（遗传学专业论文）kelch家族基因klhl5、klhl6的克隆和功能研究.pdf

一一一坠! ! ! ! 窒竖苎型坠! ! ! i ：! 望垡塑墅堡塑望壁塑垄_ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ r - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ 一摘要i 由微丝、微管、中间纤维组成的细胞骨架调节真核细胞的结构和许多的生理功能。微丝的组装和解聚是由许多肌动蛋白结合蛋白a b p s ( a c t i n gb i n d i n gd r o r e i n s ) 控制的i ? 近年来发现了一类新的和肌动蛋白结合的k e l c h 家族蛋白，它的特征是包含k e l c h 结构域串联重复而成的k e l c h r e p e a t 结构域。k e l c h 结构域由约5 0 个氨基酸组成的。l k e l c h r e p e a t 结构域一般由4 至7 个k e c h 结构j域组成。人们在真菌的半乳糖氧化酶中发现了k e l c h 结构域，而且得到了该蛋、十白的晶体结构，其中7 个k e t c h 结构域构成了一个0 螺旋桨结构( b e t a p r o p e l l e r ) 。每个k e l e h 结构域是个四条链组成的的b 折叠，构成b p r o p e l l e r 的一片桨叶，共同围绕着一个中心轴。k e l c h r e p e a t 结构域的结构表明它可以介导蛋白质之间的相互作用。果蝇k e l c h 蛋白、i p p 和e r i cl 等b t b k e l c h 亚家族是在n 端有一一个b t b结构域、c 端有k e l c h r e p e a t 结构域的k e l c h 蛋白，b t b k e l e h 亚家族蛋白还可通过b t b 结构域产生新的蛋白相互作用。b t b p o z 在进化中也是保守的，在5 - 1 0 的含c 2 h 2 锌指结构的转录因子也含有b t b 结构域。大部分b t b k e l c h 蛋白看来和细胞的许多重要的生理活动有关，包括和细胞骨架的相互作用、把转录因子隔离在细胞质里、维持细胞的形状等。，y 一一f-，、张0 式；挈t ! 、t 葫缀实验室通过e d n a 文库构建和大规模，克隆到了k e l c h 家族基因b t b k e l c h 亚家族的k l h l 5 、k l h l 6 两个新成员。通过n o r t h e r n 杂交，发现k l h l 5在卵巢、肾上腺及甲状腺组织表达最高，而在睾丸、前列腺、脊髓、淋巴结、气管的表达相对比较高。k l h l 5 基因定位到人染色体4 p 1 4 ，包括1 1 个外显子和1 0，个内含子。f 另外，我们发现了i ( l h l 5 的一种剪切形式，它没有使用原来的第2个外显子，通过r t p c r 分析了这两种剪切形式的组织表达谱。我们还分析了1 2张肝癌表达谱芯片中k l h l 5 的表达病进行了聚类分析，发现它和其它几个重要基因形成一个族，包括另一个b t b k e l c h 基因家族成员n s 卜b p 。、，k e l c h 家族基因k l h l 5 、k l h l 6 的克隆和功能研究f 而k l h l 6 在几乎所有成人和胎儿组织都表达，其中心脏、肾脏、骨骼肌、睾丸、卵巢、前列腺、脾脏的表达相对比较高，在其它组织如脑、子宫、月十脏、胰腺、甲状腺、小肠、结肠中的表达较弱。，微1 通过s a g e 分析发现k l h b 基因是在许多肿瘤组织和细胞中是广泛表达的，通过原位杂交和基因芯片分析发现，k l h l 6 基因在胰腺癌、喉癌的表达高于正常组织。i 我们设计和合成了在哺乳动物细胞中表达的自我剪切锤头状核酶，并通过体内筛选的方法找到了一个有效的核酶，而且通过转染胰腺细胞株得到了验证。k l h l 6 基因定位到人染色体7 p 1 5 3 ，包括1 1 个外显子和l o 个内含j 二，在基因组上跨越6 8 8k b 。我们发现k l h l 6 基因同样有两个不同的转录本、2 个可变剪切的外显子，这2 个转录本和对第2 个外显子的可变剪切形成的转录形式在许多组织中表达。k l h l 6 可以选择使用3 端的两个加尾信号a a t a a a 中的一个。而且我们发现k l h l 6 蛋白有个核定位信号，这个核定位信号在许多其它蛋白的核定位功能得到了实验的验证，有强烈的核定位功能。于是我们对k l h l 6蛋白的包括核定位信号的氨基端、其余氨基酸组成的羧基端以及全长蛋白用绿荧光蛋白进行了细胞定位，我们发现这个蛋白的核定位信号确实有非常强烈的核定位功能，氨基端几乎全部分布到细胞核中，而羧基端弥散在细胞核中，全长蛋白在细胞核和细胞质中都有分布，但是在细胞核的分布比较集中，说明k l h 。6 在细胞中的分布是动态的，为g n b 2 l 1 与k e l c h r e p e a t 结构域的结合提供了机会。k l h l 6 的k e l c h r e p e a t 结构域由3 个k e l c h 结构域组成，不同于其它的b t b k e l c h 的家族蛋白。大肠杆菌中进行了这个结构域的融合表达。我们用酵母双杂交方法分析了k l h l 6 蛋白的k e l c h r e p e a t 结构域的结合蛋白，我们得到了一个r a c k s ( r e c e p t o ro fa c t i r a t e dp r o t e ir lk i n a d ec ) 的新成员g n i j 2 l 1 ，这是第一次报道r a c k 蛋白可以和k e l c h 蛋白结合，而且结果表明k l h l 6 基因蛋白与p k c 的活动有关。，、，关键词也地燮残、一b t b 一k e l c h 蛋白、k l h l 5 、罂6 、跫、c d n a 表达谱芯片、酵母双杂交、锤头状核酶、r a c k 、g n b 2 l 1 、蛋白激酶c厂1l ，一坠! ! ! 窒鳖兰里坠兰旦坚：坠旦坐塑塞堕翌里堕型堕l 一a b s t r a c ti tisc o n f ir m e dt h a tt h ea c t i n b a s e dc y t o s k e l e t o n ，i nc o n j u n c t i o rw i t hm i c r o t u b u le sa n di n t e r m e d i a t ef i l a m e n t s ，p r o v i d e sa ai n t e r n a la r c h i t e c t u r a lf r a m e w o r k ，w h i c hr e g u l a t e st h es t r u c t u r ea n df u n c t i o n so fa 1 1e u k a r y o t i ce e l l s i ti sf o u n dt h a tt h ea s s e m b l ya n dd i s a s s e m b l yo fa c t i nf i l a m e n t sa r er e g u l a t e db yan u m b e ro fa c t i n - b i n d i n gp r o t e i n s ( a b p s )r e c e n t l yan e wk i n do fa c t i n b i n d i n gk e l c hp r o t e i nf a m i l yh a sb e e nf o u n d t h ek e l c hp r o t e i nf a m i l yi sc h a r a c t e r i z e db yt a n d e m l ya r r a n g e dm o t i f so fa b o u t5 0a m i n oa c i d s t h ek e l c hr e p e a t sa r ep r e d i c t e dt oa d o p tab l a d e 一1i k ec o n f o r m a t i o na n da s s e m b l ei nab p r o p e l l e rs t r u c t u r ea sd e m o n s t r a t e df o rg a l a c t o s eo x i d a s e ，e a c ho ft h ek e l c hr e p e a t sc 0 1 l e c t i v e l yf o r maf o u r s t r a n d e db s h e e tc o r r e s p o n d i n gt oas i n g l eb l a d eo ft h ep r o p e ll e t ，a n dt h es e r i e so fb l a d e sl i et i l t e da r o u n dac e n t r a la x i s t h e0 p r o p e e rm o l e c u l a rm o d u l ef a v o r st h ec o o r d i n a t i o no fm u l t i p l ep r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n si n c l u d i n ga c t i n - b i n d i n ga c t i v i t y a n o t h e rc h a r a c t e r i s t i co ft h ek e l c hf a m il yi st h a tm o s tm e m b e r ss u c ha sk e l c h ，i p pa n de n e lh a v ea n o t h e rc o n s e r v e db t bd o m a i na tt h ee x t r e m ea m i n ot e r m i n u s ，t h o s ep r o t e i n sf o r mb t b k e l c hs u b u n i to fk e l c hf a m il yp r o t e i n s t h eb t bd o m a i ni sa i s of o u n da tt h en t e r m i n u so f5 1 0 o fz i n c f i n g e rt r a n s c r i p t i o nf a c t o rt y p e sa n di sac o n s e r v e dp r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o nm o t i f m o s tb t b k e l c hp r o t e i n ss e e mt ob ec y t o s k e l e t a lp r o t e i n si m p l i c a t e di nv a r i o u se e ll u l a rp r o c e s s e s ，s u c ha sa c t i ac y t o s k e l e t o ni n t e r a c t i o n ，9 y t o p l a s m i cs e q u e s t r a t i o no ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa n de e l1m o r p h o l o g y h e r ew ed e s c r i b et h ec l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no fan o v e lh u m a nk l h l 5a n dk l h l 6g e n e s t h ee d n ao fk l h l 5a n dk l h l 6g e n e se n c o d eb t b k e l c hs u b u n i tr a m i l yp r o t e i n sh o m o l o g o u st ot h ed r o s o p h i l ak e l c hp r o t e i n n o r t h e r nb l o t a n dr t p c ra n a ly s i sw a su s e dt or e v e a lt h et w og e n e se x p r e s s i o n k l h l 5i sa b u n d a n t l ye x p r e s s e di no v a r y ，a d r e n a lg l a n d ，t h y r o i d ，a n dl e s sa b u n d a n t l ye x p r e s s e di nt r a c h e a ，p r o sr a t e ，t e s t is ，iy m p hn o d e ，a n ds pih a lc o r d k l h l 5ism a p p e dt oh u m a nc h r o m o s o m e4 p14a n d回k e l c h 家族基因k l h l 5 、k l h l 6 的克隆和功能研究i n c l u d e s1 ie x o n sa n d1 0i n t r o n s a is ow ef o u n dt h e r ew a sas p l i c i n gi s o f o r mo fk l h l 5w h i c hd o e sn o tu s et h es e c o n de x o n ，t h es p li c i n gi s o f o r m st i s s u ee x p r e s s i o nw a sa n a l y z e db yr t p c r a 1 s ow ea n a l y z e dt h ee x p r e s s i o np r o f il e so f1 2h u m a nh e p a t i cc d n am i c r o a r r a y sa n df o u n dk l f l l 5f o r m e dac i u s t e rw i t h7i m p o r t a n tg e n e si n c l u d i ga n o t h e rb t b k e l c hf a m il yg e n en s l 一b p a n dk l h l 6w a se x p r e s s e du b i q u i t o u 2 l yi nh u m a nt i s s u e s ，i ti sa b u n d a n t l yir ls p l e e n ，p r o s t a t e ，t e a t i s ，o v a r y ，s k el e t a lm u s c l e ，k i d n e ya n db r a i n ，m o s ta b u n d a n t l yi nh e a r t a i s o ，i ti sw i d el ye x p r e s s e di nal o to ft u m o r sb ys a g ea n m y z ea n dr t p c r i ns i t eh y b r i d i z a t i o na n dc d n am i c r o a r r a yc o n f i r m e di t i su p r e g u l a t e di np a n c r e a t i ct u m o ra n d1 a r y n xt u m o r i no r d e rt of i n di fi ti si n v o l r e di nt u m o rg e n e s i s ，w ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e dt h r e eh a m m e r h e a dr i b o z y m e sa n dc l o n e dt h e mi n t om a m m a l i a ne x p r e s s i n gv e c t o ra n ds e l e c t e dah i g h e re f f i c i e n to n et os u p p r e s sk l h l 6 se x p r e s s i o ni np a n c r e a t i ct u m o rc e l l1 i n e s k l h l 6w a sm a p p e dt o7 p 1 5 3 ，i th a s1le x o n sa n d1 0i n t r o n s ，s p a n n i n g6 8 8k bi nh u m a ng e n o m e a 1 s ow ef o u n da n o t h e rt r a n s c r i p to fk l h l 6w h i c hu s ed i f f e r e n tf i r s te x o n w ef o u n dt h et w ot r a n s c r i p t sa r ed i f f e r e n ti nt i s s u ee x p r e s s i o n a 】2 0u n e x p e c t e d l yw ef o u n da n o t h e rs e c o n de x o na n dt h es p l i c i n gi s o f o r m sa r ea l s oe x p r e s s e di nm a n yt i s s u e s t h e r ea r et w oa a t a a at r a n s c r i p t i o nt e r m i n a t i o ns i g n a l si nt h e3 t e r m i n u so ft h ek l h l 6 c d n a ，a l2 0w ef o u n dt h a tk l h l 6c o u l du s ea l t e r n a t i v et r a n s c r i p t i o nt e r m i n a t i o ns i g n a l s t h ek e l c h r e p e a t sm o t i fo fk l h l 6p r o t e i nc o n s i s t so n l yt h r e et a n d e mk e l c hm o t i f s ，w h i c hi sd i f f e r e n tf r o mo t h e rb t b k e l c hf a m i l yp r o t e i n s w eh a v ee x p r e s s e dt h ek e l c h r e p e a tm o t i fa saf u s i o np r o t e i ni ne c o l i ，a 1 s ow ep e r f o r m e dt w o h y b r i ds y s t e me x p e r i m e n tt of i n dt h ek e l c h r e p e a tm o t i f sb i n d i n gp r o t e i n sa n d f o u n dah u m a nr a c k ( r e c e p t o ro fa c t i v t e dp r o t e i nk i n a s ec ) m e m b e r g n b 2 l i t h i sist h ef i r s tr e p o r tt h a tr a c kp r o t e i nc o u l db i n dw i t hk e l c hp r o t e i n sa n di n d i c a t e sk l h l 6p r o t e i ni sr e l a t e dw i t hp k ca c t i v i t y 团k e l c h 家族基因k l h l 5 、k l h l 6 的克隆和功能研究t h e r ei san u c l e a rl o c a t i o ns i g n a li nl h en t e r m i n u so fk l h l 6p r o t e i na n dw ef o u n dt h ec - t e r m i f l u so fk l h l 6p r o t e i ni sd o m i n a n t l ye x p r e s s e di nn u c l e a r w ef o u n dt h en - f e r m i n t i so fk l h l 6p r o t e i ni n c l u d i n gt h ek e l c hr e p e a tm o t i fi sd i s p e r s e di nt h ec e l1a n dt h ew h o l ep r o t e i nism a i n l y1 0 c a t e di 1 3n u c l e a rl e s si nc y t o s 0 1 b e c a u s et h er a c kp r o t e i ni sl o c a t e di nc y t o s 0 1 s ot h ed y n a m i cl o c a t i o no fk l h l 6c o u l dp r o v i d ec h a n c et ob i n dw i t hg n b 2 l lp r o t e i na n dg o n n e c tk l h l 6w i t hp k c k e j , w o r d s ：k e i c hm o t i f ，b r b k e t c hp r o t e i n s ，k l h l 5 ，k l h l 6 ，c l o n i n g ，e d n am i c r o a r r a y ，t w o h y b r i ds y s t e m ，h a m m e r h e a dr i b o z y m e ，r a c k ，o n b 2 l 1 ，p k c口k e l c h 家族基因k l h l 5 、k l h l 6 的克隆和功能研究第一章：前言第一节：k e l c h 家族基因研究概述自从孟德尔的遗传定律与1 9 0 0 年被重新发现以来，经历了个世纪的发展后，遗传学取得了近代自然科学发展史上空前辉煌的成绩，并展示了极富活力的强劲的发展势头。同样，遗传学也从杂交试验阶段发展到分子实验阶段。而且，我们对于遗传的分子基础的认识同样取得了惊人的成就。w a s t o n c r i c k 于1 9 5 3 年发现了d n a 的双螺旋结构后，分子遗传学对于基因的认识远远超出了孟德尔提出的抽象的基因的概念。我们不仅知道生物的性状是可以遗传的，而且是通过基因来遗传和控制的。随着越来越多的肿瘤基因、肿瘤抑制基因和遗传病的致病基因的发现，对于基因的研究受到前所未有的重视，遗传学也从研究生物的遗传和变异的规律的科学演变为研究基因的结构和功能的科学。近年来，为了从根本上认识生物的遗传变异规律，科学家开始对许多生物的基因组进行测序。这样我们对于个别基因的拓展到研究生物的基因组信息。人类和小鼠、果蝇、斑马鱼、线虫、拟南芥等模式生物基因组序列的完成，可以使我们从基因组水平研究基因的功能、生物的进化。另外，研究人员加大了c d n a 的测序工作，越来越多的基因被识别和克隆，可以用反向遗传学的方法研究基因与疾病的关系。这样，我们可以从分子水平更加深入地认识人类疾病的发生机理，从而进行疾病的预防和治疗。当我们获知人类所有基因的功能后，就可以从一个新的角度去研究人类的发育和疾病的发生，将帮助我们目前人们在运用新技术了解个体之间基因组的差异和所有组织、细胞的基因表达谱，以进步认识人类的遗传结构和遗传指令的改变如何导致疾病的发生机制，从而为预防和治疗疾病提供有力的基础。以肌动蛋白为基础的微丝在维持细胞形状和动态调节细胞的迁移、轴突伸展、吞噬等生理功能方面发挥着重要的作用。丝的组装和解聚是由许多肌动蛋白结合蛋白a b p s ( 3 c t i n g b i n d i n gp r o t e i n s ) 控制的。近年来发现了一类新的和肌动蛋白结合的k e l c h 家族蛋白，它的特征是包含k e l c h 结构域串联重复而成的垦! ! ! 窒堕董里坠! ! 坚：坠里些堕塞堕塑兰堂竺垄参考文献：a k a m a t s u ，y a n do e t t i n g e r ，m a ( 1 9 9 8 ) m 0 1 c e l l g i 0 1 1 8 ，4 6 7 0 4 6 7 8a d a m st c e ta 1 ( 1 9 9 8 )e m l 3 0j 1 7 ，4 9 6 4 4 9 7 4a h m a d k f e ta 1 ( 1 9 9 8 ) p r o c n a t l a c a d $ c i u s a 9 5 ，1 2 1 2 3 1 2 1 2 8a r a v i n d l a r i dk o o n ir l ，e v ( 1 9 9 9 ) j m 0 1 1 3 i 0 1 2 8 7 ，1 0 2 3 一1 0 4 01 3 r u n n e r b e t , a 1 ( 1 9 9 9 ) g e n o r a er e s 9 ，4 3 7 4 4 8b o r k p a n di ) 0 0 1 i t t l e ，r f ( 1 9 9 4 ) 5 m 0 1 b i 0 1 2 3 6 ，1 2 7 7 1 2 8 2c a l1 e b a u l ；i a n dm o r n o n ，j - p ( 1 9 9 8 ) c e l1 m 0 1 l i f es c i 5 4 ，8 8 0 8 9 1c o u r t o t ，a - t v l ( 1 9 9 1 )m 0 1 t e p o r d d e v 2 8 ，2 7 2 2 7 9d i a z e e ta 1 ( 1 9 9 7 ) j c e l lb i 0 1 1 3 8 ，2 8 3 2 9 0d u k e c o h a n ，i s e ta 1 ( 1 9 9 8 ) p r o c n a t l a c a d s c i u s a 9 5 ，1 1 3 3 6 - “3 4 1e i c h i n g e r ，l e ta 1 ( 1 9 9 6 )e m b oj 1 5 ，5 5 4 7 5 5 5 6f u k u i y e ta 1 ( 1 9 8 9 )m 0 1 c e l l b i 0 1 9 ，5 6 1 7 5 6 2 2g o e b l e ，s j e ta 1 ( 1 9 9 0 )v i r o l o g y1 7 9 ，2 4 7 2 6 6g u n n t m e ta 1 ( 1 9 9 9 )n a t u r e3 9 8 ，1 5 2 1 5 6l q e r n a n d e z 。m f e ta 1 ( 1 9 9 7 )j n e u r o s c i 1 7 ，3 0 3 8 3 0 5 ll - l e r n a n d e z ，m c e l ；a 1 ( 1 9 9 8 ) e x p c e llr e s 2 4 2 ，4 7 0 4 7 7h u g h e s ，t a e ta 1 ( t 9 9 9 ) j 1 3 i o _ l _ c h e r n 2 7 4 ，1 6 4 3 7 1 6 4 4 3i t o ，n e l ；a 1 ( 1 9 9 4 ) j m 0 1 b i 0 1 2 3 8 ，7 9 4 8 1 4i t o h k e ta 1 ( 1 9 9 9 ) c j e n e sb e v 1 3 ，7 6 8 6j a c k s o n r j e ta 1 ( 1 9 9 9 )j v i r 0 1 7 3 ，2 3 7 6 2 3 8 4j o h n s o n k m e ta 1 ( 1 9 9 9 )j v i r 0 1 7 3 ，3 9 3 0 3 9 4 0k i m i f e ta 1 ( 1 9 9 9 )g e n e2 2 8 ，7 3 8 3k i m ，t a e ta 1 ( 1 9 9 8 )j c e l lb i 0 1 1 4 1 ，5 5 3 5 6 6k u r a h a s h i ，h e ta 1 ( 1 9 9 5 ) h u m m 0 1 g e n e t 4 ，5 4 1 5 4 9l a m b r i g h t ，d g e ta 1 ( 1 9 9 6 )n a t u r e3 7 9 ，3 儿一3 1 9l a t a ，j a n dn u r s e ，p ( 1 9 9 7 ) c e l l8 9 ，9 3 9 9 4 9m o ，x e ta 1 ( 1 9 9 9 ) j b i 0 1 c h e m 2 7 4 ，7 0 2 5 7 0 3 1m u l l e t ，s a e ta 1 ( 1 9 9 9 ) j m 0 1 1 3 i 0 1 2 9 1 ，8 0 1 8 1 3l c p h e r s o n ，m j e ta 1 ( 1 9 9 2 )j b i 0 1 c h e m 2 6 7 ，8 1 4 6 8 1 5 2m u r z ir l ，a g ( 1 9 9 2 ) p r o t e ir l s1 4 ，1 9 1 2 0 l1 3k e c h 家族基因k l h l 5 、k l h l 6 的克隆和功能研究n a 9 1 e d l e ta 1 ( 1 9 9 9 )n a t u r e3 9 8 ，1 4 8 1 5 2o h m a c h i m e ta 1 ( 1 9 9 9 )g e n e sc e l14 ，3 2 5 3 3 7o e t _ l ；i n g e r ，k m e ta 1 ( 1 9 9 0 )s c i e n c e2 4 8 ，1 5 1 7 一1 5 2 3p h i1i p s ，j a n dh e r s k o w i t z ，i ( 1 9 9 8 ) j c e l l1 3 i 0 1 1 4 3 ，3 7 5 3 8 9r o b i n s o n d n a n dc o o l e y ，l ( 1 9 9 7 ) j c e l lb o i l i 3 8 ，7 9 9 8 1 0r e n r u l t ，l ( 1 9 9 8 )n a t u r e3 9 2 ，9 7 1 0 1s a n d e r ，m c e ta 1 ( 1 9 9 6 )j b i 0 1 c h e m 2 7 1 ，2 6 5 1 2 6 5 7s c h m i d m f e l ；a 1 ( 1 9 9 4 )j c e l lb i 0 1 3 4 1 3 5 0s c h w a r z k e t wa 1 ( 1 9 9 6 ) s c i e r l c e2 7 4 ，9 7 9 9s m it h ，t f e ta 1 ( 1 9 9 9 ) t r e n d sb i o c h e m s c i 2 4 ，1 8 1 1 8 5s o l t y s i k - e s p a n o l a ，m e ta 1 ( 1 9 9 9 ) m 0 1 b i 0 1 g e l l1 0 ，2 3 6 1 2 3 7 5s u n ，s e ta 1 ( 1 9 9 7 ) m 0 1 1 3 1 0 1 c e l _ l8 ，4 2 卜4 3 0y e th a a r ，e e ta 1 ( 1 9 9 8 )c e l l9 5 ，5 6 3 5 7 3t a y l o r ，a e l , a 1 ( 1 9 9 8 )m 0 1 c e l1 1 3 i o c h e m 1 8 3 ，1 0 5 一儿2v a r k e y ，j p e ta 1 ( 1 9 9 5 )g e n e sd e v 9 ，1 0 7 4 一1 0 8 6v i l l a a e ta 1 ( 1 9 9 9 ) e e l l9 3 ，8 8 5 8 9 6y o ng u l o w ，m e ta 1 ( 1 9 9 5 )e x p c e l lr e s 2 1 9 ，4 0 7 4 1 3w a y ，m e ta 1 ( 1 9 9 5 ) j c e i1b i 0 1 1 2 8 ，5 卜6 0w a l l m a e ta 1 ( 1 9 9 5 )c e l l8 3 ，1 0 4 7 1 0 5 8w a y ，m e ta 1 ( 1 9 9 5 )e x p c e l lr e s 2 1 9 ，4 0 7 4 1 3w i l s o n ，a c e ta 1 ( 1 9 9 7 )m 0 1 c e l l 1 3 i 0 1 1 7 ，6 1 3 9 6 1 4 6w o lf f 。q - e ta 1 ( 1 9 9 8 ) j v i r 0 1 7 2 ，71 7 0 7 1 8 0x u e ，f a n dc o o l e y ，l ( 1 9 9 3 )c e l l7 2 ，6 8 卜6 9 31 4k e l c h 家族基因k l h l 5 、k l h l 6 的克隆和功能研究一材料和试剂第二章：材料和方法1 1 实验材料细胞株：引自中科院上海细胞生物学研究所。, m u l t i p l et i s s u en o r t h e r n 膜，美国c l o o t e e h 公司产品x 鼠体细胞辐射杂交板s t a n f o r dg 3r hp a n e i ，美国r e s e a r c hg e n e t i c s 公司产品, m a t a c h m a k el e x a 酵母双杂交系统，美国c l o n t e c h 公司产品, p v d f 膜( h y b o n d p ) ，美国a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品硝基纤维素膜( h y b o n d c ) ，美国a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品, n y t r a ns u p e r c h a r g e 膜，德国s c h l e i c h e r & s c h u e l l 公司产品l2 主要试剂和酶类i m d m ( i s c o v e sm o d i f i e dd u l b e c c o sm e d i u m ) ：g i b c o 公司产品h a n k sb a l a n c e ds a l ts o l u t i o n ：g ib c o 公司产品n e w b o r nc a l fs e r u m ：h y c l o n e 公司产品, t r y p s i n e d t a浓度1 0 x 用2 0 m lm il l 卜q h ：o 稀释含0 5 t r p si ne d t a 一4 n a ：g i b c o 公司产品- f i l t e rp a p e r ：w h a t m a n 公司产品, a g a r o s ei ：s p a n is h 分装, e d t a ：g i b c o 公司产品s d s ：g i b c o 公司产品, c a c l2 ：a m r e s c o 分装o t r i s ：a m r e s c o 分装p b s 缓冲液( 1 3 7m mn a c l 2 7m mk c l l om mn a 。h p o , 1 8i i 】 ii ( h ：p 啦，p h7 4 )o m u l t i p l et i s s u en o r t h e r n 膜，美国c l o n t e c h 公司产品m i c r o s p i ng - 2 5 纯化柱，美国a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品k e l c h 家族基因k l h l 5 、k l h l 6 的克隆和功能研究公司m u l t i s c r e e n9 6 孔d n a 纯化系统，美国m i lli p o r e 公司产品, o i a p r e ps p i n 质粒抽提试剂盒，德国q i a g e n 公司产品, i a q u i c kp c r 纯化试剂盒，德国q i a g e n 公司产品o q i a q u i c k 胶回收试剂盒，德国q i a g e n 公司产品- t 4d n a 连接酶，英国b i o l a b s 公司产品t t 4d n a 聚合酶，英国b i o l a b s 公司产品各种d n a 分子量m a r k e r ，英国b i , l a b s 公司产品中分子量蛋白标准，洛阳华美公司产品各种限制性内切酶，英国b i o l a b s 公司产品- e l o n g a s ee n z y m em i x ，美国g i b c o 公司产品o t a qp l u sid n a 聚合酶，上海生工生物工程公司产品, t a q 酶，复旦大学遗传学国家重点实验室产品细菌d n a 提取液，复旦大学遗传学国家重点实验室产品, d n t p s ，上海生工生物工程公司产品所有引物都由上海生工公司合成, g s t a g r o s e s e p h e r o s e ，美国s a n t ac r u z a n p h a m a s h i a 公司产品多克隆抗体，美国s a n t ac r u z 公司产品刊、鼠抗m y c 单克隆抗体，美国c l o n t e c h 公司产品碱性磷酸酶联兔抗小鼠二抗，美国s a n t ac r u z 公司产品碱性磷酸酶联驴抗羊二抗，美国s a n t ac r u z 公司产品, p r o t e i na g - a g a r o s e 免疫共沉淀试剂盒，美国r o c h e 公司产品, b mc h r o m o g e n i cw e s t e r nb 1 0 f t i n g 试剂盒，美国r o c h e 公司产品, b i g d y ep r i m e r 和b i g d y et e r m i n a t o r 测序试剂盒，美国p e r k i ne l m e r, i p t g ，美国p r o m e g a 公司产品氯化钙，美国a m r e s c o 公司产品, t r i s 碱，分析纯，美国b o e h r i n g e rm a n n h e i m 公司产品乙二胺四乙酸( e d t a ) ，分析纯，安徽合肥工业大学化学试剂厂氨苄青霉素，上海四药股份有限公司k e l c h 家族基因k l h l 5 、k l f t l 6 的克隆和功能研究n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺( t e m e d ) ，美国f 1 u k a 公司产品n ，n - 亚甲双丙烯酰胺，美国b b i 公司产品丙烯酰胺，美国b b i 公司产品k 2 硫酸胺，美国s i g m a 公司产品考马斯亮蓝r 2 5 0 ，美国a m r e s c o 公司产品十二烷基磺酸钠( s d s ) ，美国s e r v a 公司产品同位素【o 一“p ld c t p ( 3 0 0 0 c i m m 0 1 ) ，北京亚辉生物医学工程公司1 3 菌株和质粒大肠杆菌d h 5 a ：基因型s u p 9 4 4 a l a c u i 6 9 ( 币8 0 1 a c z z g l l 5 ) h s d r l7 r e c a1 e n d a l g y r a 9 6t h i lr e l a l ( 本实验室保存)大肠杆菌d h 5q 菌株：基因型s u p 9 4 4 a ，l a c u l 6 9 ，( 中8 0 1 a c z m 1 5 ) ，h s dr 1 7 ，r e c k l ，e n d k l ，g y r k 9 6 ，t h i l ，r e l a i ，本实验室保存大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 菌株：基因型f 一，o m p t ，h s d s b ，( r b ，m b 一) ，d c m ，g a l ，( d e 3 ) ，本实验室保存酿酒酵母e g y 4 8 菌株：m a ta ，u r a 3 ，h i s 3 ，t r p l ，l e x k o p ( x 6 ) 一l e u 2 ，购自美国c l o n t e c h 公司酿酒酵母y m 4 2 7 1 菌株：m a t a ，u r a 3 5 2 ，h i s 3 2 0 0 ，l y s 2 8 0 1 ，a d e 2 1 0 1 ，a d e 5 ，t r p l 一9 0 1 ，l e u 2 3 ，1 1 2 ，t y r l