用于构建含有编码诱饵蛋白的诱饵质粒。启动h s o s 一 诱饵表达的 a d h i 启动 子为 组成型表达。 p m y r 载体 含有编码m y r 的d n a 及一个 3 多克 隆位点， 用于 构建 含有编码靶蛋白的外源d n a 的质粒或文库。 当以葡萄糖作为碳源时， 启动子g a l 1 是受 抑制的，当 培养荃中 添加半 乳 糖时，则 可快速启 动m y r - 靶蛋白 的 表 达。 p s o s 和p m y r 载 体 都 包 含 两 种 复 制 起点， 分 别 用 于 质粒 在 大 肠 杆菌 和 酵 母 中 的复制。两个载体还分别携带有生 物合成荃因l e u 2 和u r a 3